Sunteți pe pagina 1din 14

C1

Concepte de baz n biologia molecular


Definitie
Biologia molecular este ramura biologiei care se ocup cu studierea mecanismelor biologice n cadrul
celulei, la nivel molecular.
Obiectul de studiu al biologiei moleculare include:

Interactiunile dintre variatele sisteme celulare precum si interactiunile dintre diferitele tipuri de
ADN, ARN si biosinteza proteinelor;

Rolul acizilor nucleici n cadrul pstrrii i transmiterii caracterelor ereditare;

Procesele de replicare, transcriere i traducere a materialului genetic.

Tehnicile moleculare cu larga aplicabilitate, in practic toate domeniile biologiei,sunt printre altele:

Construirea bancilor de gene si selectia genelor de interes din acestea;

Marcarea moleculelor (proteine si acizi nucleici) si urmarirea structurii si functiilor lor;

Amplificarea fragmentelor de ADN (tehnica PCR);

Tehnologia markerilor moleculari (polimorfismul fragmentelor de restrictie- tehnica RFLP;


polimorfismul unor fragmente de ADN amplificate randomic-RAPD etc.).

Istoric
Anul
Autorul (autorii)
1868 Fredrich Miescher
1875

O.Hertwig

18821885
1902
1909

E.Strasburger,
W.Flemming
Archibald Garrod
W.Johannsen
Edward M.East

1910

Thomas Hunt Morgan

1911

Thomas Hunt Morgan

1912
1927

Alfred Sturtevant
Herman J.Muller

1928

Frederick Griffith

1931
1941
1944
1946
1950

Harriet Creighton,
Barbara McClintock
George Beadle, Edward
Tatum
Oswald Avery, Collin
MacLeod, Maclyn
McCarthy
Joshua Lederberg,
E.Tatum
Barbara McClintock

Evenimentul tiinific
Izoleaz nucleina din nuclei
Arat c nucleul este necesar pentru fecundare i pentru diviziunea
celular, el coninnd astfel informaia necesar pentru aceste fenomene
Arat c nucleii conin cromosomi
Identific prima boal genetic uman
Introduce noiunea de gen
Elucideaz rolul reproducerii sexuate n evoluie
Identific prima gen sex-linkat, white, care determin culoarea alb a
ochilor de Drosophila melanogaster
Propune explicaia linkage-ul genetic: genele sunt plasate pe acelai
cromosom
Realizeaz prima hart genetic
Evideniaz faptul c radiaiile X produc mutaii
Descoper transformarea genetic la bacterii i numete agentul
responsabil drept principiu transformant
Arat c recombinarea genetic la porumb se datoreaz unor schimbri
fizice la nivelul cromosomilor omologi
Propun ipoteza o gen o enzim
Demonstreaz c principiul transformat al lui Griffith este reprezentat de
ADN
Descoper procesul de conjugare la bacterii
Explic rezultatele obinute n experimentele la porumb prin intervenia
unor elemente genetice transpozabile

1952
1953
1957
1958
1959
1961

1965
1966
1972
1973
1975
1977

1983
1986
1989
1990
1994
1995
1996

1997
1997
1998

1999
2000

Alfred Hershey, Martha


Arat c materialul genetic al bacteriofagului T2 este reprezentat de ADN
Chase
James Watson, Francis
Propun modelul dublu-helical de structur al ADN
Crick
Heinz Fraenkel-Conrat, Evideniaz c materialul genetic al virusului mozaicului tutunului este
B.Singer
ARN
Matthew Meselson, F.StahlDovedesc modelul semiconservativ de replicare al ADN
Arthus Kornberg
Izoleaz ADN polimeraza I de la E.coli
Severo Ochoa
Descoper prima ARN polimeraz
Sidney Brenner, Francois
Descoper ARNm
Jacob, Matthew Meselson
Francois Jacob, Jacques
Propun modelul operonului pentru reglarea exprimrii genelor la bacterii
Monod
Robert Holey
Determin pentru prima dat secvena de nucleotide dintr-un ARNt
Marshall Nirenberg,
Descifreaz codul genetic
H.Gobind Khorana
Paul Berg
Realizeaz in vitro prima molecul recombinat de ADN
Herb Boyer, Stanley
Utilizeaz pentru prima dat o plasmid pentru a clona ADN
Cohen
Edward M.Southern
Pune la punct o metod de identificare a genelor clonate, prin transferarea
pe un filtru a fragmentelor de ADN separate prin electroforez,
pstrndu-se poziia relativ a acestora
D.Baltimore i H.Temin Descoper fenomenul de reverstranscriere
Walter Gilbert, Frederick
Descoper metode de determinare a secvenei de nucleotide din ADN
Sanger
Phillip Sharp i colab
Descoper intronii din genele de la eucariote
Frederick Sanger
Obine secvena complet de nucleotide a virusului X174
Thomas Cech, S.Altman Descoper fenomenul de splicing la ARN
Kary Mullis i colab.
Elaboreaz tehnologia PCR de amplificare a unor segmente de ADN
L-C Tsui, John Riordan, Identific i cloneaz gena uman responsabil de producere a fibrozei
Francis Collins i colab. chistice
James Watson i numeroi Lanseaz Proiectul Genomului Uman de cartare i secveniere a
ali cercettori
genomurilor mai multor specii, inclusiv la om
M.Skolnick i colab.
Cloneaz prima gen implicat n producerea cancerului de sn (BRCA1)
E.B.Lewis, C.NussleinControlul genetic al dezvoltrii timpurii la Drosophila
Volhard, E.Wieschaus
Grup internaional de
Publicarea primei secvene complete a genomului unui organism eucariot:
cercettori
Saccharomyces cerevisiae
Public secvena complet a genomului arhebacteriei Methanococcus
J.Craig Venter
jannaschii
National Institute of
Raporteaz c au fost aprobate 150 de testri n domeniul terapiei genice
Health SUA
S.Prusiner
Descoperirea prionilor noi ageni infecioi
Institutul Roslin
Se nate primul mamifer clonat oia Dolly
Grup de cercettori
Este comunicat secvena complet a genomului de la E.coli
Se nfiineaz un grup de cercettori care s secvenieze genomul uman
Celera Genomics
utiliznd rezultatele de trei ani ale proiectului internaional al Genomului
Company
Uman
Este comunicat secvena complet a genomului de la Caenorhabditis
Grup de cercettori
elegans
Proiectul Genomului
Anun secvenierea complet a cromosomului 22 din genomul uman
Uman
Este comunicat secvena complet a genomului de la D.melanogaster, cel
Colaborare internaional
mai mare genom secveniat pn atunci
Se public secvena complet a cromosomului 21, cel mai mic dintre
Colaborare internaional
cromosomii umani

2001

Proiectul Genomului
Uman

Anun descifrarea complet a secvenei de nucleotide din genomul uman

2002

K.Wuthrich

Dezvoltarea spectroscopiei de rezonan magnetic pentru determinarea


structurii tridimensionale a macromoleculelor biologice din soluie

2002
2007
2009
2011

S.Brenner, R.H.Horvitz,
J.E.Sulston
Mario R. Capecchi, Sir
Martin J. Evans i Oliver
Smithies
Elizabeth H. Blackburn
Carol W. Greider i Jack
W. Szostak
Bruce Beutler (SUA),
Jules Hoffmann
(Luxemburg)

Reglarea genetic a dezvoltrii organelor i moartea celular programat


Descoperirea principiilor pentru introducerea unor modificri specifice n
gene prin utilizarea celulelor stem embrionare.
Descoperirea modului n care cromosomii sunt protejai de ctre telomere
i de enzima telomeraza
Descoperiri n privina "imunitii ereditare"

Exemple de organisme model utilizate n studiile de genetica molecular


Caenorhabditis elegans
Este un nematod cu durat de via scurt (2-3 sptmni) cu un timp de generaie de aprox.4 zile
-

organizare simpl (959 celule somatice dintre care 302 sunt neuroni grupai n 118 tipuri)

n anul 2003 a fost comunicat secvena complet de nucleotide a genomului su

un numr total de 131 celule sufer un proces de apoptoz (moarte celular programat) n
cursul dezvoltrii C.elegans ceea ce permite identificarea genelor de controleaz acest proces
precum i evidenierea consecinelor mutaiilor acestor gene, datele obinute putnd fi apoi
comparate cu cele obinute la animalele superioare.

Drosophila melanogaster
-

Organism eucariot de dimensiune mica (3,5-4 mm) care este folosit ca sistem biologic model

nc din 1910 (Morgan i colab.)


-

Numar mare de musculite care se formeaza intr-o perioada scurta de timp: 10-14 zile (timpul n

care apare o noua generatie)


-

Numr mic de cromosomi (8 cromosomi)

Secvea de nucleotide a genomului su a fost determinat n anul 2000

Ofer numeroase avantaje pentru evidentierea si studierea modului n care are loc

transmiterea caracterelor ereditare de-a lungul generatiilor.


n prezent este utilizata n diferite arii de cercetare stiintifica, precum:
-

analiza unor probleme legate de procesul de crestere si dezvoltare,

diferentiere celulara,

reglajul ciclului celular si

n studierea diferitelor boli genetice.

Mus musculus

Este un mamifer
3

Se crete uor n laborator, se reproduce rapid obinndu-se mai muli descendeni de la acelai
cuplu ceea ce permite studiul apariiei i transmiterii anumitor nsuiri

Prezint un grad nalt de omologie cu organismul uman, multe dintre genele murine avnd
omologie structural i funcional cu gene umane

n anul 2002 a fost comunicat secvena complet de nucleotide a genomului su

n prezent exist numeroase organisme mutante, obinute prin tehnici clasice de ameliorare (de ex.
Immunodeficient nude mice, fr pr i timus ceea ce nseamn cu el nu produce limfocite T i nu
manifest rspuns celular imun sunt utili pentru cercetri n imunologie i transplant;

Severe combined immunodeficient (SCID) la care sistemul imunitar lipsete aproape complet) sau
prin tehnici de inginerie genetic: oareci de dimensiuni foarte mari ca urmare a integrrii n
genomul lor a genei pentru hormonul de cretere de la obolan;

Oncomice la care a fost activat o oncogen ceea ce determin o inciden crescut a apariiei
cancerului;

Doogie mice care prezint o mbuntirea a memoriei i a capacitii de nvare;

knockout mice la care o gen specific a fost inactivat animalele sunt utilizate n studiile legate
de stabilirea funciilor unei gene sau a produsului codificat de aceasta sau pentru simularea unei
boli umane)

Petele zebr (zebrafish, Danio rerio)


Este un pete de acvariu folosit ca model experimental pentru genomic comparat (studiul unor gene identificarea lor i stabilirea rolului lor att n organismul de origine ct i la alte organisme nenrudite,
inclusiv om).
Avantajele modelului experimental

timpul scurt de generaie (3-4 luni);

oule fertilizate sunt transparente, iar dezvoltarea embrionar se face rapid, primordiile
organelor aprnd n primele 36 ore dup fertilizare;

dungarea apare dup 48-72 ore de la fertilizare i depinde de temperatura mediului ambiant

multe dintre genele pe care le are prezint ortologie cu gene umane

Secvenierea complet a genomului a fost comunicat n 2009

Arabidopsis thaliana

Este o planta cu genom de dimensiuni mici (27.000 gene), secveniat n anul 2000

Are o talie redusa i un ciclu de via scurt

Prezinta mutante care permit studierea funciilor unor gene

Stadiile de dezvoltare ca i structura diverselor organe pot fi studiate la nivel microscopic

Poate fi uor transformat genetic cu diverse gene, inclusiv gene marker, care permit studii legate
de localizarea i funciile unor componente celulare

Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere)


4

Organizare unicelular eucariot

cretere i multiplicare rapid, propagare clonal, posibilitate de marcare selectiv i analiz

folosite n descifrarea structurii i sintezei acizilor nucleici, a reglajului genetic, a


mecanismelor mutaiilor, reparrii i recombinrii, precum i n nelegerea unor aspecte
multiple referitoare la originea, evoluia, compoziia chimic, ultrastructura i rolul fiziologic al
unor organite celulare la eucariote;

Permite cercetri asupra controlului ciclului celular i a diviziunii celulare; secreia


proteinelor i biogeneza membranelor; funciile citosheletului; diferen ierea celular;
fenomenele de mbtrnire etc

Importana major a drojdiilor, n special a speciei Saccharomyces cerevisiae, const n


utilizarea lor industrial, n industria fermentativ tradiional (bere, vin, panificaie). In
ultimii ani, specii ale genurilor Candida, Hansenula, Saccharomycea, Pichia sunt utilizate cu
succes n industria de sintez proteic, pentru producerea de proteine furajere, cu perspective de
utilizare i n hrana omului.

Escherichia coli

bacterie care se gsete n mod normal printre microorganismele ce populeaz suprafaa


intestinului uman

Exist informaii detaliate legate de particularitile morfologice, de cultur, biochimice i


genetice ale acestei bacterii

Permite obinerea de informaii legate de structura i funciile genelor, de reglajul genetic,


de interaciunile acizi nucleici-proteine, ciclul celular, semnalizarea celular, transferul de
gene

Constituie sistem model pentru stabilirea interaciunilor dintre diferii compu i chimici (de
ex.antibiotice) i componentele celulare etc

DESCOPERIREA ROLULUI GENETIC AL ACIZILOR NUCLEICI


Materialul responsabil de transmiterea ereditar a caracterelor trebuie s ndeplineasc trei
caracteristici de baz:

s conin ntr-o form stabil informaia necesar pentru determinarea structurii celulare a
organismului, pentru realizarea funciilor, a dezvoltrii i reproducerii;

s se replice cu mare acuratee astfel nct celulele fiice rezultate n urma diviziunii s conin
aceeai informaie ca i celula parental;

s fie capabil s sufere schimbri deoarece, fr modificri la nivelul informaiei genetice,


organismele nu ar fi capabile s supravieuiasc n condiiile variate de mediu.

Pentru stabilirea faptului ca ADN este substanta ereditara responsabil pentru caracteristicile ce
sunt transmise de la o generaie la alta, au fost necesare mai multe experimente dintre care 2 au fost
mai semnificative:
1. Experientele medicului englez Frederick Griffith, efectuate n 1928 cu

Diplococcus

pneumoniae agent infectios ce determina pneumonia.


Aceasta bacterie se prezinta sub forma a 2 tipuri (tulpini) diferite:

Unul virulent notat cu S deoarece pe medii cu agar formeaza colonii netede (smooth) celula sa
fiind inconjurata de o capsula formata din polizaharide astfel ca pot aparea diferite tipuri de
pneumococi notate SI, SII si SIII;

Tipul tipul nevirulent- nu prezinta capsula formand colonii rugoase si a fost notat cu R
(rough=aspru, rugos).

In mod spontan, prin mutatie, tipul virulent S poate deveni cu o frecventa mica tipul avirulent R (SI- RI,
SII RII, SIII - RIII)
Urmarind sa obtina noi tipuri de vaccinuri prin injectare de pneumococi la soareci, Griffith a realizat
diferite variante experimentale in care a injectat cultura de pneumococi in plamanii soarecilor.
Infectarea oarecilor cu pneumococi s-a realizat n diferite variante:

cu tulpini virulente de tip SIII soarecii mor

cu tulpini avirulente de tip RII- soarecii supravietuiesc

cu suspensie bacterian de tip SIII inactivat prin fierbere soarecii supravietuiesc

cu un amestec de bacterii de tip RII cu suspensie bacterian de tip SIII inactivat prin fierberesoarecii mor.

In ultima variant experimental rezultatul a fost: moartea oarecilor inoculai i detectarea bacteriilor
virulente de tip S alturi de cele de tip R , desi fiecare in parte nu determina moartea animalelor.
Acest fapt a condus la concluzia c
6

anumite proprieti ale bacteriilor de tip S omorte prin tratament termic au fost transferate
bacteriilor avirulente de tip R, acestea devenind capabile de a produce polizaharide capsulare.

Griffith descoperea astfel un fenomen biologic nou acela de transformare bacteriana pe care nu l-a
putut explica cauzal. El a realizat doar ca intr-un fel sau altul in prezenta resturilor de pneumococilor
virulenti de tip SIII, omorati prin fierbere, pneumococii vii nevirulenti RII se transforma in pneumococi
de tip SIII.
Iniial, componenta bacterian responsabil de transformare a fost denumit principiu transformant
2. Experimentele decisive in elucidarea naturii agentului transformant au fost cele realizate
efectuate n 1944 de grupul de cercettori condus de Avery (Oswald Avery, Collin MacLeod i
Maclyn McCarty), s-a demonstrat, fr echivoc, natura acestuia: acidul dezoxiribonucleic (ADN).
In acest caz, cercettorii au utilizat un lizat celular de la pneumococi viruleni de tip SIII pe care
l-au tratat cu diferite tipuri de enzime care au degradat:
fie proteinele,
fie polizaharidele,
fie lipidele,
fie acizii nucleici.
Lizatul tratat cu cte un tip de enzim a fost amestecat cu pneumococi aviruleni de tip RII iar
amestecul a fost plasat pe un mediu de cultur corespunztor.

In urma cultivrii diferitelor variante experimentale au fost obinui pneumococi viruleni de tip SIII,
excepie fcnd situaia n care lizatul a fost tratat cu enzimele ce degradeaz n mod specific ADN.
Concluzia acestor experimente a fost aceea c ADN este purttorul informaiei genetice.

STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

Descoperirea acizilor nucleici dateaz din anul 1868 cnd chimistul elveian Friedrik Miescher a
izolat din nuclei o substan cu caracter acid pe care a denumit-o nuclein.

ADN i ARN sunt molecule complexe, polinucleotidice, formate prin unirea unui numr mare de
uniti monomere, numite nucleotide.

O nucleotid reprezint unitatea structural fundamental a acizilor nucleici, fiind alctuit din
trei componente:

o baz azotat purinic sau pirimidinic

o molecul de pentoz, riboz, pentru ARN i dezoxiriboz pentru ADN

un rest de fosfat anorganic.

Fiecare tip de acid nucleic conine patru tipuri de nucleotide, care se deosebesc dup natura bazelor
azotate care intr n compoziia lor:

adenina (A), guanina (G), timina (T) i citozina (C), n structura ADN, respectiv

adenin (A), guanin (G), uracil (U) si citozina (C), n structura ARN.

Adenina (6-aminopurina) i guanina (2-amino-6-oxipurina) sunt baze purinice.

Timina (5-metil-2,6-dioxipirimidina), citozina (2-oxi-6-aminopirimidina) i uracilul (2,6dioxipiri-midina) sunt baze pirimidinice.

n afara acestor baze comune sau obinuite n structura ADN al unor bacteriofagi au mai fost
semnalate baze azotate modificate cum ar fi: 2-aminoadenina, 5-hidroximetilcitozina, 5hidroximetiluracil, 5-hidroxipentiluracil, 5-metilcitozina i altele.

Pentozele ce intr n alctuirea acizilor nucleici sunt reprezentate de:


8

deoxiribox, n structura ADN i

riboz n structura ARN.

Denumirea celor dou tipuri de acizi nucleici reflect de fapt natura pentozei prezent n structura
lor.

In mod convenional, pentru a desemna nucleotidele ce alctuiesc acizii nucleici, se utilizeaz prima
liter a fiecrei baze azotate specifice: A, T, C, G pentru ADN, respectiv A, U, C, G pentru ARN.

Combinarea dintre o baz azotat i pentoz se realizeaz ntre carbonul 1' al pentozei i atomul de
azot din poziia 9 sau 1 din structura bazelor purinice, respectiv pirimidinice prin legatura
denumit -N-glucozidic. In urma acestei legturi se formeaz nucleozidele.

Acidul fosforic se afl sub form de ortofosfat conferind moleculei caracterul acid i numeroase sarcini
negative.

Datorit acestor sarcini, acizii nucleici sunt molecule puternic ionizate.

In vivo, la eucariote sarcinile negative sunt neutralizate de histone n timp ce la procariote neutralizarea
se face cu ajutorul unor proteine asemntoare histonelor (histone-like proteins).
Radicalul fosforic se ataeaz la nivelul carbonului 5 al pentozei din nucleozide ceea ce are ca
rezultat formarea nucleotidelor.

10

STRUCTURA PRIMAR A ADN

Rezult din succesiunea celor patru deoxinucleotide specifice care intr n alctuirea lui i
stabilesc legturi fosfodiesterice covalente 3'-5'.

Aceste legturi se stabilesc ntre gruparea OH din poziia 3' a moleculei de deoxiriboz a unei
nucleotide i gruparea OH din poziia 5' a deoxiribozei din nucleotida adiacent, prin intermediul
gruprii fosfat

n felul acesta, se formeaz monocatene liniare cu o extremitate 3'-OH i una 5'-fosforilat.

Aceast particularitate implic existena unei polariti a catenei polinucleotidice.

Prezena legturilor fosfodiesterice internucleotidice confer catenei un grad important de


flexibilitate care permite realizarea structurilor secundare i teriare ale moleculelor, cu
semnificaie funcional.

11

STRUCTURA SECUNDAR A MOLECULEI


ADN (MODELUL WATSON-CRICK)
Structura de dublu helix a ADN (format din dou catene polinucleotidice complementare i
antiparalele) reprezint structura secundar a ADN

Rezult din asamblarea coaxial a dou catene polinucleotidice prin nfurarea lor, una n jurul
celeilalte i cu orientare spre dreapta.

Elaborarea modelului structurii secundare a ADN de ctre James Watson i Francis Crick (1953)
este considerat ca unul dintre cele mai importante evenimente care au stat la baza evoluiei
biologiei moleculare.

Modelul de structur propus de Watson i Crick a permis nelegerea mecanismelor eseniale


care asigur transmiterea corect a informaiei genetice.

Analizele efectuate de ctre Rosalind Franklin i Maurice Wilkins (fig.a i b) asupra


moleculelor de ADN cu ajutorul difraciei n raze X, au sugerat existena unei structuri
paracristaline, cu dimensiuni repetate la intervale precis determinate.

Imaginile obinute de Franklin cu diferite tipuri de ADN erau foarte asemntoare, indiferent de
proveniena lor, n felul acesta demonstrndu-se existena unui model molecular unic pentru
macromoleculele de ADN.
Datele obinute a aceasta au reprezentat dovada experimental necesar modelului de structur al
ADN elaborat de Watson i Crick.

12

Cteva date experimentale anterioare au susinut elaborarea modelului de structur secundar, dintre care
sunt de amintit aa numitele legi ale lui Chargaff:

numrul bazelor purinice este egal cu cel al bazelor pirimidinice,

suma bazelor purinice este egal cu cea a bazelor pirimidinice: (A+G)=(T+C)

rapoartele A/T = 1, G/C = 1 i A+G/T+C = 1.

http://www.youtube.com/watch?v=qy8dk5iS1f0

STRUCTURA ARN
In cazul ARN, majoritatea moleculelor de acest tip sunt monocatenare, prezentnd structur primar
rezultat prin asamblarea ribonucleotidelor prin legturi fosfodiesterice.
Structura primar a ARN este reprezentat de ordinea ribonucleotidelor din monocatena sa.

13

In anumite cazuri, moleculele de ARN pot prezenta i structur secundar (ex. ARNt- vezi figura de
mai jos) care se refer la formarea unor duplexuri n interiorul monocatenei ca urmare a stabilirii de
legturi de hidrogen ntre regiuni complementare ale acesteia.

14