Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr.

1, Decembrie 2005 67

NOTE DE CURS

Crioglobulinele - semnificaie clinic i determinare de

laborator
Cryoglobulins clinical importance and laboratory assesment

Ileana Funduc

Rezumat
Crioglobulinele sunt proteine sau complexe de proteine care precipit reversibil la temperaturi sczute.
Clasificarea lor cuprinde crioglobulinele monoclonale, mixte monoclonale policlonale i mixte policlonale. Meca-
nismul crioprecipitrii rmne nc obscur, iar incidena crioglobulinemiei mixte la pacienii cu HCV cronic nu es-
te nc total demonstrat. Totui, crioglobulinemia mixt ar putea reprezenta o punte de legtur ntre o tulburare
autoimun clasic i malignitate. Pentru a realiza o caracterizare adecvat, crioglobulinele sunt rcite sub tempera-
tura normal a corpului, se fac splri repetate pentru a ndeprta proteinele serice aderente nespecifice i alte ele-
mente sanguine; dup aceast etap, crioglobulinele se resolubilizeaz prin nclzire la 370C i apoi se analizeaz.
Deoarece testarea crioglobulinelor pn n prezent nu este standardizat, evalurile seriate nu pot fi un
ghid al evoluiei bolii sau a eficacitii terapiei, pn n prezent existnd doar o corelaie srac ntre parametrii de
laborator i prezena crioglobulinemiei. Valorile crioglobulinelor serice nu se corelez totdeauna cu prognoza i se-
veritatea bolii, ele trag doar un semnal asupra prezenei acestor proteine nc incomplet cunoscute.

Abstract
Cryoglobulins are proteins or protein complexes that undergo reversible precipitaton at low temperatures.
Their classification includes monoclonal, mixed monoclonal-polyclonal and mixed polyclonal cryoglobulins. The
mechanism of cryoprecipitation remains still unanswered and the incidence of mixed cryoglobulinemia in patients
with chronic HCV infection has only little evidence. However, mixed cryoglobulinemia could represent a crossroad
between a classic autoimmune disorder and malignancy.
In order to realise an adequate characterisation, cryoglobulins are cooled below core body temperature,
than repeatedly washed to remove nonspecifically adherent serum proteins and other blood elements. After such a
process the cryoglobulins are resolubled by warming to 370C and only then analyzed. Because the testing for cryo-
globulins is not standardized until this moment, serial evaluation cannot be a guide for disease evolution or for the
efficacy of therapy; it only remains a sign of the presence of these proteins, which are still not well known.
Crioglobulinele sunt proteine sau com-
plexe de proteine ce precipit reversibil la tempe-
raturi sczute.
68 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005
Clasificare
Crioglobulinele se clasific n unul din
cele 3 tipuri emise de ctre BROUET nc n
1974: primul, reprezentat de crioglobuline simple
monoclonale, al doilea i al treilea cuprinznd
crioglobuline mixte monoclonale cu policlonale
i respectiv exclusiv policlonale, n care de obicei
IgM are activitate de factor reumatoid.
n ultima vreme s-a extins aceast clasi-
ficare prin introducerea unui nou tip II-III sau II
special, ce cuprinde crioglobuline mixte cu
microheterogenitate. n acest tip se includ
crioglobuline cu o structur imunochimic diferi-
t de a celorlalte tipuri, fiind format din IgM
oligoclonal i urme de IgG policlonal.
Imunoglobulinele secretate de plasmoci-
tele clonelor de celul B ca rspuns la diversele
stimulri antigenice sunt caracterizate prin
heterogenitate. n condiii patologice, cnd sunt
afectate mecanismele de aprare imun, are loc o
disfuncie a celulei B, o restricie a heterogenitii
sintetizrii imunoglobulinelor, care se manifest
fie prin aspectul monoclonal, fie prin cel
oligoclonal de multi-benzi - cel puin dou - ce
implic una sau mai multe clase de imunoglobu-
line.
Microheterogenitatea IgM s-a considerat
a fi un rezultat al unei posibile tranziii de la tipul
III cu imunoglobuline exclusiv policlonale la cel
oligoclonal (tipul II-III) i apoi la cel monoclonal
(tipul II). Aceast transformare reflect un spec-
tru al continuitii biologice asupra prii clonelor
de celul B prin care expansiunea n rspunsul la
un stimul antigenic conduce la prevalena unei
clone fa de altele.
Mecanismul crioprecipitrii
Ipotezele recente asupra mecanismului
crioprecipitrii explicate pe baza biologiei mole-
culare nu s-au putut total dovedi, aa nct aceas-
t problem a rmas nc obscur. Aceasta se da-
toreaz caracteristicilor intrinseci ale componen-
ilor individuali mono- sau policlonali individuali
i/sau interaciei lor.
ntre crioimunoglobuline i imunoglobu-
line ce nu precipit la rece nu exist diferene.
Totui, ntre acestea s-au semnalat nite particula-
riti.
Pentru tipul I de crioglobuline:
obolanii indui cu un sindrom asemenea lu-
pusului i cu IgG3 (care se pare c are un rol
criogenic crescut, cci se asambleaz cu el
nsi prin interacii spontane Fc-Fc) au pre-
zentat reziduurile 6 i 23 din vH cu surplus de
pozitivitate fa de proteinele care nu
crioprecipit.
Crioprecipitabilitatea este inhibat de ctre
anticorpi antiidiotipici i antigene ce implic
ulterior regiunea variabil i locul de combi-
nare a antigenului n procesul de
crioprecipitare.
La unele proteine ce crioprecipit s-a obser-
vat descreterea coninutului de tirozin sau
descreterea accesibilitii reziduurilor de ti-
rozin i/sau creterea celui de triptofan.
Crioprecipitabilitatea s-ar datora unor anoma-
lii ale interaciei ap-protein (supraabunden-
de reziduuri hidrofobice) sau a unor trs-
turi unice ale structurii teriare.
Crioimunoglobulinele prezint un numr re-
dus de reziduuri de acid sialic; mai mult, n-
deprtarea glucidelor rmase n
crioimunoglobulin face s creasc tempera-
tura de solubilizare a sa. Ficatul rspunde de
ndeprtarea glicoproteinelor desialilate din
circulaie, incluznd i crioimunoglobulinele,
prin receptori specifici hepatocelulari pentru
astfel de proteine. De altfel, se tie c nivele
crescute de crioglobuline sunt asociate cu bo-
lile hepatice.
Interaciile intermoleculare ce rezult n
urma formrii unui crioprecipitat sunt slabe i
depind de condiiile experimentale ca temperatu-
ra, pH, putere ionic. Concentraia este un deter-
minant al crioprecipitabilitii, creterea ei de-
termin o cretere a temperaturii de
crioprecipitare. Prezena altor proteine serice aju-
t la solubilizarea crioglobulinelor.
 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005
Tipului II de crioglobuline i se aplic
multe din trsturile anterioare. Ele au proprieti
tipice de complexe imune, sunt mult mai mari ca
volum.
Crioprecipitarea apare numai cnd proteinei
monoclonale, de obicei IgM, i se permite s
reacioneze cu o imunogloublin normal, de
obicei IgG.
IgM ce fac parte din crioglobulinele mixte di-
fer de factorii reumatoizi clasici:
nu reacioneaz cu fragmentele Fc;
are reactivitate preferenial pentru frag-
mentele F(ab)2.
n complexele imune de tip II pot apare anti-
gene ca: HCV, HBV, HAV, virusul Epstein
Baar, complexe polinucleotide i anticorpi
ca: anticorpi anti-ADN, anticorpi fa de fi-
brinogen, limfocite, -fetoprotein, muchi
neted, ageni infecioi incluznd Coxiella
burnetti.
Crioglobulinele mixte reacioneaz cu com-
ponenii complementului i, pentru unele,
crioprecipitarea depinde de prezena C1q, ca
n LES. Crioglobulinele mixte activeaz
complementul in vitro, ca i cum ncorpora-
rea complementului n complexele imune,
cum sunt crioglobulinele mixte ar influena
semnificativ proprietile lor de solubilitate i
ar crete ulterior potenialul lor de lezare tisu-
lar. Nivelele de complement seric n
crioglobulinemia mixt scad n cazul C1q,
C4 i C2, sunt normale pentru C3 i normale
sau chiar crescute pentru C5, C9. Lipsa acti-
vrii C3 se pare c ar fi rezultatul descreterii
sintezei i creterii catabolismului n cazul
C1 i C4, sau, dup ali autori, s-ar datora
mecanismului regulator care controleaz
convertaza C3 a cii clasice a complementu-
lui.
n tipul II, defectele cleareance-lui de com-
plexe imune favorizeaz acumularea lor n
circulaie i depunerea n esuturi (piele, ri-
nichi, plmni). Acestea conduc la descrete-
rea abilitii complexelor de crioglobuline s
fixeze complementul i la fagociatarea lor
69
prin mecanismele mediate de Fc.
Asocierea crioglobulinemiei cu alte boli
n ultimii ani, datorit frecvenei hepati-
tei cronice concomitent cu crioglobulinemia mix-
t, s-a sugerat faptul c virusurile hepatotrope ar
avea un rol n patogenia bolii. HBV este un factor
cauzal al crioglobulinemiei mixte n mai puin de
5% din indivizi. Nu acelai lucru ns se ntmpl
cu HCV, care se pare c joac un rol important n
patogeneza crioglobulinemiei mixte. n ultimii 10
ani s-au semnalat 80% crioglobulinemii mixte tip
II asociate cu HCV, comparativ cu 14-26% cu 30
ani n urm. Legat de aceasta se presupune c
stimularea cronic cu HCV a celulelor B duce la
mutaii somatice ce genereaz molecule de factor
reumatoid de nalt afinitate, a cror producie
are loc sub un control inadecvat. De aceea s-a
explorat originea viral a crioglobulinelor, res-
pectiv mecanismul legat de virus al limfopro-
liferrii la bolnavii cu crioglobulinemie, legnd
infecia viral i autoimunitatea de tulburrile
limfoproliferative benigne i maligne.
Asocierea ntre HCV i unele tulburri
imunologice este o coinciden sau ntre ele exis-
t o legtur patogenic real ?
Crioglobulinele mixte sunt cauza sau
efectul bolii hepatice ?
Complexele imune din crioglobulinele
mixte se pot altera prin activarea celulelor
Kupffer; invers, alterarea celulelor Kupffer poate
cauza un clearence al complexelor imune sau a
crioglobulinelor mixte existente n bolile virale
cronice, deci apar modificri imunologice induse
de disfuncia hepatic.
Asocierea crioglobulinemiei cu HCV
prezint dovezi etiologice :
HCVARN din crioprecipitat este de 10
1000 ori mai mare ca n supernatant;
IgG legat de IgM - factor reumatoid este di-
recionat fa de proteina HCV;
Prezena proteinelor virale n esuturile leza-
te.
Detectarea HCV asociat cu crioglobu-
70 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005
linemie mixt nu trebuie efectuat cu anticorpi,
deoarece n acest fel nu se poate diferenia infec-
ia activ de cea pasiv i mai mult, anticorpul fa-
de HCV poate precipita cu crioglobulinele i
poate fi mascat. Determinarea HCV din esut (fi-
cat) trebuie efecuat sub form de HCV - ARN
prin hibridizare in situ sau PCR in situ.
HCV-ARN nu se asociaz cu severitatea
biopsiei hepatice, ceea ce sugereaz o cale pato-
genic extrahepatic a HCV pentru producerea
excesiv de crioglobuline. Cum HCV poate rs-
punde de diverse tulburri hepatice sau extrahe-
patice mediate imun, crioglobulinemia mixt
poate reprezenta o punte ntre o tulburare autoi-
mun clasic (hepatita autoimun, glomerulo-
nefrit, tiroidit etc.) i malignitate (limfom de
celul B, carcinom hepatocelular). Este ns greu
de demonstrat dac asocierea HCV cu unele tul-
burri imunologice este o coinciden sau o leg-
tur patogenic real. Virusul hepatitei C nrudit
cu limfoproliferare variind de la expansiunea ce-
lulei B benign poli- la oligoclonal, frecvent ob-
servat n crioglobulinemia mixt, ctre limfomul
malign, este un proces multifactorial cu multe
etape, la care multiple devieri genetice sunt nece-
sare. Deorece recent s-a artat existena unei rela-
ii de importan potenial ntre HCV, crioglobu-
line i limfom non Hodgkin de grad inferior, se
sugereaz extinderea determinrilor de crioglobu-
line n bolile limfoproliferative.
Exist ns teorii i n sens contrar asoci-
erii hepatitei C cu crioglobulinemiile. Acestea
susin c prezena HCV mpiedic oarecum pro-
ducerea crioglobulinelor, deoarece complexele de
crioglobuline conin deseori material genetic
HCV i Ac anti-HCV.
Diagnosticul de laborator
Crioprecipitatul preparat cu grij, innd
cont de jocul de temperatur 4 370C, care trebu-
ie respectat cu strictee ct i de puritatea maxim
n ceea ce privete eliminarea oricror alte ele-
mente sanguine sau proteine aderente, este evalu-
at prin una din modalitile cunoscute (criocrit,
diferena proteinelor totale sau a imunoglobuline-
lor din serul total i supernatant, spectrofotome-
tric la 280 nm). Apoi se continu cu analiza cali-
tativ, mult mai eficient dect cea cantitativ, ul-
tima neputnd s fac diferenierea dintre mono-
sau policlonalitate i chiar s eroneze valorile
imunoglobulinelor i ale altor parametri din cau-
za formei coloidale sub care se prezint
crioglobulinele. Mai mult, n cazul unor
crioglobuline, peste o treime din proteine nu sunt
imunoglobuline i, pe de alt parte, un procent
semnificativ de crioglobuline nu se mai poate di-
zolva la repetatele nclziri i apoi crioprecipitri.
Metodele clasice de determinare calitati-
v, n afar de imunofixare, este recomandabil de
a fi completate cu: immunoblotting combinat cu
imunofixare (separare pe poliacrilamid i detec-
tarea imunoglobulinelor cu As de imunoglobuline
coninnd determinani de lanuri uoare i grele),
electroforez bidimensional cu focalizare izoe-
lectric sau electroforez capilar prin subtracie,
cnd se determin curba de -globuline nainte i
dup crioprecipitare.
n contextul multitudinii factorilor ce se
coreleaz cu crioglobulinemia, pe lng metodo-
logia obligatorie descris exist i o serie de de-
terminri opionale:
Vscozitatea seric a crioprecipitatului la
370C, temperatura camerei i 40C, pentru a
arta variaiile ce ar reflecta modificrile n
reologia sanguin a microcirculaiei.
Fraciunile de complement
Activitatea de factor reumatoid.
Rezultatul final obinut n urma acestei
analize complexe permite includerea crioglobuli-
nelor studiate ntr-unul din tipurile n care acestea
se clasific.
La testarea serului coninnd crioglobuli-
ne exist i capcane:
Dac separarea electroforetic de rutin nu se
face la temperatura adecvat, proteina
monoclonal poate fi omis i valorile imu-
noglobulinelor aparent sczute.
Cuantificarea nefelometric a imunoglobuli-
nelor monoclonale poate s nu fie real, de-
 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005
oarece aparatele nu sunt standardizate n ra-
port cu acestea, iar crioprecipitatul, fiind n
form coloidal, afecteaz msurtorile prin
difracie ale imunoglobulinelor, complemen-
tului sau a activitii factorului reumatoid.
Crioglobulinele pot precipita la start n cazul
separrii electroforetice la rece, crend iluzia
unui peak monoclonal.
Concluzii
Testarea de laborator a crioglobulinelor
nu este standardizat i, n consecin, evalurile
seriale nu se pot utiliza ca ghid al activitii bolii,
sau de eficacitate a terapiei. Pn n prezent, exis-
t doar o corelaie srac ntre parametrii de labo-
rator ce indic prezena unei crioglobulinemii.
Compoziia crioglobulinelor mixte se poate mo-
difica n timp, n ceea ce privete variaiile IgM
cu evoluia bolii, scderea sa ca urmare a terapiei,
sau n cazul unei hipogammaglobulinemii. Efec-
tele acestor modificri asupra amplitudinii terma-
le, stoichiometriei complexelor cu rcirea, sau
proprietilor fizice ale crioglobulinelor au fost
limitat studiate. Ceea ce s-a urmrit pn n pre-
71
zent a fost variaia nivelelor de crioglobuline n
funcie de tratamentul aplicat (plasmaferez,
ageni citotoxici, interferon ) i aceasta utiliznd
un singur laborator de referin sau tehnici de
nalt standardizare.
Valorile crioglobulinelor serice, de obi-
cei, nu se coreleaz cu severitatea i prognoza bo-
lii. Valori foarte mici de criocrit, deseori greu de
cuantificat, se pot asocia cu sindrom crioglobuli-
nic sever; din contr, concentraii mari de
crioglobuline pot fi caracteristice bolilor
oligosimptomatice sau asimptomatice.
Corelaia HCV cu crioglobulinemia mix-
t poate constitui un model interesant de virus ce
dirijeaz o boal autoimun i neoplazic; n
acest fel, se arunc o nou lumin asupra legturii
strnse ntre tulburrile limfoproliferative - boala
autoimun i a interpretrii fenomenului autoi-
mun din cursul infeciei virale. Valoarea pre- i
postferezei cantitative pentru crioglobuline sau
imunoglobuline (n particular pentru IgM) i a
nivelelor HCV RNA pentru prezicerea evoluiei
clinice de lung durat rmne o problem de vii-
tor.