Proiect 5

Proiect
GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA
HOTRRE
nr. ____ din ___.___.2015
Cu privire la aprobarea Cerinelor privind metodele de analiz i

evaluare calitativ a laptelui i a produselor lactate
n temeiul Legii 78-XV din 18 martie 2004 privind produsele alimentare

(Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2004, nr. 83-87, art. 431), Guvernul
HOTRTE:
1. Se aprob Cerinele privind metodele de analiz i evaluare calitativ a laptelui i
a produselor lactate (se anexeaz).
2. Prezenta Hotrre intr n vigoare dup 24 luni din data publicrii n Monitorul
Oficial al Republicii Moldova.
3. Controlul asupra executrii prezentei Hotrri se pune n sarcina Ageniei Naionale
pentru Sigurana Alimentelor.
Prim-ministru interimar Gheorghe BREGA
Contrasemneaz:
Viceprim-ministru, ministrul economiei Stephane Christophe BRIDE
Ministrul agriculturii i
industriei alimentare Ion SULA
Aprobate prin Hotrrea Guvernului
nr. din
CERINE PRIVIND METODELE DE ANALIZ I EVALUARE

CALITATIV A LAPTELUI I A PRODUSELOR LACTATE
Prezentele Cerine privind metodele de analiz i evaluare calitativ a

laptelui i a produselor lactate transpune parial Regulamentul (CE) nr. 273/2008 al
Comisiei din 5 martie 2008 de stabilire a normelor de aplicare a Regulamentului
(CE) nr. 1255/1999 al Consiliului privind metodele de analiz i evaluare calitativ
a laptelui i a produselor lactate.
I. Domeniu de aplicare
1. Cerinele privind metodele de analiz i evaluare calitativ a laptelui i a

produselor lactate (n continuarea textului - Cerine) stabilesc anumite metode
naionale de referin pentru efectuarea de ctre laboratoarele naionale acreditate a
analizelor chimice, fizice i microbiologice i pentru evaluarea senzorial a laptelui
i a produselor lactate (n continuare - produse), provenite att din producia
autohton, ct i din import.
2. Sub incidena prezentelor Cerine cad grupele de produse cu poziiile tarifare de la
poziia 0401-0406 i 2309 conform Nomenclaturii combinate a mrfurilor, aprobat
prin Legea nr. 172 din 25 iulie 2014, prezentate n urmtorul tabel.
II. Dispoziii generale

3. Metodele de referin pentru analiza chimic, fizic i microbiologic i pentru
evaluarea senzorial a laptelui i produselor lactate, precum i normele de aplicare
a metodelor respective sunt prevzute n anexa nr. 1 la prezentele Cerine.
4. Metodele de rutin folosite pentru analizele necesare trebuie s fie validate i
verificate cu regularitate pe baza metodei de referin. Rezultatele sunt comparate
innd cont de inegalitile constante, de repetabilitate i de reproductibilitate.
n cazul unor contestaii, rezultatul obinut prin metoda de referin este
hotrtor.
5. Evaluarea conformitii unui lot cu limita legal, cu excepia analizei marcatorilor
se specific n anexa nr. 2 la prezentele Cerine i se aplic n scopul definirii
conformitii cu cerinele n ceea ce privete compoziia.
6. Pentru evaluarea senzorial a laptelui i produselor lactate, altele dect untul
destinat depozitrii publice, ca metod de referin se folosete fie standardul SM
ISO 22935-1:2015, SM ISO 22935-2:2015, SM ISO 22935-3:2015, fie alte metode
comparabile.
7. Pentru verificarea performanei evaluatorilor i a preciziei rezultatelor n analizele
senzoriale se aplic procedurile descrise n anexa nr. 3 la prezentele Cerine.
8. Pentru untul destinat depozitrii publice, procedurile descrise n anexa nr. 3 la
prezentele Cerine se aplic n vederea verificrii performanei evaluatorilor i a
acurateii rezultatelor n analizele senzoriale.
9. Procedura prevzut n anexa nr. 4 la prezentele Cerine se aplic ca metod de
referin pentru evaluarea senzorial.
10.Metoda de analiz prevzut n anexa nr. 5 la prezentele Cerine se folosete ca
metod de referin pentru determinarea coninutului de trigliceride ale acidului
enantic n unt, ulei de unt i smntn.
metod de referin pentru determinarea vanilinei n untul concentrat, unt i
smntn.
metod de referin pentru determinarea coninutului de etil ester al acidului beta-
apo-8'-carotenic n untul concentrat i n unt.
metod de referin pentru determinarea coninutului de -sitosterol i stigmasterol
n unt i n untul concentrat.
14.Untul concentrat, untul i smntna se consider a fi marcate n cazul n care
rezultatele obinute sunt conforme cu specificaiile prevzute la pct. 12 i 13 din
anexa nr. 5 la prezentele Cerine, pct. 8 din anexele nr. 6 i 7 la prezentele Cerine
i pct. 12 din anexa nr. 8 la prezentele Cerine.
15.Metoda de referin prevzut n anexa nr. 9 la prezentele Cerine asigur faptul c,
brnza produs numai din lapte de oaie, din lapte de capr sau din lapte de bivoli
sau dintr-un amestec de lapte de oaie, capr i bivoli nu conine cazein din lapte
de vac.
16.Se consider c este prezent cazeina din lapte de vac n cazurile n care
coninutul de cazein din lapte de vac al probei analizate este egal sau mai mare
dect coninutul probei de referin coninnd 1 % lapte de vac n conformitate cu
anexa nr. 9 la prezentele Cerine.
17.Metodele de rutin pentru detectarea cazeinei din laptele de vac n brnzeturi
prevzute la pct. 15 i 16 pot fi folosite cu condiia c:
a) limita de detecie s fie de maximum 0,5 %
b) s nu existe rezultate fals pozitive;
c) cazeina din lapte de vac s poat fi detectat cu sensibilitatea necesar
chiar i dup perioade lungi de maturare, cum este cazul n condiii
obinuite de comercializare.
n cazul n care niciuna dintre cerinele menionate mai sus nu este
ndeplinit, se folosesc metodele de referin prevzute n anexele nr. 9 la
prezentele Cerine.
18.Detectarea bacteriilor coliforme n unt, lapte praf degresat, cazein i cazeinai se
efectueaz n conformitate cu metoda de referin prevzut n anexa nr. 10 la
prezentele Cerine.
19.Determinarea coninutului de lactoz al produselor care intr sub incidena codului
2309 al Nomenclaturii combinate a mrfurilor se efectueaz n conformitate cu
metoda de referin prevzut n anexa nr. 11 la prezentele Cerine.
20.Detectarea zerului nchegat n laptele praf degresat se efectueaz n conformitate
cu metoda de referin prevzut n anexa nr. 12 la prezentele Cerine.
21.Zerul nchegat n laptele praf degresat i n amestecurile destinate utilizrii ca
furaje pentru animale se detecteaz n conformitate cu metoda de referin
prevzut n anexa nr. 12 la prezentele Cerine. n cazul detectrii zerului nchegat
se aplic anexa nr. 13 la prezentele Cerine.
22.Detectarea zarei n laptele praf degresat se efectueaz n conformitate cu metoda de
referin prevzut n anexa nr. 14 la prezentele Cerine.
23.Detectarea reziduurilor antimicrobiotice n laptele praf degresat se efectueaz n
conformitate cu metoda de referin prevzut n anexa nr. 15 la prezentele Cerine.
24.Determinarea coninutului de lapte praf degresat n furajele combinate se
prezentele Cerine.
25.Detectarea amidonului n laptele praf degresat, n laptele praf denaturat i n
furajele combinate se efectueaz n conformitate cu metoda de referin prevzut
n anexa nr. 17 la prezentele Cerine.
26.Determinarea coninutului umed n smntna deshidratat se efectueaz n
conformitate cu metoda de referin prevzut n anexa nr. 18 la prezentele Cerine.
27.Determinarea coninutului umed al zarei praf acide destinate utilizrii n furaje se
prezentele Cerine.
28.Determinarea puritii grsimilor din lapte se efectueaz n conformitate cu metoda
de referin prevzut n anexa nr. 20 la prezentele Cerine.
29. Analizele se realizeaz n laboratoare acreditate conform SM SR EN ISO/CEI
17025 n care exist un sistem analitic de asigurare a calitii, inclusiv proceduri
interne de control al calitii.
30.n laborator trebuie s fie disponibil pentru consultare o descriere detaliat a
sistemelor utilizate de asigurare a calitii.
31.Laboratoarele acreditate n conformitate cu standardele internaionale de referin
adoptate ca standarde moldovene asigur participarea la testele de competen
dup cum este stabilit n standardul de referin.
32.Prelevarea de probe se realizeaz n conformitate cu prezentele Cerine pentru
produsul n cauz. n cazul n care nu exist dispoziii privind prelevarea de probe,
se folosete standardul SM SR EN ISO 707:2012 Lapte i produse lactate. Ghid
pentru eantionare.
33.Rapoartele de ncercri emise de laborator privind rezultatele analizei trebuie s
conin suficiente informaii conform pct. 5.10 din standardul SM SR EN ISO/CEI
17025 pentru a se putea efectua o evaluare a rezultatelor n conformitate cu
prevederile anexei nr. 2 i 21 la prezentele Cerine.
34.n cazul n care rezultatele unei analize nu sunt acceptate de ctre operator, se
folosete procedura descris n anexa nr. 21 la prezentele Cerine.
35.n cazul n care productorul poate dovedi, n termen de cinci zile lucrtoare de la
prelevarea probelor, c procedura de prelevare a probelor nu a fost realizat corect,
laboratorul i asum responsabilitatea pentru repetarea acesteia.
Anexa nr. 1
la Cerine privind metodele de
analiz i evaluare calitativ a
laptelui i a produselor lactate
Lista metodelor de referin

Partea A
Produsul Parametrul Limita(1) Metoda de referin Not
Unt fr sare Grsime, min. 82 % m/m SM SR EN ISO 17189:2012
Ap, max. 16 % m/m SM SR EN ISO 3727-1:2012
SNF, max. 2 % m/m SM SR EN ISO 3727-2:2012
Acizi grai liberi 1,2 mmol/100 g grsime SM ISO 1740:2015
PV, max. 0,3 mechiv. oxigen/1000 g SM ISO 3976:2015 Nota 1
grsime
Bacterii coliforme Nedetectabile n 1 g Anexa nr. 10 Nota 4
Grsime care nu provine din Nedetectabil prin analiza Anexa nr. 20
lapte trigliceridelor
Marcatori de steroli Nedetectabili, -sitosterol 40 Anexa nr. 8
mg/kg
Ali marcatori:
- vanilin Nedetectabil Anexa nr. 6
- etil esterul acidului 6 mg/kg Anexa nr. 7
carotenic
- trigliceride ale acidului Nedetectabile Anexa nr. 5
enantic
Caracteristici de sensibilitate Cel puin 4 din 5 puncte pentru Anexa nr. 4
A, F i C
Dispersia apei Cel puin 4 puncte Nota 2
Unt srat Grsime, min. 80 % m/m SM SR EN ISO 17189:2012
Grsime care nu provine din Anexa nr. 20
lapte
Ap, max. 16 % m/m SM SR EN ISO 3727-1:2012
SNF (cu excepia srii), max. 2 % m/m SM SR EN ISO 3727-2:2012
Sare, max. 2 % m/m SM ISO 15648:2015
Marcatori:
- steroli A se vedea anexa nr. 8 Anexa nr. 8
- vanilin A se vedea anexa nr. 6 Anexa nr. 6
- etil esterul acidului A se vedea anexa nr. 7 Anexa nr. 7
carotenic
- trigliceride ale acidului A se vedea anexa nr. 5 Anexa nr. 5
enantic
Unt concentrat Grsime, min. 99,8 % m/m SM ISO 8851-3:2015
utilizat pentru Ap i SNF, max. 0,2 % m/m SM ISO 8851-1:2015 (ap)
fabricarea SM ISO 8851-2:2015 (SNF)
produselor de Acizi grai liberi 1,2 mmol/100 g grsime SM ISO 1740:2015
patiserie, PV, max 0,5 mechiv. oxigen/1000 g SM ISO 3976:2015 Nota 1
ngheatei i altor grsime
produse Grsime care nu provine din Absent Anexa nr. 20
alimentare lapte
Arom Proaspt
Miros Fr mirosuri strine
Altele Absena agenilor de neutralizare,
a antioxidanilor i conservanilor
Marcatori:
- steroli A se vedea anexa nr. 8 Anexa nr. 8
- etil esterul acidului A se vedea anexa nr. 7 Anexa nr. 7
carotenic
enantic
Unt concentrat Grsime, min. 96 % m/m SM ISO 8851-3:2015
destinat Grsime care nu provine din Anexa nr. 20
consumului lapte
direct SNF, max. 2 % m/m SM SR EN ISO 3727-2:2012
Marcatori:
- stigmasterol (95 % m/m) 15 g/100 kg de unt concentrat Anexa nr. 8
- stigmasterol (85 % m/m) 17 g/100 kg de unt concentrat Anexa nr. 8
- trigliceride ale acidului 10,34 g/100 t de unt concentrat Anexa nr. 5
enantic
- etil ester al acidului butiric - etil esterul acidului butiric Nota 2
i stigmasterol - anexa nr. 8 (stigmasterol)
- etil esterul acidului butiric - etil esterul acidului butiric Nota 2
i trigliceridele acidului - anexa nr. 5 (trigliceride
enantic ale acidului enantic)
lecitin (E 322), max. 0,5 % m/m Nota 2
NaCl, max. 0,75 % m/m SM ISO 15648:2015
Acizi grai liberi 1,2 mmol/100 g grsime SM ISO 1740:2015
PV, max 0,5 mechiv. oxigen/1000 g SM ISO 3976:2015 Nota 1
grsime
Arom Proaspt
Miros Fr mirosuri strine
Altele Absena agenilor de neutralizare,
a antioxidanilor i a
conservanilor
Smntn Grsime, min. 35 % m/m SM EN ISO 2450:2014
Grsime care nu provine din Anexa nr. 20
lapte
Marcatori:
- steroli A se vedea anexa nr. 8 Nota 2
- etil esterul acidului A se vedea anexa nr. 7 Nota 2
carotenic
enantic
Brnz produs Lapte de vac < 1 % m/m Anexa nr. 9
din lapte de oaie
i/sau capr
Cazein acid Ap, max. 12,00 % m/m SM ISO 5550:2015
Grsime, max. 1,75 % m/m SM ISO 5543:2015
Aciditate liber, max. 0,30 ml soluie 0,1 N NaOH/g SM SR ISO 5547:2012
TBC, max. 30000/g SM EN ISO 4833-1:2014 Nota 3
SM EN ISO 4833-2:2014
Bacterii coliforme Absente n 0,1 g Anexa nr. 10 Nota 3
Therm., max. 5000/g SM EN ISO 4833-1:2014 Notele
SM EN ISO 4833-2:2014 3 i 4
Cazein cheag Ap, max. 12,00 % m/m SM ISO 5550:2015
Cenu, min. 7,50 % m/m SM SR ISO 5545:2012
SM EN ISO 4833-2:2014
SM EN ISO 4833-2:2014 3 i 4
Cazeinai Ap, max. 6,00 % m/m SM ISO 5550:2015
Proteine ale laptelui, min 88,00 % m/m SM SR ISO 5549:2012
Cenu, max. 6,50 % m/m SM ISO 5544:2015
SM SR ISO 5545:2012
Cenu insolubil SM ISO 5544:2015
Lactoz, max. 1,00 % m/m SM ISO 5548:2015
SM EN ISO 4833-2:2014
SM EN ISO 4833-2:2014 3 i 4
Furaje combinate Ap (zar acid praf), max. 5 % m/m Anexa nr. 19
i lapte praf Proteine, min. 31,4 % m/m din materia uscat SM EN ISO 8968-1:2014
degresat (SMP) negras SM EN ISO 8968-3:2014
(folosite n Ap (SMP), max. 5 % m/m SM EN ISO 5537:2014
furaje) Grsimi (SMP), max. 11 % m/m SM SR EN ISO 1736:2012
Zer nchegat (SMP) Absent Anexa nr. 13
Amidon (SMP) Absent Anexa nr. 17
Ap (amestecuri), max. 5 % din materia negras SM EN ISO 5537:2014
Grsime (amestecuri) SM SR ISO 6492:2012
Zer nchegat (amestecuri) Absent Anexa nr. 13
Coninutul SMP (din produsul 50 % m/m Anexa nr. 16
final), min
Grsime (din produsul final), 2,5 % m/m sau 5 % m/m SM SR ISO 6492:2012
min.
Amidon (din produsul final), 2 % m/m Anexa nr. 17
min.
Cupru (din produsul final) 25 ppm SM SR EN ISO 6869:2012
SPM (spray) Grsime, max. 1,0 % m/m SM SR EN ISO 1736:2012
Proteine, min. 34 m/m din materia uscat SM EN ISO 8968-1:2014
negras
Ap, max. 3,5 % m/m SM EN ISO 5537:2014
Aciditate, max. 19,5 ml, 0,1 N NaOH, 10 g SM ISO 6091:2014
substane solide negrase
Lactai, max. 150 mg/100 g substane solide SM EN ISO 8069:2014
negrase
Fosfataz Negativ SM EN ISO 11816-1:2014
Indicele insolubilitii, max. 0,5 ml la 240C SM STB ISO 8156:2015
Particule arse Disc A sau B (15,0 mg) Nota 2
TBC 40000/g SM EN ISO 4833-1:2014 Nota 3
SM EN ISO 4833-2:2014
Bacterii coliforme Negativ/0,1 g Anexa nr. 10 Nota 3
Zar Negativ Anexa nr. 14
Zer nchegat Negativ Anexa nr. 12
Zer acid Negativ Nota 2
Ageni antimicrobieni Anexa nr. 15
1
( ) Fr a se aduce atingere cerinelor prezentelor Cerine.
Not: Limitele stabilite n coloana a treia a tabelului sunt aplicate n cazul efecturii interveniilor de ctre autoritile competente
pe piaa intern a produselor lactate.
Partea B
Metodele de referin enumerate n partea B pot fi folosite pentru analiza laptelui i produselor lactate
Produsul Codul NC Parametrul Limita Metoda de referin Not
Lapte i smntn din 0401 Grsime ( 6 % m/m) Limitele sunt cele SM EN ISO 1211:2015
lapte, neconcentrate, specificate n
fr adaos de zahr sau descrierea codului
ali ndulcitori NC pentru
produsul respectiv
Grsime (> 6 % m/m) SM EN ISO 2450:2014
Lapte i smntn din 0402 Grsime (form lichid) SM EN ISO 1737:2015
lapte, concentrate sau Grsime (form solid) SM SR EN ISO 1736:2012
cu adaos de zahr sau Proteine SM EN ISO 8968-1:2014
ali ndulcitori SM EN ISO 8968-3:2014
Sucroz (coninut normal) SM ISO 2911:2015
Sucroz (coninut sczut) Nota 2
Solide (SCM) SM ISO 6734:2015
Solide (EMC) SM ISO 6731:2014
Ap (lapte praf) SM EN ISO 5537:2014
Ap (smntn praf) Anexa nr. 18
Lapte acru, lapte i 0403 Grsime SM EN ISO 1211:2015
smntn covsite, iaurt, SM SR EN ISO 1736:2012
chefir i alte sortimente SM EN ISO 2450:2014
de lapte i smntn SM EN ISO 7208:2014
fermentate sau acrite, SM SR ISO 8262-3:2012
chiar concentrate, sau Proteine SM EN ISO 8968-1:2014
cu adaos de zahr sau SM EN ISO 8968-3:2014
ali ndulcitori, sau Sucroz (coninut normal) SM ISO 2911:2015
aromatizate, sau cu Sucroz (coninut sczut) Nota 2
adaos de fructe, nuci Ap (zar acid praf) Anexa nr. 19
sau cacao Ap (zar dulce praf) SM EN ISO 5537:2014
Solide (alte produse) Nota 2
Zer, chiar concentrat 0404 Grsime SM SR EN ISO 1736:2012
sau cu adaos de zahr SM EN ISO 2450:2014
sau de ali ndulcitori; SM EN ISO 7208:2014
produse obinute din Proteine SM EN ISO 8968-1:2014
compui naturali ai SM EN ISO 8968-3:2014
laptelui, chiar cu adaos Sucroz (coninut normal) SM ISO 2911:2015
de zahr sau ali Sucroz (coninut sczut) Nota 2
ndulcitori, nedenumite 0404 90 Proteine SM EN ISO 8968-1:2014
i necuprinse n alt Ap Nota 2
parte Solide SM ISO 6734:2015
(Produse concentrate) SM ISO 6731:2014
Unt i alte grsimi care 0405 Grsime (n cazul n care SM SR EN ISO
provin din lapte; past 85 % m/m) 17189:2012
din lapte pentru tartine Unt Ap SM SR EN ISO 3727-
1:2012
SNF SM SR EN ISO 3727-
2:2012
NaCl SM ISO 15648:2015
Grsime (n cazul n care SM SR EN ISO
> 99 % m/m) 17189:2012
Ulei de unt Ap (n cazul n care < 99 SM EN ISO 5536:2014
% m/m)
Brnz i ca 0406 Grsime SM EN ISO 1735:2014
Solide SM SR EN ISO 5534:2014
Solide (Urd) SM ISO 2920:2015
NaCl SM SR EN ISO 5943:2012
Lactoz SM ISO 5765-1:2015
SM ISO 5765-2:2015
Preparate de tipul celor 2309 Lactoz Anexa 21
folosite pentru hrana
animalelor
Observaii la lista metodelor de referin:

Nota 1: Izolarea grsimii din lapte conform SM ISO 1740:2015 (la adpost de lumin).
Nota 2: Nu s-a stabilita nici o metod de referin.
Nota 3: Proba este preparat conform SM SR EN ISO 6887-5:2014.
Nota 4: Incubate timp de 48 de ore la temperatura de 550C, acordndu-se atenie prevenirii uscrii mediului de cultur.
Nota 5: % m/m SNF = % m/m solide - % m/m grsime.
Abrevieri:
Min. = minimum
Max. = maximum
Anex = anexa la regulamentul menionat anterior
SNF = substane solide negrase
PV = valoarea peroxidului
A = aspect
F = miros
C = consisten
TBC = numr total de bacterii
Therm = numr de bacterii termofile
SMP = furaje combinate i lapte praf degresat
SCM = lapte condensat ndulcit
EMC = lapte sau smntn evaporate
ISO = Organizaia Internaional de Standardizare
Anexa nr. 2
Evaluarea conformitii unui lot cu limita legal

1. Principiu
n cazurile n care este stabilit o norm de reglementare care prevede proceduri
detaliate de prelevare a probelor, aceste proceduri trebuie utilizate. n toate
celelalte cazuri, se utilizeaz o prob din cel puin 3 uniti de prob luate la
ntmplare din lotul supus controlului. Se poate prepara o prob compozit.
Rezultatul obinut este comparat cu limitele legale prin calcularea intervalului de
ncredere de 95 % pe baza a 2 x deviaia standard, unde deviaia standard relevant
depinde:
1) de validarea metodei n cadrul colaborrii internaionale cu valorile
pentru r i R; sau
2) n cazul validrii interne, de calcularea reproductibilitii interne. Acest
interval de ncredere este apoi comparat cu incertitudinea de msurare a
rezultatului.
2. n cazul n care metoda este validat n cadrul colaborrii internaionale,
deviaia standard a repetabilitii r i deviaia standard a reproductibilitii
R au fost stabilite i laboratorul poate demonstra conformitatea cu
caracteristicile de performan ale metodei validate.
_
A se calcula media aritmetic x din n msurtori repetate.
_
A se calcula incertitudinea extins (k = 2) din x pe baza

U=2 2R
n1 2

n r
n cazul n care rezultatul final x al msurtorii se calculeaz utiliznd o

formul de forma x = y 1 + y 2, x = y 1 y 2, x = y 1 y 2 sau x = y 1 / y 2, se respect
procedurile obinuite de combinare a deviaiilor standard n astfel de cazuri.
Se apreciaz c lotul nu respect limita legal superioar UL n cazul n care
_
x U > UL;
n caz contrar, se apreciaz c lotul respect UL.
Se apreciaz c lotul nu respect limita legal inferioar LL n cazul n care
_
x+ U < LL;
n caz contrar, se apreciaz c lotul respect LL.
3. n cazurile n care se folosesc metode care nu sunt specificate n prezentele
Cerine i nu sunt stabilite msuri de precizie, se realizeaz o validare
intern. Se utilizeaz deviaia standard a repetabilitii interne s ir i deviaia
standard a reproductibilitii interne siR n locul r i R , respectiv, n
formulele de calcul ale incertitudinii extinse U.
Regulile de luare a unei decizii sunt aceleai ca la punctul 1 din prezenta anex.
Cu toate acestea, n cazul n care se consider c lotul nu respect limita legal,
msurtorile se repet folosind metoda specificat n prezentele Cerine, decizia
urmnd s fie luat n conformitate cu punctul 1.
Anexa nr. 3
Evaluarea evaluatorilor i fiabilitatea rezultatelor n analizele senzoriale

n cazul n care se folosesc metode de punctare se aplic urmtoarele proceduri.
1. Determinarea indicelui de repetabilitate
Cel puin 10 probe sunt analizate de un evaluator ca duplicat prob martor ntr-o
perioad de 12 luni. Aceast procedur se realizeaz de obicei n cteva edine.
Rezultatele pentru caracteristicile produsului individual sunt evaluate utilizndu-se
formula:
w1 = 1 + (((xi1 xi2)2 /n)
unde:
w1 - indice de repetabilitate;
xi1 - punctajul pentru prima evaluare a probei xi;
xi2 - punctajul pentru a doua evaluare a probei xi;
n - numrul de probe.
Probele care urmeaz a fi evaluate trebuie s reflecte o gam larg de calitate.
w1 nu trebuie s depeasc 1,5 (pe o scar de 5 puncte).
2. Determinarea indicelui de deviaie
Acest indice trebuie utilizat pentru a se verifica n cazul n care un evaluator
utilizeaz aceeai scal pentru evaluarea calitativ ca i un grup de evaluatori
experimentai. Punctajul obinut de evaluator este comparat cu media punctajelor
obinute de grupul de evaluatori.
Pentru evaluarea rezultatelor se utilizeaz urmtoarea formul:
_ _
D1 = 1 + (|(xi1 xi1) + (xi2 xi2)2|)/(2n)
2
unde:
xi1; xi2 - a se vedea punctul 1;
_ _
xi1; xi2 - punctajul mediu al grupului de evaluator pentru prima, respective a
doua evaluare a probei xi;
n - numrul de probe (cel puin 10 per 12 luni).
Probele care urmeaz a fi evaluate trebuie s reflecte o gam larg de calitate.
D1 nu trebuie s depeasc 1,5 (pe o scar de 5 puncte).
n cazul n care se constat c evaluatorii individuali depesc limita de 1,5
pentru indicii de repetabilitate sau de deviaie, expertul (experii) autoritii publice
trebuie s efectueze una sau mai multe verificri aleatorii de reevaluare asupra
probelor clasificate de acetia n urmtoarele cteva sptmni sau s efectueze una
sau mai multe verificri n paralel cu evaluatorii respectivi. Este necesar o
monitorizare atent n vederea lurii unei decizii de meninere a serviciilor
acestora. Constatrile trebuie s fie atestate n mod corespunztor, fiind reinute ca
dovad n aciunile ulterioare.
Anexa nr. 4
Evaluarea senzorial a untului

1. Domeniul de aplicare
Scopul procedurii de evaluare senzorial a untului este de a furniza o metod
uniform aplicabil pe teritoriul republicii.
2. Definiii
Evaluarea senzorial - examinarea caracteristicilor unui produs cu ajutorul
organelor de sim.
Panel - un grup de evaluatori selectai care, pe perioada evalurii, lucreaz
independent, fr a comunica ntre ei i fr a se influena reciproc.
Evaluatorul - o persoan aleas pentru capacitatea sa de a efectua un test
senzorial. Acest tip de evaluator poate avea experien limitat.
Evaluatorul expert - o persoan cu un grad nalt de sensibilitate senzorial i cu
experien n metodologia senzorial, care este capabil s efectueze evaluri
coerente i sigure ale unor produse variate. Acest tip de evaluator dispune pe
termen lung de o bun memorie senzorial.
Punctare - evaluarea senzorial realizat de un panel, folosindu-se o scal
numeric. Trebuie s se foloseasc un nomenclator al defectelor.
Clasificare - clasificarea calitativ realizat pe baza punctrii.
Documente de control - documentele folosite pentru nregistrarea punctajelor
individuale pentru fiecare caracteristic i a clasificrii finale a produsului (acest
document poate fi folosit i pentru nregistrarea compoziiei chimice).
3. Camer de testare
Evaluatorii din camera de testare nu trebuie s fie influenai de factori externi.
n camera de testare nu trebuie s existe mirosuri strine i trebuie s fie uor de
curat. Pereii trebuie s aib o culoare deschis i nereflectant.
Camera de testare i iluminarea acesteia trebuie s fie de aa natur nct s nu
afecteze proprietile produsului care urmeaz s fie punctat.
Camera trebuie dotat cu un sistem adecvat de control al temperaturii care s
permit pstrarea unei temperaturi constante a untului. Untul trebuie s aib o
temperatur de 12 C (2 C) n momentul clasificrii.
4. Selecia evaluatorilor
Un evaluator trebuie s fie familiarizat cu produsele din unt i s aib
competena necesar pentru a realiza o gradare a sensibilitii senzoriale.
Competena evaluatorului este monitorizat de ctre autoritatea competent n mod
regulat (cel puin o dat pe an).
1) Cerinele generale i testele de selecie care trebuie aplicate naintea
utilizrii oficiale a unui nou evaluator sunt specificate n SM ISO 22935-
1.
Formarea profesional trebuie s fie continu, iar edinele generale trebuie s
aib loc n mod regulat. Formarea profesional a panelului se efectueaz conform
SM EN ISO 8586.
2) Formarea iniial trebuie s acopere urmtoarele:
a) teoria general i importana practic a evalurii senzoriale;
b) metodele, scalele i descrierea percepiilor senzoriale;
c) detectarea i recunoaterea caracteristicilor senzoriale i termenilor
senzoriali specifici;
d) pregtire de baz n fabricarea untului;
e) referine i probe valide care s l ajute pe evaluator n identificarea
aromelor specifice i a intensitii aromei produsului.
5. Cerine pentru panel
Numrul evaluatorilor din panel trebuie s fie impar, numrul minim fiind de
trei. Majoritatea acestora trebuie s fie angajai ai autoritii competente, dar s nu
fie angajai n industria de prelucrare a laptelui. n panel pot fi maxim doi experi
neangajai ai autoritii competente.
nainte de evaluare, trebuie avui n vedere mai muli factori pentru obinerea
unor performane optime ale subiecilor:
1) subiecii nu trebuie s sufere de boli care le-ar putea afecta performana.
ntr-un asemenea caz, evaluatorul n cauz trebuie nlocuit n panel cu un
alt evaluator;
2) subiecii trebuie s se prezinte n mod punctual la evaluare i s dispun
de suficient timp pentru realizarea evalurii;
3) subiecii nu trebuie s foloseasc substane cu miros puternic cum ar fi
parfum, loiune dup ras, deodorant etc. i trebuie s evite consumul de
alimente cu arome puternice (de exemplu, foarte condimentate) etc.;
4) subiecii nu au voie s fumeze, s mnnce i s bea altceva dect ap cu
o jumtate de or nainte de evaluare.
6. Performana
Toi evaluatorii trebuie s participe n mod regulat la panele de evaluare
senzorial pentru a-i pstra competenele. Frecvena acestora depinde de volumul
i capacitatea de producie a untului i, n msura n care acest lucru este posibil,
trebuie s se organizeze cel puin un panel pe lun.
Evaluatorii principali trebuie, de asemenea, s participe la un numr de panele
n fiecare an i, n msura n care acest lucru este posibil, cel puin o dat pe
trimestru.
7. Prelevarea i prepararea probei
Este esenial ca identitatea probelor s fie ascuns n timpul evalurii, astfel
nct s se evite orice posibilitate de favorizare. Probele trebuie s fie codate.
Aceast etap are loc naintea evalurii propriu-zise. Se stabilete temperatura
untului n timpul transportului ctre camera de testare (6 C 2 C).
Cnd evaluarea senzorial se realizeaz ntr-un antrepozit frigorific, proba este
prelevat cu ajutorul unui prelevator de unt. n cazul n care evaluarea senzorial se
realizeaz n alt loc dect n antrepozitul frigorific, se preleveaz o prob de cel
puin 500 g. Pe parcursul evalurii, untul trebuie s aib o temperatur de 12 C
(2 C). Deviaiile mari trebuie evitate.
8. Evaluarea valorii fiecrei caracteristici
1) Evaluarea senzorial se realizeaz pentru urmtoarele trei caracteristici:
aspect, consisten i arom.
Aspectul implic urmtoarele caracteristici: culoare, puritate vizibil, absena
contaminrii fizice, absena fungilor i uniformitatea de dispersie a apei.
Consistena implic urmtoarele caracteristici: corp, textur i fermitate.
Tartinabilitatea poate fi monitorizat prin utilizarea mijloacelor fizice, n cazul n
care agentul economic dorete acest lucru n vederea satisfacerii cerinelor
clientului.
Corp - termenul care se refer la coeziunea produsului n timp ce este consumat.
n mod normal este asociat cu fermitatea i tartinabilitatea i trebuie s fie uniform
n ntregul produs. Se afl n strns legtur cu textura i reprezint abilitatea
produsului de a-i menine poziia iniial. Este indicat de rezisten la tiere,
putnd fi msurat mecanic i prin evaluare buco-tactil i tactil.
Aroma - caracteristica perceput n cavitatea bucal, n principal prin
intermediul papilelor gustative de la nivelul limbii.
Mirosul - caracteristica perceput prin intermediul nasului i al simului
olfactiv.
O deviaie semnificativ fa de temperatura recomandat mpiedic evaluarea
sigur a consistenei i a aromei. Temperatura este extrem de important.
Clasificarea untului trebuie amnat n cazul n care temperatura se afl n afara
intervalului recomandat.
2) Fiecare caracteristic trebuie s fac obiectul unei evaluri senzoriale
separate. Punctarea se realizeaz n conformitate cu tabelul 1.
Tabelul 1. Punctajul pentru unt
Aspect Consisten Arom+miros
Puncte Nr. Observaii Puncte Nr. Observaii Puncte Nr. Observaii

(1) (clas de (1) (clas de (1)
calitate) calitate)
5 Foarte bine 5 Foarte bine 5 Foarte bine
tipul ideal tipul ideal tipul ideal
cea mai bun cea mai bun cea mai bun

calitate calitate calitate
(substan uscat (bine tartinabil) (cea mai fin arom

egal) absolute pur)
4 Bine (2) 4 Bine (2) 4 Bine (2)
nu exist defecte 16 tare nu exist defecte

evidente evidente
17 moale
3 Acceptabil (mici 3 Acceptabil (mici 3 Acceptabil (mici
defecte) defecte) defecte)
nelegat (necompact), dezemulsionat, impur

1 umed 13 friabil, sfrmicios 19
arome strine
neuniform, n dou pstos, de 20
culori consistena acid
aluatului, gras
2 14 23
cu dungi arom de copt,
lipicios arom de ars
25
pestri, marmorat
tare arom de furaj
3
cu aspect granulat
moale aspru, amar
4 15 31
separare a uleiurilor
5 16 32 suprasrat
supracolorat
6 17 33
textur slab,
deschis
7
2 Slab (defecte 2 Slab (defecte 2 Slab (defecte

evidente) evidente) evidente)
nelegat (necompact), dezemulsionat, impur

1 13 friabil, sfrmicios 19
umed arome strine
pstos, de 20
cu dungi consistena vechi
aluatului, gras
3 14 21
pestri, marmorat acid
lipicios
4 23
cu aspect granulat miros oxidat, miros
tare metalic
5 30
separare a uleiurilor
moale arom de furaj
6 15
supracolorat
7 16 31 aspru, amar
granulat
9 17 32 suprasrat
materii strine
10 33 mucegit, putred
mucegit
11 34 miros de substane
sare nedizolvat chimice
12 36
1 Foarte slab (defecte 1 Foarte slab 1 Foarte slab

mari) (defecte mari) (defecte mari)
dezemulsionat,
nelegat (necompact), friabil, sfrmicios arome strine
1 13 20
umed pstos, de brnzos, miros de
consistena brnz lactic
aluatului, gras 22
cu dungi
3 pestri, marmorat 14 lipicios acid
4 cu aspect granulat tare 23 spumos
5 separare a uleiurilor moale 24 miros de mucegai
6 supracolorat 15 26 rnced
7 granulat 16 27 uleios, cu gust de

pete
9 materii strine 17 28
cu aspect/gust de
10 mucegit seu
11 sare nedizolvat 29 miros oxidat, miros

metalic
12
aspru, amar
30
suprasrat
mucegit, putred
32
cu aspect de mal
33
miros de substane
chimice
34
35
36
(1) Punctul 10.
(2) Defectele menionate la bun reprezint numai deviaii foarte mici de la tipul ideal.
3) Pentru a se obine uniformitate, uneori este de dorit ca, nainte de nceperea

evalurii, evaluatorii s puncteze mpreun una sau mai multe probe de
referin, n privina aspectului, a consistenei i a aromei.
4) Punctajul de acceptare este urmtorul:
Maxim Necesar
Aspect 5 4
Consisten 5 4
Arom/miros 5 4
n cazurile n care nu se obine punctajul necesar, trebuie s se prezinte o
descriere a defectului.
Punctajul acordat de fiecare evaluator pentru fiecare caracteristic trebuie
nregistrat n documentul de control.
Produsul este acceptat sau respins pe baza deciziei majoritii.
Nu trebuie s se nregistreze n mod frecvent cazuri n care diferenele dintre
punctajele individuale acordate pentru fiecare caracteristic s fie mai mari de un
punct (nu mai frecvent de un caz la 20 de probe). n caz contrar, competena
panelului trebuie verificat de conductorul panelului.
9. Supraveghere
Conductorul panelului, care trebuie s fie angajat oficial al autoritii
competente i care poate fi membru al panelului, trebuie s rspund n general
pentru ntreaga procedur. Acesta trebuie s nregistreze n documentul de control
punctajele individuale pentru fiecare caracteristic i s confirme dac produsul
este acceptat sau respins.
10. Nomenclator
Tabelul 2. Defectele untului
I. Aspect:
1. nelegat (necompact), umed
2. neuniform, n dou culori
3. cu dungi
4. pestri, marmorat
5. cu aspect granulat
6. separare a uleiurilor
7. supracolorat
8. textur slab, deschis
9. granulat
10. materii strine
11. mucegit
12. sare nedizolvat
II. Consisten:
13. dezemulsionat, friabil, sfrmicios
14. pstos, de consistena aluatului, gras
15. lipicios
16. tare
17. moale
III. Miros i arom:
18. fr miros
19. impur (1)
20. arome strine
21. vechi
22. brnzos, miros de brnz lactic
23. acid
24. spumos
25. (a) arom de copt
(b) arom de ars
26. miros de mucegai
27. rnced
28. uleios, cu gust de pete
29. cu aspect/gust de seu
30. (a) miros oxidat
(b) miros metalic
31. arom de furaj
32. aspru, amar
33. suprasrat
34. mucegit, putred
35. cu aspect de mal
36. miros de substane chimice
(1) Aceast desemnare trebuie folosit ct mai rar posibil i numai atunci cnd defectul nu poate fi descris mai exact.
Anexa nr. 5
Determinarea coninutului de trigliceride ale acidului enantic n unt, ulei de

unt i smntn prin analiza cromatografic n faz gazoas a trigliceridelor
1. Obiectul
Prezenta metod stabilete o metod pentru determinarea coninutului de
trigliceride ale acidului enantic n unt, ulei de unt i smntn.
2. Termeni i definiie
Coninutul de acid enantic - coninutul de trigliceride ale acidului enantic
determinat prin procedura specificat n prezenta metod.
Not: Coninutul de acid enantic este exprimat n kg/ton din produs pentru
uleiul de unt i unt, iar pentru smntn este exprimat n kg/ton din grsimea din
lapte.
3. Principiu
Grsimea din lapte este extras din diferite produse n conformitate cu SM ISO
14156. Determinarea cantitativ a coninutului de trigliceride ale acidului enantic
n grsimea extras este realizat prin cromatografie n faz gazoas n coloan
capilar (GC). Rezultatul obinut pentru prob este evaluat prin aplicarea
standarduluiprivind trigliceridele acidului caproic.
4. Reactivi
Se folosesc reactivi de calitate analitic recunoscut.
1) n-Hexan
2) Trigliceride etalon ale acidului caproic, cel puin 99 % puritate
3) Trigliceride etalon ale acidului enantic, cel puin 99 % puritate
4) Sulfat de sodiu, anhidru (Na2SO4)
5. Aparatur
Aparatura obinuit de laborator:
1) Balan analitic echilibrat la 1 mg
2) Baloane cotate cu capacitate de 10 ml i 20 ml
3) Tuburi de centrifug cu capacitate de 30 ml
4) Evaporator rotativ
5) Cuptor care s poat fi meninut la o temperatur de 50 C 5 C
6) Hrtie de filtru de porozitate medie cu diametrul de aproximativ 15 cm
7) Aparatur de cromatografie n faz gazoas
a) Cromatograf n faz gazoas dotat cu un injector cu sau fr divizare sau
n coloan i cu un detector cu ionizare n flacr
b) Coloan de cromatografie n faz gazoas cu faz staionar care a fost
folosit cu succes n operaiunea de separare a trigliceridelor (100 %
dimetilpolisiloxan sau 5 % fenil-95 % metilpolisiloxan). Se selecteaz faza
staionar, se ajusteaz lungimea coloanei (ntre 4 m i 15 m), diametrul
intern (ntre 0,22 mm i 0,50 mm) i grosimea stratului (0,12 m sau mai
mult), innd cont de experiena laboratorului i de sistemul de injectare
aplicat. n orice caz, coloana selectat produce n acelai timp o separare
complet ntre vrful solventului i trigliceridele acidului caproic i o
rezoluie a liniei de baz ntre vrfurile trigliceridelor acidului caproic i ale
acidului enantic
8) Sering pentru injectare, cu capacitate de 5 l.
6. Prelevarea probelor
Proba primit n laborator trebuie s fie reprezentativ i care s nu fi fost
deteriorat sau modificat n timpul transportului sau pe durata depozitrii.
Metoda recomandat de prelevare a probelor este prezentat n SM SR EN ISO
707:2012 Lapte i produse lactate. Ghid pentru eantionare.
7. Prepararea probei pentru analiz i a cantitii analizate se realizeaz n
conformitate cu SM ISO 14156.
1) Ulei de unt, unt
a) Se topete ntre 50 g i 100 g din proba pentru analiz n cuptor
b) Se pun ntre 0,5 g i 1 g de sulfat de sodiu anhidru ntr-o hrtie de filtru
pliat
c) Se filtreaz grsimea prin hrtia de filtru care conine sulfat de sodiu
anhidru, colectnd filtratul ntr-un pahar de laborator care se pstreaz
n cuptor. n timpul decantrii, se acord mult atenie untului topit n
hrtia de filtru, pentru a nu se transfera serul
2) Smntn
a) Proba analizat se aduce la o temperatur de 20 C 2 C
b) Proba se amestec sau se agit bine
c) Se dilueaz o cantitate adecvat din proba analizat pentru a se obine
100 ml de cantitate analizat cu o fraciune de mas a grsimii de
aproximativ 4 %
d) Se procedeaz ca i n cazul laptelui crud i al laptelui omogenizat (SM
ISO 14156) pentru a extrage grsimea din smntn
e) Se cntrete, cu o precizie de 1 mg, 1 g din grsimea extras, ntr-un
balon cotat de 10 ml. Se adaug 1 ml din soluia indicat la punctul 8,
subpunctul 1). Se completeaz pn la 10 ml cu n-hexan i se
omogenizeaz
f) Se introduce 1 ml din soluia indicat la subpunctul 1, lit. b) din
prezentul punct, ntr-un balon cotat de 10 ml i se dilueaz pn la
10 ml cu n-hexan
8. Prepararea etaloanelor de calibrare
1) Se dizolv 100 mg de trigliceride ale acidului enantic n 10 ml de n-
hexan
2) Se dizolv 100 mg de trigliceride ale acidului caproic n 10 ml de n-
hexan
3) Se introduce 1 ml din soluia indicat la subpunctul 2) din prezentul
punct, ntr-un balon cotat de 10 ml. Se completeaz pn la 10 ml cu n-
hexan
punct i 1 ml din soluia indicat la subpunctul 2) din prezentul punct
punctul 2, ntr-un balon cotat de 10 ml. Se completeaz pn la 10 ml cu
n-hexan
punct ntr-un balon cotat de 10 ml i se completeaz pn la 10 ml cu n-
hexan
9. Determinarea cromatografic
1) Se injecteaz de dou ori 1 l din soluia etalon indicat la punctul 8,
subpunctul 5)
2) Se injecteaz 1 l din fiecare soluie de prob
Not: n cazul n care se adopt sistemul de injectare n coloan, se aplic o
diluare mai mare att soluiei etalon, ct i soluiei de prob.
3) Operaia indicat la subpunctul 1) din prezentul punct se repet la
fiecare 3 probe n vederea ncadrrii probelor ntre injectrile etalon
martor. Rezultatele se bazeaz pe media coeficienilor de rspuns din
cromatogramele etalon.
10. Calcularea rezultatelor
Pentru fiecare cromatogram, se integreaz suprafaa vrfurilor asociate cu
trigliceridele acidului enantic i ale acidului caproic.
Se urmeaz aceste instruciuni pentru fiecare ciclu delimitat, respectiv pentru un
set de probe delimitate, etalonul injectat de dou ori imediat dup acestea este
STD1, iar etalonul injectat de dou ori imediat dup acestea este STD2.
1) Calibrare
a) Se calculeaz coeficientul de rspuns pentru fiecare duplicat al STD 1,
Rf1(a) i Rf1(b)
Rf1 (a) sau (b) = (Suprafaa vrfului pentru trigliceridele acidului
caproic/Suprafaa vrfului pentru trigliceridele acidului enantic) 100
Se calculeaz media coeficientului de rspuns, Rf1
Rf1 = [Rf1(a) + Rf1(b)] / 2
b) n mod similar, se calculeaz media coeficientului de rspuns STD2, Rf2
c) Se calculeaz media coeficientului de rspuns, Rf
Rf = (Rf1 + Rf2) /2
2) Probele analizate
Pentru fiecare cromatogram a probei obinut ntre STD 1 i STD2, se calculeaz
coninutul de acid enantic, C (kg/ton):
C = (Suprafaa vrfului pentru trigliceridele acidului enantic Rf 100)/
(Suprafaa vrfului pentru trigliceridele acidului caproic Wt 1 000)
unde:
Wt = greutatea grsimii prelevate (g);
100 = volumul de diluare pentru prob;
1 000 = coeficientul de transformare (pentru g/g n kg/t).
Pentru probele de unt, se ine cont de coninutul de grsime al untului i se
calculeaz o valoare a concentraiei corectat, Cunt (kg/t de unt)
Cunt = Cgrsime F
unde F este coninutul de grsime al untului.
11.Precizia
Valorile pentru limita de repetabilitate i reproductibilitate sunt exprimate
pentru nivelul de probabilitate de 95 %, fiind posibil ca acestea s nu fie aplicabile
n cazul altor intervale i matrice de concentraie dect cele prezentate.
1) Repetabilitate
Diferenele absolute dintre dou rezultate individuale ale unui singur test,
obinute prin aceeai metod aplicat asupra unor materiale de testare identice, n
acelai laborator, de ctre acelai operator, utilizndu-se acelai echipament, la un
interval scurt de timp nu vor fi mai mari de 0,35 kg/t, n nu mai mult de 5 % din
cazuri.
2) Reproductibilitate
Diferenele absolute dintre dou rezultate individuale ale unui singur test,
obinute prin aceeai metod aplicat asupra unor materiale de testare identice, n
laboratoare diferite, de ctre operatori diferii, utilizndu-se echipamente diferite
nu vor fi mai mari de 0,66 kg/t, n nu mai mult de 5 % din cazuri.
12.Limitele de toleran: limite inferioare (n cazul cantitilor insuficiente)
1) Pentru a verifica marcarea corect a produsului, trebuie prelevate trei probe
din produsul studiat.
2) Unt i unt concentrat
a) Rata de ncorporare este de 11 kg din trigliceridele
acidului enantic cu o puritate de cel puin 95 %, respectiv
10,45 kg/t
b) Rezultatele pentru cele trei probe obinute n urma analizei
produsului se utilizeaz la verificarea ratei i a omogenitii de
ncorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compar cu
urmtoarele limite:
- 9,51 kg/t (rat de ncorporare minim de 95 % pentru
trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95 %,
determinare separat);
- concentraia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab
este utilizat prin interpolare, respectiv ntre 9,51 kg/t
i 6,89 kg/t.
3) Smntn
a) Rata de ncorporare este de 10 kg de trigliceride ale
acidului enantic, cu o puritate de cel puin 95 %, pe tona de
grsimi din lapte, respectiv 9,5 kg/t grsimi din lapte marcate
produsului se folosesc pentru verificarea ratei
omogenitii de ncorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se
compar cu urmtoarele limite:
- concentraia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este
utilizat prin interpolare, respectiv ntre 8,60 kg/t i 6,23 kg/t.
13. Limitele de toleran: limitele superioare (n cazul depirii
cantitii cu peste 20 %)
2) Unt i unt concentrat
Rezultatele pentru cele trei probe obinute n urma analizei produsului
se folosesc pentru verificarea ratei i omogenitii de ncorporare a marcatorilor, iar
media acestor rezultate se compar cu limita superioar de 12, 96 kg/t.
3) Smntn
Rezultatele pentru cele trei probe obinute n urma analizei produsului
se folosesc pentru verificarea ratei i omogenitii de ncorporare a marcatorilor, iar
media acestor rezultate se compar cu limita superioar de 11,82 kg/t.
Anexa nr. 6
Determinarea coninutului de vanilin n untul concentrat, unt sau smntn

prin cromatografie lichid de nalt performan
1. Obiectul i domeniul de aplicare
Metoda implic o procedur de determinare cantitativ a vanilinei din untul
concentrat, unt i smntn.
2. Principiu
Extragerea unei cantiti cunoscute din prob cu ajutorul unui amestec de
izopropanol/etanol/acetonitril (1:1:2). Precipitarea majoritii grsimii prin rcire
ntre 15 C i 20 C, urmat de centrifugare.
Dup diluarea cu ap, determinarea coninutului de vanilin prin cromatografie
lichid de nalt performan (HPLC).
3. Aparatur:
1) Refrigerator cu funcionare n intervalul de temperatur 15 C la 20 C
2) Seringi de unic folosin cu capacitate de 2 ml
3) Membran filtrant cu pori de 0,45 m, rezistent la o soluie coninnd 5 %
soluie de extragere
4) Sistem de cromatografie lichid coninnd o pomp (cu debit de 1,0 ml/min),
un injector (injectare automat sau manual a 20 l), un detector UV
(acionat la 306 nm, 0,01 scal complet), un nregistrator sau integrator i
o coloan termostat care funcioneaz la 25 C
5) Coloan analitic (aproximativ 250 mm 4,6 mm diametru interior)
umplut cu LiChrospher RP 18 (Merck, 5 m) sau o coloan echivalent
6) Coloan de control (aproximativ 20 mm 3 mm diametru interior) umplut
cu LiChrospher RP 18 (5-10 m) sau o coloan echivalent
7) Centrifug care opereaz la 2 000 rpm.
4. Reactivi
Reactivii utilizai trebuie s fie de calitate analitic recunoscut.
1) Izopropanol
2) Etanol 96 % (v/v)
3) Acetonitril
4) Soluie de extragere
Se amestec izopropanol, etanol i acetonitril n proporie de 1:1:2 (v/v).
5) Vanilin (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid) 98 %
a) Soluie stock de vanilin (= 500 g/ml)
Se cntresc, cu o precizie de 0,1 mg, aproximativ 50 mg (CM mg) de vanilin
ntr-un balon cotat de 100 ml, se adaug 25 ml de soluie de extragere i se
completeaz cu ap.
b) Soluie etalon de vanilin (= 10 g/ml)
Se pipeteaz 5 ml de soluie stock de vanilin ntr-un balon cotat de
250 ml i se completeaz cu ap.
c) Metanol, calitate HPLC
d) Acid acetic, glacial
e) Ap, calitate HPLC
f) Faza mobil HPLC
Se amestec 300 ml de metanol cu aproximativ 500 ml ap
i 20 ml de acid acetic ntr-un balon cotat de 1 000 ml i se completeaz cu ap. Se
filtreaz printr-un filtru de 0,45 m.
5. Procedur
1) Prepararea probei pentru analiz
a) Unt
Se nclzete proba pn cnd ncepe s se topeasc. Se evit supranclzirea
unor poriuni din prob la peste 30 C. n orice caz, exist posibilitatea ca untul s
nu se separe n dou faze. Cnd proba devine suficient de maleabil, se
omogenizeaz prin scuturare. Untul se amestec timp de 15 s nainte de prelevarea
unei probe. Se cntresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 5 g (SM g) de unt
ntr-un balon cotat de 100 ml.
b) Unt concentrat
Imediat dup prelevarea probei, recipientul coninnd un concentrat se
introduce n cuptor la 40-50 C pn cnd se topete complet. Proba se amestec
prin turbionare sau agitare, evitndu-se formarea de bule de aer din cauza
amestecrii prea puternice. Se cntresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 4 g
(SM g) de unt concentrat ntr-un balon cotat de 100 ml.
c) Smntn
Proba se nclzete n baie de ap sau ntr-un incubator la o temperatur de 35-
40 C. Grsimea se distribuie omogen prin turbionare i, dup caz, prin
amestecare. Proba se rcete rapid la 20 2 C. Proba trebuie s aib un aspect
omogen; n caz contrar, procedura trebuie repetat. Se cntresc, cu o precizie de
1 mg, aproximativ 10 g (SM g) de smntn ntr-un balon cotat de 100 ml.
2) Prepararea soluiei de analiz
Se adaug aproximativ 75 ml de soluie de extragere la proba prelevat (punctul
5, subpunctul 1, lit. a), b) sau c)), se agit sau se scutur cu putere timp de
aproximativ 15 minute i se completeaz cu soluie de extragere. Se transfer
aproximativ 10 ml din acest extract ntr-o eprubet prevzut cu dop. Eprubeta se
introduce n refrigerator timp de aproximativ 30 minute. Extractul rece se
centrifugheaz timp de 5 minute la aproximativ 2 000 rpm i se decanteaz
imediat. Soluia decantat se las s se rceasc la temperatura camerei. Se
pipeteaz 5 ml din soluia decantat ntr-un balon cotat de 100 ml i se
completeaz cu ap. Se filtreaz o parte alicot printr-o membran microfiltrant
cu ajutorul unei seringi. Filtratul este gata pentru determinarea HPLC.
3) Calibrare
Se pipeteaz 5 ml de soluie etalon de vanilin ntr-un balon cotat de 100 ml. Se
adaug 5 ml de soluie de extragere i se completeaz cu ap pn la marcaj.
Aceast soluie conine 0,5 g/ml de vanilin.
4) Determinarea prin HPLC
Se las sistemul cromatografic s se stabilizeze timp de aproximativ 30 minute.
Se injecteaz soluia etalon (subpunctul 3 din prezentul punct). Procedura se repet
pn cnd diferena dintre suprafeele vrfurilor sau dintre nlimile vrfurilor a
dou injectri succesive este sub 2 %. n condiiile descrise timpul de retenie al
vanilinei este de aproximativ 9 minute. Soluia etalon (subpunctul 3 din prezentul
punct) se analizeaz n duplicat prin injectarea a 20 l. Se injecteaz 20 l din
soluia de analiz (subpunctul 2 din prezentul punct). Se determin suprafaa sau
nlimea vrfului obinut pentru vanilin. Se repet injectarea soluiei etalon
(subpunctul 3 din prezentul punct) n duplicat, dup 10 injectri ale probelor
analizate (subpunctul 2 din prezentul punct).
Se calculeaz suprafaa (sau nlimea) medie a vrfurilor (AC) pentru vrfurile
vanilinei asociate injectrii duplicatelor la nceputul i la sfritul fiecrui lot de
soluie de analiz (n total patru suprafee sau nlimi).
Se calculeaz coeficientul de rspuns (R):
R=AC/CM
unde CM este masa vanilinei n mg.
Coninutul (mg/kg) de vanilin (C) din prob se calculeaz cu ajutorul formulei:
C=[(AS 20 0,96)/(SM R)]
unde:
AS - suprafaa vrfului sau nlimea pentru vrful vanilinei din proba pentru
analiz
SM - masa probei pentru analiz exprimat n g (punctul 5, subpunctul 1, lit. a),
b) sau c)).
Not: La analiza vanilinei din smntn, concentraia marcatorului se exprim
ca mg marcator/kg grsime din lapte. Pentru aceasta se nmulete C cu 100/f. f
este coninutul de grsime al smntnii n procente (m/m).
20 - coeficientul de diluare a probei etalon i a probei pentru analiz
0,96 - factorul de corecie pentru coninutul de grsime la prima diluare a
probei pentru analiz.
Not: n locul suprafeei vrfului se poate folosi nlimea vrfului (a se vedea
punctul 8, subpunctul 3).
7. Precizia metodei
1) Repetabilitate(r)
Diferena dintre rezultatele a dou determinri efectuate n cel mai scurt
interval de timp posibil de un operator care utilizeaz aceeai aparatur pe material
de analiz identic nu trebuie s depeasc 16 mg/kg.
Diferena dintre rezultatele a dou determinri efectuate de operatori din
laboratoare diferite care utilizeaz aparatur diferit pe material de analiz identic
nu trebuie s depeasc 27 mg/kg.
8. Limitele de toleran
1) Trebuie s se preleveze trei probe din produsul urmrit pentru a se verifica
omogenitatea
2) Marcator obinut fie din vanilie, fie din vanilin sintetic
a) Rata de ncorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid este de 250 g
pe ton de unt concentrat sau de unt. Pentru smntna marcat, rata de
ncorporare este de 250 g pe ton de grsime din lapte.
b) Rezultatele pentru cele trei probe obinute n urma analizei produsului se
utilizeaz la verificarea ratei i a omogenitii de ncorporare a
marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compar cu urmtoarele limite:
- 220,8 mg/kg (95 % din rata minim de ncorporare);
- 158,3 mg/kg (70 % din rata minim de ncorporare).
Concentraia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizat
prin interpolare ntre 220,8 mg/kg i 158,3 mg/kg.
3) Marcator obinut numai din psti de vanilie sau extracte integrale ale
acesteia:
a) Rata de ncorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid est de 100 g
pe ton de unt concentrat sau de unt. Pentru smntna marcat, rata de
ncorporare este de 100 g pe ton de grsime din lapte
b) Rezultatele pentru cele trei probe obinute n urma analizei produsului se
folosesc pentru verificarea ratei i a omogenitii de ncorporare a
9. Note
1) Recuperarea vanilinei adugate la un nivel de 250 mg/kg ulei de unt variaz
de la 97,0 la 103,8. Coninutul mediu identificat a fost de 99,9 %, cu o
deviaie standard de 2,7 %.
2) Soluia etalon conine 5 % soluie de extragere pentru a compensa creterea
suprafeei vrfului provocat de prezena a 5 % soluie de extragere n prob.
Astfel, se poate opera o clasificare n funcie de nlimea vrfului.
3) Analiza se bazeaz pe o curb liniar de etalonare, cu intersecie cu punctul
zero.
4) Folosindu-se soluii diluate adecvate de soluie etalon, se verific liniaritatea
n momentul realizrii primei analize, iar apoi la intervale regulate i dup
modificri sau reparaii la echipamentul HPLC. Vanilina poate fi degradat
n acid vanilic, divanilin i ali compui prin aciunea enzimelor intrinseci
n smntna nepasteurizat sau produsele obinute din aceasta.
Anexa nr. 7
Detectarea prin spectrometrie a etil esterului acidului beta-apo-8'-carotenic n

untul concentrat i n unt
Aceast metod descrie o procedur de determinare cantitativ a etil esterului
acidului beta-apo-8'-carotenic (ester apo-carotenic) n untul concentrat i n unt.
Esterul apo-carotenic este suma tuturor substanelor prezente ntr-un extract din
probe prelevate n condiiile prevzute pentru aceast metod, care absorb lumin
la 440 nm.
2. Principiu
Grsimea din unt se dizolv n eter de petrol i se msoar absorbana la
440 nm. Coninutul de ester apo-carotenic se determin prin raportare la un
standard extern.
3. Aparatur
1) Pipete gradate, cu capacitate de 0,25, 0,50, 0,75 i 1,0 ml
2) Spectrofotometru adecvat utilizrii la 440 nm (i la 447-449 nm) i
prevzut cu celule cu drum optic de 1 cm
3) Baloane cotate, de 20 ml i de 100 ml
4) Balan analitic cu sensibilitate de 0,1 mg, cu o capacitate de cntrire
avnd o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg
5) Cuptor, 45 C 1 C
6) Filtre fr cenu cu filtrare rapid
4. Reactivi
Toi reactivii utilizai trebuie s fie de calitate analitic recunoscut
1) Suspensie de acid apo-carotenic (aproximativ 20 %)
a) Coninutul suspensiei se determin astfel:
Suspensia se nclzete ntre 45 C i 50 C i se omogenizeaz n
recipientul original nchis. Se cntresc aproximativ 400 mg ntr-un balon cotat
(100 ml), se dizolv n 20 ml cloroform i se completeaz volumul cu ciclohexan.
Se dilueaz 5,0 ml din aceast soluie cu 100 ml de ciclohexan (soluia A). Se
dilueaz 5,0 ml de soluie A cu ciclohexan pn la 100 ml. Se msoar absorbana
la 447-449 nm (se msoar valoarea maxim fa de o prob de ciclohexan ca
prob martor, folosindu-se celule cu drum optic de 1 cm).
Coninutul de ester apo-carotenic P (%) = (Absmax 40 000)/(Msusp
2 550) sau se dezvolt: (Absmax /2 550) (100/5) (100/5)
(100/Msusp)
Absmax = absorbana soluiei de msurare la maximum
Msusp = masa suspensiei (g)
2 550 = valoarea de referin Abs (1 %, 1 cm)
P = Puritatea (coninutul) suspensiei (%)
Not: Suspensia de ester apo-carotenic este sensibil la aer,
cldur i lumin. Se poate pstra la loc rece timp de aproximativ 12 luni, n
recipientul original nchis (sigilat sub azot). Dup deschiderea recipientului,
coninutul trebuie utilizat ct de repede posibil.
b) Soluia etalon de ester apo-carotenic, aproximativ 0,2 mg/ml
Se cntresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 0,100 g de
suspensie de ester apo-carotenic (W), se dizolv n ligroin, se
transfer cantitativ ntr-un balon cotat cu capacitate de 100 ml i
se completeaz pn la marcaj cu ligroin.
Aceast soluie conine (W P)/10 mg/ml de ester apo-carotenic.
Not: Soluia trebuie pstrat la rece i la adpost de lumin. Soluia
nefolosit se arunc dup o lun.
2) Ligroin (40-60 C)
3) Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat n prealabil la 102 C timp de 2
ore
4) Cloroform
5) Ciclohexan
5. Procedur
a) Unt concentrat
Proba se topete n cuptor la aproximativ 45 C
b) Unt
Proba se topete n cuptor la aproximativ 45 C i se filtreaz o parte
reprezentativ printr-un filtru care conine aproximativ 10 g de sulfat de sodiu
anhidru ntr-un mediu protejat de lumina natural sau artificial puternic i se
pstreaz la 45 C. Se colecteaz o cantitate adecvat de grsime din unt
2) Determinare
Se cntrete, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt concentrat [sau
grsime extras din unt (subpunctul 1, lit. b) din prezentul punct), (M). Se transfer
cantitativ ntr-un balon cotat de 20 ml (V), folosindu-se ligroin, se completeaz
pn la marcaj i se amestec bine.
Se transfer o parte alicot ntr-o celul de 1 cm i se msoar absorbana la
440 nm, fa de o prob martor de ligroin. Concentraia de ester apo-carotenic n
soluie se determin conform curbei de etalonare (C g/ml).
3) Calibrare
Se pipeteaz 0, 0,25, 0,5, 0,75 i 1,0 ml de soluie etalon de ester apo-carotenic
n cinci baloane cotate de 100 ml. Se dilueaz la volum cu ligroin i se amestec.
Concentraiile aproximative ale soluiei variaz ntre 0 i 2 g/ml i se
calculeaz cu precizie prin referire la concentraia soluiei etalon de ester apo-
carotenic (W P)/10 mg/ml. Se msoar absorbana la 440 nm fa de o prob
martor de ligroin.
Valorile absorbanei se reprezint pe axa y, iar pe axa x se reprezint
concentraia esterului apo-carotenic. Se calculeaz ecuaia curbei de etalonare.
Coninutul de ester apo-carotenic, exprimat n mg/kg de produs, se calculeaz
dup cum urmeaz:
Unt concentrat: (C V)/M
Unt: 0,82 (C V)M
unde:
C - coninutul de ester apo-carotenic, n g/ml, citit de pe curba de etalonare
(punctul 5, subpunctul 3);
V - volumul (ml) soluiei de analiz (punctul 5, subpunctul 2);
M - masa (g) cantitii analizate (punctul 5, subpunctul 2);
0,82 - factorul de corecie pentru coninutul de grsime al untului.
7. Precizia metodei
1) Repetabilitate
a) Analiza untului
de analiz identic nu trebuie s depeasc 1,4 mg/kg.
b) Analiza untului concentrat
Diferena dintre rezultatele a dou determinri efectuate n cel mai scurt interval
de timp posibil de un operator care utilizeaz aceeai aparatur pe material de
analiz identic nu trebuie s depeasc 1,6 mg/kg.
a) Analiza untului
nu trebuie s depeasc 4,7 mg/kg.
b) Analiza untului concentrat
8. Limitele de toleran
2) Unt
a) Rata de ncorporare pentru unt, avnd n vedere
absorbana de fond, este de 22 mg/kg
urmtoarele limite:
3) Unt concentrat
a) Rata de ncorporare pentru untul concentrat, avnd n
vedere absorbana de fond, este de 24 mg/kg.
urmtoarele limite:
Anexa nr. 8
Determinarea sitosterolului sau a stigmasterolului din unt i unt concentrat

prin cromatografia n faz gazoas cu coloan capilar
Metoda implic o procedur care permite determinarea cantitativ a
sitosterolului i a stigmasterolului din unt i din untul concentrat. Coninutul de
sitosterol reprezint suma cantitilor de -sitosterol i de 22-dihidro--sitosterol,
ceilali sitosteroli fiind considerai nesemnificativi.
2. Principiu
Untul sau untul concentrat este saponificat cu hidroxid de potasiu ntr-o soluie
de etanol, iar substanele nesaponificabile sunt extrase cu ajutorul dietil eterului.
Sterolii se transform n trimetil-silil-eteri i sunt analizai prin cromatografie n
faz de gaz cu coloan capilar prin raportare la un etalon intern/betulina.
3. Aparatur
1) Balon de saponificare de 150 ml, dotat cu un refrigerator cu reflux cu capete
rodate
2) Conducte de decantare de 500 ml
3) Baloane de 250 ml
4) Conducte de egalizare a presiunii, de 250 ml sau cu o capacitate similar,
pentru a colecta dietil eterul residual
5) Coloan de sticl de 350 mm 20 mm, prevzut cu un racord cu frit
6) Baie de ap sau izoterm
7) Eprubete de reacie de 2 ml
8) Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloan capilar, prevzut cu un
dispozitiv de scindare format din urmtoarele:
a) etuv cu termostat pentru coloane, care poate menine
temperatura dorit cu o precizie de 1 C;
b) injector termoreglabil;
c) detector cu ionizare n flacr i convertor-amplificator;
d) integrator-nregistrator care poate fi utilizat mpreunc cu
convertorul-amplificator.
9) Coloan capilar din sticl de siliciu acoperit n ntregime de BP1 sau de o
substan echivalent (sau orice alt coloan cu rezoluie cel puin egal) n
strat uniform cu grosimea de 0,25 m; coloana trebuie s poat reduce
derivaii trimetil-silil ai lanosterolului i ai sitosterolului. Este recomandabil
s se utilizeze o coloan cu lungimea de 12 m i diametrul intern de 0,2 mm.
10) Microsering cu ac din oel inoxidabil de 1 l pentru cromatografie cu gaz.
4. Reactivi
Toi reactivii utilizai trebuie s fie de calitate analitic recunoscut. Apa
utilizat trebuie s fie ap distilat sau ap de o puritate cel puin echivalent.
1) Etanol, cu o puritate de cel puin 95 %
2) Hidroxid de potasiu, soluie 60 %, prin dizolvarea a 600 g de hidroxid de
potasiu (minimum 85 %) n ap, la care se adaug ap pn la 1 l
3) Betulin cu o puritate de cel puin 99 %
a) Soluii de betulin n eter dietilic
Concentraia soluiei de betulin utilizat pentru determinarea sitosterolului
trebuie s fie de 1,0 mg/ml.
Concentraia soluiei de betulin utilizat pentru determinarea
stigmasterolului trebuie s fie de 0,4 mg/ml.
4) Eter dietilic de puritate analitic (fr peroxizi sau reziduuri).
5) Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat n prealabil la 102 C timp de 2
ore.
6) Reactiv de sililare (TRI-SIL) sau un reactiv echivalent (Important: TRI-SIL
este inflamabil i toxic, coroziv i are un posibil potenial cancerigen.
Personalul de laborator trebuie s cunoasc normele de siguran aplicabile
n cazul utilizrii TRI-SIL i trebuie s ia toate msurile de precauie care se
impun).
7) Lanosterol
8) Sitosterol, cu puritate cunoscut, mai mare sau egal cu 90 % (P)
Soluia etalon de sitosterol: se prepar o soluie cu o precizie de 0,001 mg/ml,
coninnd aproximativ 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol n eter dietilic
9) Stigmasterol, cu puritate cunoscut, mai mare sau egal cu 90 % (P)
Soluie etalon de stigmasterol: se prepar o soluie cu o precizie de
0,001 mg/ml, coninnd aproximativ 0,2 mg/ml (W1) de stigmasterol n eter dietilic
10) Amestec pentru testul de rezoluie.
Se prepar o soluie coninnd 0,05 mg/ml de lanosterol i 0,5 mg/ml de
sitosterol n eter dietilic.
5. Prepararea soluiilor etalon pentru cromatografie
Se adaug soluia etalon intern la soluia etalon de sterol adecvat i, simultan,
la proba saponificat (punctul 6, subpunctul 2).
1) Soluia cromatografic etalon de sitosterol: se transfer 1 ml de soluie
etalon de sitosterol n fiecare dintre cele dou eprubete de reacie i se
elimin dietil eterul sub flux de azot. Se adaug 1 ml de soluie etalon intern
i se elimin dietil eterul sub flux de azot
2) Soluia cromatografic etalon de stigmasterol: se transfer 1 ml de soluie
etalon de stigmasterol n fiecare dintre cele dou eprubete de reacie i se
elimin dietil eterul sub flux de azot. Se adaug 1 ml de soluie etalon intern
i se elimin dietil eterul sub flux de azot.
6. Prepararea substanelor nesaponificabile
1) Se topete proba de unt la o temperatur de maximum 35 C; se amestec cu
grij.
Se cntrete, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt (W2) sau de unt
concentrat (W2) ntr-un balon de 150 ml. Se adaug 50 ml de etanol i 10 ml de
soluie de hidroxid de potasiu. Se adapteaz refrigeratorul cu reflux i se aduce la
aproximativ 75 C timp de 30 de minute. Se deconecteaz refrigeratorul i se las
balonul s se rceasc la temperatura camerei.
2) Se adaug 1,0 ml de soluie etalon intern n balon, n cazul n care se
determin sitosterolul, sau, n cazul n care se determin stigmasterolul. Se
amestec bine. Se transfer cantitativ coninutul balonului ntr-o conduct de
decantare de 500 ml, se spal balonul cu 50 ml de ap, apoi cu 250 ml de
eter dietilic. Se agit puternic conducta de decantare timp de 2 minute i se
las fazele s se separe. Se elimin faza apoas inferioar i se spal faza
eteric agitndu-se 4 pri alicote succesive de 100 ml ap.
Nota 2: Pentru a evita formarea unei emulsii, este neaprat necesar ca primele
dou splri cu ap s se efectueze uor (10 rotaii). Pentru a treia splare, se poate
agita mai puternic timp de 30 de secunde. n cazul n care se formeaz o emulsie,
aceasta poate fi eliminat prin adugarea a 5 pn la 10 ml de etanol. n cazul n
care se adaug etanol, este absolut necesar s se efectueze nc dou splri
puternice cu ap.
3) Se trece faza eteric limpede i desaponificat pe o coloan de sticl care
conine 30 g de sulfat de sodiu anhidru. Se colecteaz eterul ntr-un balon de
250 ml. Se adaug bile antiproiecie i se evapor pn la uscare aproape
complet ntr-o baie de ap sau ntr-o izoterm, colectndu-se solvenii care
trebuie eliminai.
Nota 3: n cazul n care anumite pri din prob se evapor n uscat la o
temperatur prea ridicat, este posibil s se piard cantiti de sterol.
7. Prepararea trimetil-silil-eterilor
1) Se transfer soluia de eter rmas n balon ntr-o eprubet de reacie de 2 ml
cu ajutorul a 2 ml de dietil eter i se elimin eterul sub flux de azot. Se spal
balonul cu dou pri alicote suplimentare de 2 ml de eter dietilic,
transferndu-se coninutul n eprubet i eliminndu-se eterul de fiecare dat
sub flux de azot
2) Se silileaz proba prin adugarea a 1 ml de TRI-SIL. Se
astup eprubeta i se agit puternic pentru a produce dizolvarea. n
cazul n care proba nu s-a dizolvat complet, se aduce la temperatura de 65-
70 C. Se las s stea cel puin 5 minute nainte de a se injecta n
cromatograful cu gaz. Se silileaz etaloanele n acelai mod ca
i probele. Se silileaz amestecul pentru testul de rezoluie n acelai mod ca
i probele.
Nota 4: Sililarea trebuie efectuat ntr-un mediu anhidru.
Sililarea incomplet a betulinei se recunoate prin obinerea unui al
doilea vrf apropiat de cel al betulinei.
Prezena etanolului n timpul sililrii va interfera cu procesul de sililare. Acest
fapt poate fi consecina unei splri insuficiente n momentul extragerii. n
cazul n care aceast problem persist, n etapa de extragere se va include o a
cincea splare, cu agitare puternic timp de 30 de secunde.
8. Alegerea condiiilor pentru analiza prin cromatografie cu gaz
Se instaleaz cromatograful cu gaz conform instruciunilor productorului.
Condiiile pentru procedur sunt:
1) temperatura coloanei: 265 C;
2) temperatura injectorului: 265 C;
3) temperatura detectorului: 300 C;
4) debitul gazului vector: 0,6 ml/min;
5) presiunea hidrogenului: 84 kPa;
6) presiunea aerului: 155 kPa;
7) fracionarea probei: de la 10:1 la 50:1; raportul de fracionare trebuie
optimizat n funcie de instruciunile productorului i de liniaritatea
rspunsului detectorului i validat ulterior n funcie de intervalele de
concentraii luate n considerare.
Nota 5: Camera de vaporizare trebuie curat regulat.
8) cantitatea de substan injectat: 1 l de soluie TMSE.
Se las sistemul s se echilibreze i se obine un raspuns stabil nainte de a se
efectua vreo analiz
Aceste condiii pot fi modificate n funcie de caracteristicile coloanei i ale
cromatografului cu gaz, pentru a se obine cromatograme care s ndeplineasc
condiiile urmtoare:
a) vrful sitosterolului trebuie s prezinte o rezoluie suficient fa de
lanosterol
b) timpii relativi de retenie ai sterolilor de mai jos trebuie s fie de
aproximativ:
colesterol: 1,0;
stigmasterol: 1,3;
sitosterol: 1,5;
betulin: 2,5;
c) timpul de retenie al betulinei trebuie s fie de aproximativ 24 minute.
9. Protocolul de analiz
Se injecteaz 1 l de soluie etalon sililat (stigmasterol sau sitosterol) i se
ajusteaz parametrii de calibrare ai integratorului.
Se injecteaz din nou 1 l de soluie etalon sililat pentru a se determina
coeficientul de rspuns fa de betulin.
Se injecteaz 1 l de soluie de prob sililat i se msoar suprafaa vrfurilor.
Fiecare serie de probe trebuie precedat i urmat de o injectare de soluie etalon.
n general, injectarea soluiei de prob se poate efectua dup o serie de ase
probe.
Nota 6: Integrarea vrfului sitosterolului trebuie s nglobeze suprafaa
vrfului 22- dihidro--sitosterolului (stigmastanol) care apare imediat
dup sitosterol n momentul evalurii sitosterolului total.
10.Calcularea rezultatelor
Se determin suprafaa vrfurilor sterolului i a vrfurilor betulinei n cele dou
etaloane, la nceputul i la finalul fiecrei serii, i se calculeaz R1:
R1 - (suprafaa medie a vrfului sterolului n etalon)/(suprafaa medie a vrfului
betulinei n etalon)
Se determin suprafaa vrfului de sterol (stigmasterol sau sitosterol) i a
vrfului betulinei n prob i se calculeaz R2:
R2 - (suprafaa vrfului sterolului n prob)/(suprafaa vrfului betulinei n
prob)
W1- coninutul de sterol al etalonului (mg) din 1 ml de soluie etalon
W2- masa probei (g)
P - puritatea sterolului etalon
Coninutul de sterol din prob (mg/kg) = [(R 2) / (R 1)] [(W 1) / (W 2)] P
10.
11.Precizia metodei
1) Unt
a) Repetabilitate
Stigmasterol
Sitosterol
b) Reproductibilitate
Stigmasterol
Sitosterol
nu trebuie s depeasc 8,7 % din valoarea medie a acestor determinri.
2) Unt concentrat
a) Repetabilitate
Stigmasterol
Sitosterol
de analiz identic nu trebuie s depeasc 3,6 % din valoarea medie a acestor
determinri.
Stigmasterol
Sitosterol
nu trebuie s depeasc 8,9 % din valoarea medie a acestor determinri.
12.Limitele de toleran
2) Unt
a) Stigmasterol
Rata de ncorporare pentru stigmasterol este de 150 g de
stigmasterol, cu o puritate de cel puin 95 %, pe o ton de unt, respectiv
142,5 mg/kg, sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puin 85 %, pe o
ton de unt, respectiv 144,5 mg/kg.
Rezultatele pentru cele trei probe obinute n urma analizei
produsului se utilizeaz la verificarea ratei i a omogenitii de ncorporare a
- 115,8 mg/kg (rat de ncorporare minim de 95 % pentru
stigmasterol cu o puritate de 95 %);
stigmasterol cu o puritate de 85 %).
prin interpolare ntre 115,8 mg/kg i 80,1 mg/kg sau ntre 117,7 mg/kg
i 81,5 mg/kg.
b) Sitosterol
Rata de ncorporare pentru sitosterol este de 600 g de
sitosterol, cu o puritate de cel puin 90 %, pe o ton de unt, respectiv
540 mg/kg.
produsului se folosesc pentru verificarea ratei i omogenitii de ncorporare a
sitosterol cu o puritate de 90 %);
sitosterol cu o puritate de 90 %).
3) Unt concentrate
a) Stigmasterol
Rata de ncorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o
puritate de cel puin 95 %, pe o ton de unt concentrat, respectiv 142,5 mg/kg; sau
de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puin 85 %, pe o ton de unt
concentrat, respectiv 144,5 mg/kg.
stigmasterol cu o puritate de 85 %).
prin interpolare ntre 118,5 mg/kg i 82,9 mg/kg sau ntre 120,4 mg/kg
i 84,3 mg/kg.
b) Sitosterol
Rata de ncorporare pentru sitosterol este de 600 g de
sitosterol, cu o puritate de cel puin 90 %, pe o ton de unt concentrat,
respectiv 540 mg/kg.
sitosterol cu o puritate de 90 %);
sitosterol cu o puritate de 90 %).
Anexa nr. 9
Metod de referin pentru detectarea laptelui de vac i a

cazeinatului n brnzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capr sau lapte
de bivoli sau din amestecuri de lapte de oaie, capr i bivoli
1. Obiectul
Detectarea laptelui de vac i a cazeinei n brnzeturile produse din lapte de
oaie, lapte de capr, lapte de bivoli sau din amestecuri de lapte de oaie, capr i
bivoli prin focalizarea izoelectric a -cazeinelor dup plasminoliz.
2. Domeniul de aplicare
Aceast metod poate fi folosit pentru detectarea sensibil i specific a
laptelui de vac natural i tratat termic i a cazeinatului n brnzeturile proaspete i
maturate produse din lapte de oaie, lapte de capr, lapte de bivoli sau din
amestecuri de lapte de oaie, capr i bivoli. Nu poate fi folosit pentru detectarea
falsificrii laptelui i a brnzei cu concentrate de proteine de zer de bovine tratate
termic.
3. Principiul metodei
1) Izolarea cazeinei din brnz i din probele de referin
2) Dizolvarea cazeinelor izolate i tratarea acestora prin clivare plasminic
3) Focalizarea izoelectric a cazeinelor tratate cu plasmin n prezena ureii i
colorarea proteinelor
4) Evaluarea benzilor colorate de 2- i 3-cazein (dovezi ale prezenei laptelui
de vac) prin compararea benzilor obinute din prob cu benzile obinute pe
acelai gel din probele de referin coninnd 0 % i 1 % lapte de vac
4. Reactivi
n afara cazurilor n care se precizeaz altceva, produsele chimice utilizate
trebuie s fie de puritate analitic. Apa folosit trebuie s fie dublu-distilat sau de
o puritate echivalent.
Not: Urmtoarele detalii se aplic gelurilor de poliacrilamide cu coninut de
uree preparate n laborator, cu dimensiunile de 265 125 0,25 mm. n cazul n
care se folosesc geluri de alte dimensiuni sau tipuri, poate fi necesar modificarea
condiiilor de separare.
Focalizarea izoelectric
1) Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu coninut de uree
a) Soluie stock de gel
Se dizolv n ap:
4,85 g acrilamid
0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamid (BIS)
48,05 g uree
15,00 g glicerol (87 % m/m)
i se completeaz cu ap pn la 100 ml, apoi se pstreaz produsul obinut n

refrigerator, ntr-un recipient de sticl de culoare maro.
Not: n locul cantitilor fixe de acrilamide neurotoxice menionate mai sus se
poate folosi o soluie de acrilamid/BIS prefabricat disponibil n comer. n cazul
n care o asemenea soluie conine 30 % m/v acrilamid i 0,8 % m/v BIS,
cantitile de acrilamid i BIS din preparatul de mai sus se nlocuiesc cu 16,2 ml
de soluie. Termenul de valabilitate a soluiei stock este de maximum 10 zile; n
cazul n care conductibilitatea acesteia este mai mare de 5 S, se deionizeaz
substana prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 minute, ulterior se
filtreaz printr-o membran de 0,45 m.
b) Soluia de gel
Se prepar o soluie de gel amestecnd aditivii i amfoliii cu soluia stock de
gel.
9,0 ml soluie stock
24 mg -alanin
500 l amfolit pH 3,5-9,5
250 l amfolit pH 5-7
250 l amfolit pH 6-8

Se amestec soluia de gel i se degazeific timp de dou sau trei minute ntr-o
baie ultrasonic sau sub vid.
Not: Soluia de gel se prepar imediat nainte de a o turna (punctul 6,
subpunctul 2)).
c) Soluii catalizator
N, N, N' N' tetrametiletilendiamin (Temed)
40 % m/v persulfat de amoniu (PER):
Se dizolv 800 mg PER n ap i se completeaz cu ap pn la 2 ml.
Not: A se folosi ntotdeauna soluie PER proaspt preparat.
2) Fluid de contact - kerosen sau parafin lichid
3) Soluie anodic
Se dizolv n ap 5,77 g acid fosforic (85 % m/m) i se dilueaz pn la 100 ml.
4) Soluie catodic
Se dizolv n ap 2,00 g hidroxid de sodiu i se dilueaz pn la 100 ml.
Prepararea probei
5) Reactivi pentru izolarea proteinelor
a) Se dilueaz acid acetic (25,0 ml acid acetic cristalizabil completat cu ap
pn la 100 ml)
b) Diclorometan
c) Aceton
6) Soluie tampon de dizolvare a proteinelor
Se dizolv n ap:
5,75 g glicerol (87 % m/m)
24,03 g uree
250 mg ditiotreitol
i se completeaz cu ap pn la 50 ml.
Not: Se pstreaz substana n refrigerator, termen de valabilitate: maximum o

sptmn.
7) Reactivi pentru clivarea plasminic a cazeinelor
a) Soluie tampon de carbonat de amoniu
Se titreaz pn la pH 8 o soluie de hidrogencarbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,58
g/100 ml ap) coninnd acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA,
1,46 g/100 ml) cu o soluie de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml ap)
coninnd 0,05 mol/l EDTA.
b) Plasmin bovin, cu activitate de minimum 5 U/ml
c) Soluie de acid -aminocaproic pentru inhibarea enzimelor
Se dizolv 2,624 g acid -aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) n 100 ml de
etanol 40 % (v/v).
8) Standarde
a) Amestecuri de lapte nchegat de oaie i capr cu coninutul de 0 %,
respectiv 1 % lapte de vac.
b) Prepararea probelor de referin provizorii de laborator din lapte de
bivoli nchegat coninnd 0 % i 1 % lapte de vac.
Laptele degresat se prepar prin centrifugarea laptelui crud de bivoli sau de
vac n vrac la 37 C (2 500 g, timp de 20 minute). Dup rcirea rapid a tubului i
a coninutului la 6-8 C, stratul superior de grsime se ndeprteaz n totalitate.
Pentru prepararea probei etalon 1 % se adaug 5,00 ml de lapte de vac degresat la
495 ml lapte de bivoli degresat ntr-un vas de 1 l, se ajusteaz pH-ul la 6,4 prin
adugarea de acid lactic diluat (10 % m/v). Se ajusteaz temperatura la 35 C i se
adaug 100 l de cheag de viel, se amestec timp de 1 minut, apoi se acoper
vasul cu o folie de aluminiu i se las la 35 C timp de 1 or pentru a se putea
forma coagulul. Dup formarea acestuia, laptele nchegat este liofilizat n
ntregime fr omogenizare prealabil i fr a se extrage zerul. Dup liofilizare,
produsul se zdrobete pn se obine o pulbere fin omogen. Pentru prepararea
probei etalon 0 %, se urmeaz aceeai procedur folosind lapte degresat de bivoli
veritabil. Probele trebuie pstrate la 20 C.
Not: naintea preparrii probelor etalon, se recomand verificarea puritii
laptelui de bivoli prin focalizarea izoelectric a cazeinelor tratate cu plasmin.
Reactivi pentru colorarea proteinelor
9) Fixativ
Se dizolv n ap 150 g acid tricloroacetic i se completeaz cu ap pn la
1 000 ml.
10) Soluie pentru decolorare
Se dilueaz n ap distilat pn la 2 000 ml 500 ml metanol i 200 ml acid
acetic cristalizabil.
Not: Se prepar zilnic o soluie proaspt de decolorare; soluia poate fi
preparat prin amestecarea de volume egale de soluii stock metanol 50 % (v/v)
i acid acetic cristalizabil 20 % (v/v).
11) Soluii pentru colorare
a) Soluie pentru colorare (soluie stock 1)
Se dizolv 3,0 g Albastru Briliant de Coomassie G-250 n 1 000 ml metanol
90 % (v/v) folosind un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 minute), apoi se
filtreaz prin dou filtre pliate de vitez medie.
b) Soluie pentru colorare (soluie stock 2)
Se dizolv 5,0 g sulfat de cupru pentahidrat n 1 000 ml acid acetic 20 % (v/v).
c) Soluie pentru colorare (soluie de lucru)
Se amestec 125 ml din fiecare soluie stock imediat nainte de colorare.
Not: Se recomand prepararea soluiei de colorare n ziua folosirii acesteia.
5. Aparatur
1) Plci de sticl (265 125 4 mm); rol de cauciuc (lime
15 cm); mas reglabil
2) Foaie susintoare de gel (265 125 mm)
3) Foaie de acoperire (280 125 mm). Se lipete o bucat de
band adeziv (280 6 0,25 mm) pe fiecare latur lung (figura 1)
Figura 1. Schia foii de acoperire
4) Cuv de electrofocalizare cu plac de rcire cu unitate de
alimentare electric adecvat ( 2,5 kV) sau cu aparat
automat de electroforez
5) Criostat de circulaie controlat termostatic la 12 0,5 C
6) Centrifug ajustabil la 3 000 g
7) Benzi de electrozi (lungime 265 mm)
8) Sticle picurtoare de plastic pentru soluiile anodice i catodice
9) Aplicatoare de probe (10 5 mm, vscoz sau hrtie de
filtru cu absorbie redus a proteinelor)
10) Foarfeci, scalpele i pensete din oel inoxidabil
11) Cuve din oel inoxidabil pentru colorare i decolorare
12) Omogenizator ajustabil cu tij (diametrul tijei 10 mm),
vitez de rotaie 8 000-20 000 rpm
13) Agitator magnetic
14) Baie ultrasonic
15) Aparat de sudur a foliilor
16) Micropipete de 25 l
17) Concentrator sub vid sau liofilizator
18) Baie de ap cu agitator, controlat termostatic i ajustabil la
35 i 40 1 C
19) Echipament de densitometrie cu citire la = 634 nm
6. Procedur
1) Prepararea probei
a) Izolarea cazeinelor
Se cntrete ntr-un tub de centrifug de 100 ml echivalentul a 5 g materie
uscat de brnz sau prob de referin, se adaug 60 ml ap distilat i se
omogenizeaz cu un omogenizator cu tij (8 000-10 000 rpm). Se ajusteaz la un
pH de 4,6 cu o soluie de acid acetic diluat i se pune n centrifug (5 minute,
3 000 g). Se decanteaz grsimea i zerul, se omogenizeaz reziduul la 20 000 rpm
n 40 ml ap distilat ajustat la un pH de 4,5 cu soluie de acid acetic diluat, se
adaug 20 ml diclorometan, se omogenizeaz din nou i se pune n centrifug (5
minute, 3 000 g). Se ndeprteaz cu o spatul stratul de cazein care se afl ntre
faza apoas i cea organic (figura 2) i se elimin ambele faze. Se
reomogenizeaz cazeina n 40 ml ap distilat i n 20 ml diclorometan, apoi se
pune n centrifug. Se repet procedura pn cnd ambele faze extrase sunt
incolore (de dou sau trei ori). Se omogenizeaz reziduul de protein cu 50 ml
aceton i se filtreaz printr-o hrtie de filtru pliat de vitez medie. Se spal de
fiecare dat reziduul de pe filtru cu cte dou porii separate de 25 ml aceton i se
las s se usuce n aer sau sub jet de azot, apoi se transform n pulbere ntr-un
mojar.
Figura 2. Strat de cazein plutind dup centrifugare ntre faza apoas i faza
organic.
Not: Cazeina izolat uscat trebuie pstrat la 20 C.
b) Clivarea plasminic al -cazeinelor pentru intensificarea -cazeinelor
Se prepar o suspensie de 25 mg cazeine isolate (subpunctul 1 din prezentul
punct) n 0,5 ml soluie tampon de carbonat de amoniu i se omogenizeaz timp de
20 minute folosind, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se nclzete la 40 C i se
adaug 10 l plasmin, apoi se amestec i se incubeaz timp de o or la 40 C,
agitnd continuu. Pentru a inhiba enzimele se adaug 20 l soluie de acid -
aminocaproic, apoi se adaug 200 mg uree solid i 2 mg ditiotreitol.
Not: Pentru a obine o simetrie mai mare a benzilor cazeinice focalizate se
recomand liofilizarea soluiei dup adugarea acidului -aminocaproic i
dizolvarea reziduurilor n 0,5 ml soluie tampon pentru dizolvarea proteinelor.
2) Prepararea gelurilor poliacrilamide care conin uree
Cu ajutorul ctorva picturi de ap se ntinde foaia susintoare de gel pe o
plac de sticl, ndeprtndu-se surplusul de ap cu un erveel. Se ntinde n mod
similar foaia de acoperire cu spaiatoare (0,25 mm) pe o alt plac de sticl. Se
aeaz placa orizontal pe masa reglabil.
Se adaug 10 l Temed la soluia de gel degazeificat pregtit, se amestec i
se adaug 10 l soluie PER, se amestec bine i se toarn imediat amestecul ntr-
un strat egal pe centrul foii de acoperire. Se pune o margine a plcii susintoare de
gel (cu faa foii ndreptat n jos) pe placa de acoperire i se coboar ncet, astfel
nct ntre foi s se formeze un strat subire de gel care s se ntind uniform i fr
bule (figura 3). Se coboar cu grij pn la capt placa susintoare de gel, folosind
o spatul subire, apoi se aeaz nc trei plci de sticl deasupra, pentru a aciona
ca greutate. Dup ncheierea polimerizrii (aproximativ 60 minute), se transfer
gelul polimerizat mpreun cu foaia de acoperire pe foaia susintoare de gel,
nclinnd plcile de sticl. Se cur cu grij spatele foii susintoare de gel pentru
a elimina reziduurile de gel i de uree. Se sudeaz marginile sandviului de gel,
astfel nct s se obin un tub i se pstreaz n refrigerator (timp de maximum
ase sptmni).
Figura 3. Tehnic de pliere pentru obinerea straturilor foarte fine de geluri
poliacrilamide
a - band adeziv pentru spaiere (0,25 mm);
b - foaie de acoperire;
c, e - plci de sticl;
d - soluie de gel;
f - foaie susintoare de gel
Not: Foaia de acoperire i spaiatoarele pot fi refolosite. Gelul de
poliacrilamid poate fi tiat la dimensiuni mai mici, aciune care este recomandat
n cazul n care exist puine probe sau n cazul n care se folosete un aparat
automat de electroforez (dou geluri format 4,5 5 cm).
3) Focalizarea izoelectric
Se regleaz termostatul de rcire la 12 C. Se terge cu kerosen spatele foii
susintoare de gel, apoi se picur cteva picturi de kerosen pe centrul blocului de
rcire. Se ruleaz apoi pe el sandviul de gel, cu partea susintoare de gel
ndreptat n jos, avnd grij s se evite formarea bulelor. Se terge excesul de
kerosen i se ndeprteaz foaia de acoperire. Se mbib benzile de electrozi n
soluiile electrolitice, se taie dup lungimea gelului i se plaseaz n poziia
prevzut (distana dintre electrozi de 9,5 cm).
Condiii pentru focalizarea izoelectric:
Dimensiunile gelului 265 125 0,25 mm
Etap
Timp Tensiune Intensitate Putere Voli
or
(min (V) (mA) (W)
) (Vh)
1. Prefocaliz 30 maximum maximum constant 4 c. 300
are 2 500 15
2. Focalizare 60 maximum maximum constant 4 c.
a probei ( )
1
2 500 15 1 000
3. Focalizare 60 maximum maximum maximum c.
a final 2 500 5 20 3 000
40 maximum maximum maximum c.
2 500 6 20 3 000
30 maximum maximum maximum c.
2 500 7 25 3 000
( ) Aplicarea probei: Dup prefocalizare (etapa 1), se picur 18 l
1
din proba i din soluiile standard pe aplicatorii probei (10 5 mm), se plaseaz
aplicatorii pe gel la distan de 1 mm unul de cellalt i la 5 mm longitudinal fa de
anod i se apas uor. Procedura de focalizare se finalizeaz n condiiile
specificate mai sus, ndeprtnd cu grij aplicatorii probei dup 60 minute de
focalizare a probei.
Not: n cazul n care se modific grosimea sau limea gelurilor, atunci
intensitatea i puterea curentului trebuie ajustate n consecin.
4) Colorarea proteinelor
a) Fixarea proteinelor
Se ndeprteaz benzile de electrozi imediat dup stingerea aparatului i se
plaseaz imediat gelul ntr-o cuv de colorare/decolorare umplut cu 200 ml
fixativ; se las acolo timp de 15 minute, agitnd n continuu.
b) Splarea i colorarea plcii de gel
Se scurge cu grij fixativul i se spal placa de gel de dou ori, timp de cte 30
de secunde, cu 100 ml soluie decolorant. Se decanteaz soluia decolorant i se
umple cuva cu 250 ml soluie colorant; se las 45 minute s se coloreze, agitndu-
se uor cuva.
c) Decolorarea plcii de gel
Se decanteaz soluia colorant, se spal placa de gel de dou ori, cu cte
100 ml soluie decolorant, apoi se agit timp de 15 minute cu 200 ml soluie
decolorant i se repet pasul de decolorare de cel puin dou-trei ori, pn cnd
fundul vasului este curat i incolor. Se cltete apoi cu ap distilat placa de gel
(2 2 minute) i se usuc la aer (2-3 ore) sau cu un usctor de pr (10-15 minute).
Nota 1: Fixarea, splarea, colorarea i decolorarea se efectueaz la 20 C. A nu
se folosi temperaturi ridicate.
Nota 2: n cazul n care se prefer colorarea mai sensibil cu argint, probele de
cazein tratate cu plasmin trebuie diluate la 5 mg/ml.
7. Evaluare
Evaluarea este efectuat prin compararea benzilor de proteine ale probei
necunoscute cu probele de referin efectuate pe acelai gel. Detectarea laptelui de
vac n brnzeturile din lapte de oaie, lapte de capr i lapte de bivoli i n
amestecurile de lapte de oaie, capr i bivoli se face prin intermediul 3- i 2-
cazeinelor, ale cror puncte izoelectrice se afl n intervalul pH 6,5-pH 7,5 (figurile
4a, 4b i 5). Limita de detecie este mai mic de 0,5 %.
Figura 4a. Focalizare izoelectric a cazeinelor tratate cu plasmin din brnz
din lapte de oaie i de capr care conine diferite cantiti de lapte de vac.
% CM = procentaj lapte de vac;
C = vac;
E = oaie;
G = capr.
Este ilustrat jumtatea de sus a gelului IEF.
Figura 4b. Focalizare izoelectric a cazeinelor tratate cu plasmin din brnz

din amestec de lapte de oaie, capr i bivoli care conine diferite cantiti de lapte
de vac.
% CM = procentaj lapte de vac;
1 + = prob coninnd 1 % lapte de vac i dopat cu cazein pur de lapte de

vac la mijlocul traiectului gelului.
C = vac;
E = oaie;
G = capr;
B = bivoli.
Este ilustrat distana separatoare total a gelului IEF.
Figura 5. Suprapunerea densitogramelor probelor etalon (STD) i a probelor de

brnz preparate din amestec de lapte de oaie i de capr dup focalizarea
izoelectric
a, b - probe etalon coninnd 0, respectiv 1 % lapte de vac;
c-g - probe de brnz coninnd 0, 1, 2, 3 i 7 % lapte de vac.
C - vac;
E - oaie;
G - capr.
Jumtatea superioar a gelului IEF a fost scanat la = 634 nm.
1) Estimare vizual
Pentru evaluarea vizual a cantitii de lapte de vac se recomand ajustarea
concentraiilor probelor i a probelor etalon pentru a obine acelai nivel de
intensitate a 2- i 3-cazeinelor din laptele de ovine, caprine i/sau bivolie (a se
vedea 2 E, G, B i 3 E, G, B din figurile 4 a i 4 b i din figura 5). Dup
aceasta, nivelul de lapte de vac (mai mic dect, egal cu sau mai mare de 1 %) din
proba necunoscut poate fi estimat direct, prin compararea intensitii 3- i 2-
cazeinelor din laptele de vac (a se vedea 3 C i 2 C din figurile 4 a, 4 b i 5)
cu cea a probelor de referin de 0 % i 1 % (oaie, capr) sau cu standardele
provizorii de laborator (bivoli).
2) Estimare densitometric
n cazul n care este disponibil, se aplic densitometria pentru determinarea
raportului dintre suprafaa vrfurilor 2- i 3-cazeinelor din laptele de vac,
respectiv din laptele de oaie, capr i/sau bivoli (figura 5). Aceast valoare se
compar cu raportul dintre suprafaa vrfurilor 2- i 3-cazeinelor pentru proba de
referin 1 % (oaie, capr) sau pentru standardul provizoriu de laborator (bivoli),
analizate pe acelai gel.
Not: Metoda funcioneaz corespunztor n cazul n care se obine un semnal
pozitiv clar pentru ambele cazeine bovine 2- i 3- din proba de referin 1 %, dar
nu i din proba de referin 0 %. Dac nu, procedura trebuie mbuntit
respectndu-se cu exactitate detaliile metodei.
O prob este considerat pozitiv n cazul n care ambele cazeine bovine 2- i
3- sau raportul suprafeei vrfurilor corespunztor sunt mai mari sau egale cu
nivelul din proba de referin 1 %.
Anexa nr. 10
Metod de referin pentru detectarea bacteriilor coliforme din unt, lapte

praf degresat, cazein i cazeinai
1. Prepararea probelor
Standardul SM SR EN ISO 6887-5.
2. Procedur
Standardul SM ISO 4831.
Se inoculeaz probe de 1 g de unt sau de 0,1 g de lapte praf degresat sau

cazein/cazeinai n mediul de cultur.
Se inoculeaz trei tuburi pentru fiecare prob.
3. Rezultate
n cazul n care cele 3 tuburi produc 3 rezultate negative, rezultatul este

conform
n cazul n care cele 3 tuburi produc 2 sau 3 rezultate pozitive, rezultatul este
neconform
n cazul n care cele 3 tuburi produc 2 rezultate negative, analiza se repet (cu
dou tuburi)
1) n cazul n care cele 2 rezultate sunt negative, rezultatul este conform
2) n cazul n care cel puin 1 rezultat este pozitiv, rezultatul este neconform
Anexa nr. 11

Determinarea lactozei n furajele combinate
Determinarea lactozei n furajele combinate.

2. Referine
Coninutul de lactoz se definete ca procent de mas determinat prin procedura

descris.
3. Definiie
Coninutul de lactoz anhidr se exprim n g per 100 g.
4. Principiu
Furajul compus se reconstituie cu ap. Se adaug soluie Biggs la o parte

alicot cntrit diluat pentru precipitarea grsimii i a fraciunilor componente
ale proteinei furajului combinat. Proba este filtrat (sau centrifugat) i filtratul
(sau supernatantul) este injectat printr-o coloan HPLC de schimb de cationi n
forma de plumb folosind ap de calitate HPLC ca faz mobil. Lactoza eluat este
detectat cu un refractometru i diferenial.
5. Reactivi
1) Generaliti
Se folosesc numai reactivi de calitate analitic recunoscut, cu excepia

cazurilor n care se precizeaz altceva, i ap de calitate HPLC degazat.
2) Lactoz
Monohidratatul de D-Lactoz [(C12H22)O11. H2O] poate prelua umezeala

suplimentar. nainte de folosire, se msoar cantitatea real de ap cu titratorul
Karl-Fisher sau se elimin umezeala suplimentar plasnd lactoza ntr-un cuptor la
105 C, timp de 8 ore.
3) Soluie concentrat Biggs/Szijarto
Se dizolv 9,10 g dihidrat de acetat de zinc [Zn(CH3COO)2.2H2O] i 5,46 g de

acid fosfotungstic monohidrat (H3[P(W3O10)4.xH2O]) n aproximativ 70 ml cu ap
de calitate HPLC ntr-un balon cotat de 100 ml.
Se adaug 5,81 ml acid acetic glacial (CH3COOH). Se dilueaz pn la nivelul

de 100 ml cu ap de calitate HPLC i se amestec. Soluia poate fi depozitat la
temperatura camerei pentru o perioad de 1 an.
4) Soluie diluat Biggs/Szijarto
Se dilueaz 25 ml de soluie concentrat Biggs/Szijarto cu ap pn la nivelul

de 500 ml folosind un balon cotat. Soluia poate fi depozitat la temperatura
camerei pentru o perioad de 1 lun.
5) Prepararea apei de calitate HPLC
Se filtreaz ap ultra pur folosind sistemul de filtrare cu vid. Pentru a

mbunti performana pompei i pentru a obine o linie de baz stabil, se
degazific zilnic faza mobil optnd pentru una dintre tehnicile disponibile, cum ar
fi splarea cu heliu, dezintegrarea, sistemul de degazificare n vid sau n linie.
Not: Pentru a prelungi viaa coloanei este esenial ca procentul de bioxid de

carbon al eluantului s fie ct mai mic posibil i s fie mpiedicat o reabsorbie.
6. Aparatur
Aparatur obinuit de laborator i, n special, urmtoarele:
1) Coloan de plastic pentru schimb ioni HPLC
Umplerea coloanei: copolimer polistiren-divinilbenzen cu legtur ntre catene

8 %, funcionalizat cu grupuri de schimb de cationi n form de plumb.
Dimensiunile coloanei: lungimea 300 mm, diametrul interior aproximativ

8 mm.
Este posibil i utilizarea altor diametre, cu condiia ca debitul s fie reglat n

mod corespunztor.
2) Coloan de control
Coloana de control este o combinaie ntre un schimbtor de cationi separat

+
(H ) i un schimbtor de anioni (CO3-), fiecare introdus n coloane de aproximativ
30 mm 4,6 mm (L ID) i conectat n serie sau sub forma unui strat combinat
constnd din AG 50W-X4, 400 ochiuri de sit (H+) i AG3-X4A, 200-400 ochiuri
de sit (OH-) n raportul de 35:65 (m/m) umplute manual ntr-o coloan de
aproximativ 20 9 mm (L ID).
3) Cuptorul de coloan
Cuptor capabil s menin o temperatur constant de 85 C 1 C.
4) Pompa de HPLC
Pomp capabil s genereze un debit constant (fluctuaii < 0,5 %) la 0,2-

1,0 m/min.
5) Dispozitiv de injectare a HPLC
Autosond capabil s injecteze 25 L i avnd o repetabilitate < 0,5 %.

Ca soluie alternativ poate fi folosit un dispozitiv manual.
6) Detector de HPLC
Detector de index refractant de mare sensibilitate avnd un zgomot < 5.10 -9 RI

uniti.
7) Integrator
Software sau un integrator dedicat pentru a realiza strngerea datelor,

procesarea i generarea suprafeei vrfurilor i a nlimilor vrfurilor, care pot fi
transformate n concentraii de lactoz.
8) Unitate de purificare a apei
Sistem capabil s furnizeze ap foarte pur avnd o rezistivitate >14 M.cm.
9) Unitate de filtrare a solventului
Sistem care asigur filtrarea apei folosind un filtru cu membran filtrant cu

diametrul porilor de 0,45 m.
Not: Multe uniti de purificare a apei au o unitate de filtrare integrat de 0,45

sau de 0,2 m. Se poate renuna la o filtrare suplimentar dac aceast ap este
folosit direct.
10) Balan analitic
Balan avnd un afiaj de 0,1 mg.
11) Baie de ap
Baie de ap capabil s menin o temperatur de 40 C (0,5).
12) Centrifug
Avnd o capacitate de generare de cel puin 3 000 g pentru eprubete Eppendorf

sau echivalente sau pentru tipuri mai mari de eprubete.
13) Balon cotat de 50 mL
Capacitate de 50 mL, clasa A.
Not: Pot fi folosite i baloane de alt capacitate innd cont de factorul volum.
14) Balon cotat de 100 mL

Capacitate de 100 mL, clasa A.
15) Pipet gradat
Pipet gradat de 10 mL.
Not: Ca soluie alternativ, se poate folosi un picurtor manual cu o capacitate

de 5 mL, adugnd un volum dublu de 5 mL de reactiv (punctul 5, subpunctul 3).
Este important ca laboratorul s primeasc o prob prelevat conform SM SR

EN 707 care s fie cu adevrat reprezentativ i care s nu fi fost deteriorat n
timpul transportului sau pe durata depozitrii.
8. Prepararea soluiei etalon de lactoz
1) Etalon 1
Se dizolv o cantitate cntrit exact (cu indicaii de 0,1 mg) de aproximativ

50 mg monohidrat de lactoz ntr-un balon cotat de 100 mL i se completeaz cu
ap pn la marcaj.
2) Etalon 2
Se dizolv o cantitate cntrit exact (cu indicaii de 0,1 mg) de aproximativ

100 mg monohidrat de lactoz ntr-un balon cotat de 100 mL i se completeaz cu
ap pn la marcaj.
Not: Soluiile etalon pot fi depozitate pentru maximum 1 sptmn, la

aproximativ 5 C.
9. Prepararea probei pentru analiz
1) Reconstituirea probei
Se cntresc aproximativ 5 g de lapte praf ntr-un balon de 50 mL i se noteaz

greutatea cu o precizie de 1 mg [W1, (11)]. Se adaug 50 mL de ap i se noteaz
creterea de greutate [W2, (11)] cu o precizie de 0,01 g. Se aaz balonul nchis n
baia de ap timp de 30 min. i se rstoarn de cteva ori n aceast perioad. Apoi
se las s se rceasc la temperatura camerei.
2) Tratarea probei
Se ia aproximativ 1 g din aceast soluie i se pune ntr-un balon cotat de

50 mL, se noteaz greutatea cu o precizie de 1 mg [W3 (11)], se adaug 20 mL de
ap, dup care se adaug 10 mL de reactiv diluat Biggs/Szijarto, completai cu ap
pn la marcaj. Balonul se rstoarn uor de 5 ori n timpul primelor 30 de minute.
Dup 1 or, se ia o parte alicot i se centrifugheaz la 3 000 g timp de 10 min.

(poate fi folosit o g mai mare ntr-o perioad de timp micorat n mod
corespunztor). Se folosete o cot alicot de supernatant pentru analiza HPLC.
10.Determinarea HPLC
1) Prepararea preliminar a HPLC
a) Instalarea coloanei i a precoloanei
Se intaleaz precoloana (punctul 6, subpunctul 2) n afara cuptorului de

coloan (punctul 6, subpunctul 3) i coloana (punctul 6, subpunctul 1) n cuptor.
Not: n cazul n care cuptorul nu conine evi pentru prenclzirea eluantului,

este necesar ca eluantul s treac prin aproximativ 15 cm de eav de oel
inoxidabil n cuptor, nainte de a intra n coloan (este absolut necesar ca eluantul
s se fi nclzit nainte de a intra n coloan, altfel va avea loc o cretere a
suprafeei vrfului).
b) Detectorul i fluxul iniial
Pentru a obine o linie de baz stabil, detectorul de HPLC se pune n

funciune cu cel puin 24 de ore nainte de a ncepe analiza. Se stabilete
temperatura interioar a detectorului la 35 C. Se stabilete debitul la 0,2 ml/min.
(punctul 6, subpunctul 4) pentru cel puin 20 min., n timp ce cuptorul de coloan
este reglat la temperatura camerei.
c) Cuptorul de coloan i debitul final
Se regleaz cuptorul de coloan la 85 C. Cnd se atinge aceast temperatur,

se crete, dup 30 de minute, treptat, debitul de la 0,2 ml/min. la 0,6 ml/min.
(punctul 6, subpunctul 4). Se las sistemul s ajung n echilibru cu acest debit i la
85 C, timp de 2 ore sau pn se obine o linie de baz stabil.
d) Integrarea
Se aleg cu grij parametrii de colectare a datelor i integrare (punctul 6,

subpunctul 7), cum ar fi estimarea datelor, sensibilitatea, constanta de timp, limea
vrfului i pragul.
Timpul de retenie al lactozei este de aproximativ 11 minute.
Not: Multe programe software de strngere de date (punctul 6, subpunctul 7)

permit o msurare uoar a numrului de plac teoretic. Se msoar numrul de
plac teoretic al etalonului 1 n mod normal i se nlocuiete coloana (punctul 6,
subpunctul 1) cnd numrul de plac este cu 25 % mai mic dect cel al valorii
iniiale a unei noi coloane.
e) Testarea coloanei de control
Se verific regulat (cel puin o dat la fiecare ciclu de analiz) capacitatea

coloanei de control de a elimina srurile din prob prin injectarea a 25 L de
soluie 0,05 % de clorur de sodiu. De fiecare dat cnd apar vrfuri, coloana de
control trebuie schimbat.
2) Prelucrarea etaloanelor
Se injecteaz, la nceputul fiecrei serii de analize, 25 L (punctul 6,

subpunctul 7) din etalonul 1 i apoi din etalonul 2. Aceast operaiune se repet la
fiecare 10-20 de probe i, de asemenea, la sfritul ciclului.
3) Prelucrarea probelor
Se injecteaz 25 L de supernatant (punctul 9, subpunctul 2) din prob.
11. Calcularea i exprimarea rezultatelor
1) Calibrare
n mod normal, nlimile vrfurilor sunt folosite pentru a calcula rezultatele,

totui, dac semnalul conine prea mult zgomot, se poate folosi suprafaa vrfului
(cuantificarea n cazul nlimii vrfului este mai puin influenat de vrfurile
componentelor n concentraie mic i care sunt separate n parte, dar nu suficient,
de vrful lactozei).
Cu ajutorul software-ului (punctul 6, subpunctul 7) trebuie s se calculeze o

curb liniar de etalonare ce trece forat prin origine. Se verific curba pentru a
identifica posibila neliniaritate (neliniaritatea poate fi provocat de o greeal n
pregtirea etaloanelor 1 sau 2 , de o integrare greit i, mai puin probabil, de o
funcionare necorespunztoare a injectorului).
Se folosesc ca date de introducere concentraiile de lactoz calculate n mg/mL

ale etaloanelor 1 i 2 , cum ar fi lactoza fr ap.
nclinarea (RF) a liniei de calibrare este definit de raportul

suprafa/concentraie n mg/mL.
2) Probe
Rezultatul analizei este obinut n g/100 g i este calculat folosind software-ul

(punctul 6, subpunctul 7) sau folosind urmtoarea formul:
H x ( W 1+ W 2 ) x 50
C= x 0,1
RF x W 1 x W 3
unde:
C - concentraia lactozei n g/100 g lapte praf;
H - nlimea vrfului de lactoz al probei;
RF - factorul de rspuns (sau nclinarea) curbei de calibrare n mV/mg/mL;
W1 - greutatea probei de lapte praf n g (punctul 9, subpunctul 1);
W2 - greutatea apei adugat n g la proba de lapte praf (punctul 9, subpunctul

1);
W3 - greutatea probei din soluia reconstituit de lapte praf n g (punctul 9,

subpunctul 2);
50 - volumul balonului cotat folosit n (punctul 9, subpunctul 2);
0,1 - conversia rezultatului n g/100 g.
12. Precizia
Se poate ca valorile obinute prin aceast prob interlaboratoare s nu fie

aplicabile la valorile i matricele de concentraie altele dect cele date. Valorile
pentru repetabilitate i reproductibilitate vor fi derivate din rezultatul unei probe
interlaboratoare realizate conform cu SM SR ISO 5725-1.
1) Repetabilitate
Diferena absolut dintre rezultatele a dou probe individuale, obinute prin

folosirea aceleiai metode pe material de prob identic n acelai laborator, cu
acelai operator, folosind aceeai aparatur, ntr-un interval scurt de timp, nu va
depi, n peste 5 % din cazuri, xxx (care va fi determinat printr-o prob realizat
n comun).
Diferena absolut ntre dou rezultate de probe individuale, obinute folosind

aceeai metod, pe material de prob identic, n laboratoare diferite, cu diferii
operatori, folosind aparatur diferit, nu va depi, n peste 5 % din cazuri,
0,5 g/100 g (care va fi determinat printr-o prob realizat n comun).
Anexa nr. 12
Detectarea zerului praf din laptele praf degresat destinat depozitrii publice
prin determinarea cromatografiei lichide de nalt performan a
cazeinomacropeptidelor (HPLC)
Aceast metod permite detectarea zerului nchegat din laptele praf degresat
destinat depozitrii publice prin determinarea cazeinomacropeptidelor.
2. Referine
Standardul SM SR EN ISO 707:2012 Lapte i produse lactate. Ghid pentru

eantionare.
3. Definiie
Coninutul de substane solide din zer nchegat se definete ca procent de mas

determinat de coninutul de cazeinomacropeptide prin procedura descris.
4. Principiu
1) Reconstituirea laptelui praf degresat, ndeprtarea grsimilor i proteinelor

cu acid tricloroacetic, urmat de centrifugare sau filtrare.
2) Determinarea cantitii de cazeinomacropeptide (CMP) din supranatant prin

cromatografie lichid de nalt performan (HPLC).
3) Evaluarea rezultatelor obinute pentru probe fa de probe etalon formate din

lapte praf degresat cu sau fr adugarea unui procent cunoscut de zer praf.
5. Reactivi

1) Soluie de acid tricloroacetic
Se dizolv 240 g de acid tricloroacetic (CCl3COOH) n ap i se completeaz

pn la 1 000 ml. Soluia trebuie s fie limpede i incolor.
2) Soluie eluant, pH 6,0
Se dizolv 1,74 g de fosfat dipotasic (K2HPO4), 12,37 g de fosfat monopotasic

(KH2PO4) i 21,41 g de sulfat de sodiu (Na2SO4) n aproximativ 700 ml de ap. n
cazul n care este necesar, se ajusteaz cu ajutorul unei soluii de acid fosforic sau
hidroxid de potasiu pn la obinerea unui pH de 6,0.
Se completeaz cu ap pn la 1 000 ml i se omogenizeaz.
Not: Compoziia eluantului poate fi actualizat pentru a respecta certificatul

standardelor sau recomandrile productorului de pe ambalajul coloanei.
Soluia eluant se filtreaz nainte de folosire printr-o membran filtrant cu

diametrul porilor de aproximativ 0,45 m.
3) Solvent de splare
Se amestec un volum de acetonitril (CH3CN) cu nou volume de ap.

Amestecul se filtreaz nainte de folosire printr-o membran filtrant cu pori cu
diametrul de 0,45 m.
Not: Se poate folosi orice alt solvent de splare cu efect bactericid care nu
afecteaz eficiena rezoluiei coloanelor.
4) Probele etalon
a) Lapte praf degresat care ndeplinete cerinele prezentei rezoluii

(respectiv [0]).
b) Acelai lapte praf degresat modificat cu 5 % (m/m) zer nchegat praf cu

compoziie standard (respectiv [5]).
6. Aparatur
1) Balan analitic
2) Centrifug opional cu o for de centrifugare de 2 200 g, prevzut cu

tuburi astupate sau acoperite pentru centrifugare cu o capacitate de
aproximativ 50 ml
3) Agitator mecanic
5) Coloane de sticl cu diametrul de aproximativ 7 cm
6) Filtre de hrtie cu filtrare medie cu diametrul de aproximativ 12,5 cm

7) Dispozitiv de sticl pentru filtrare prevzut cu membran filtrant cu
diametrul porilor de aproximativ 0,45 m
8) Pipete gradate de 10 ml sau un sistem prin care pot trece 10,0 ml n dou
minute
9) Sistem prin care pot trece 20,0 ml de ap la aproximativ 50 C
10) Baie termostat de ap, reglat la 25 0,5 C
11) Echipament pentru HPLC format din:
a) Pomp
b) Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 15-30 l
c) Dou coloane TSK 2 000-SW n serie (lungime de 30 cm, diametru intern

de 0,75 cm) sau coloane echivalente i o precoloan (3 cm 0,3 cm)
umplute cu I 125 sau cu un material cu eficien echivalent
d) Cuptor cu coloan termostat, reglat la 35 1 C
e) Detector UV cu lungime de und variabil care permite realizarea de

msurtori la 205 nm cu o sensibilitate de 0,008 A
f) Integrator cu ajutorul cruia se poate realiza integrarea la linia de baz
Not: Se poate lucra cu coloanele aflate la temperatura camerei, dar puterea lor
de rezoluie este puin mai mic. n acest caz, temperatura nu trebui s varieze cu
mai mult de 5 C n nici o serie de analize.
1) Probele se preleveaz conform procedurii descrise de standardul SM SR EN

ISO 707.
2) Probele se depoziteaz n condiii n care nu poate surveni nici o deteriorare

sau modificare a compoziiei.
8. Procedur
Se transfer laptele praf ntr-un recipient cu o capacitate aproximativ tripl fa

de volumul laptelui praf, prevzut cu un capac etan la aer. Recipientul se nchide
imediat. Laptele praf se amestec bine prin rsturnri repetate ale recipientului.
2) Cantitatea analizat
Se cntresc 2,000 0,001 g din proba analizat ntr-un tub de centrifugare sau
ntr-un balon astupat adecvat (50 ml).
3) ndeprtarea grsimii i a proteinelor
a) Se adaug 20,0 ml de ap cald (50 C) la cantitatea analizat. Se dizolv

laptele praf agitndu-se cteva minute cu ajutorul unui agitator mecanic.
Tubul se introduce n baia de ap i se las s se echilibreze la 25 C.
b) Se adaug 10,0 ml de soluie de acid tricloroacetic la aproximativ 25 C

timp de dou minute, amestecndu-se puternic cu ajutorul unui agitator
magnetic. Tubul se introduce ntr-o baie de ap i se las timp de 60 de
minute.
c) Se centrifugheaz timp de 10 minute la 2 200 g sau se filtreaz printr-o

hrtie, eliminndu-se primii 5 ml de filtrat.
4) Determinarea cromatografic
a) Se injecteaz 15-30 l de supernatant sau filtrat msurat cu precizie n

aparatul HPLC funcionnd la un debit de 1,0 ml de soluie eluant pe
minut.
Nota 1: Se poate folosi un alt debit n funcie de diametrul intern al coloanelor

utilizate sau de instruciunile productorului coloanei.
Nota 2: Soluia eluant se menine la 85 C pe parcursul ntregii analize

cromatografice pentru ca eluantul s se menin degazat i pentru a mpiedica
dezvoltarea bacteriilor. Se poate recurge la orice msur de precauie cu efect
similar.
Nota 3: Coloanele se cltesc cu ap la fiecare ntrerupere. Soluia nu se las

niciodat n coloane.
nainte de orice ntrerupere care dureaz mai mult de 24 de ore, coloanele se

cltesc cu ap i se spal cu soluie timp de cel puin trei ore la un debit de 0,2 ml
pe minut.
b) Rezultatele analizei cromatografice a probei etalon [E] se obin sub forma

unei cromatograme n care fiecare vrf se identific dup timpul de
retenie RT dup cum urmeaz:
Vrful II Al doilea vrf al cromatogramei cu un RT de aproximativ

12,5 minute.
Vrful III Al treilea vrf al cromatogramei, corespunznd CMP, cu

un RT de 15,5 minute.
Alegerea coloanei (coloanelor) poate afecta timpii de retenie ai fiecrui vrf, n

mod considerabil.
Integratorul calculeaz automat suprafaa A a fiecrui vrf.
AII: suprafaa vrfului II
AIII: suprafaa vrfului III
Este esenial s se examineze aspectul fiecrei cromatograme nainte de

realizarea interpretrii cantitative pentru a se detecta orice eventuale anomalii
datorate fie funcionrii necorespunztoare a aparatului sau a coloanelor, fie
originii sau naturii probei analizate.
n cazul n care exist dubii, analiza se repet.
5) Calibrare
a) Probelor etalon li se aplic exact procedura descris de la, subpunctul 2

din prezentul punct la subpunctul 4, litera b) din prezentul punct.
Se folosesc soluii proaspt preparate, ntruct CMP se degradeaz ntr-un mediu

8 % tricloroacetic. Pierderea este estimat la 0,2 % pe or la 30 C.
b) nainte de determinarea cromatografic a probelor, coloanele trebuie

condiionate prin injectarea repetat a probei etalon n soluie (litera a)
din prezentul subpunct), pn cnd suprafaa vrfului i timpul de retenie
al acestuia pentru CMP sunt constante.
c) Se determin coeficientul de rspuns R prin injectarea aceluiai volum de

filtrai (litera a) din prezentul subpunct) folosit i n probe.
9. Experimentarea rezultatelor
1) Metoda de calcul i formule
a) Calcularea factorilor de rspuns R:
Vrful II: RII = 100/(AII[0])

unde:
RII - coeficienii de rspuns pentru vrfurile II;
AII [0] - suprafeele vrfurilor II pentru proba etalon [0] obinute la punctul 8,
subpunctul 5, litera c).
Vrful III: RIII = W/(AIII[5]

unde: AIII[0])
RIII - coeficientul de rspuns pentru vrful III;

AIII [0] i AIII [5] - suprafeele vrfului III pentru probele etalon [0] i, respectiv,
[5] obinute la punctul 8, subpunctul 5, litera c);
W - cantitatea de zer din proba etalon [5], respectiv 5.
b) Calcularea suprafeei relative a vrfurilor probei [E]
SII[E] = RII AII[E]
SIII[E] = RIII AIII[E]

SIV[E] = RIV AIV[E]
unde:
SII [E], SIII [E], SIV [E] - suprafeele relative ale vrfurilor II, III i, respectiv, IV
din proba [E];
AII [E], AIII [E] - suprafeele vrfurilor II i, respectiv, IV din proba [E] obinute
la punctul 8, subpunctul 4), litera b);
RII, RIII - coeficienii de rspuns calculai la litera a) din prezentul subpunct.
c) Calcularea timpului relativ de retenie al vrfului III pentru proba [E]:

RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])
unde:
RRTIII [E] - timpul relativ de retenie al vrfului III pentru proba [E];
RTIII [E] - timpul relativ de retenie al vrfului III din proba [E] obinut la
punctul 8, subpunctul 4, litera b);
RTIII [5] - timpul relativ de retenie al vrfului III din proba de control [5] obinut
la punctul 8, subpunctul 5, litera c).
d) Exist o relaie liniar ntre timpul relativ de retenie al vrfului III,

respectiv RRTIII [E] i procentul de zer praf de pn la 10 % adugat.
- RRTIII [E] este < 1,000 n cazul n care coninutul de zer este > 5 %;
- RRTIII [E] este 1,000 n cazul n care coninutul de zer este 5 %.
Nesigurana permis pentru valorile RRTIII este de 0,002.
n mod normal, valoarea RRTIII [0] deviaz puin de la 1,034. n funcie de starea
coloanelor, valoarea se poate apropia de 1,000, dar este ntotdeauna mai mare de
aceast valoare.
2) Calcularea procentului de zer nchegat praf din prob:
W = SIII[E] [1, 3 + (SIII[0] 0, 9)]
unde:
W - procentul m/m de zer nchegat n proba [E];
SIII [E] - suprafaa relativ a vrfului III al probei analizate [E] obinut ca la
subpunctul 1, litera b) din prezentul punct;
1,3 - reprezint suprafaa medie relativ a vrfului III exprimat n grame de zer
nchegat pe 100 g determinat pentru lapte praf degresat nemodificat cu diferite
origini. Aceast valoare a fost obinut experimental;
SIII [0] - reprezint suprafaa relativ a vrfului III egal cu R III AIII [0]. Aceste
valori au fost obinute la subpunctul 1, litera a) din prezentul punct i, respectiv,
punctual 8, subpunctul 5, litera c);
(SIII [0] 0,9) - reprezint corecia care trebui adus suprafeei relative 1,3 cnd
SIII [0] nu are valoarea 0,9. n mod experimental, suprafaa medie relativ a
vrfului III al probei martor [0] este de 0,9.
3) Precizia metodei
a) Repetabilitate
Diferena dintre rezultatele a dou determinri efectuate simultan sau n cel mai
scurt interval de timp posibil de acelai operator care utilizeaz aceeai aparatur
pe material de analiz identic nu trebuie s depeasc 0,2 % m/m.
Diferena dintre dou rezultate separate i independente, obinute de doi

operatori care lucreaz n laboratoare diferite cu material de analiz identic nu
trebuie s depeasc 0,4 % m/m.
10.Interpretare
1) Se presupune c zerul este absent n cazul n care suprafaa relativ a

vrfului III, SIII[E] exprimat n grame de zer nchegat pe o sut de grame de
produs este 2,0 + (SIII[0] 0,9), unde
2,0 - valoarea maxim permis a suprafeei relative a vrfului III
avndu-se n vedere suprafaa relativ a vrfului III, respectiv 1,3, nesigurana
datorat variaiilor compoziiei laptelui praf degresat i reproductibilitatea metodei
(punctul 9, subpunctul 3, litera b));
(SIII [0] 0,9) - corecia care trebuie adus cnd suprafaa SIII [0] nu este
0,9 (punctul 9, subpunctul 2).
2) n cazul n care suprafaa relativ a vrfului III, S III[E] este > 2,0 + (SIII[0]
0,9) i suprafaa relativ a vrfului II, SII[E] 160, se determin coninutul
de zer nchegat conform indicaiilor de la punctul 9, subpunctul 2.
3) n cazul n care suprafaa relativ a vrfului III, SIII[E] este > 2,0 + (SIII[0]
0,9) i suprafaa relativ a vrfului II, S II[E] 160, se determin coninutul
total de proteine (P%); apoi se examineaz graficele 1 i 2.
a) Linia continu reprezint regresia liniar, ai crei coeficieni se
calculeaz prin metoda ptratului celui mai mic.
Linia dreapt punctat marcheaz limita superioar a suprafeei relative a

vrfului III, cu probabilitatea ca aceasta s nu fie depit n 90 % din cazuri.
Ecuaiile liniilor drepte punctate de pe graficele 1 i 2 sunt:
SIII = 0,376 P % 10,7 (graficul 1)
SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93 (graficul 2)

i, respectiv, unde:
SIII - suprafaa relativ a vrfului III calculat fie pe baza coninutului total de
proteine, fie pe baza suprafeei relative a vrfului SII[E];
P % - coninutul total de proteine exprimat ca procent de mas;
SII [E] - suprafaa relativ pentru prob calculat la punctul 9, subpunctul 1,
litera b).
Diferena (T1 i T2) dintre suprafaa relativ SIII[E] determinat i suprafaa

relativ SIII se calculeaz dup cum urmeaz: T1 = SIII[E] [(0,376 P % 10,7) +
(SIII[0] 0,9)]T2 = SIII[E] [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] 0,9)]
b) n cazul n care T1 i/sau T2 au valoarea zero sau mai mic,

nu se poate determina prezena zerului nchegat.
n cazul n care T1 i T2 au o valoare mai mare de zero, zerul

nchegat este prezent.
Coninutul de zer nchegat se calculeaz cu ajutorul formulei: W = T2+0,91
unde:
0,91 este distana pe axa vertical ntre linia dreapt continu i linia dreapt
punctat.
Anexa nr. 13
Determinarea substanelor solide din zer nchegat n laptele praf degresat i n

amestecurile ce conin lapte praf degresat i, dup caz, grsime, vitamine,
sruri minerale, zaharoz, ageni anticoagulani i/sau ageni fluidizani i ali
ageni fluidizani, n special antioxidani i emulsificatori
1. Referine
Standardul SM SR EN ISO 707.
2. Definiie
Coninutul de substane solide din zer nchegat procentul de mas determinat
de coninutul de cazeinomacropeptide prin procedura descris.
3. Principiu
Coninutul de cazeinomacropeptide se determin conform anexei nr. 12.
Probele pentru care se obin rezultate pozitive se analizeaz pentru detectarea
cazeinomacropeptidelor A prin procedura de cromatografie lichid de nalt
performan n faz inversat (procedura HPLC). Ca soluie alternativ, probele
sunt analizate direct prin procedura HPLC n faz invers. Evaluarea rezultatelor se
face prin referire la probe etalon formate din lapte praf degresat care conin sau nu
conin un procent cunoscut de zer praf. Rezultatele mai mari de 1 % (m/m) indic
prezena substanelor solide din zer nchegat.
4. Reactivi
Acetonitrilul trebuie s fie de calitate spectroscopic sau de calitate HPLC.
Reactivii necesari pentru aceast procedur sunt descrii n anexa nr. 12 la
prezentele Cerine.
Reactivi pentru HPLC n faz inversat.
1) Soluie de acid tricloroacetic
Se dizolv 240 g de acid tricloroacetic (CCl3COOH) n ap i se completeaz
pn la 1 000 ml. Soluia trebuie s fie limpede i incolor.
2) Eluanii A i B
Eluantul A: Se introduc ntr-un balon cotat de 1 000 ml 150 ml acetonitril
(CH3CN), 20 ml izopropanol (CH3CHOHCH3) i 1,00 ml de acid trifloroacetic
(TFA, CF3COOH). Se completeaz cu ap pn la 1 000 ml.
Eluantul B: Se introduc ntr-un balon cotat de 1 000 ml 550 ml acetonitril,
20 ml izopropanol i 1,00 ml TFA. Se completeaz cu ap pn la 1 000 ml.
Soluia eluant se filtreaz nainte de folosire printr-o membran filtrant cu pori
cu diametrul de 0,45 m.
3) Conservarea coloanei
Dup analize, coloana se cltete cu eluantul B (cu un gradient), iar apoi se
cltete cu acetonitril (cu un gradient timp de 30 de minute). Coloana se pstreaz
n acetonitril.
4) Probele etalon
a) Lapte praf degresat care ndeplinete cerinele pentru depozitare public
(respectiv, [0]).
b) Acelai lapte praf degresat modificat cu 5 % (m/m) zer nchegat praf cu
c) Acelai lapte praf degresat modificat cu 50 % (m/m) zer nchegat praf cu
5. Aparatur
Aparatura necesar pentru procedura descris este cea descris n anexa nr. 12
la prezentele Cerine.
1) Balan analitic
2) Centrifug opional cu o for de centrifugare de 2 200 g, prevzut cu
tuburi astupate sau acoperite pentru centrifugare cu o capacitate de
aproximativ 50 ml
3) Agitator mecanic
5) Coloane de sticl cu diametrul de aproximativ 7 cm
6) Filtre de hrtie cu filtrare medie cu diametrul de aproximativ 12,5 cm
7) Dispozitiv de sticl pentru filtrare prevzut cu membran filtrant cu
diametrul porilor de aproximativ 0,45 m
8) Pipete gradate de 10 ml, sau un sistem prin care pot trece 10,0 ml n dou
minute
9) Sistem prin care pot trece 20,0 ml de ap la aproximativ 50 C
10) Baie termostat de ap, reglat la 25 0,5 C
11) Echipament pentru HPLC format din:
a) Sistem binar de pompare reglabil
b) Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 100 l
c) Coloan Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (lungime 25 cm,
diametru intern 0,46 cm) sau o coloan n faz inversat cu pori mari pe
baz de silice echivalent
d) Cuptor cu coloan termostat, reglat la 35 1 C
e) Detector UV cu lungime de und variabil care permite realizarea de
msurtori la 210 nm (n cazul n care este necesar se poate folosi o
lungime de und mai mare, de pn la 220 nm) cu o sensibilitate de 0,02

f) Integrator cu ajutorul cruia se poate realiza integrarea la linia de baz
comun sau la linia de baz
Not: Se poate lucra cu coloana la temperatura camerei, cu condiia ca
temperatura s nu varieze cu mai mult de 1 C; n caz contrar, se nregistreaz o
variaie mult prea mare a timpului de retenie al CMPA.
1) Probele se preleveaz conform procedurii descrise de standardul SM SR EN
ISO 707.
2) Probele se depoziteaz n condiii n care nu poate surveni nici o deteriorare
sau modificare a compoziiei.
7. Procedur
Se transfer laptele praf ntr-un recipient cu o capacitate aproximativ tripl fa
de volumul laptelui praf, prevzut cu un capac etan la aer. Recipientul se nchide
imediat. Laptele praf se amestec bine prin rsturnri repetate ale recipientului.
Se cntresc 2,00 0,001 g din proba analizat ntr-un tub de centrifugare sau
ntr-un balon astupat adecvat (50 ml).
Not: n cazul amestecurilor, se cntrete o anumit cantitate din proba
analizat, astfel nct s rezulte o cantitate de prob degresat de 2,00 g.
3) ndeprtarea grsimii i a proteinelor
a) Se adaug 20,0 ml de ap cald (50 C) la cantitatea analizat. Se dizolv
laptele praf agitndu-se cinci minute sau 30 de minute n cazul zarei
acide cu ajutorul unui agitator mecanic. Tubul se introduce n baia de ap
i se las s se echilibreze la 25 C.
b) Se adaug constant 10,0 ml de soluie de acid tricloroacetic la
aproximativ 25 C timp de peste dou minute, amestecndu-se puternic
cu ajutorul unui agitator magnetic. Tubul se introduce ntr-o baie de ap
i se las timp de 60 de minute.
c) Se centrifugheaz 2 200 g timp de 10 minute sau se filtreaz prin hrtie,
eliminndu-se primii 5 ml de filtrat.
4) Determinarea cromatografic
a) Se efectueaz analiza HPLC conform descrierii din anexa nr. 12. n cazul
n care se obine un rezultat negativ, proba analizat nu conine solide din
zer nchegat n cantiti detectabile. n cazul n care rezultatul este
pozitiv, se alic procedura HPLC n faz inversat descris mai jos. Ca
soluie alternativ, se poate aplica direct metoda HPLC n faz inversat.
Prezena zarei acide praf poate provoca apariia unor rezultate fals
pozitive folosind metoda descris n anexa nr. 12. Metoda HPLC n faz
invers exclude aceast posibilitate.
b) nainte de realizarea analizei HPLC n faz invers se optimizeaz
condiiile de gradient. Pentru sistemele reglabile cu un volum mort de
aproximativ 6 ml (volum de la punctul n care solvenii se ntlnesc pn
la bucla injectorului inclusiv) timpul de retenie de 26 2 minute pentru
CMPA este optim. Pentru sistemele reglabile cu un volum mort mai mic
(de exemplu, 2 ml) timpul optim de retenie este de 22 de minute.
Se recolteaz soluii de prob etalon cu i fr 50 % zer nchegat.
Se injecteaz 100 l de supranatant sau de filtrat n sistemul HPLC care
funcioneaz n condiiile de gradient de explorare din tabelul 1.
Tabelul 1. Condiii de gradient de explorare pentru optimizarea cromatografiei
Timp Flux %A %B Curb
(min) (ml/min)
Iniial 1,0 90 10 *
27 1,0 60 40 lin
32 1,0 10 90 lin
37 1,0 10 90 lin
42 1,0 90 10 lin
Compararea celor dou cromatograme trebuie s indice poziia vrfului CMPA.
Cu ajutorul formulei de mai jos se poate calcula compoziia iniial a solventului
care se folosete pentru gradientul normal % B = 10 2,5 + [13,5 + (RTcmpA 26) /
6] 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA 26) / 6) 1,11
unde:
RTcmpA - timpul de retenie al CMPA la gradientul de explorare
10 - % B iniial al gradientului de explorare
2,5 - % B n punctul de mijloc minus % B iniial la gradientul normal
13,5 - timpul corespunztor punctului de mijloc
26 - timpul necesar de retenie pentru CMPA
6 - raportul pantelor gradienilor de explorare i normal
30 - % B iniial minus % B la 27 minute la gradientul de explorare
27 - timpul de rulare al gradientului de explorare.
c) Prelevarea soluiilor din probele analizate
Se injecteaz 100 l de supernatant sau filtrat (subpunctul 3, litera c) din
prezentul punct) msurat cu precizie n aparatul HPLC funcionnd la un debit de
1,0 ml de soluie eluant pe minut.
Compoziia eluantului la nceputul analizei se obine ca la punctul 6.4.2. n mod
normal este de aproximativ A:B = 76:24. Imediat dup injectare se pornete un
gradient liniar, rezultatul fiind un procent al B cu 5 % mai mare peste 27 minute.
Apoi se pornete un gradient liniar, datorit cruia, dup cinci minute, compoziia
eluantului este de 90 % B. Compoziia se menine timp de cinci minute, dup care
compoziia se modific n cinci minute, ia un gradient liniar, ajungnd la
compoziia iniial. n funcie de volumul intern al sistemului de pompare,
urmtoarea injectare se poate face la 15 minute dup ce se ajunge la condiiile
iniiale.
Nota 1: Timpul de retenie al CMPA trebuie s fie de 26 2 minute. Acesta se
poate obine prin modificarea condiiilor iniiale i finale ale primului gradient. Cu
toate acestea, diferena la nivelul % B n condiiile iniiale i finale ale primului
gradient trebuie s se menin la 5 % B.
Nota 2: Eluanii trebuie degazai suficient i trebuie, de asemenea, s se
menin degazai. Acest lucru este esenial pentru buna funcionare a sistemului de
pompare reglabil. Deviaia standard a timpului de retenie al vrfului CMP A trebuie
s fie sub 0,1 minute (n = 10).
Nota 3: Dup fiecare cinci probe se injecteaz proba de referin i se folosete
pentru calcularea noului coeficient de rspuns R (punctul 8, subpunctul 1, litera a)).
d) Rezultatele analizei cromatografice a probei analizate (E) se obin sub
forma unei cromatograme n care vrful CMPA este identificat pe baza
timpului su de retenie de aproximativ 26 minute.
Integratorul calculeaz automat nlimea vrfului H pentru vrful CMP A. Se
verific poziia liniei de baz n fiecare cromatogram. n cazul n care poziia
liniei de baz este incorect, analiza sau integrarea se repet.
Not: n cazul n care vrful CMPA este suficient de bine separat de alte vrfuri,
se folosete alocarea liniei de baz tip baz la baz sau, dac nu, se folosesc
perpendiculare trase pe o linie de baz comun, care s aib punctul de plecare
lng vrful CMPA. Se folosete pentru etalon i pentru probe acelai tip de
integrare i, n cazul liniei de baz comune, se verific consistena pentru probe i
etalon.
Este extrem de important s se examineze aspectul fiecrei cromatograme
nainte de interpretarea cantitativ pentru a se detecta orice eventuale anomalii
datorate fie funcionrii necorespunztoare a aparatului sau a coloanelor, fie
originii sau naturii probei analizate. n cazul n care exist dubii, analiza se repet.
5) Calibrare
a) Se aplic cu exactitate procedura descris de la punctul 7, subpunctul 2)
la punctul 7, subpunctul 4, liteda d) folosindu-se probele etalon. Se
folosesc soluii proaspt preparate, ntruct CMP se degradeaz ntr-un
mediu 8 % tricloroacetic la temperatura camerei. La 4 C soluia este
stabil timp de 24 ore. Pentru seriile lungi de analize este de preferabil ca
n injectorul automat s se foloseasc o tav rcit pentru probe.
Not: Punctul 7, subpunctul 4, litera b) se poate omite n cazul n care se
cunoate % B n condiiile iniiale din analizele efectuate anterior.
b) nainte de determinarea cromatografic a probei se injecteaz 100 l din
proba etalon care nu conine zer nchegat [0].
Pe cromatogram nu trebuie s apar un vrf pentru timpul de retenie al
vrfului CMPA.
c) Se determin coeficientul de rspuns R prin injectarea aceluiai volum de
filtrate (litera a) din prezentul subpunct) folosit i n probe.
8. Exprimarea rezultatelor
1) Metoda de calcul i formula
Calcularea coeficientului de rspuns R:
Vrful CMPA: R = W/H
unde:
R - coeficientul de rspuns al vrfului CMPA;
H - nlimea vrfului CMPA;
W - cantitatea de zer din proba etalon.
2) Calcularea procentului de zer nchegat praf din prob
W(E) = R H(E)
unde:
W(E) - procentul (m/m) de zer nchegat n proba (E);
R - coeficientul de rspuns al vrfului CMPA (subpunctul 1, litera a));
H(E) - nlimea vrfului CMPA al probei (E).
n cazul n care W(E) este mai mare de 1 % i diferena dintre timpul de retenie
i cel al probei etalon este mai mic de 0,2 minute, atunci sunt prezente substane
solide din zer nchegat.
3) Precizia metodei
a) Repetabilitate
Diferena dintre rezultatele a dou determinri efectuate simultan sau n cel mai
scurt interval de timp posibil de acelai operator care utilizeaz aceeai aparatur
pe material de analiz identic nu trebuie s depeasc 0,2 % m/m.
Nedeterminat.
c) Liniaritate
De la 0 la 16 % zer nchegat se obine o relaie de liniaritate cu un coeficient de
corelare > 0,99.
Anexa nr. 14
Lapte praf degresat: determinarea cantitativ a fosfatidilserinei i a

fosfatidiletanolaminei
Metod: HPLC n faz invers.
Aceast metod descrie o procedur de determinare cantitativ a
fosfatidilserinei (PS) i a fosfatidiletanolaminei (PE) din laptele praf degresat
(SMP) i este adecvat pentru determinarea substanelor solide din zar din SMP.
2. Definiie
Coninutul de PS + PE - fraciunea de mas a substanei determinate prin
procedura descris n prezenta anex. Rezultatul se exprim n miligrame de
dipalmitoil fosfatidiletanolamin (PEDP) n 100 g praf.
Extragerea aminofosfolipidelor cu metanol din lapte praf reconstituit.
Determinare PS i PE ca derivai ai o-ftaldialdehidei (OPA) prin HPLC n faz
invers (RP) i prin detectare prin fluorescen. Cuantificarea coninutului de PS i
PE din proba analizat prin referire la o prob etalon coninnd o cantitate
cunoscut de PEDP.
4. Reactivi
utilizat trebuie s fie ap distilat sau ap de o puritate cel puin echivalent, cu
excepia cazurilor n care se precizeaz altceva.
1) Material etalon: PEDP, cu o puritate de cel puin 99 %
Not: Materialul etalon se depoziteaz la 18 C.
2) Reactivi pentru prepararea probei etalon i a probei pentru analiz
a) Metanol de calitate HPLC
b) Cloroform de calitate HPLC
c) Monoclorhidrat de triptamin
3) Reactivi pentru derivarea o-ftaldialdehidei
a) Hidroxid de sodiu, soluie de ap 12 M
b) Acid boric, soluie de ap 0,4 M ajustat cu hidroxid de sodiu pn la un
pH de 10,0
c) 2-mercaptetanol
d) o-ftaldialdehid (OPA)
4) Solveni de eluare HPLC
a) La prepararea solvenilor de eluare se folosesc reactivi de calitate HPLC
b) Ap de calitate HPLC
c) Metanol cu puritate fluorimetric testat
d) Tetrahidrofuran
e) Fosfat monosodic
f) Acetat de sodium
g) Acid acetic
5. Aparatur
1) Balan analitic cu o capacitate de cntrire avnd o precizie de 1 mg, cu o
capacitate de citire de 0,1 mg
2) Pahare de laborator cu capacitate de 25 i 100 ml
3) Pipete cu o capacitate de 1 i 10 ml
5) Pipete gradate cu o capacitate de 0,2, 0,5 i 5 ml
6) Baloane cotate cu capacitate de 10, 50 i 100 ml
7) Seringi cu capacitate de 20 i 100 l
8) Baie ultrasonic
9) Centrifug care poate opera la 27 000 g
10) Fiole de sticl cu capacitate de aproximativ 5 ml
11) Cilindru gradat cu capacitate de 25 ml
12) Aparat de msurare a pH-ului cu o precizie de 0,1 uniti pH
13) Echipament HPLC
a) Sistem de pompare reglabil care poate funciona la 1,0 ml/min. la 200
bari
b) Aparat de prelevare automat de probe cu posibilitate de derivare
c) nclzitor de coloan care poate menine coloana la o temperatur de
30 C 1 C
d) Detector de fluorescen care poate opera la o lungime de und de
excitare de 330 nm i la o lungime de und de emisie 440 nm
e) Integrator sau software de procesare de date care poate msura suprafaa
vrfului
f) Licrosfer 100 coloan (250 4,6 mm) sau o coloan echivalent
umplut cu octadecilsilan (C 18) cu particule de 5 m
Prelevarea probelor se realizeaz conform standardului SM SR EN ISO 707.
7. Procedur
1) Prepararea soluiei etalon intern
a) Se cntresc 30,0 0,1 mg de monoclorhidrat de triptamin ntr-un
balon cotat de 100 ml i se completeaz cu metanol pn la marcaj.
b) Se pipeteaz 1 ml din aceast soluie ntr-un balon cotat de 10 ml i se
completeaz cu metanol pn la marcaj pentru a se obine o concentraie
de triptamin de 0,15 mM.
2) Prepararea soluiei din proba pentru analiz
a) Se cntresc 1,000 0,001 g din proba de SMP ntr-un pahar de
laborator de 25 ml. Se adaug cu o pipet 10 ml de ap distilat cu
temperatura de 40 C 1 C i se amestec cu un agitator magnetic timp
de 30 de minute pentru a se dizolva toate cocoloaele.
b) Se pipeteaz 0,2 ml din laptele reconstituit ntr-un balon cotat de 10 ml,
se adaug 100 l din soluia de triptamin de 0,15 mM cu ajutorul unei
seringi i se completeaz la volum cu metanol. Se amestec cu grij prin
rsturnare i se sonicheaz timp de 15 minute.
c) Se centrifugheaz la 27 000 g g timp de 10 minute i se colecteaz
supranatantul ntr-o fiol de sticl.
Not: Soluia prob se depoziteaz la 4 C pn la finalizarea analizei HPLC.
3) Prepararea soluiei etalon extern
a) Se cntresc 55,4 g de PEDP ntr-un balon cotat de 50 ml i se adaug
aproximativ 25 ml de cloroform cu ajutorul unui cilindru gradat. Se
nclzete balonul astupat la 50 C 1 C i se amestec cu atenie pn
cnd se dizolv PEDP. Balonul se rcete la 20 C i se completeaz la
volum cu metanol i amestec prin rsturnare.
b) Se pipeteaz 1 ml din aceast soluie ntr-un balon cotat de 100 ml i se
completeaz la volum cu metanol. Se pipeteaz 1 ml din aceast soluie
ntr-un balon cotat de 10 ml i se adaug 100 l de soluie de triptamin
de 0,15 mM (subpunctul 1) din prezentul punct) i se completeaz la
volum cu metanol. Se amestec prin rsturnare.
Not: Soluia prob de referin se depoziteaz la 4 C pn la finalizarea
analizei HPLC.
4) Prepararea reactivului de derivare
Se cntresc 25,0 0,1 mg de OPA ntr-un balon cotat de 10 ml i se adaug
0,5 ml de metanol i se amestec cu atenie pentru ca OPA s se dizolve. Se
completeaz pn la marcaj cu soluie de acid boric i se adaug 20 l de 2-
mercaptetanol cu o sering.
Not: Reactivul de derivare se depoziteaz la 4 C ntr-o fiol brun, rmnnd
stabil timp de o sptmn.
5) Determinarea prin HPLC
a) Solveni de eluare
Solventul A: Soluie 0,3 mM de fosfat monosodic i 3 mM de soluie de acetat
de sodiu (ajustat cu acid acetic la un pH de 6,5 0,1):metanol:
tetrahidrofuran = 558:440:2 (v/v/v).
Solventul B: metanol.
b) Gradient de eluare recomandat:
Timp (min) Solventul A (%) Solventul B (%) Debit (ml/min)
Iniial 40 60 0
0,1 40 60 0,1
5,0 40 60 0,1
6,0 40 60 1,0
6,5 40 60 1,0
9,0 36 64 1,0
10,0 20 80 1,0
11,5 16 84 1,0
12,0 16 84 1,0
16,0 10 90 1,0
19,0 0 100 1,0
20,0 0 100 1,0
21,0 40 60 1,0
29,0 40 60 1,0
30,0 40 60 0
Not: Este posibil s fie nevoie de o uoar modificare a gradientului de eluare
pentru a se obine rezoluia din figura 1.
Temperatura coloanei: 30 C.
c) Volumul injectat: 50 l reactiv de derivare i 50 l soluie
prob
d) Echilibrarea coloanei
Sistemul se pornete n fiecare zi, se cltete coloana cu solvent B 100 % timp
de 15 minute, apoi se regleaz la A:B = 40:60 i se echilibreaz la 1 ml/min. timp
de 15 minute. Se lucreaz cu o prob martor injectndu-se methanol.
Not: nainte de o depozitare pe termen lung coloana se cltete cu metanol:
cloroform = 80:20 (v/v) timp de 30 de minute.
e) Se determin coninutul de PS + PE din proba analizat
f) Se realizeaz secvena de analize cromatografice lsndu-se un timp
constant ntre seriile de analize pentru a se obine timpi de reinere
constani. Soluia etalon extern se injecteaz la fiecare 5-10 soluii prob
pentru a se calcula coeficientul de rspuns
Not: Coloana se cur prin cltire cu solvent B 100 % (litera a) din prezentul
subpunct) timp de cel puin 30 de minute la fiecare 20-25 de serii.
6) Modul de integrare
a) Vrful PEDP
PEDP este eluat ca un singur vrf (figura 1). Se determin suprafaa vrfului
prin integrare la linia de baz.
b) Vrful triptaminei
Triptamina este eluat ca un singur vrf (figura 1). Suprafaa vrfului se
determin prin integrare la linia de baz.
c) Grupurile de vrfuri ale PS i PE
n condiiile descrise (figura 1), PS elueaz sub forma a dou vrfuri principale
parial fr rezoluie, precedate de un vrf minor. PE elueaz sub forma a trei
vrfuri principale parial fr rezoluie. Se determin ntreaga suprafa a fiecrei
aglomerri de vrfuri, stabilindu-se linia de baz ca n figura 1.
Figura 1. Model HPLC al derivailor OPA ai fosfatidilserinei (PS) i ai
fosfatidiletanolamidei (PE) n extractul de metanol al laptelui praf reconstituit.

Coninutul de PS i PE din proba analizat se calculeaz dup cum urmeaz:
C = 55,36 [(A2)/(A1)] [(T1)/(T2)]
unde:
C - coninutul de PS sau PE (mg/100 g praf) din proba analizat;
A1 - suprafaa vrfului PEDP din soluia etalon din prob (punctul 7,

subpunctul 3);
A2 - suprafaa vrfului PS sau PE din soluia din prob (punctul 7, subpunctul

2);
T1 - suprafaa vrfului triptaminei din soluia etalon din prob (punctul 7,

subpunctul 3);
T2 - suprafaa vrfului triptaminei din soluia din prob (punctul 7, subpunctul

2).
9. Precizia metodei
1) Repetabilitate
Derivaia standard relativ a repetabilitii, care exprim variabilitatea
rezultatelor independente de analiz obinute de acelai operator care folosete
aceeai aparatur n aceleai condiii i probe pentru analiz identice ntr-un
interval scurt de timp, nu trebuie s depeasc relativ 2 %. n cazul n care se
obin dou determinri n aceste condiii, diferena relativ dintre cele dou
rezultate nu trebuie s fie mai mare de 6 % din media aritmetic a rezultatelor.
n cazul n care se realizeaz dou determinri de ctre operatori din
laboratoare diferite care folosesc aparatur diferit n condiii diferite i aceeai
prob pentru analiz, diferena relativ dintre cele dou rezultate nu trebuie s fie
mai mare de 11 % din media aritmetic a rezultatelor.
Anexa nr. 15
Detectarea reziduurilor antimicrobiotice n laptele praf degresat
Se folosete un test de selecie al unui inhibitor microbian n care se

folosete Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis ca microorganism de test
i care este suficient de sensibil pentru a detecta 4 g benzilpenicilin per kg de
lapte i 100 g sulfamidin per kg de lapte. Sunt disponibile i se pot folosi kituri
comerciale pentru analize n cazul n care acestea au sensibilitatea necesar la
benzilpenicilin i sulfamidin.
Pentru analiz, se folosete lapte praf degresat reconstituit (1 g praf +9 ml ap

distilat). Testul se realizeaz n conformitate cu standardul SM ISO/TS
26844:2015 sau n conformitate cu instruciunile productorului kitului pentru
analize.
Rezultatele pozitive se interpreteaz dup cum urmeaz:
1. Prezena -lactamilor poate fi confirmat prin repetarea analizei,

adugndu-se penicilinaz n sistemul de analiz:
Rezultat negativ: Substana inhibitoare este un antibiotic -lactam.
Rezultatul pozitiv rmne: Substana inhibitoare nu poate fi identificat prin

aceast procedur, se continu cu 2.
2. Prezena sulfamidelor poate fi confirmat prin repetarea analizei,

adugndu-se acid p-aminobenzoic n sistemul de analiz:
Rezultat negativ: Substana inhibitoare este o sulfamid.
Rezultatul pozitiv rmne: Substana inhibitoare nu poate fi identificat prin

aceast procedur, se continu cu 3.
3. Prezena combinaiei dintre -lactam i sulfamid poate fi confirmat

prin repetarea analizei, adugndu-se penicinilaz + acid p-aminobenzoic
n sistemul de analiz:
Rezultat negativ: Substanele inhibitoare sunt un antibiotic -lactam i o

sulfamid.
Rezultat pozitiv: Substana inhibitoare nu poate fi identificat prin aceast

procedur.
Anexa nr. 16
Determinarea cantitativ a laptelui praf degresat n furajele combinate

prin coagularea enzimatic a para-cazeinei
1. Scopul
Determinarea cantitativ a laptelui praf degresat n furajele combinate prin

coagularea enzimatic a para-cazeinei.
2. Obiectul
Aceast metod se aplic furajelor combinate coninnd cel puin 10 % lapte

praf degresat; prezena unor cantiti mari de zar i/sau de anumite proteine care
nu provin din lapte pot duce la apariia unor interferene.
1) Dizolvarea cazeinei coninute n furajele combinate prin extragere cu

soluie de citrat de sodiu.
2) Ajustarea concentraiei de ioni de calciu la nivelul necesar pentru
precipitarea para-cazeinei se realizeaz prin adugarea de cheag.
3) Coninutul de azot al precipitatului de para-cazein se determin prin

metoda Kjeldahl, aa cum este descris n standardul SM EN ISO 8968-
1:2014; cantitatea de lapte praf degresat se calculeaz pe baza unui coninut
minim de cazein de 27,5 % (punctul 8).
4. Reactivi

utilizat trebuie s fie ap distilat sau ap de o puritate cel puin echivalent. Cu
excepia cheagului, toi reactivii i toate soluiile trebuie s nu conin substane
azotate.
1) Citrat trisodic (soluie 1 % m/v)
2) Clorur de calciu (aproximativ 5 M de soluie)
Se dizolv 75 g de CaCl2 2 H2O n 100 ml de ap distilat prin scuturare (se

acord atenie reaciei exotermice). Soluia se las peste noapte i apoi se filtreaz.
Soluia se pstreaz n refrigerator.
3) Hidroxid de sodiu 0,1 N
4) Acid clorhidric 0,1 N
5) Cheag lichid de viel (trie de aproximativ 100 IMCU/ml). Se pstreaz n

refrigerator la 4-6 C.
6) Reactivii pentru determinarea cantitativ a azotului n conformitate cu

metoda Kjeldahl descris n standardul SM EN ISO 8968-1:2014
5. Aparatur
Aparatur obinuit de laborator, cuprinznd:
1) Mojar sau omogenizator

capacitate de citire de 0,1 mg
3) Centrifug de mas (500 g sau 2 000-3 000 rpm) cu tuburi de 50 ml i

2 000 g
4) Agitator magnetic (10-15 mm) cu minimagnei

5) Pahare de laborator de 150-200 ml
6) Baloane de 250 i 500 ml
7) Conducte de sticl cu diametru de 60-80 mm
8) Filtre fr cenu cu filtrare rapid cu diametrul de 150 mm
9) Pipete cu diverse volume nominale
10) Baie de ap cu termostat la 37 C 1 C
11) Aparat de msurare a pH-ului cu o precizie de 0,1 uniti
12) Termometre cu o precizie de 1 C
6. Procedur
1) Prepararea probei
Se zdrobesc n mojar sau se omogenizeaz n rni 10-20 g din prob pentru a

se obine un amestec omogen.
2) Dizolvarea laptelui praf i separarea reziduului insolubil
a) Se cntresc 1,000 0,002 g de furaje combinate bine omogenizate

direct ntr-un tub de centrifugare de 50 ml. Se adaug 30 ml de soluie de
citrat trisodic nclzit n prealabil la 45 C 2 C. Se amestec timp de
cel puin cinci minute cu ajutorul unui agitator magnetic sau prin
scuturare puternic cu mna.
b) Se centrifugheaz la 500 g (2 000-3 000 rpm) timp de 10 minute i se

decanteaz cu atenie supranatantul apos limpede ntr-un pahar de
laborator de 150-200 ml, pentru a nu se pierde material.
c) Se realizeaz nc dou extrageri de reziduu prin aceeai procedur i se

adaug extractele la primul.
d) n cazul n care se formeaz un strat de ulei la suprafa, se rcete n

refrigerator pn cnd grsimile se solidific i se ndeprteaz stratul
solid cu o spatul.
3) Coagularea cazeinei cu enzime din cheag
a) Se amestec continuu i se adaug prin picurare 2 ml de clorur de calciu

la ntregul extract apos (aproximativ 100 ml). Se ajusteaz pH-ul la 6,4-
6,5 cu soluii de NaOH sau de HCl. Se introduce n baia de ap controlat
prin termostat la 37 C 1 C timp de 15-20 minute pentru a se obine un
echilibru salin. Acesta este indicat de o uoar tulburare.
b) Lichidul se transfer ntr-un tub de centrifugare i se centrifugheaz la

2 000 g timp de 10 minute pentru a se ndeprta substanele precipitate.
Se transfer supranatantul, fr a se spla sedimentul, n alt tub de
centrifugare.
c) Supranatantul se aduce din nou la temperatura de 37 C 1 C. n timp

ce se amestec extractul, se adaug prin picurare 0,5 ml de cheag lichid.
Coagularea se produce n dou minute.
d) Proba se introduce din nou n baia de ap i se las la o temperatur de

37 C 1 C timp de 15 minute. Proba se scoate din baie, iar coagulul se
sparge prin amestecare. Se centrifugheaz la 2 000 g timp de 10 minute.
Se filtreaz supranatantul printr-o hrtie de filtru adecvat i se pstreaz
hrtia de filtru. Precipitatul se cltete n tubul de centrifugare cu 50 ml
de ap la aproximativ 35 C, amestecndu-se precipitatul.
Se centrifugheaz din nou la 2 000 g timp de 10 minute. Supranatantul se

filtreaz prin hrtia de filtru pstrat.
4) Determinarea azotului din cazein
Dup cltire, precipitatul se transfer cantitativ n hrtia de filtru rmas de la

punctul 6, subpunctul 3, litera d) cu ajutorul apei distilate. Hrtia de filtru uscat se
transfer n balonul Kjeldhal. Se determin azotul prin metoda Kjeldahl n
conformitate cu standardul SM EN ISO 8968-1:2014.
7. Test cu prob martor
1) Se efectueaz cte un test cu prob martor supus la mineralizare prin

metoda Kjeldhal n conformitate cu standardul SM EN ISO 8968-1:2014,
folosindu-se o hrtie de filtru fr cenu umezit cu un amestec de 90 ml de
soluie de citrat de sodiu, 2 ml soluie de clorur de calciu, 0,5 ml de cheag
lichid i splat cu 3 15 ml de ap distilat.
2) Volumul de acid folosit pentru testul cu prob martor se ia din volumul de

acid folosit pentru titrarea probei.
Procentul de lapte praf concentrat din furajul combinat se calculeaz cu ajutorul

formulei de mai jos:
N x 6,38
( x 100)2,81
27,5
%SMP=
0,908
unde:
N - procentul de azot din para-cazein;
27,5 - coeficientul de transformare a cazeinei determinate n procentul de lapte

praf degresat;
2,81 i 0,908 - coeficienii de corecie obinui prin analiza regresiei.
9. Precizia metodei
1) Repetabilitate
Analiza probelor martor pentru aceeai prob realizat de acelai operator n

acelai laborator trebuie s dea rezultate echivalente cu cele pentru o cantitate nu
mai mare de 2,3 g de lapte praf degresat n 100 g de furaj combinat.
n cel puin 95 % din cazurile studiate, analiza probelor martor pentru aceeai
prob realizat de dou laboratoare trebuie s dea rezultate echivalente cu cele
pentru o cantitate nu mai mare de 6,5 g de lapte praf degresat n 100 g de furaj
combinat.
10. Observaii
1) Adugarea unor procente mari de proteine care nu provin din lapte i n

special de proteine din soia care sunt nclzite mpreun cu laptele praf
degresat poate genera rezultate prea mari din cauza coprecipitrii cu para-
cazeina din lapte.
2) Adugarea de zar poate duce la obinerea unor cifre mai mici din cauza
faptului c se determin numai cantitatea fr grsime. Adugare de zar
acid poate genera rezultate considerabil mai mici din cauza dizolvrii
incomplete n soluia de citrat.
3) Adugarea de 0,5 % sau mai mult lecitin poate, de asemenea, genera

rezultate cu valori mici.
4) ncorporarea de lapte praf degresat tratat la temperaturi nalte poate genera

obinerea de valori prea mari din cauza coprecipitrii anumitor proteine cu
para-cazeina din lapte.
Anexa nr. 17
Detectarea amidonului din laptele praf degresat, lapte praf denaturat i furaje
combinate
1. Obiectul
Prin aceast metod se detecteaz amidonul utilizat ca marcator n lapte praf
denaturat.
Limita de detectare a metodei este de aproximativ 0,05 g de amidon n 100 g de
prob.
2. Principiu
Reacia se bazeaz pe cea folosit n iodometrie:
1) fixarea iodului liber din soluie apoas de ctre coloizi;
2) absorbia de ctre miceliile de amidon i prin colorare.
3. Reactivi
Soluie de iod
1) iod - 1,0 g;
2) iodur de potasiu - 2,0 g;
3) ap distilat - 100 ml.
Se dizolv 1,0 g de iod i 2,0 g de iodur de potasiu n ap, ntr-un balon cotat
de 100 ml cu un singur marcaj. Se dilueaz cu ap pn la marcajul de 100 ml.
4. Aparatur
1) Balan analitic
2) Baie de ap care fierbe
3) Eprubete, 25 mm 200 mm
5. Procedur
Se cntrete 1,0 g din prob cu o precizie de 0,1 g i se transfer ntr-o
eprubet.
Se adaug 20 ml de ap distilat i se amestec pentru a se dispersa proba.
Se introduce n baia de ap i se las timp de 5 minute.
Se scoate din baia de ap i se rcete la temperatura camerei.
Se adaug 0,5 ml de soluie de iod i se amestec, observndu-se culoarea
rezultat.
Culoarea albastr indic prezena amidonului natural n prob.
n cazul n care proba conine amidon modificat, poate rezulta o alt culoare
dect albastru.
7. Observaii
Culoarea, intensitatea culorii i aspectul observat la microscop al amidonului
variaz n funcie de originea amidonului natural (de exemplu, porumb sau cartof)
i de tipul de amidon modificat din prob.
n prezena amidonului modificat culoarea rezultat este violet, rou sau maro,
n funcie de amploarea modificrii din structura cristalin a amidonului natural.
Anexa nr. 18
Determinarea coninutului umed n smntna deshidratat
1. Obiectul
Prezenta anex precizeaz o metod de determinare a coninutului umed n
smntna deshidratat.
2. Termeni i definiii
Coninut umed: pierderea de mas determinat prin procedura specificat n
prezentele Cerine.
Acesta este exprimat ca procent de mas.
3. Principiu
Uscarea unei cantiti analizate la 102 2 C pn se obine o mas constant i
cntrirea n vederea determinrii pierderii de mas.
4. Aparatur
Aparatur obinuit de laborator, n special urmtoarele:
capacitate de citire de 0,1 mg.
2) Cuptor de uscare, bine ventilat, care poate fi meninut prin termostat la 102
2 C n ntregul spaiu de lucru.
3) Desicator, prevzut cu silicagel proaspt uscat cu indicator higroscopic sau
un alt desicant eficace.
4) Vase cu fundul plat, avnd o adncime de aproximativ 25 mm, cu diametru
de aproximativ 50 mm, confecionate dintr-un material adecvat (de exemplu,
sticl, oel inoxidabil, nichel sau aluminiu), prevzute cu capace potrivite i
uor de desfcut.
5) Sticle cu dopuri etane, pentru amestecarea probelor de laborator.
Proba primit n laborator nu trebuie s fie deteriorat sau modificat n timpul
transportului sau pe durata depozitrii.
Prelevarea probelor nu face parte din metoda specificat n prezentele Cerine.
n standardul SM SR EN ISO 707 este prezentat metoda recomandat de
prelevare a probelor.
Probele se depoziteaz n condiii n care nu poate surveni nici o deteriorare sau
modificare a compoziiei.
6. Prepararea probei pentru analiz
Se amestec proba cu grij prin scuturarea i rsturnarea repetat a recipientului
(n cazul n care este necesar, dup transferarea tuturor probelor pentru analiz ntr-
un recipient etan cu o capacitate suficient care s permit realizarea acestei
operaii).
n cazul n care nu se obine omogenizarea complet prin aceast procedur, se
iau cantitile analizate (pentru dou determinri separate) din proba pregtit la
dou puncte situate ct mai departe posibil unul de cellalt.
7. Procedur
1) Prepararea vasului
a) Se nclzesc un vas neacoperit i capacul acestuia n cuptor, reglat la
102 2 C, timp de cel puin o or.
b) Se aaz capacul pe vas i se transfer vasul acoperit n desicator; se las
s se rceasc la temperatura slii de balane i se cntrete cu o precizie
de 1 mg, nregistrnd greutatea la 0,1 mg.
Se transfer aproximativ 1-3 g din proba pregtit n vas, se acoper cu capacul
i se cntrete cu o precizie de 1 mg, nregistrnd greutatea la 0,1 mg.
3) Determinare
a) Se descoper vasul i se aaz mpreun cu capacul acestuia n cuptor,
reglat la 102 2 C, timp de dou ore.
b) Se reaaz capacul i se transfer vasul acoperit n desicator; se las s se
rceasc la temperatura slii de balane i se cntrete cu o precizie de
1 mg, nregistrnd greutatea la 0,1 mg.
c) Se descoper vasul i se nclzete din nou, mpreun cu capacul, n
cuptor, timp de o or. Se repet apoi operaia de la litera b) din prezentul
subpunct.
d) Se repet procedura de nclzire i cntrire pn cnd masa scade cu
1 mg sau mai puin sau crete ntre dou cntriri succesive.
Se folosete pentru calcule cea mai mic mas nregistrat.
Coninutul umed, exprimat n g/100 g, este egal cu:
m1m2
x 100
m1m0
unde:
m0 - masa vasului i a capacului exprimat n grame (punctul 7, subpunctul 1,
litera b));
m1 - masa vasului, a capacului i a cantitii analizate exprimat n grame
nainte de uscare (punctul 7, subpunctul 2);
m1 - masa vasului, a capacului i a cantitii analizate exprimat n grame dup
uscare (punctul 7, subpunctul 3, litera d)).
Rezultatul se raporteaz cu dou zecimale.
9. Precizia
1) Repetabilitate
Diferena absolut dintre rezultatele a dou determinri separate, obinute prin
aceeai metod cu material de analiz identic, n acelai laborator, de ctre acelai
operator, folosind aceeai aparatur, ntr-un interval scurt de timp, va depi n nu
mai mult de 5 % din cazuri 0,20 g de coninut umed per 100 g de produs.
aceeai metod cu material de analiz identic, n laboratoare diferite, de ctre
operatori diferii, folosind aparatur diferit, va depi n nu mai mult de 5 % din
cazuri 0,40 g de coninut umed per 100 g de produs.
10. Raportul de analiz
Raportul de analiz specific:
1) toate informaiile necesare pentru identificarea complet a probei;
2) metoda de prelevare a probelor, dac aceasta este cunoscut;
3) metoda de analiz folosit n conformitate cu prezentul standard
internaional;
4) toate detaliile de funcionare care nu sunt specificate n prezentul standard
internaional sau sunt considerate opionale, alturi de detalii asupra oricror
incidente care ar fi putut influena rezultatul (rezultatele);
rezultatul (rezultatele) de analiz obinut(e) i, n cazul n care repetabilitatea a fost
verificat, rezultatul final obinut menionat anterior.
Anexa nr. 19
Determinarea umiditii n zara praf acid

1. Obiectul
Determinarea coninutului de umiditate din zara praf acid destinat iniial
furajelor.
2. Principiu
Proba se usuc n vid. Pierderea de mas se determin prin cntrire.
3. Aparatur
capacitate de citire de 0,1 mg.
2) Vase din metal care nu se corodeaz sau de sticl cu capace etane la aer; o
suprafa de lucru care s permit ntinderea probei la aproximativ 0,3 g/cm2.
3) Cuptor electric reglabil cu vid prevzut cu pomp de ulei i cu un mecanism
de introducere a aerului uscat fierbinte printr-un turn coninnd, de exemplu,
oxid de calciu sau sulfat de calciu (coninnd indicator de umiditate).
4) Desicator cu agent de uscare eficient.
5) Cuptor de uscare ventilat cu temperatura controlat de un termostat la
102 2 C
4. Procedur
Se nclzesc un vas i capacul acestuia n cuptor timp de cel puin o or. Se
aaz capacul pe recipient i se transfer imediat n desicator; se las s se rceasc
la temperatura camerei i se cntrete cu o precizie de 1 mg, nregistrnd masa la
0,1 mg.
Se descoper vasul, se transfer aproximativ 5 g din prob n vas i se
cntrete cu o precizie de 1 mg, nregistrnd masa la 0,1 mg. Se aaz vasul
mpreun cu capacul n cuptorul cu vid prenclzit la 83 C. Pentru a mpiedica
scderea temperaturii din cuptor la o valoare inacceptabil, vasul se introduce n
cuptor ct mai rapid posibil.
Se mrete presiunea pn la 100 Torr (13,3 kPa) i se las s se usuce la o
mas constant (timp de aproximativ patru ore) la aceast presiune ntr-un curent
de aer fierbinte i uscat.
Timpul de uscare se calculeaz din momentul n care temperatura cuptorului
revine la 83 C. Presiunea cuptorului se reduce cu grij pn la nivelul presiunii
atmosferice. Se deschide cuptorul, vasul se acoper imediat cu capacul, se scoate
vasul din cuptor i se las s se rceasc n desicator timp de 30-45 minute i se
cntrete cu o precizie de 1 mg, nregistrnd masa la 0,1 mg. Se usuc timp de
nc 30 de minute n cuptorul cu vid la 83 C i se cntrete din nou. Se repet
procedura de nclzire i cntrire pn cnd masa vasului i a capacului scade cu
1 mg sau mai puin sau crete ntre dou cntriri succesive. Se folosete pentru
calcule cea mai mic mas nregistrat.
5. Calcularea
% Umiditate = (m1 m2) / (m1 m0) 100 %
unde:
m0 - masa vasului i a capacului;
m1 - masa recipientului, a capacului i a cantitii analizate nainte de uscare;
m2 - masa recipientului, a capacului i a cantitii analizate dup uscare.
Rezultatele se nregistreaz cu o precizie de 0,1 g/100 g.
6. Precizia
1) Limita de repetabilitate
aceeai metod cu material de analiz identic, n acelai laborator, de ctre acelai
operator, folosind aceeai aparatur, ntr-un interval scurt de timp, va depi, n nu
mai mult de 5 % din cazuri, 0,4 g de ap/100 g de zar praf.
2) Limita de reproductibilitate
aceeai metod cu material de analiz identic, n laboratoare diferite, de ctre
operatori diferii, folosind aparatur diferit, va depi, n nu mai mult de 5 % din
cazuri, 0,6 g de ap/100 g de zar praf acid.
Anexa nr. 20
Metoda de referin pentru determinarea puritii grsimilor din lapte prin

analiza cromatografic n faz gazoas a trigliceridelor
Prezentele Cerine descriu o metod de referin pentru determinarea puritii
grsimii din lapte utiliznd analiza cromatografic n faz gazoas a trigliceridelor.
Pot fi detectate att grsimile vegetale, ct i cele animale, cum ar fi seul de vit i
untura.
Cu ajutorul anumitor formule pentru trigliceride se poate determina integritatea
grsimilor din lapte. n principiu, metoda descris se aplic laptelui de vac n vrac
sau produselor derivate din acesta, indiferent de condiiile de hrnire, reproducere
sau lactaie. Rezultatele fals pozitive pot s apar doar n cazul hrnirii excesive cu
uleiuri vegetale pure, cum ar fi uleiul de rapi. De asemenea, produsele de lapte
obinute de la fiecare vac n parte pot produce rezultate fals pozitive.
Metoda este aplicabil n special grsimilor extrase din produsele de lapte care
ar trebui s conin grsimi pure din lapte a cror compoziie este nemodificat,
cum ar fi untul, smntna, laptele i laptele praf. Tratamentul tehnologic al
grsimilor din lapte, cum ar fi eliminarea colesterolului sau fracionarea, poate
produce rezultate fals pozitive. Acest lucru se aplic i n cazul grsimii din lapte
obinut din laptele degresat sau zar. Metoda nu este ntotdeauna aplicabil pentru
grsimea extras din brnz, deoarece procesul de maturare poate afecta
compoziia grsimii att de mult nct se obin rezultate fals positive.
Nota 1: Acidul butiric (n-butanoic) (C4) apare exclusiv n grsimile din lapte i
permite realizarea estimrii cantitative a cantitilor mici pn la cele medii de
grsimi din lapte n grsimile vegetale i animale. Totui, datorit variaiilor mari
ale C4 n procente aproximative ale intervalului fraciunii de mas de 3,1 %
i 3,8 %, este dificil de furnizat informaii calitative i cantitative referitoare la
fraciunile de mas de pn la 20 % ale grsimilor strine din grsimile pure din
lapte.
Nota 2: Practic, rezultatele cantitative nu pot fi obinute din coninutul de steroli
al grsimilor vegetale, deoarece acestea depind de condiiile de producie i de
prelucrare. Mai mult, determinarea calitativ a grsimilor vegetale cu ajutorul
sterolilor este ambigu.
2. Definiie
Puritatea grsimii din lapte: absena grsimilor vegetale sau animale
determinate cu ajutorul procedurii specificate n prezentele Cerine.
Not: Puritatea este determinat cu ajutorul valorilor S care sunt obinute din
compoziia trigliceridelor. Fraciunile de mas ale trigliceridelor sunt exprimate
procentual.
Grsimea extras din lapte sau produse de lapte este analizat prin gaz-
cromatografie cu ajutorul unei coloane umplute sau al unei coloane capilare scurte
n scopul determinrii trigliceridelor (TG) care sunt separate prin numrul total de
atomi de carbon. Prin introducerea fraciunii de mas a moleculelor de grsime de
diferite dimensiuni (C24 pn la C54, utiliznd doar numere pare pentru atomii de
C), exprimat procentual, n formule adecvate pentru trigliceride, se pot calcula
valorile S. Prezena grsimilor strine este detectat dac valorile S depesc
limitele stabilite pentru grsimile pure din lapte.
Nota 1: Valoarea S este suma tuturor fraciunilor de mas a TG, nmulit cu
coeficienii respectivi definii.
4. Reactivi
1) Gaz vector: azot sau, ca alternativ, heliu sau hidrogen, avnd toate o
puritate de cel puin 99,995 %.
2) Grsimi standard pentru standardizarea unei grsimi standard din lapte n
conformitate cu punctul 7, subpunctul 3, litera c).
a) Trigliceride etalon saturate; n comer sunt disponibile produse adecvate.
b) Colesterol etalon.
3) Metanol (CH3OH), fr ap.
4) n-hexan (CH3(CH2)4CH3).
5) n-heptan (CH3(CH2)5CH3).
6) Alte gaze: hidrogen, puritate de cel puin 99,995 %, fr impuriti organice
(CnHm < 1 l/l); aer sintetic, fr impuriti organice (CnHm < 1 l/l).
7) Sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4).
5. Aparatur
1) Gaz-cromatograf pentru temperatur nalt
Gaz-cromatograful de temperatur nalt trebuie s fie adecvat pentru
temperaturi de cel puin 400 C i s fie prevzut cu detector cu ionizare n flacr.
Pereii despritori utilizai pentru injector trebuie s reziste la temperaturi nalte i
trebuie s prezinte un grad foarte sczut de curgere. Pentru gaz-cromatograful
(GC) cu coloane capilare, se folosete un injector pentru coloane. ntotdeauna se
utilizeaz garnituri de grafit pentru a conecta att coloanele, ct i injectorul i/sau
racordurile detectorului (acolo unde este cazul).
2) Coloana de cromatografie
a) Coloan umplut
Se utilizeaz o coloan de sticl cu diametru intern de 2 mm i lungime de
500 mm, umplut cu OV-1 3 % n faz staionar la 125 m pn la 150 m (100
pn la 120 ochiuri de sit) Gas ChromQ. Prepararea, silanizarea, umplerea i
condiionarea coloanei umplute sunt descrise n Instruciunea nr.1.
Ca o alternativ, se poate utiliza o coloan capilar.
b) Coloan capilar
Se utilizeaz o coloan capilar scurt, de exemplu, de lungime de 5 m cu o
faz staionar nepolar care poate rezista la temperaturi de 400 C sau peste.
Coloana se condiioneaz prin efectuarea a 20 de analize pentru o soluie de
grsime din lapte (punctul 8) n decurs de 2 pn la 3 zile cu ajutorul indicaiilor
date la punctul 9, subpunctul 4, litera b) . Apoi, coeficienii de rspuns (punctual 9,
subpunctul 3) se vor apropia de valoarea 1, dar vor fi mai mici de 1,20.
Not: Se pot utiliza coloane cu dimensiuni diferite i cu faze diferite nepolare,
rezistente la temperaturi nalte, att timp ct performana acestora corespunde cu
prezentele Cerine.
3) Coloan Extrelut cu capacitatea de 1 ml pn la 3 ml cu gel de siliciu,
necesar extraciei grsimii din lapte n conformitate cu punctul 7,
subpunctul 3.
4) Garnituri de grafit, rezistente la temperaturi de cel puin 400 C, care sunt
folosite pentru a conecta att coloanele GC, ct i injectorul i/sau
racordurile detectorului.
5) Baie de ap, care s menin o temperatur de 50 C 2 C.
6) Cuptor care funcioneaz la 50 C 2 C i 100 C 2 C.
7) Micropipet.
8) Pipet gradat, avnd capacitatea de 5 ml.
9) Balon cu fund rotund, avnd capacitatea de 50 ml.
10) Balon Erlenmeyer, cu volum nominal de 250 ml.
11) Plnie.
12) Filtru de hrtie cu pori fini.
13) Evaporator rotativ.
14) Fiole, cu volum nominal de 1 ml, prevzute cu capac de aluminiu acoperit
cu politetrafluoroetilen, care se ataeaz sau se nurubeaz.
15) Sering de injectare al crei piston nu trebuie s ajung la vrful acului (GC
cu coloan umplut).
Not: Cu aceste seringi se obine o repetabilitate mai mare a rezultatelor.
16) Balan analitic, cu care se pot cntri greuti pn la aproximativ 1 mg,
cu capacitate de citire de 0,1 mg.
O prob trebuie trimis la laborator. n timpul transportului sau al depozitrii,
aceasta nu trebuie s fie deteriorat sau modificat.
Prelevarea probelor se efectueaz conform SM SR EN ISO 707.
7. Prepararea probelor pentru analiz
Pentru prepararea probelor pentru analiz se folosete una dintre urmtoarele trei
metode de extracie a grsimii din lapte.
1) Izolarea din unt sau ulei de unt
Se topesc 50 g pn la 100 g din proba pentru analiz la 50 C, utiliznd o baie
de ap sau un cuptor. Se pun 0,5 pn la 1,0 g de sulfat de sodiu ntr-un filtru de
hrtie pliat. Prenclzii un balon Erlenmeyer de 250 ml i o plnie cu filtrul de
hrtie introdus n cuptorul reglat la 50 C. Stratul de grsime din proba topit se
filtreaz, n timp ce balonul prenclzit, plnia i dispozitivul de filtrare introdus se
menin n cuptor. Trebuie acordat atenia corespunztoare, astfel nct serul s nu
fie transferat.
Poate fi folosit o cantitate mai mic din proba analizat doar n cazurile n care
este disponibil o cantitate limitat de prob, iar procedura trebuie adaptat n
consecin. Cu toate acestea, manipularea unei cantiti mai mici de prob implic
un risc mai mare de obinere a unei mostre nereprezentative.
Nota 1: Untul poate fi obinut din smntn prin agitarea i splarea temeinic a
granulelor de unt rezultate.
Nota 2: Grsimea din lapte obinut prin utilizarea procedurii descrise n
prezentul punct nu va conine aproape deloc fosfolipide.
2) Extracia conform metodei gravimetrice Rse-Gottlieb
Fraciunea grsimilor se extrage din proba pentru analiz prin utilizarea metodei
gravimetrice descris n unul dintre standardele SM EN ISO 1211:2015, SM EN
ISO 2450:2014 sau SM EN ISO 7328.
Not: Dac n grsimea din lapte sunt prezente fosfolipide, se va obine un vrf
de colesterol cu aproape 0,1 % mai mare. Influena asupra compoziiei TG
standardizate la 100 %, inclusiv colesterolul, este deci neglijabil
3) Extracia din lapte utiliznd coloane cu silicagel
Se adaug cu ajutorul micropipetei 0,7 ml din proba pentru analiz la o
temperatur de 20 C ntr-o coloan Extrelut de 1 ml pn la 3ml. Se las s se
distribuie uniform pe silicagel timp de aproximativ 5 min.
Pentru denaturarea complexelor protein-lipidice, se adaug n coloana Extrelut
1,5 ml de metanol, cu ajutorul pipetei gradate. n consecin, fraciunea grsimilor
se extrage din proba pentru analiz cu 20 ml de n-hexan. n-Hexanul se adaug
treptat n cantiti mici. Solventul drenat se colecteaz ntr-un balon cu fund rotund
de 50 ml, care a fost uscat n prealabil, pn la obinerea unei mase constante
cunoscute, cntrit cu o precizie de 1 mg, nregistrnd masa la 0,1 mg.
Dup extracie, coloana se las s se scurg pn la golire. Solvenii din eluant
se distileaz ntr-un evaporator rotativ cu baia de ap reglat la o temperatur ntre
40 C i 50 C. Dup distilarea solvenilor, se usuc i se cntrete n continuare
balonul cu fund rotund i coninutul acestuia cu o precizie de 1 mg nregistrnd
masa la 0,1 mg. Se determin masa grsimii rezultat prin scderea din masa
obinut a masei balonului uscat cu fund rotund.
Not: Extracia grsimilor prin metodele Gerber, Weibull-Berntrop sau Schmid-
Bonzynski-Ratzlaff sau izolarea grsimilor din lapte cu ajutorul detergenilor
(metoda BDI) nu sunt adecvate pentru analiza TG, deoarece cantiti semnificative
de gliceride pariale sau de fosfolipide pot trece n faz gras. n consecin,
aplicarea prezentelor Cerine este limitat la anumite produse, n particular la
brnz.
8. Prepararea soluiei de prob
Pentru gaz-cromatografia cu coloan umplut, se prepar o soluie de grsime
(punctul 7) de 5 % (frace de volum) n n-hexan sau n-heptan. n funcie de
dimensiunile coloanei, se folosete o concentraie de 1 % (0,53 mm, tub deschis de
diametru mare) sau mai mic n cazul injectrii coloanei cu o coloan capilar.
n funcie de coloana utilizat i de masa grsimilor obinute la punctul 7,
subpunctul 3, se determin cantitatea de solvent care trebuie adugat la proba
pentru analiz din balon pe baza cntririi cu o precizie de 1 mg i a nregistrrii
masei la 0,1 mg. Cantitatea rmas se dizolv complet.
Se transfer aproximativ 1 ml din soluia de prob ntr-o fiol.
9. Determinarea cromatografic a trigliceridelor
1) Deviaia liniei de baz
Pentru a reduce creterea liniei de baz, coloana trebuie condiionat dup cum
este specificat la punctul 5, subpunctul 2, litera b) (coloana capilar) sau n
Instruciunea nr. 1 (coloana umplut).
Not: Din cauza temperaturii nalte a coloanei, analiza TG este n mod particular
sensibil la creteri ale liniei de baz pentru valorile mari ale numrului de atomi
de carbon.
2) Tehnica injectrii
a) Coloana umplut
Pentru evitarea efectelor de discriminare, se aplic tehnica injectrii fierbini n
scopul mbuntirii cuantificrii componentelor trigliceridice cu punct nalt de
fierbere. Se umple acul cu aer prin tragerea soluiei grase n sering. Acul se
introduce n injector. naintea injectrii, acul se nclzete timp de aproximativ 3 s.
Apoi, coninutul seringii se injecteaz rapid.
b) Coloan capilar
Cnd se folosete injectarea la rece n coloan, se introduce acul seringii i se
injecteaz imediat. Timpul de retenie al acului n orificiul de injectare trebuie s
fie n aa fel nct s se poat evita curbele ample ale vrfului solventului.
Not: n mod normal, timpul optim de retenie este de aproximativ 3 s.
3) Calibrare
a) Generaliti
Pentru calibrarea probelor analizate se realizeaz dou pn la trei analize ale
grsimilor standardizate din lapte la nceputul fiecrei zile. Se folosete ultima
analiz a grsimilor standardizate din lapte pentru determinarea coeficienilor de
rspuns (fraciunea de mas/fraciunea de arie) ai TG i ai colesterolului care se
aplic urmtoarelor probe pentru analiz (punctul 11, subpunctul 1):
w Si x A Si
R F Si =
w Si x A Si (1)
unde:
w si - fraciunea de mas, exprimat procentual, pentru fiecare dintre TG sau
pentru colesterolul din grsimea standardizat din lapte;
A si - valoarea numeric a ariei de vrf pentru fiecare TG sau pentru colesterolul
din grsimea standardizat din lapte.
Se utilizeaz fie litera b), fie litera c) din prezentul subpunct pentru a obine
grsimi standardizate din lapte care au o compoziie cunoscut de TG.
b) Grsimi comerciale standard din lapte
Cea mai bun metod de determinare a coeficientului de rspuns pentru fiecare
compus al probei pentru analiz o reprezint utilizarea grsimilor standardizate din
lapte care au o compoziie de TG certificat.
c) Grsimi standard din lapte obinute n laborator
Se prepar aproximativ 1 g din amestecul de grsimi standard (punctul 4,
subpunctul 2, care conine cel puin trigliceridele saturate C 24, C30, C36, C42,
C48 i C54, precum i colesterol; n plus, de preferin, C 50 i C52) prin cntrire cu o
precizie de 1 mg, nregistrnd masa la 0,1 mg, pentru a obine o compoziie
relativ a TG asemntoare cu grsimile din lapte.
Se analizeaz n mod repetat o soluie de amestec de grsimi standard n n-hexan
sau n-heptan, conform subpunctului 4 din prezentul punct. Pstrnd aceeai
desfurare secvenional, se analizeaz repetat compoziia aproximativ a
grsimilor din lapte.
Din amestecul de grsimi standard, se determin coeficienii de rspuns ai TG.
Coeficienii de rspuns parial ai TG, care nu exist n amestec, se pot calcula prin
interpolare matematic. Coeficienii de rspuns obinui se aplic grsimilor din
lapte pentru a obine o compoziie standardizat. Grsimile standardizate din lapte,
astfel obinute, au un termen de valabilitate de mai muli ani, n condiii de
depozitare cu azot i la o temperatur maxim de 18 C.
4) Condiii de cromatografie
Not: Utilizarea coloanelor umplute sau a coloanelor capilare are ca rezultat o
rezoluie asemntoare cu figura 1. Descompunerea trigliceridelor cu numr par de
atomi de C nu se observ n mod obinuit i trebuie evitat.
a) Coloana umplut
Programul de temperatur - temperatura iniial a cuptorului se fixeaz la
210 C. Aceast temperatur se menine timp de 1 min. Apoi temperatura se
mrete cu 6 C/min. pn ajunge la 350 C. Aceast temperatur (final) se
menine timp de 5 min.
Temperaturile pentru detector i injector - ambele temperaturi se fixeaz la
370 C.
Gazul vector - se utilizeaz azotul cu un debit constant de aproximativ
40 ml/min. Debitul exact al gazului vector se ajusteaz, astfel nct C 54 este eluat
la o temperatur de 341 C.
Durata analizei - 29,3 min.
Volumul injectat - se injecteaz 0,5 l din soluia de prob de 5 % (fraciune de
volum).
Dac nu se desfoar nici o analiz a TG, se menine temperatura iniial a
cuptorului, se menin temperaturile detectorului i injectorului i se menine rata de
flux a gazului vector la un nivel constant, de asemenea i n timpul nopii, n
weekend sau n timpul concediilor. Acest lucru asigur performana optim a
coloanei.
b) Coloan capilar
Programul de temperatur - temperatura iniial a cuptorului se fixeaz la 80 C.
Aceast temperatur se menine timp de 0,5 min. Apoi temperatura se mrete cu
50 C/min. pn la 190 C i, apoi, cu 6 C/min. pn la 350 C. Aceast
temperatur (final) se menine timp de 5 min.
Temperatura detectorului - se fixeaz la 370 C.
Gazul vector - se utilizeaz azotul la un debit constant de aproximativ 3 ml/min.
Durata analizei - 34,4 min.
Volumul injectat - se injecteaz 0,5 l din soluia de prob de 1 % (fraciune de
volum).
Aceste setri se menin i n timpul perioadei de standby, pentru a se asigura
performane optime (litera a) din prezentul subpunct).
Setrile analitice prezentate la prezentul subpunct sunt adecvate pentru utilizarea
unei coloane cu diametru interior larg (0,53 mm ID). Dac se utilizeaz o coloan
cu alte dimensiuni sau alt faz, trebuie aplicate condiii diferite.
10. Integrarea, evaluarea i controlul performanei analitice
Se evalueaz vrfurile de pe cromatogram cu un sistem de integrare cu care se
poate trasa o linie de baz i cu care se poate realiza o reintegrare. n figura 1 este
prezentat o cromatogram integrat corect, n timp ce n figura 2 este prezentat o
eroare sporadic la sfritul liniei de baz dup C 54 care influeneaz procentajul
tuturor trigliceridelor. Vrfurile eluate dup C54 se exclud din evaluare.
Trigliceridele cu numr acil-C impar (2n + 1) se combin cu trigliceridele
anterioare cu numr par (2n). Nu se iau n considerare coninutul mic de C 56. Aria
procentelor trigliceridelor rmase, inclusiv colesterolul, se nmulete cu
coeficienii de rspuns corespunztori ai grsimii standard din lapte (de la ultima
calibrare) i se normalizeaz global la 100 conform punctului 11, subpunctul 1.
Figura 1. Exemplu de cromatogram trigliceridic a grsimii din lapte, cu linia
de baz trasat corect
Figura 2. Exemplu de cromatogram trigliceridic a grsimii din lapte, cu linia de
baz trasat incorect
Trigliceridele cu numr acil-C impar (2n + 1) se combin cu trigliceridele

anterioare cu numr par (2n). Nu se iau n considerare coninutul mic de C 56. Aria
procentelor trigliceridelor rmase, inclusiv colesterolul, se nmulete cu
coeficienii de rspuns corespunztori ai grsimii standard din lapte (de la ultima
calibrare) i se normalizeaz global la 100 conform punctului 11, subpunctul 1.
Pentru controlarea condiiilor de msurare, se compar coeficienii de variaie,
CV, exprimai procentual pentru diferite trigliceride prezentate n tabelul 1 i care
se bazeaz pe 19 analize consecutive pentru aceeai prob de grsime din lapte.
Dac valorile CV sunt semnificativ mai mari dect valorile date n tabelul 1,
condiiile de cromatografie nu sunt adecvate.
Tabelul 1. Coeficienii de variaie pentru coninutul de trigliceride (19 analize
consecutive)
Triglicerid CV %
C24 10,00
C26 2,69
C28 3,03
C30 1,76
C32 1,03
C34 0,79
C36 0,25
C38 0,42
C40 0,20
C42 0,26
C44 0,34
C46 0,37
C48 0,53
C50 0,38
C52 0,54
C54 0,60
Not: Valorile prezentate n tabelul 1 nu sunt obligatorii, dar sunt orientative
pentru controlul calitii.
Cu toate acestea, n cazul n care se accept valori mai mari ale CV, trebuie s se
respecte limitele de repetabilitate i de reproductibilitate din clauza 12.
1) Compoziia de trigliceride
a) Calcularea
Se calculeaz fraciunea de mas pentru fiecare TG (pentru i = C24, C26, C28, C30,
C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52, i C54) i pentru colesterol, wi ,
exprimat ca procent, din coninutul total de TG al probei pentru analiz prin
utilizarea formulei urmtoare:
A

1 x RF Si

(2)
A 1 x R F Si
w 1=

unde:
Ai - valoarea numeric a ariei vrfului pentru fiecare dintre TG din proba pentru
analiz;
RF si - coeficientul de rspuns pentru fiecare TG determinat prin calibrare
(punctul 9, subpunctul 3).
b) Exprimarea rezultatelor analizei
Rezultatele se exprim cu dou zecimale.
2) Valorile S
a) Calcularea
Valorile S, exprimate procentual, se calculeaz prin introducerea wi (subpunctul
1, litera a) din prezentul punct) calculat pentru procentul adecvat de TG n
formulele de la (3) la (7). Se folosesc toate formulele, indiferent de tipul suspectat
de grsime strin.
Ulei de soia, de floarea-soarelui, de msline, de rapi, de in, de germeni de ru,
de germeni de porumb, din semine de bumbac i de pete
S = 2,098 3 w C30 + 0,728 8 w C34 + 0,692 7 w C36 + 0,635 3 w C38 + 3,745 2
w C40 1,292 9 w C42 + 1,354 4 w C44 + 1,701 3 w C46 + 2,528 3 w C50 (3)
Grsime de palmier i grsime din smburi de palmier
S = 3,745 3 w C32 + 1,113 4 w C36 + 1,364 8 w C38 + 2,154 4 w C42 + 0,427 3
w C44 + 0,580 9 w C46 + 1,292 6 w C48 + 1,030 6 w C50 + 0,995 3 wC52 + 1,239 6
w C54 (4)
Ulei de palmier i seu de vit
S = 3,664 4 w C28 + 5,229 7 w C30 12,507 3 w C32 + 4,428 5 w C34 0,201 0
w C36 + 1,279 1 w C38 + 6,743 3 w C40 4,271 4 w C42 + 6,373 9 wC46 (5)
Untur
S = 6,512 5 w C26 + 1,205 2 w C32 + 1,733 6 w C34 + 1,755 7 w C36 + 2,232 5
w C42 + 2,800 6 w C46 + 2,543 2 w C52 + 0,989 2 w C54 (6)
Total
S = 2,757 5 w C26 + 6,407 7 w C28 + 5,543 7 w C30 15,324 7 w C32 + 6,260
0 w C34 + 8,010 8 w C40 5,033 6 w C42 + 0,635 6 w C44 + 6,017 1 wC46 (7)
b) Exprimarea rezultatelor analizei
Rezultatele se exprim cu dou zecimale.
3) Detectarea grsimilor strine
Se compar cele 5 valori S obinute la subpunctul 2, litera a) din prezentul punct
cu limitele S corespunztoare prezentate n tabelul 2.
Tabelul 2. Limitele S pentru grsimile pure din lapte
Grsimea strin Formu Limitele S
l (1)
Ulei de soia, de floarea-soarelui, de msline, (3) 98,05
de rapi, de in, de germeni de ru, de germeni de 101,95
porumb, din semine de bumbac i de pete
Grsime de palmier i grsime din smburi de (4) 99,42
palmier 100,58
Ulei de palmier i seu de vit (5) 95,90
104,10
Untur (6) 97,96
102,04
Total (7) 95,68
104,32
( ) Calculat pentru un nivel de ncredere de 99 %, astfel nct
1
adugarea de grsimi strine este indicat doar dac limitele de

detectare ale formulei respective sunt depite (tabelul 1).
Proba pentru analiz se consider grsime pur din lapte dac toate cele 5
valori S sunt cuprinse ntre limitele menionate n tabelul 2. Cu toate acestea, dac
o valoare S este n afara limitelor corespunztoare, se consider c proba conine
grsime strin.
Cu toate c fiecare formul de la (3) la (6) este mai sensibil pentru anumite
grsimi strine dect formula total (7) (tabelul 1), un rezultat pozitiv obinut doar
cu o singur formul de la (3) la (6) nu permite tragerea unor concluzii cu privire la
tipul de grsime strin.
Instruciunea nr. 2 prezint o modalitate de calcul al coninutului de grsime
vegetal sau animal n grsimea impur din lapte. Acest procedeu nu este validat,
fiind doar orientativ.
12. Precizia
1) Analiz interlaboratoare
Valorile pentru repetabilitate i reproductibilitate sunt determinate pe baza
formulelor de la (3) la (7), utilizndu-se grsimi pure din lapte, fiind posibil ca
acestea s nu fie aplicabile n cazul altor matrice dect cele prezentate.
2) Repetabilitate
Diferena absolut dintre dou rezultate individuale ale unui singur test, obinute
cu aceeai metod aplicat asupra unor materiale de testare identice, n acelai
laborator, de ctre acelai operator, utilizndu-se acelai echipament, la un interval
scurt de timp, nu va depi limitele din tabelul 3 n peste 5 % din cazuri.
Tabelul 3. Limitele de repetabilitate, r, pentru formulele de la (3) la (7)
Grsimea strin Formu r %
l
Ulei de soia, de floarea-soarelui, de msline, de (3) 0,6
rapi, de in, de germeni de ru, de germeni de porumb, din 7
semine de bumbac i de pete
Grsime de palmier i grsime din smburi de palmier (4) 0,1
2
0
Untur (6) 0,5
8
Total (7) 1,4
9
Diferena absolut dintre dou rezultate ale unui singur test, obinute cu aceeai
metod aplicat asupra unor materiale de testare identice, n laboratoare diferite, de
ctre operatori diferii, utilizndu-se un echipament diferit, nu va depi limitele
din tabelul 4 n peste 5 % din cazuri.
Tabelul 4. Limitele de reproductibilitate, R, pentru formulele de la (3) la (7)
Grsimea strin Formu R%

l
Ulei de soia, de floarea-soarelui, de msline, de (3) 1,0
rapi, de in, de germeni de ru, de germeni de porumb, din 8
semine de bumbac i de pete
Grsime de palmier i grsime din smburi de palmier (4) 0,4
0
1
Untur (6) 0,6
0
Total (7) 2,0
7
13. Incertitudinea de msurare
Incertitudinea extins pentru valoarea S se poate calcula cu ajutorul
repetabilitii, r, i a reproductibilitii, R.
Introducerea incertitudinii extinse (pe baza probelor martor) ntre limitele S din
tabelul 2 are ca rezultat extinderea limitelor S prezentate n tabelul 5.
Tabelul 5. Limitele S extinse pentru grsimile pure din lapte, inclusiv

incertitudinea extins
Grsimea strin Formu

l Limitele S ex
tinse
Ulei de soia, de floarea-soarelui, de msline, (3) 97,36
de rapi, de in, de germeni de ru, de germeni de 102,64
porumb, din semine de bumbac i de pete
Grsime de palmier i grsime din smburi de (4) 99,14
palmier 100,86
105,23
Untur (6) 97,65
102,35
Total (7) 94,42
105,58
14. Raportul de analiz
Raportul de analiz specific:
1) toate informaiile necesare pentru identificarea complet a probei;
2) metoda utilizat pentru prelevarea probelor, dac se cunoate;
3) metoda de analiz utilizat, n conformitate cu prezentul standard
internaional;
4) toate detaliile operaionale care nu sunt specificate n prezentul standard
internaional sau care sunt considerate opionale, mpreun cu detaliile
referitoare la orice incident care ar putea influena rezultatul (rezultatele)
testului;
5) rezultatul (rezultatele) testului care a fost obinut i, dac repetabilitatea a fost
verificat, rezultatul final stabilit care a fost obinut.
Instruciunea nr. 1
Prepararea coloanei umplute

1. Reactivi i echipament
1) Toluen (C6H5CH3).
2) Soluie de dimetildiclorsilan [Si(CH3)2Cl2]
Se dizolv 50 ml de dimetildiclorsilan n 283 ml de toluen
3) Soluie de unt de cocos, cu o fraciune de mas de 5 % unt de cocos n n-
hexan sau n-heptan
4) Faz staionar, 3-% OV-1 la 125 m pn la 150 m (100 pn la 120
ochiuri de sit) Gas ChromQ
5) Coloan de sticl, avnd un diametru intern de 2 mm i o lungime de
500 mm, n form de U
6) Echipament pentru umplerea coloanei
a) Coloan de umplere, cu capac care se nurubeaz, prevzut cu un
marcaj pn la care se poate umple cu cantitatea necesar de faz
staionar.
b) Sit fin, cu dimensiunea ochiurilor de sit de aproximativ 100 m, cu
capac care se nurubeaz pentru etaneizarea coloanei de sticl.
c) Vat de sticl silanizat, dezactivat.
d) Vibrator, pentru distribuia uniform a fazei staionare n timpul
umplerii.
e) Dispozitive de silanizare, pentru silanizarea suprafeei de sticl a
coloanei.
f) Vas Woulff.
g) Pomp de aspiraie a apei.
2. Silanizarea (dezactivarea suprafeei de sticl)
Dup conectarea vasului Woulff la pompa de aspiraie a apei, se introduce
tubul 2 (figura 3) n soluia de dimetilclorsilan. Se umple coloana cu aceast soluie
prin nchiderea robinetului. Se deschide robinetul din nou i apoi se ndeprteaz
cele dou tuburi. Se fixeaz coloana pe stativ. Se umple complet cu soluia de
dimetildiclorsilan cu ajutorul unei pipete.
Figura 3. Dispozitivul de silanizare
Legend
1 - tub 1
2 - tub 2
3 - pomp de aspiraie
4 - robinet
5 - coloan de sticl
6 - dimetildiclorsilan i toluen
Se las coloana n poziie vertical ntre 20 i 30 min. Apoi se nlocuiete vasul
Woulff cu un balon de filtrare. Se golete coloana prin conectarea acesteia la
pompa de aspiraie a apei (figura 4). Se cltete repetat coloana golit cu 75 ml de
toluen i 50 ml metanol prin introducerea tubului 2 n solvent. Coloana cltit se
usuc n cuptor la 100 C timp de aproximativ 30 min.
Figura 4. Dispozitivul de cltire
Legend
1 - tub 1
2 - tub 2
3 - pomp de aspiraie a apei
4 - balon de filtrare
5 - coloan de sticl
6 - agent de cltire
3. Umplerea
Coloana se umple cu ajutorul dispozitivului reprezentat n figura 5. Coloana de
umplere se umple cu faz staionar pn la marcaj. Captul inferior al coloanei de
sticl se sigileaz cu un dop de vat comprimat de sticl silanizat cu o lungime
de aproximativ 1 cm. Captul coloanei de sticl se nchide cu o sit fin.
Figura 5.Umplerea coloanei de sticl
Legend
1 - orificiu de ptrundere a azotului
2 - coloana de umplere care trebuie umplut cu OV-1 pn la marcaj
3 - coloana de sticl care trebuie umplut
4 - capac care se nurubeaz, cu filtru, prin care fibrele de sticl i faza
staionar sunt comprimate.
Coloana se umple cu faza staionar sub presiune (300 kPa i debit de azot).
Pentru a se obine o umplere uniform, continu i ferm, n timpul umplerii se
deplaseaz vibratorul n sus i n jos pe coloana de sticl. Dup umplere, la captul
cellalt al coloanei umplute se ataeaz un dop solid de vat de sticl silanizat.
Capetele care ies n exterior se taie. Dopul se mpinge n interiorul coloanei cu
civa milimetri cu ajutorul unei spatule.
4. Condiionarea
Pentru a se evita contaminarea, n timpul etapelor de la (a) la (c), captul din
spate al coloanei nu se conecteaz la detector. Coloana umplut se condiioneaz
dup cum urmeaz:
1) coloana se spal cu azot timp de 15 min, la un debit de 40 ml/min. i o
temperatur a cuptorului GC de 50 C;
2) coloana se nclzete cu 1 C/min. pn la 355 C, cu un debit al azotului de
10 ml/min;
3) coloana se menine la 355 C, timp de 12 h pn la 15 h;
4) se injecteaz de dou ori 1 l de soluie de unt de cocos, utilizndu-se
programul de temperatur al coloanei umplute prezentat la punctul 9,
subpunctul 4, litera a);
Not: Untul de cocos este format aproape n ntregime din trigliceride C 50 pn
la C54 cu punct ridicat de fierbere, reducndu-se eforturile condiionrii coloanei n
conformitate cu coeficienii de rspuns respectiv.
5) se injecteaz de 20 de ori 0,5 l de soluie de grsimi din lapte timp de 2
pn la 3 zile conform punctului 8, utiliznd indicaiile pentru coloana
umplut prezentate la punctul 9, subpunctul 4, litera a).
La probele pentru analiz se utilizeaz doar coloane cu coeficieni de rspuns
aproape de 1. Coeficienii de rspuns nu trebuie s depeasc 1,20.
Instruciunea nr. 2
Cuantificarea coninutului de grsimi strine

1. Generaliti
Tabelul 1 prezint limitele de detectare pentru diferite grsimi strine calculate
pentru un interval de ncredere de 99 %. Coloana din mijloc indic limitele de
detectare pentru cele mai bune formule de la (3) la (6).
Limitele de detectare a formulei totale (7), indicate de coloana din extrema
dreapt, sunt ceva mai mari. n principiu, formula (7) este necesar doar pentru
cuantificarea grsimilor strine.
Cu ajutorul tuturor formulelor pot fi detectate, de asemenea, combinaii ale
diferitelor tipuri de grsimi strine. Diferena de compoziie a TG dintre probele
individuale ale unui tip de grsime strin nu influeneaz semnificativ limitele de
detectare.
Dac se folosesc ambele formule individuale i ecuaia total, se aplic limitele
de detectare ale ecuaiilor individuale. Cu toate acestea, n anumite cazuri, valoarea
S pentru formula total este necesar pentru cuantificare.
Tabelul 6. Limitele de detectare cu o precizie de 99 % pentru grsimile strine
adugate n grsimile din lapte exprimate procentual
Grsime strin Formul individual % Formul total %
Ulei de soia 2,1 4,4
Ulei de floarea-soarelui 2,3 4,8
Ulei de msline 2,4 4,7
Ulei de cocos 3,5 4,3
Ulei de palmier 4,4 4,7
Ulei de smburi de palmier 4,6 5,9
Ulei de rapi 2,0 4,4
Ulei de in 2,0 4,0
Ulei de germeni de gru 2,7 6,4
Ulei de germeni de porumb 2,2 4,5
Ulei din semine de bumbac 3,3 4,4
Untur 2,7 4,7
Seu de vit 5,2 5,4
Ulei de pete hidrogenat 5,4 6,1
2. Calculare
Determinarea cantitativ a grsimii strine se realizeaz doar dac cel puin una
dintre limitele S (tabelul 2 sau tabelul 5) este depit. Pentru a se obine informaii
cantitative, se calculeaz fraciunea de mas a grsimii strine sau fraciunea de
mas a amestecului de grsimi strine din proba pentru analiz, w f, exprimat
procentual, cu ajutorul formulei urmtoare:
(100S)
wf =100
(100Sf ) (8)
unde:
S - rezultatul obinut prin introducerea datelor despre TG din grsimea din lapte,
la care s-a adugat o grsime strin sau un amestec de grsimi strine, n una
dintre formulele de la (3) la (7);
S f - o constant care depinde de tipul de grsime strin adugat.
Dac nu se cunoate tipul de grsime strin adugat la grsimea din lapte, se
utilizeaz o valoarea general pentru S f de 7,46 (tabelul 7). Se utilizeaz
ntotdeauna valoarea S obinut din formula (7), chiar dac limitele S pentru
aceasta nu sunt depite, spre deosebire de limitele altei formule.
Dac se cunosc grsimile strine, valorile individuale Sf ale acestora (tabelul 7)
se introduc n formula (8). Pentru a se calcula valoarea S, se alege formula
relevant pentru grsimea strin din formulele de la (3) la (6).
Tabelul 7. Valorile Sf pentru diferitele grsimi strine
Grsimea strin Sf
Necunoscut 7,46
Ulei de soia 8,18
Ulei de floarea-soarelui 9,43
Ulei de msline 12,75
Ulei de cocos 118,13
Ulei de palmier 7,55
Ulei de smburi de 112,32
palmier
Ulei de rapi 3,30
Ulei de in 4,44
Ulei de germeni de gru 27,45
Ulei de germeni de 9,29
porumb
Ulei din semine de 41,18
bumbac
Untur 177,55
Seu de vit 17,56
Ulei de pete 64,12
3. Exprimarea rezultatelor analizei
Rezultatele analizei se exprim cu dou zecimale.
Anexa nr. 21
Procedura aplicabil cnd rezultatele unei analize sunt contestate

(analiz chimic)
1. La cererea productorului, se poate realiza o analiz suplimentar prin
metoda relevant n alt laborator acreditat, cu condiia s fie disponibile
probe martor sigilate din produs care s fi fost depozitate n siguran de
autoritatea competent. Cererea se face n termen de 7 apte zile lucrtoare
de la notificarea rezultatelor primei analize. Analiza este efectuat n termen
de 21 de zile lucrtoare de la primirea cererii. Autoritatea competent trimite
aceste probe unui al doilea laborator, la cererea i pe cheltuiala
productorului. Cel de-al doilea laborator trebuie s aib competene
dovedite n realizarea analizelor n cauz.
2. Incertitudinile extinse (k = 2) pentru valoarea medie 1 pentru msurtorile
n1 repetate n laboratorul 1 i pentru valoarea medie 2 pentru msurtorile n2
repetate n laboratorul 2 sunt
1 1
1 1
n1 n2
3. R 2r () i respectiv
2
R 2r ()
2
U =2
1
U =2
2
unde:
r - deviaia standard a repetabilitii, iar
R - deviaia standard a reproductibilitii pentru metoda relevant.
Dac rezultatul y al msurtorii n laboratoare este calculat folosind o formul
de tipul
y = x1 + x2, y = x1 - x2, y = x1 x2 or y = x1 / x2,
n astfel de cazuri trebuie urmate modalitile obinuite de combinare a
deviaiilor standard pentru a obine incertitudinea.
4. Pentru a verifica dac rezultatele celor dou laboratoare corespund cu
deviaia standard R a reproductibilitii metodei, se calculeaz
incertitudinea extins a diferenei 1- 2.
1
2
n1
1
5. 2R 2r ( ) . Dac valoarea absolut a diferenei dintre valorile
n2
U =U 2 + U 2 =2
1 2 1 1
medii | 1- 2|, obinute de laborator, nu este mai mare dect incertitudinea

U
1 2
,
U
| 1- 2 | 1 2
,
rezultatele celor dou laboratoare corespund cu deviaia standard r a
reproductibilitii, iar media aritmetic a valorilor medii obinute de cele dou
laboratoare,
y 1 y 2
2 ,
este raportat drept rezultat final. n acest caz, incertitudinea extins este
1
2
n1
1
2R 2r ( ) .
n2
1
U y = U +U =
2 2
2 1 1
Lotul este respins pentru c nu respect limita legal superioar UL n cazul n

care
Uy
- >UL;
n caz contrar, lotul este acceptat ca respectnd UL.
Lotul este respins pentru c nu respect limita legal inferioar LL n cazul n
care
Uy
- <LL;
n caz contrar, lotul este acceptat ca respectnd LL.
Dac valoarea absolut a diferenei dintre valorile medii| 1- 2 |, obinute de
U U
laborator, este mai mare dect incertitudinea 1 2
, | 1- 2 | > 1 2
,
rezultatele celor dou laboratoare nu respect deviaia standard a
reproductibilitii.
n cazul n care a doua analiz o confirm pe prima, lotul este respins ca fiind
neconform. n caz contrar, lotul este acceptat ca fiind conform.
Rezultatele finale trebuie notificate de ctre autoritatea competent
productorului, ct mai curnd posibil. Costurile celei de-a doua analize sunt
suportate de productor, n cazul n care lotul este respins.

Proiect 5

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proiect 5

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proiect

GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA

Cu privire la aprobarea Cerinelor privind metodele de analiz i

n temeiul Legii 78-XV din 18 martie 2004 privind produsele alimentare

Prim-ministru interimar Gheorghe BREGA

CERINE PRIVIND METODELE DE ANALIZ I EVALUARE

Prezentele Cerine privind metodele de analiz i evaluare calitativ a

1. Cerinele privind metodele de analiz i evaluare calitativ a laptelui i a

II. Dispoziii generale

Lista metodelor de referin

Observaii la lista metodelor de referin:

Evaluarea conformitii unui lot cu limita legal

n cazul n care rezultatul final x al msurtorii se calculeaz utiliznd o

Evaluarea evaluatorilor i fiabilitatea rezultatelor n analizele senzoriale

Evaluarea senzorial a untului

Tabelul 1. Punctajul pentru unt

Aspect Consisten Arom+miros

Puncte Nr. Observaii Puncte Nr. Observaii Puncte Nr. Observaii

5 Foarte bine 5 Foarte bine 5 Foarte bine

tipul ideal tipul ideal tipul ideal

cea mai bun cea mai bun cea mai bun

(substan uscat (bine tartinabil) (cea mai fin arom

4 Bine (2) 4 Bine (2) 4 Bine (2)

nu exist defecte 16 tare nu exist defecte

nelegat (necompact), dezemulsionat, impur

2 Slab (defecte 2 Slab (defecte 2 Slab (defecte

nelegat (necompact), dezemulsionat, impur

1 Foarte slab (defecte 1 Foarte slab 1 Foarte slab

4 cu aspect granulat tare 23 spumos

5 separare a uleiurilor moale 24 miros de mucegai

7 granulat 16 27 uleios, cu gust de

11 sare nedizolvat 29 miros oxidat, miros

(1) Punctul 10.

3) Pentru a se obine uniformitate, uneori este de dorit ca, nainte de nceperea

Determinarea coninutului de trigliceride ale acidului enantic n unt, ulei de

Determinarea coninutului de vanilin n untul concentrat, unt sau smntn

Detectarea prin spectrometrie a etil esterului acidului beta-apo-8'-carotenic n

Determinarea sitosterolului sau a stigmasterolului din unt i unt concentrat

Metod de referin pentru detectarea laptelui de vac i a

0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamid (BIS)

15,00 g glicerol (87 % m/m)

i se completeaz cu ap pn la 100 ml, apoi se pstreaz produsul obinut n

9,0 ml soluie stock

500 l amfolit pH 3,5-9,5

250 l amfolit pH 5-7

250 l amfolit pH 6-8

5,75 g glicerol (87 % m/m)

Not: Se pstreaz substana n refrigerator, termen de valabilitate: maximum o

Este ilustrat jumtatea de sus a gelului IEF.

Figura 4b. Focalizare izoelectric a cazeinelor tratate cu plasmin din brnz

1 + = prob coninnd 1 % lapte de vac i dopat cu cazein pur de lapte de

Este ilustrat distana separatoare total a gelului IEF.

Figura 5. Suprapunerea densitogramelor probelor etalon (STD) i a probelor de

a, b - probe etalon coninnd 0, respectiv 1 % lapte de vac;

c-g - probe de brnz coninnd 0, 1, 2, 3 i 7 % lapte de vac.

Jumtatea superioar a gelului IEF a fost scanat la = 634 nm.

Metod de referin pentru detectarea bacteriilor coliforme din unt, lapte

Standardul SM SR EN ISO 6887-5.

Standardul SM ISO 4831.

Se inoculeaz probe de 1 g de unt sau de 0,1 g de lapte praf degresat sau

Se inoculeaz trei tuburi pentru fiecare prob.

n cazul n care cele 3 tuburi produc 3 rezultate negative, rezultatul este

1) n cazul n care cele 2 rezultate sunt negative, rezultatul este conform