Sunteți pe pagina 1din 132

Mircea Leabu i Marina T.

Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.1. Consideraii generale asupra membranelor


biologice (biomembranelor)
2.1.1. Definiia noiunii de membran celular
Pentru ca o celul s supravieuiasc i s-i desfoare eficient activitatea
trebuie s îi asigure o independen relativ fa de mediul înconjurtor. Asta
înseamn c trebuie atât s-i protejeze structurile i echilibrele moleculare interne,
cât s i fie capabil s recepteze informaii despre ce se întâmpl în jurul su, s le
interpreteze i s îi adapteze corespunztor comportamentul. Pentru rezolvarea
acestor nevoi ale celulei trebuie s existe o component în organizarea celulei care s
delimiteze i s protejeze celula de variaiile necontrolabile din mediu. Aceast
component, acceptat intuitiv de mult vreme, a fost la început denumit
membran plasmatic. Noiunea îi are originea în lucrrile lui Wilhelm
Friedrich Benedikt Hofmeister (1824 – 1877) care, în 1867, a postulat c fiecare
mas plasmatic este mrginit la suprafaa exterioar de un strat subire mai
translucid, cu indice de refracie a luminii mai mare i cu densitate i tenacitate
crescute. Hofmeister a numit aceast structur de mrginire ca ”strat de piele” al
protoplasmei (Hautschicht). Noiunea de membran plasmatic i caracterul su
semipermeabil au început s fie menionate în manuale numai dup studiile de
osmolaritate ale botanistului, chimistului i farmacistului german Wilhelm
Friedrich Phillip Pfeffer (1845 – 1920), respectiv de permeabilitate ale
botanistului i geneticianului olandez Hugo Marie de Vries (1848 – 1935). O alt
denumire sinonim, sub care poate fi întâlnit ceea ce acum se denumete
membran celular este aceea de plasmalem.
Am putea defini lapidar membrana celular ca acea ultrastructur,
format în principal din lipide polare i proteine, care separ, dar i unete
celula cu mediul. Se va vedea c pe msur ce vom înainta în prezentarea
organizrii moleculare i a funcionrii membranei celulare definiia se va încrca de
semnificaii. Este aici momentul s menionm o convenie: vom numi ultrastructur
în cursul acestui manual orice component supramolecular din structurile vii, în
acest context din celule, care nu poate fi observat la microscopul optic (a crui
putere de rezoluie este de 0,2Pm), ci doar la microscopul electronic. Aadar,
convenional, în contextul biologiei celulare, numim ultrastructur orice element de
organizare a celulelor, esuturilor sau organelor care nu se poate observa decât la
microscopul electronic, iar structur ceea ce se poate observa la microscopul optic.
Membrana celular i, în general, biomembranele, unde includem i
endomembranele, au o grosime de 7-10nm (0,007-0,01Pm), adic sunt de ~20 de ori
mai subiri decât o structur observabil la microscopul optic.
O scurt incursiune în istoria evoluiei cunotinelor despre organizarea
molecular a membranei celulare poate fi util formrii gândirii tiinifice a tinerilor
interesai s se îndrepte ctre cercetarea biomedical.

2.1.2. Repere istorice în cunoaterea organizrii membranei


celulare
Prezena unei ultrastructuri care s înveleasc celula, pentru a o separa de
mediu i a menine homeostazia intern, a fost intuit, aa cum am amintit mai sus,
dinainte de a se cunoate din ce este format la nivel biochimic i cum este
organizat pentru a îndeplini funciile de baz: separarea mediului intracelular de cel
extracelular i permiterea interaciunilor celulei cu mediul, fr de care nu ar fi
posibil supravieuirea. Aceast intuire a reprezentat totodat o provocare pentru
oamenii de tiin din domeniu. Dup studiile de pionierat menionate mai sus,
primul care a contribuit la obinerea unor informaii utile în dezvoltarea
13
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

cunotinelor despre natura (bio)chimic a membranei celulare a fost Charles


Ernest Overton, care în 1899 [1] a raportat o serie de rezultate ce au artat c
permeabilitatea prin membran a unor compui chimici este cu atât mai ridicat cu
cât solubilitatea lor în lipide este mai ridicat. Aceste rezultate au dus la ideea c
lipidele sunt componente majore ale membranelor celulare. Experimentele au fost
efectuate atât pe celule vegetale, cât i pe eritrocite, dovedindu-se c lipidele
structureaz membranele celulare indiferent de regnul crora acestea aparin.
Acestei informaii i s-au adugat rezultatele studierii tipurilor de molecule din
diverse organisme, care au dovedit c lipidele sunt de departe cele mai abundente
molecule hidrofobe din sistemele celulare. Investigaiile asupra proprietilor fizice
ale membranelor celulare au artat c rezistena lor electric sau capacitana sunt în
domeniile celor obinute în sisteme create prin folosirea lipidelor izolate.
Evidenierea de ctre Irving Langmuir1 a faptului c lipidele amfifile întinse
într-un film pe o suprafa apoas se orienteaz cu capul polar ctre ap i cu prile
hidrofobe ctre aer, a reprezentat premiza unor experimente care au dus la
aprofundarea cunoaterii modului de organizare a membranelor celulare. Aceasta
pentru c, în 1925, medicul olandez Evert Görter (1881 – 1954) i asistentul su
Frank Grendel, folosind tehnica lui Langmuir au descoperit c lipidele extrase din
membrana eritrocitar acoper o suprafa dubl de monofilm, fa de suprafaa
populaiei eritrocitare din care lipidele au fost extrase [2]. Ei au propus c lipidele
sunt organizate în membranele celulare sub forma unui bistrat i pot fi considerai
prinii actualului model de organizare a membranei celulare, pe care îl vom dezvolta
i analiza detaliat ceva mai jos.
Urmtorul moment în înelegerea organizrii moleculare a membranei
celulare a fost în 1935, când James Frederic Danielli (1911 – 1984) i Hugh
Davson (1909 – 1996), ambii de la University College din Londra au stipulat c la
nivelul membranelor trebuie s existe i proteine întrucât tensiunile superficiale de la
suprafaa unui bistrat lipidic sunt mult mai ridicate decât cele de la suprafaa
membranelor celulare. Adugarea de proteine în mediul de formare a unui bistrat
lipidic duce la scderea tensiunilor superficiale. Pe baza acestor rezultate
experimentale Danielli i Davson au propus modelul „sandwich” de organizare a
membranei celulare conform cruia aceasta este format dintr-un bistrat lipidic
plasat între dou straturi de proteine globulare.
Modelul Danielli-Davson a prut s fie confirmat de aspectul trilaminat
evideniat electrono-microscopic pentru membranele celulare (Fig. 2.1). Examinarea
electrono-microscopic a membranelor într-o diversitate de celule i observaia c
toate arat la fel, l-a determinat pe J. David Robertson (1923 – 1995) s lanseze,
în 1957, modelul „unit membrane”. Toate membranele se evideniau ca dou
straturi (lamine) electrono-opace ce delimitau unul electrono-transparent. Modelul
meninea ideea c membranele sunt alctuite dintr-un bistrat lipidic plasat între
dou straturi proteice, iar observarea atent sugera c proteinele din exterior sunt
diferite de cele din interior [3].
Anii ’60 – ’70 ai secolului XX au reprezentat perioada unor dezvoltri care au
dus în 1972 la elaborarea de ctre Seymour Jonathan Singer (n. 1924) i Garth
L. Nicolson (n. 1943) a modelului în mozaic fluid de organizare a membranei
celulare [4], model valabil i pentru endomembrane, adic pentru toate tipurile de
biomembrane. Articolul care a introdus denumirea modelului a fost anticipat de o
lucrare a celor doi, din noiembrie 1971, în care au definit principiile organizrii
moleculare a membranei celulare [5]. În conformitate cu acest model, formaiunea

1 Irving Langmuir, chimist i fizician (1881 – 1957), a primit în 1932 Premiul Nobel în chimie pentru lucrrile sale

în chimia suprafeelor, aa cum a motivat juriul ("for his discoveries and investigations in surface chemistry").

14
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

de baz a unei membrane este un bistrat lipidic cu proprieti fluide manifestate


bidimensional, mozaicat cu proteine care fie sunt ataate de o parte sau de cealalt a
bistratului, fie sunt cufundate în acesta strbtându-l complet sau parial.

Fig. 2.1. Biomembranele (membranele celulare i endomembranele) se evideniaz în imaginile


de microscopie electronic de transmisie ca ultrastructuri cu aspect trilaminat. Punctele negre
de pe suprafaa celulei reprezint markeri electronodeni (aur coloidal cu diametrul de 5nm) pregtii
pentru evidenierea componentei glucidice a membranei. © Mircea Leabu, 2014.

Fig. 2.2. Imagine de microscopie electronic de transmisie pentru un preparat obinut prin
tehnica de îngheare-fracturare. În jumtatea dreapt a imaginii, unde fractura a trecut printre foiele
bistratului lipidic al unei membrane celulare, se observ abundena de particule proteice care
reprezint proteine ce strbat complet structura lipidic de baz. (Imagine pus cu amabilitate la
dispoziie de Dr. Florea Lupu, University of Oklahoma Health Sciences Center.) © Florea Lupu, 2014.

15
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.3. O reprezentare la nivel molecular a organizrii biomembranelor sub forma mozaicului
fluid. Desenul sugereaz diversitatea de componente (diferite lipide, variate proteine – în verde,
multiple structuri glucidice – hexagoane albastre) care argumenteaz eterogenitatea organizrii, ca i
distribuia asimetric a biomoleculelor la nivelul ultrastructurii. © Mircea Leabu, 2014.

Membranele, organizate în mozaic fluid (Fig. 2.3), se caracterizeaz prin


eterogenitate compoziional (bazat pe o mare diversitate de tipuri de molecule ce
intr în alctuirea lor) i prin aranjare asimetric (ce este conferit chiar de
elementul de baz, bistratul lipidic, la nivelul cruia foia extern conine
preponderent anumite tipuri de lipide, iar foia intern altele). Asimetria este sporit
de proteinele ce completeaz organizarea membranelor, cele adsorbite pe faa
extern fiind diferite de cele prezente pe faa intern, în timp ce proteinele cufundate
în structura lipidic de baz expun poriuni diferite ale lanului polipeptidic de o
parte sau de cealalt a bistratului. Pe de alt parte, componenta glucidic a
membranelor se gsete numai la suprafaa acestora, crescând caracterul asimetric al
organizrii lor. În sfârit, diversitatea de molecule care organizeaz membranele
prezint o permanent dinamicitate, ceea ce le confer un comportament fluid. Mai
mult, micarea componentelor lipidice sau proteice se realizeaz aproape în
exclusivitate în planul membranei, fr rsturnri spontane ale moleculelor care s
permit trecerea lipidelor dintr-o foi a bistratului în cealalt, sau s permit
proteinelor s treac poriunile expuse la exterior ctre interior, sau invers. Aceast
mobilitate restricionat la micrile în plan determin caracterul fluid manifestat
bidimensional al membranelor. Toate aceste caracteristici, datorate
comportamentului componentelor moleculare ale membranelor, se rsfrâng, într-un
mod fericit, asupra funcionalitii lor, aa cum se va vedea în detaliile de mai jos
asupra organizrii ultrastructurii care separ, dar i unete celula cu mediul
înconjurtor.

16
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

În ceea ce urmeaz ne propunem s abordm organizarea molecular i


funcionarea membranei celulare parcurgând drumul de la molecule la o structur
funcional.

2.1.3. Compoziia chimic global a membranei celulare


Pentru o abordare logic i angajarea în drumul pe care ni l-am propus, putem
pleca de la ceea ce conine sub aspect chimic membrana celular. În compoziia
membranelor se afl ap într-un procent de 20-30, restul de 70-80% fiind reziduu
uscat. Cât privete compoziia acestui reziduu uscat, substanele minerale sunt slab
reprezentate (pân la 1%), restul de 99% fiind substane organice, adic lipide 40-
50%, proteine 50-60% i o component glucidic de pân la 10%2.
Compoziia chimic global mai sus menionat poate prea contradictorie
cunotinelor noastre despre cantitatea de ap din sistemele biologice. Este corect, în
sistemele biologice apa reprezint aproximativ 70-80%, iar substana uscat numai
20-30%. Care este logica acestei situaii rsturnate? O putem înelege plecând de la
însi definiia membranei celulare: ultrastructura care separ, dar i unete celula
cu mediul.
S dezvoltm raionamentul. Ce caracter fizico-chimic are interiorul celular?
Unul hidrofil. Apa este solventul biologic fr de care reaciile biochimice care stau la
baza proceselor celulare nu s-ar putea desfura. Dar ce proprieti fizico-chimice are
mediul extracelular? Tot hidrofile. Aadar, membrana celular trebuie s separe
dou medii hidrofile. Este de ateptat, în conformitate cu legile fizicii, ca o barier
eficient între dou medii hidrofile s aib caracter hidrofob. Aa stând lucrurile,
aceast ultrastructur cu caracter hidrofob trebuie s exclud masiv apa, de unde
procentul redus de ap aflat la nivelul structurii membranelor. Aadar, soluia
optim s-a dovedit a fi o ultrastructur bazat pe lipide. Care sunt modalitile de
aranjare i rolurile lipidelor, proteinelor i componentei glucidice din organizarea
molecular a membranelor vom dezvolta în cele ce urmeaz, abordând pe rând
aceste componente i având în minte, în permanen, modelul mozaicului fluid de
organizare a ultrastructurii denumit membran celular.
Ceea ce mai putem meniona aici este faptul c aa cum se sugera din definiia
noiunii de membran celular aceasta trebuie s se comporte ca o barier între
mediile extracelular, respectiv intracelular, îns aceast barier nu trebuie s fie una
absolut ci selectiv, adic s permit interaciunea celulei cu mediul. De aceea,
putem afirma c membrana celular trebuie s îndeplineasc dou mari categorii de
funcii: (i) funcie de barier (adic s nu permit trecerea întâmpltoare prin ea)
i (ii) funcie metabolic (adic s asigure celulei schimburi de informaie i de
substan cu mediul, în ambele sensuri: dinspre exterior spre interior i dinspre
interior spre exterior).
Bibliografie selectiv
1. Overton E. (1899) Über die allgemeinen osmotischen Eigenschaften der Zelle, ihre vermutlichen
Ursachen und ihre Bedeutung für die Physiologie. Vierteljahrsschr. Naturforsch. Ges Zürich 44: 88–
114.
2. Gortel E, Grendel F. (1925) On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood. J Exp
Med. 41, 439–443.
3. Robertson JD. (1957) New observations on the ultrastructure of the membranes of frog peripheral
nerve fibers. J Biophys Biochem Cytol. 3: 1043-8.
4. Singer SJ, Nicolson GL. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science.
175: 720-31.

2 Repartizarea procentelor între substanele organice se raporteaz la totalul acestora; adic totalul lipide +
proteine + glucide = 100%. Atragem atenia cititorilor c în toate situaiile în care se opereaz cu procente,
acestea trebuie corect raportate la baza de referin.

17
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

5. Singer SJ, Nicolson GL. (1971) The structure and chemistry of mammalian cell membranes. Am J
Pathol. 65: 427-37.
6. Steck TL, Weinstein RS, Straus JH, Wallach DF. (1970) Inside-out red cell membrane vesicles:
preparation and purification. Science. 168: 255-7.
7. Steck TL. (1972) Selective solubilization of red blood cell membrane proteins with guanidine
hydrochloride. Biochim Biophys Acta. 255: 553-6.
8. Steck TL. (1974) The organization of proteins in the human red blood cell membrane. A review. J Cell
Biol. 62: 1-19.
9. Marchesi SL, Steers E, Marchesi VT, Tillack TW. (1970) Physical and chemical properties of a
protein isolated from red cell membranes. Biochemistry. 9: 50-7.
10. Tillack TW, Marchesi SL, Marchesi VT, Steers E Jr. (1970) A comparative study of spectrin: a
protein isolated from red blood cell membranes. Biochim Biophys Acta. 200: 125-31.
11. Tillack TW, Marchesi VT. (1970) Demonstration of the outer surface of freeze-etched red blood cell
membranes. J Cell Biol. 45: 649-53.
12. Segrest JP, Jackson RL, Andrews EP, Marchesi VT. (1971) Human erythrocyte membrane
glycoprotein: a re-evaluation of the molecular weight as determined by SDS polyacrylamide gel
electrophoresis. Biochem Biophys Res Commun. 44: 390-5.
13. Nicolson GL, Marchesi VT, Singer SJ. (1971) The localization of spectrin on the inner surface of
human red blood cell membranes by ferritin-conjugated antibodies. J Cell Biol. 51: 265-72.
14. Marchesi VT, Tillack TW, Jackson RL, Segrest JP, Scott RE. (1972) Chemical characterization
and surface orientation of the major glycoprotein of the human erythrocyte membrane. Proc Natl Acad
Sci U S A. 69: 1445-9.
15. Tillack TW, Scott RE, Marchesi VT. (1972) The structure of erythrocyte membranes studied by
freeze-etching. II. Localization of receptors for phytohemagglutinin and influenza virus to the
intramembranous particles. J Exp Med. 135: 1209-27.
16. Segrest JP, Kahane I, Jackson RL, Marchesi VT. (1973) Major glycoprotein of the human
erythrocyte membrane: evidence for an amphipathic molecular structure. Arch Biochem Biophys. 155:
167-83.

18
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.2. Lipidele membranare


2.2.1. Aspecte generale
Lipidele reprezint 40-50% din materialul organic al membranelor. Sub
aspect molecular ele constituie componenta biochimic de baz a membranelor
celulare (raportul molecular lipide/proteine fiind de ~50/1).
Aa cum stipuleaz modelul în mozaic fluid al organizrii
membranelor, lipidele sunt organizate în membrane sub form de bistrat, cu
capetele hidrofile la exterior i cozile hidrofobe în interior, bistrat care prezint
proprieti fluide, manifestate bidimensional. În bistrat lipidele au o distribuie
(dispunere) asimetric i sunt de o mare eterogenitate. Aadar, membranele celulare
au la baza organizrii lor un bistrat lipidic cu comportament fluid manifestat
bidimensional, caracterizat prin asimetrie i eterogenitate.
În cele ce urmeaz vom cuta s argumentm aceste afirmaii de ordin
general, detaliind aspectele legate de eterogenitatea lipidelor ce intr în componena
membranelor, dispunerea lor asimetric în cadrul bistratului i comportamentul lor
fluid, manifestat bidimensional, cu scopul de a înelege cum acestea asigur
funcionarea membranelor. Informaiile se vor nuana i ne vor ajuta s înelegem
mai bine cum opereaz membranele celulare, prin abordarea ulterioar a aspectelor
legate de proteinele membranare ca i prin discutarea componentei glucidice a
membranelor. De punctat c tot ce vom prezenta aici, în principiu, pentru
organizarea i funcionalitatea membranei celulare se aplic i membranelor din
interiorul celulelor, aa-numitele endomembrane, cele care structureaz organitele
delimitate de membrane.

2.2.2. Definiia lipidelor membranare


În problema definirii lipidelor membranare, nu ne propunem un enun cu
valabilitate absolut. Intenia este de a formula o definiie operaional, pentru
interesul nostru, astfel încât s avem aceeai percepie a noiunii. Vom structura
aceast definiie dup modelul logic al definirii prin gen proxim i diferen(e)
specific(e)3.

3 Logica, tiina care ne înva cum s gândim corect pe baza unor structurri raionale ale cunotinelor,
stabilete patru modaliti de construcie a definiiilor pentru noiuni (fiine, obiecte, fenomene). Aceste patru
modaliti conduc la patru tipuri de definiii care sunt: (i) definiiile genetice (constructive) prin care se
indic modul în care a luat fiin noiunea; (ii) definiiile ostensive (demonstrative sau prin indicare) prin
care se enumer câiva dintre membrii (preferabil reprezentativi) clasei din care face parte noiunea de definit;
(iii) definiiile enumerative prin care se enumer toi membrii clasei; (iv) definiiile prin gen proxim i
diferen(e) specific(e) prin care, mai întâi se stabilete o categorie mai larg de noiuni creia îi aparine i
cea pe care dorim s o definim (genul proxim), dup care se identific i se enumer atâtea caracteristici, specifice
noiunii pe care urmrim s o definim, câte sunt necesare pentru o extragere fr ambiguiti din genul proxim i
pentru definirea clar.
Pentru extinderea demersului intelectual al acestei note de subsol, s exemplificm cu definiii pentru fiecare tip
din cele patru.
În privina definiiilor genetice am putea propune una pentru ce este România i vom spune: România este o ar
european format printr-un proces îndelungat de unire a unor ri medievale mici, mai întâi a Moldovei cu ara
Româneasc, în a doua jumtate a secolului al XIX-lea, proces finalizat prin adugarea Ardealului i Basarabiei la
sfâritul primului rzboi mondial.
Ca exemplu de definiie ostensiv s încercm aplicarea la Oceania, spunând: Oceania este o regiune de insule din
Oceanul Pacific între care se afl Papua Noua Guinee, Insulele Marshall, Samoa, Noua Zeeland.
Definiia enumerativ o putem exemplifica pentru rile scandinave i vom putea spune: rile scandinave sunt
Norvegia, Suedia, Finlanda i Danemarca.
Nu vom da exemplu de definiie prin gen proxim i diferen(e) specific(e), deoarece folosim metoda în text la
definirea lipidelor membranare, dar vom remarca faptul c toate celelalte tipuri de definiii se adreseaz, de
regul, unor iniiai (în istorie sau geografie pentru exemplele folosite), pe când tipul de definiie ce face subiectul
acestei fraze este unul instructiv, care poate ajuta înelegerea i unora mai puin sau deloc iniiai. Definiia cu gen
proxim i diferene specifice este cel mai des utilizat în tiine, dac nu în exclusivitate. Prin acest tip de definiie
se pot defini chiar i obinuinele, despre care tot tiina logicii ne spune c sunt greu de definit. Condiia este ca
cel care definete s cunoasc foarte bine ceea ce trebuie s defineasc. Pentru cei care sunt instruii, acest tip de

19
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Lipidele membranare reprezint o categorie larg de substane organice


relativ insolubile în ap, solubile în cei mai muli solveni organici, cu caracter
amfifil, multe dintre ele fiind esteri ai unor alcooli polihidroxilici cu acizi grai (acizi
carboxilici cu lan alifatic liniar, adic o caten liniar coninând mai muli atomi de
carbon).
Se observ c, din punct de vedere al structurii chimice, definiia este foarte
cuprinztoare sub aspectul speciilor moleculare pe care le poate include. S nu
uitm, îns, c interesul nostru este de natur biologic, aa c, privind din aceast
perspectiv, mai multe întrebri pot frmânta dorina de a ptrunde logic domeniul.
Care ar fi acestea?
1. De ce lipide (în elementul de baz al organizrii biomembranelor care este
bistratul lipidic)?
2. Care dintre lipide (particip la organizarea membranelor)?
3. De ce (dispunere în) bistrat?
S lum pe rând aceste întrebri i s punctm aspecte care s ne ajute în a
gsi rspunsuri, cu rsfrângere asupra înelegerii funcionalitii membranelor.

2.2.3. Descrierea lipidelor membranare i caracterizarea


bistratului lipidic
2.2.3.1. Lipidele sunt componente ideale pentru structurarea
membranelor
Aceast seciune îi propune s rspund la prima întrebare din cele de mai
sus: de ce lipide? Caracterele fizico-chimice ale lipidelor le definesc drept molecule
ideale pentru structurarea de membrane, a cror principal menire este aceea de a
separa dou compartimente apoase (interiorul celulelor de mediul înconjurtor). De
ce le definesc drept molecule ideale? Pentru c structura chimic i caracterul lor
amfifil induce proprieti amfipate arhitecturii pe care o organizeaz, partea
hidrofob putând crea o barier, iar partea hidrofil conferind capacitatea de a
acomoda mediile apoase aflate de o parte i de cealalt, adic interiorul, respectiv
exteriorul celulei.
Lipidele sunt molecule mici cu posibiliti mari de mobilitate, astfel încât
structurile pe care le pot asambla nu sunt rigide (acest lucru reprezentând un avantaj
pentru biomembrane). Sunt molecule relativ insolubile în medii apoase, prezentând
tendin de asociere spontan, ceea ce confer structurilor pe care le formeaz
tenacitatea de a-i pstra integritatea sau de a se reface rapid, atunci când sunt
agresate mecanic. Tendina spontan de asociere implic un consum energetic
minim în pstrarea integritii bistratului, ceea ce reprezint un avantaj în economia
celular. Dei sunt molecule mici, structura lor este deosebit de complex (chiar
numai rememorând definiia, dar i, cum se va vedea în cele ce urmeaz, când vom
rspunde întrebrii “Care dintre lipide?”). Vom vedea c aceast complexitate
chimic este exploatat judicios de celul (vezi la seciunea despre rolul lipidelor
membranare). Dac ar fi s punctm, pentru început, avantajele ce rezult în privina
structurrii membranelor, notm c defectele, ce ar putea aprea în structura
chimic a lipidelor membranare sau în organizarea bistratului, sunt uor de acceptat
i, ulterior, de corectat, fr a induce efecte biologice catastrofale (caracterul amfifil
nu se pierde). Mai mult, modelarea structural a lipidelor, dup cum va reiei mai jos
(vezi la seciunea despre rolul lipidelor membranare), care se face printr-un bagaj
enzimatic adecvat, consistent i bine elaborat, folosete integrrii celulei în contextul
biologic în care se afl i funcioneaz.

definiie este elocvent din punct de vedere formator, deoarece creeaz o imagine sugestiv pentru obiectul,
noiunea sau fenomenul care se definete.

20
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.2.3.2. Clasificarea lipidelor membranare


Prin ceea ce vom include în rspunsul la întrebarea: “care dintre lipide?” vom
argumenta caracterul eterogen al organizrii moleculare a membranelor celulare.
Biochimia descrie o mare diversitate de clase de lipide, grupate în dou mari
categorii: lipide complexe, caracterizate prin prezena în structura lor a acizilor grai
(acilgliceroli, fosfogliceride, sfingolipide, ceruri) i lipide simple (steroizi,
prostaglandine i terpene). Ne putem întreba, pe bun dreptate, dac toate aceste
clase de lipide pot fi întâlnite în structura membranelor celulare. Ei bine, rspunsul
este: NU! În membranele celulare întâlnim numai trei tipuri de lipide pe care le
putem clasifica, în funcie de structura lor chimic global, în: (1) fosfolipide, (2)
colesterol i (3) glicolipide.
Enumerarea este în funcie de abundena în care apar. Fosfolipidele reprezint
70-75% dintre lipidele membrane, colesterolul 20-25%, iar glicolipidele 1-10%. O
meniune de fcut, în legtur cu glicolipidele din membranele celulelor animale,
este aceea c ele sunt din clasa sfingolipidelor (vezi despre sfingolipide mai jos, la
clasificarea în funcie de poliolul din structur). Iat, în aceast prim clasificare a
lipidelor membranare, o prim dovad a eterogenitii lipidelor membranare.
Ideea de eterogenitate a lipidelor membranare sporete, îns, dac ne-am
propune s abordm chiar i numai complexitatea tipurilor de lipide din clasa
fosfolipidelor, cele mai bine reprezentate lipide din membranele celulare, sub
aspectul abundenei. Acestea se pot clasifica, în funcie de poliolul din structur în:
(i) fosfogliceride (glicerofosfatide) – dac poliolul este glicerin (un
triol);
(ii) fosfosfingozide (sfingofosfatide, sau simplu sfingozide) – dac
poliolul este sfingozin, de fapt un aminodiol cu un lan alifatic (acesta
constituie unul din lanurile alifatice ale cozii hidrofobe, cel de al doilea
fiind un acid gras inserat printr-o legtur amidic la gruparea amino a
sfingozinei).
Dar eterogenitatea fosfolipidelor membranare nu se termin aici. Ea se
nuaneaz prin analiza detaliilor referitoare la structura lor chimic. În cele ce
urmeaz, vom discuta despre eterogenitatea structural a fosfogliceridelor, dar
menionm c unele aspecte se extind i asupra sfingozidelor.
Structura de principiu a unui fosfoglicerid este reprezentat grafic, în mod
intuitiv, în Fig. 2.4. Se observ c pe scheletul polialcoolului (glicerina) se afl grefate
pe de o parte (la hidroxilii din poziiile 1 i 2) dou lanuri alifatice provenind de la
acizii grai esterificai cu gruprile hidroxil (acestea formând coada hidrofob a
lipidului membranar), iar, pe de alt parte (la hidroxilul din poziia 3), o molecul,
notat simbolic cu X (variabil), ataat prin intermediul unei grupri fosfat,
împreun formând partea esenial a capului hidrofil al fosfolipidului.
În funcie de compusul hidrofil, variabil X, fosfogliceridele se împart în:
(i) fosfatidilcoline (prescurtare internaional PC, denumire uzual
lecitin), când X este colin (Fig. 2.5);
(ii) fosfatidiletanolamine (PE), X fiind etanolamin;
(iii) fosfatidilserine (PS), la care X este serin;
(iv) fosfatidilinozitoli (PI), în care X este inozitol;
(v) acid fosfatidic (PA), cu X-ul fiind, simplu, un atom de hidrogen.
Fosfolipidele enumerate mai sus se afl în diferite proporii în membranele
diverselor celule, dei exist date care le clasific în anumite intervale de abunden,
cum se va meniona puin mai jos. Celula controleaz aceste rapoarte între cantitatea
de diferite fosfolipide în membrane în funcie de nevoile ei, în diferitele situaii
concrete în care se poate afla.

21
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.4. Structura schematic, de principiu, a unui fosfoglicerid. În


verde este reprezentat miezul glicerolului; în cafeniu sunt reprezentate
lanurile alifatice ale acizilor grai; cu X, în albastru, este reprezentat
partea variabil din capul hidrofil.

Echivalentul fosfatidilcolinelor pentru sfingofosfolipidele membranare sunt


sfingomielinele (SM). De amintit aici (pentru sporirea ideii de eterogenitate a
fosfolipidelor membranare) i dou tipuri de fosfolipide ”neuzuale”: 1) fosfolipidele
în care dou molecule de acid fosfatidic sunt condensate la hidroxilii laterali ai unei a
treia molecule de glicerin, formând cardiolipine (1,3-difosfatidil-gliceroli),
fosfolipide specifice membranei mitocondriale interne; 2) fosfolipidele echivalente
fosfatidilcolinelor sau fosfatidiletanolaminelor, care în poziia 1 a glicerinei au
eterificat un alcool gras nesaturat cu dubla legatur între C1 i C2, numite
plasmalogene i reprezentând ~10% dintre fosfolipide în creier, muchi, testicul,
rinichi. De remarcat c în muchiul cardiac nivelul plasmalogenelor ajunge la 50%,
speculându-se c ar putea proteja miocardul fa de efectul speciilor reactive de
oxigen de tipul oxigenului singlet.
Cât privete abundena sub care tipurile de fosfolipide apar în organizarea
bistratului, PC, SM, PE i PS sunt majoritare, reprezentând fiecare, în medie, dac ar
fi s calculm considerând toate membranele despre care
avem date, între 20 i 25%. PI i PA sunt fosfolipide mai
slab reprezentate, însemnând pân la 10-15% primul,
respectiv 1-2% cel de-al doilea; în ciuda acestui fapt (sau
poate tocmai de aceea) aceste dou fosfolipide sunt
implicate în procese celulare deosebit de importante (vezi
la rolul lipidelor membranare). Dincolo de aceste valori
medii, mai uor de reinut, abundena fiecrui tip de
fosfolipid în diversele biomembrane variaz, îns, în limite
destul de largi [1].

Fig. 2.5. Structura unei fosfatidilcoline (1-stearil-2-oleil-fosfatidil-


colin). Lecitina, denumirea uzual a acestui fosfoglicerid, vine de la
cuvântul  (lekithos), care în limba greac înseamn glbenu
de ou, întrucât acesta are un coninut foarte bogat în lecitin.

22
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.6. Lipidele membranare în foiele bistratului. Este evideniat diversitatea i distribuia
difereniat între cele dou foie ale bistratului, inducând membranelor caracterul eterogen i
asimetric.4 Aceast reprezentare simbolic a bistratului lipidic i tipurilor de lipide membranare va fi
utilizat în figurile din carte ori de câte ori este nevoie. © Mircea Leabu, 2014.

Dup prime argumente referitoare la eterogenitatea lipidelor membranare,


aduse pân în acest moment, ne aflm acum în situaia de a putea puncta aspecte
legate de dispunerea asimetric a fosfolipidelor în biomembrane (Fig. 2.6).
Experimental s-a dovedit c PC i SM sunt preponderent distribuite în foia extern a
bistratului, în timp ce PE este preponderent distribuit în foia intern, iar PS i PI
sunt, dup datele existente pân în prezent, aproape exclusiv în foia intern, în
condiii normale [2]. Mai mult, apariia PS în foia extern a bistratului reprezint o
dovad timpurie a intrrii celulei într-un proces apoptotic [3-5]. De asemenea,
activarea plachetelor sanguine este însoit de apariia PS în foia extern a
bistratului lipidic membranar [6]. Colesterolul este, în general, egal distribuit între
ambele foie ale bistratului, dei anumite situaii pot determina o redistribuire
asimetric a sa. Glicolipidele se afl numai în foia extern a bistratului lipidic. De
curând, distribuia asimetric a fosfolipidelor bistratului lipidic membranar a început
s fie investigat în contextul anumitor patologii [7, 8], afectarea ei fiind însoit de
defecte în funcionarea normal a celulelor.
Ideea eterogenitii fosfolipidelor membranare este argumentat i de
diversitatea tipurilor de acizi grai care intr în structura lor. Acetia au un numr
par de atomi de carbon cuprins între 12 i 24 (C12-C24), dei limitele valorilor
menionate sunt controversate, în sensul c ar fi prea largi pentru cea inferioar i c
ar fi mai precaut s considerm cifra 14 ca adevrat. La acizii grai cu mai puin de
12 atomi de carbon, solubilitatea în ap a lipidelor pe care acetia le formeaz crete
prea mult, ceea ce poate afecta integritatea bistratului i rolul de barier al acestuia.
Acizii grai cu mai mult de 24 de atomi de carbon în molecul sporesc prea mult
hidrofobicitatea lipidelor i îngroa bistratul reducând eficiena sub aspectul
proprietilor de permeabilitate selectiv i îi reduc fluiditatea, prin creterea
interaciunilor la nivelul cozilor hidrofobe. Aadar, din motive de eficien în
funcionarea membranelor acizii grai evideniai a structura lipidele membranare
conin între 12(14) i 24 de atomi de carbon. Ei pot fi acizi grai saturai sau

4 Exist între profesionitii domeniului o convenie ca atunci când în desene, scheme sau imagini de microscopie
electronic se prezint poriuni din membranele celulare spaiul extracelular s se aeze sus (ctre nord), iar
citosolul jos (ctre sud). Vom respecta în carte aceast convenie.

23
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

nesaturai, cu catena hidrocarbonat neramificat. În ceea ce privete poziionarea


acizilor grai în structura glicerofosfatidelor putem face urmtoarele afirmaii:
1. În poziia 1 a glicerinei, de regul, se afl esterificat un acid gras saturat. Cei
mai des întâlnii sunt (i) C14, acidul miristic, (ii) C16, acidul palmitic i (iii)
C18, acidul stearic. O ordine a frecvenei sub care apar ar fi: C16 > C18 > C14.
2. În poziia 2 a glicerinei, de regul, este esterificat un acid gras nesaturat. Cei
mai des întâlnii sunt (i) C18:1,5 acidul oleic, (ii) C18:2, acidul linoleic i (iii)
C18:3, acidul linolenic. Trebuie s amintim aici, pentru rolul su deosebit de
important (vezi “Rolul lipidelor membranare”), acidul arahidonic sau
acidul eicosatetraenoic (C20:4).
De menionat, în încheierea acestui comentariu, c acizii grai din sfingolipide
sunt, de regul, saturai.
Înainte de a trece la aspecte mai detaliate asupra organizrii lipidelor la
nivelul membranelor i cum aceasta se rsfrânge asupra comportamentului
bistratului lipidic i funcionalitii sale, merit de punctat, pentru o ultim
argumentare a amplei eterogeniti a lipidelor membranare, faptul c, luând în
considerare cele dou poziii de esterificare i doar cei 20 de acizi grai mai des
întâlnii, numrul diverselor entiti moleculare din fiecare tip de fosfolipid (PC, PE,
PS, PI, SM) poate atinge valoarea de 400. Bineîneles c aceste valori teoretice nu se
regsesc în realitate dintr-o multitudine de motive de constrângere specifice
sistemelor biologice.
2.2.3.3. Structura de bistrat rezolv dezideratul esenial al organizrii
membranei
Vom încerca s precizm aici câteva argumente logice pentru a rspunde
întrebrii „De ce bistrat?”. Bistratul este cea mai simpl form de organizare a
lipidelor care poate închide un volum mare de mediu hidrofil, spre a-l separa de un
altul, tot hidrofil (capetele hidrofile la exterior, putând acomoda cele dou medii
hidrofile; cozile hidrofobe în interior, în adâncimea structurii, conferind rolul de
barier). Aadar, bistratul este o form de organizare a lipidelor amfifile care poate
corespunde dezideratelor celulelor de a fi separate de mediul înconjurtor i de a-i
menine într-o manier eficient homeostazia intern.
Asamblarea în bistrat se poate face spontan, fiind deci favorizat energetic, iar
bistratul nu poate prezenta, din considerente termodinamice, capete libere. Acest
lucru confer membranelor tenacitate în pstrarea integritii structurale i
capacitate de refacere rapid chiar în cazul unor distrugeri datorate agresiunilor
mecanice.
Organizarea sub form de bistrat i dispunerea asimetric a componentelor
acestuia confer proprieti fizico-chimice diferite celor dou fee ale membranei;
mai mult, asigur comportament independent celor dou fee ale membranei, dar i
solidar, atunci când nevoile celulei o cer, aceasta având cile de a controla
comportamentul (independent sau solidar) al componentelor membranare.
2.2.3.4. Starea fizic a bistratului lipidic
Discuia asupra strii fizice a bistratului lipidic îi propune s ne dea o
imagine intuitiv privind efectele comportamentului bistratului asupra funcionrii

5 În simbolistica notrilor abreviate ale acizilor grai, prima cifr din indicele inferior reprezint numrul de
atomi de carbon din molecul, „:” reprezint simbolul pentru prezena dublelor legturi, iar cifra a doua
reprezint numrul de duble legturi din molecul. În biochimie notaiile pot fi mult mai detaliate pentru
indicarea suplimentar a poziiei dublelor legturi în lanul alifatic, îns, în economia discuiei noastre i în
înelegerea implicaiilor biologice, aceste detalii nu sunt semnificative. Totui, variabilitatea poziionrii dublelor
legturi în acizii grai nesaturai reprezint un argument suplimentar al eterogenitii lipidelor membranare (în
special pentru fosfolipide).

24
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

membranelor. Bistratul lipidic este fluid, adic într-o continu dinamic, aceasta
având efect asupra interrelaiilor dintre moleculele care îl compun, interrelaii care
sunt într-o permanent modificare. Fluiditatea bistratului lipidic este o rezultant a
diverselor posibiliti de micare a lipidelor ce îl alctuiesc. În ce const aceast
diversitate? Lipidele membranare pot executa urmtoarele tipuri de micri:
1. Micri intramoleculare, pe care lipidele le realizeaz în raport cu propria
lor structur (în raport cu propria lor ax, în raport cu propria lor geometrie), spaiul
ocupat de ele putând fi aproximat cu un cilindru având o baz cu suprafaa de ~60 Å2
(raz de ~4.4 Å) i o înlime de ~30 Å. Aceste micri intramoleculare pot fi:
x De rotaie, cu o frecven de 109 rotaii/s; aceste micri izvorsc din
capacitatea lanurilor acizilor grai de a se roti în jurul legturilor C-C, însoit
de vibraia atomilor de carbon angajai în legtur, iar aceste micri se
rsfrâng asupra comportamentului întregii molecule, prin cuplurile de fore pe
care le induc; rezultanta acestui „zbucium” intern molecular este micarea de
rotaie a moleculei lipidice în ansamblu.
x De flexie a cozilor hidrofobe, cu o frecven de 108 flexii/s; aceste micri
trebuie înelese tot ca rezultat al micrilor din interiorul moleculelor de lipid,
la nivelul cozilor hidrofobe ale acizilor grai nesaturai, care, din cauza
împiedicrilor datorate prezenei celuilalt acid gras din structur, nu pot
executa, de regul, decât micri asemntoare tergtorului de parbriz, dei
mobilitatea celuilalt lan, saturat, poate permite chiar rotaii complete; efectul
la nivelul întregii molecule este acela al micrii de flexie a cozii.
2. Micri intermoleculare, care implic schimbarea poziiei moleculelor de
lipid unele în raport cu altele. Acestea pot fi:
x Micri de translaie (difuzie lateral), micri ale lipidelor în planul
membranei, în aceeai foi a bistratului, unele printre altele; dinamicitatea
acestei micri este sugerat de frecvena schimbrilor de direcie, care este de
107/s, distana parcurs de un lipid în unitatea de timp neavând o semnificaie
biologic major. Trebuie menionat faptul c prezena colesterolului în
bistrat determin o diminuare a mobilitii laterale.
x Micri “flip-flop”, denumite astfel prin termenul importat din limba
englez, adic micri de trecere a lipidelor dintr-o foi a bistratului în
cealalt; aceste micri presupun o rsturnare a moleculei în planul
membranei, pentru a-i pstra capul hidrofil la exteriorul structurii, adic
trecerea capului hidrofil prin poriunea hidrofob a membranei; frecvena
acestor micri este foarte mic, practic nul (dac ar fi s riscm o cifr, am
putea spune c aceast micare ar putea avea loc o dat pe lun pentru fiecare
molecul individual), ceea ce pare logic; exist totui o endomembran la
nivelul creia micarea de “flip-flop” are loc frecvent i anume membrana
reticulului endoplasmic (aspecte ce vor fi detaliate în capitolul “Biogeneza i
traficul intracelular al membranelor” din volumul al II-lea al crii).
Valorile pentru frecvene, mai sus menionate, sunt rezultatul unor msurtori
fizice pe bistraturi artificiale. În membranele celulare i în biomembrane, în general,
micrile lipidelor nu se supun legilor micrii browniene, ci sunt mai reduse, fiind
limitate de organizarea molecular complex i de ultrastructurile proteice corticale,
aflate în spaiul citosolic de sub membrane [9].
Revenind la tema acestei seciuni, s punctm c absena practic a micrilor
“flip-flop” explic bidimensionalitatea strii fluide a bistratului lipidic, elementul de
baz din organizarea membranelor celulare. Micrile lipidelor se manifest practic
numai în cadrul aceluiai strat al bistratului. De asemenea, frecvena extrem de
redus a micrilor “flip-flop” are ca efect meninerea distribuiei asimetrice a

25
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

moleculelor de lipide între cele dou straturi, distribuie construit de celul cu mare
consum energetic odat cu biogeneza de novo a membranelor (vezi la “Biogeneza
membranelor” în volumul al II-lea). Manifestarea bidimensional a fluiditii
bistratului lipidic d membranei celulare caracterul de structur cu proprieti
mezomorfe, proprieti specifice cristalelor lichide. Acest comportament mezomorf
este accentuat de capacitatea lipidelor de a organiza microdomenii bogate în
sfingolipide (parte dintre ele glicolipide), colesterol i anumite proteine membranare.
Aceste microdomenii sunt denumite “plute lipidice” (în englezete ”lipid rafts”)
i au deosebit importan atât structural (organizeaz ultrastructuri specializate
ale membranei, cum ar fi caveolele), cât i metabolic inând laolalt molecule i
macromolecule destinate a funciona împreun în complexe supramoleculare [10].
Pentru a înelege mai bine organizarea microdomeniilor de membran, s
menionm c lipidele, aa cum nu sunt echilibrat repartizate între cele dou foie ale
bistratului, nu sunt omogen amestecate nici în cadrul fiecrei foie a bistratului, ci se
asociaz într-un mod neomogen pe baza unor considerente fizico-chimice. Plutele
lipidice fie planare, fie invaginate sub forma caveolelor (numite vezicule
plasmalemale în celula endotelial) se caracterizeaz printr-o fluiditate mai mic în
comparaie cu restul bistratului. Prezena plutelor lipidice i eterogenitatea lor susin
i nuaneaz ideea de organizare a membranelor ca un mozaic fluid. Plutele lipidice
pot fi asemuite unor sloiuri de forme, dimensiuni i compoziie biochimic variate, ce
plutesc în oceanul lipidic mai puin specific organizat. Caveolele reprezint o form
de plute lipidice, ce se dispun individual sau în ciorchini la nivelul membranei.
Eterogenitatea plutelor lipidice a fost evideniat prin interpretarea
rezultatelor diferitelor metode de obinere sau de studiu:
- diveri detergeni neionici utilizai (duc la fraciuni cu compoziie diferit);
- sonicarea preparatelor de membrane i analizarea fraciunii uoare (alte
rezultate);
- analize imunocitochimice (diferite încrcturi proteice la nivelul diverselor
microdomenii reprezentate de plutele lipidice).
Dei rezultatele experimentale sunt, în anumite limite, variate, sugerând
diversitatea compoziional a plutelor lipidice, se pot extrage, totui, câteva
caracteristici generale [10]:
- colesterolul este de 3-5 ori mai abundent decât în restul membranei i reprezint
33-50% din totalul lipidelor la acest nivel;
- sfingolipidele (SM i glicolipidele) sunt îmbogite i reprezint 30-35% dintre
lipidele din plute;
- glicerofosfolipidele sunt srac reprezentate (în comparaie cu restul membranei);
d30% pentru PC + PE, fa de ~50% în restul membranei;
- lipidele specifice foiei interne a bistratului (PS, PI) sunt slab reprezentate la
nivelul plutelor lipidice;
- în foia intern de la nivelul plutelor, lipidele conin preferenial acizi grai
saturai (prin aceasta, s-ar putea realiza necesarul de rigiditate corespunztor
celui al foiei externe, unde sfingolipidele, coninând acizi grai saturai, sunt
bogat reprezentate).
Anticipând, vom meniona aici c plutele lipidice se caracterizeaz i prin
capacitatea de a aglomera anumite tipuri de proteine membranare. Aadar, repetm
pentru reinerea mai atent, organizarea lipidelor membranare în microdomenii
accentueaz aspectul de mozaic fluid al membranelor (ca nite sloiuri plutind în
bistrat). Conceptul de plut lipidic este într-o continu dezvoltare [11].
În ciuda acestor organizri eterogene, capacitatea lipidelor de a se mica în
cadrul bistratului este doar nuanat pe întinsul suprafeei membranei i nu anulat.

26
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Aceast capacitate de micare a lipidelor în cadrul membranei determin


proprietatea numit fluiditate. Fluiditatea membranelor poate fi modulat
(modificat, reglat) de mai muli factori. Aceti factori pot fi de natur fizic, sau
chimic. Ca factori fizici amintim temperatura i presiunea. Fluiditatea membranelor
este direct proporional cu temperatura i invers proporional cu presiunea.
Efectivitatea acestor factori fizici în modularea fluiditii membranare este îns
limitat, dup cum uor ne putem da seama. Nici presiunea i nici temperatura nu
pot varia în limite largi (ba dimpotriv) în condiii fiziologice. Mult mai pregnant este
efectul factorilor chimici în modularea fluiditii membranei. Acetia, în funcie de
provenien, se pot clasifica în (i) factori chimici intrinseci sau (ii) factori
chimici extrinseci.
Factorii chimici intrinseci, pe care celula îi folosete în modularea fluiditii
membranei în funcie de necesiti, sunt cantitatea de acizi grai nesaturai din
structura fosfolipidelor sau a glicolipidelor i/sau cantitatea de colesterol din bistrat.
Fluiditatea membranei este direct proporional cu procentul de acizi grai
nesaturai din structura chimic a lipidelor bistratului (crete cantitatea de acizi grai
nesaturai, crete i fluiditatea), în timp ce creterea procentului de colesterol duce la
rigidizarea membranei (micorarea fluiditii). Aadar, fluiditatea membranei este
invers proporional cu cantitatea de colesterol din bistrat (Fig. 2.7). Cum trebuie
înelese sugestiv motivele acestor efecte ale colesterolului i acizilor grai nesaturai
asupra fluiditii membranei celulare? Descriptiv, geometria angular a cozilor
acizilor grai nesaturai are ca efect deprtarea spaial a lipidelor i micorarea
interaciunilor între acestea atât la nivelul poriunii hidrofobe, cât i al capetelor
hidrofile. În ceea ce privete efectul colesterolului, din motive structurale (datorit
geometriei spaiale), acesta sporete tria interaciunilor atât la nivelul cozilor
hidrofobe, cât i al capetelor hidrofile, anulând efectul acizilor grai nesaturai
Factorii chimici extrinseci se clasific la rândul lor în (a) fiziologici
(hormoni sau mediatori chimici liposolubili), (b) patologici (metabolii liposolubili
ai unor ageni patogeni, substane chimice toxice, liposolubile) sau (c) terapeutici
(medicamente liposolubile). Multe analgezice, ca i unele anestezice, fiind compui
liposolubili, acioneaz i prin modificarea fluiditii membranelor neuronale. Dovezi
experimentale recente dovedesc faptul c, alturi de efectele datorate modificrii
fluiditii membranare, anestezicele i/sau analgezicele acioneaz i prin
modificrile conformaionale induse la nivelul unor proteine transmembranare,
afectându-le funcia.

Fig. 2.7. Efectul rigidizant al colesterolului la nivelul bistratului. Datorit geometriei moleculare,
colesterolul are abilitatea de a se insera în spaiile dintre fosfolipide sporind interaciunile moleculare
atât la nivelul capetelor hidrofile, cât i la nivelul cozilor hidrofobe. © Mircea Leabu, 2014.

27
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Dup cum vom vedea, fluiditatea membranelor este modulat i nuanat i


de ctre celelalte componente ale membranelor: proteinele i structurile glucidice.
Practic, dinamicitatea componentelor membranare, care asigur buna funcionare a
lor i, prin aceasta, a întregii ultrastructuri, difer de la un moment la altul în funcie
de starea în care (macro)moleculele se afl: independente sau în interrelaie cu alte
componente din membrana însi sau din spaiile apropiate (citosolul cortical sau
elemente din exterior).

2.2.4. Rolul lipidelor membranare


Dup cum am artat pân acum, rezult c fr bistrat lipidic nu pot exista
membrane celulare. Bistratul lipidic reprezint componenta de baz a organizrii
membranelor, funcia structural a lipidelor membranare organizate în bistrat
fiind esenial. Dincolo de funcia structural prin care ofer membranei cel mai bun
element pentru organizare i funcionare, bistratul lipidic confer membranei
celulare rolul de barier, aceast menire a lipidelor membranare fiind enunat înc
de la dovedirea prezenei lor în membrane. Dar lipidele nu se afl, nici pe departe, în
membrane numai din considerente structurale. Ele sunt implicate în importante
funcii metabolice, acele funcii care unesc celula cu mediul înconjurtor, o
integreaz pe aceasta în “ambiana biosocial”. Mai mult, echilibrul dintre diferitele
tipuri de lipide din membrane influeneaz comportamentul normal al celulei, iar
modificarea lui poate atrage deviaii patologice. De aceea, lipidele membranare pot
reprezenta inte terapeutice [12].
Glicolipidele sunt implicate în fenomene de recunoatere i semnalizare
intercelular (vezi la “Componenta glucidic a membranei”).
Detalii referitoare la rolurile metabolice ale lipidelor sunt cunoscute pentru
fosfolipide. Acestea pot fi modificate de enzime specifice numite fosfolipaze. De
regul, aceste modificri se petrec ca urmare a unor procese de semnalizare, parte
dintre metaboliii rezultai acionând ca mesageri secunzi (vezi semnificaia
sintagmei la „Semnalizarea celular”) i faciliteaz numeroase procese prin care
celulele rspund semnalelor receptate.
Exist mai multe tipuri de fosfolipaze, care au proprietatea de a elibera diverse
molecule din complexa structur biochimic a fosfolipidelor (Fig. 2.8). Acestea sunt:6
(i) fosfolipaza A1 (prescurtare internaional PLA1, cu PL de la termenul
englezesc PhosphoLipase), care elibereaz acidul gras din poziia 1 a
glicerinei;
(ii) fosfolipaza A2 (prescurtare internaional PLA2), care detaeaz acidul
gras din poziia 2 a glicerinei, cu formare de lizofosfatide;
(iii) fosfolipaza B (prescurtare internaional PLB), care poate scoate acizi grai
din ambele poziii ale glicerolului din structura fosfolipidelor, completând de
regul activitatea PLA1 sau PLA2; acioneaz în general asupra lizofosfatidelor
eliminând din bistrat fosfolipidul afectat;
(iv) fosfolipaza C, care desface legtura dintre glicerin i fosfat, cu eliberarea
diacilglicerolilor (DAG), care rmân în bistrat i a unui compus hidrofil ce
difuzeaz în citosol;
(v) fosfolipaza D, care elimin restul hidrofil X, cu formarea PA la nivelul
bistratului.

6
Recomandm o modalitate mnemotehnic de a reine legtura dintre tipurile de fosfolipaze i rolul lor. Este
uor de remarcat c, plecând de la acizii grai legai la hidroxilii din poziiile 1 i 2 ale glicerinei i mergând ctre
compusul variabil din capul hidrofil al fosfolipidelor, fosfolipazele se denumesc succesiv de la A la D în funcie de
partea din molecul pe care o taie: A1 pentru cele care scot acizii grai din poziia 1 (A de la acid i 1 poziia), A2
elibereaz acidul gras din poziia 2, apoi B contribuie la eliminarea ambilor acizi grai, C taie legtura esteric
dintre glicerin i fosfat, iar D desface numai partea variabil din capul hidrofil.

28
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Pentru exemplificarea efectelor celulare, datorate aciunii fosfolipazelor,


punctm urmtoarele (vezi i subcapitolul “Semnalizarea celular”):
a) Fosfolipaza A2 poate elibera acidul arahidonic, care este precursor pentru patru
clase de substane cu roluri dintre cele mai diverse: 1. prostaglandine; 2.
tromboxani; 3. prostacicline; 4. leucotriene. Aceti compui sunt obinui
prin complexe procese de metabolizare a acidului arahidonic (cu bagaje
enzimatice adecvate), dup eliberarea sa din fosfolipidele care îl conin. Primele
trei tipuri rezult pe calea ciclo-oxigenazei, cea de-a patra clas pe calea lipo-
oxigenazei. Toate aceste tipuri de metabolii ai acidului arahidonic sunt
eliberate din celulele care îi produc i au rol de molecule mesager în diferite
procese de semnalizare celular.
b) Fosfatidilinozitolii sunt implicai în mecanisme de transmitere transmem-
branar i intracelular a semnalelor. Când unele molecule semnal (liganzi) se
leag de receptorii specifici din membranele celulare, PI intr într-o secven de
reacii denumit cascada fosfoinozitidelor (Fig. 2.9).
În aceast cascad PI sunt, pas cu pas, fosforilai iniial la fosfoinozitolfosfai
(PIP), sub aciunea fosfatidilinozitol kinazei7 (PI kinaza), cu consum de ATP, apoi la
fosfatidilinozitol-bis-fosfai8 (PIP2), sub aciunea PIP kinazei, de asemenea cu
consum de ATP. Asupra fosfatidilinozitol-4,5-bis-fosfatului format acioneaz
fosfolipaza C (izoforme E i J ale fosfolipazei C, specifice pentru fosfatidilinozitoli)
cu eliberarea de IP3 (inozitol-1,4,5-tris-fosfat9) i DAG. IP3 acioneaz ca mesager
secund inducând creterea Ca2+ în citosol i conducând la rspunsuri celulare rapide
i de scurt durat (exemplu, contracia muscular). La rândul su, DAG este
implicat în declanarea unor rspunsuri celulare mai lente i de lung durat
(exemplu, semnalizarea prin cile protein-kinazei C).

Fig. 2.8. Locurile specifice de aciune pentru diferitele tipuri


de fosfolipaze, la nivelul moleculelor de fosfolipide. A1 –
fosfolipaza A1; A2 – fosfolipaza A2; B – fosfolipaza B; C –
fosfolipaza C; D – fosfolipaza D.

7 Prin kinaze desemnm acele enzime a cror activitate se soldeaz cu grefarea de fosfat pe diferite substrate.
8 Atenie! În denumirea acestor metabolii se folosesc particulele „bis”, respectiv „tris” i nu di sau tri, deoarece
fiecare reziduu fosfat este inserat pe un alt hidroxil al inozitolului. Formele bi/di, respectiv tri se folosesc în
denumirea compuilor în care fosfatul se leag unul de altul (exemple: adenozin-difosfat, adenozin-trifosfat).
9 Vezi nota de subsol numrul 7.

29
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.9. Cascada fosfoinozitide-


lor. Aciunea secvenial a fosfati-
dilinozitol-kinazelor duce la formarea
PIP2. Ulterior fosfolipaza C-E, cea
din exemplul figurii, cu specificitate
pentru fosfatidil-inozitoli, elibereaz
IP3 i DAG, care sunt mesageri
secunzi în anumite procese de sem-
nalizare transmembranar.

Dei rolul colesterolului în procesele metabolice de la nivelul membranei a


fost mai puin investigat, studii recente au dovedit c el este implicat în interaciuni
cu proteine platform/proteine adaptoare care au rol în formarea de complexe de
semnalizare [13]. În felul acesta colesterolul contribuie la recrutarea acestor proteine
platform, ca endoproteine pe faa citosolic a membranei celulare, cu facilitarea
funciei acestora de a pune în bun situaie de aciune proteine implicate în diferite
procese de semnalizare i eficientizarea fenomenelor la care trebuie s participe
partenerii asociai la nivelul platformei de semnalizare astfel formate.
Ca s rezumm cele prezentate despre lipidele membranare punctm:
1. Lipidele membranare organizeaz componenta de baz a biomembranelor,
bistratul lipidic, element cu proprieti fluide, manifestate bidimensional i
caracterizat atât prin eterogenitate compoziional, cât i prin asimetrie;
2. Structura de bistrat lipidic este ideal pentru separarea eficient, selectiv a
dou medii hidrofile (interiorul celular de mediul extern);
3. Prin componenta sa hidrofob, mrginit pe ambele pri de suprafee hidrofile
care îl compatibilizeaz cu mediile apoase separate, bistratul lipidic asigur
funcia de barier a membranelor, fr a-i conferi caracter de barier absolut,
adic fr a împiedica selectivitatea acestei structuri în interaciunea celulei cu
mediul (schimbul de substan i de informaie);
4. Departe de a avea numai un rol structural, lipidele membranare particip la
funcia metabolic a membranei celulare în procese de semnalizare, dar i prin
posibilitile de control a conformaiei proteinelor cufundate în bistrat,
putându-le modula funcia.

Bibliografie selectiv
1. Frega NG, Pacetti D, Boselli E. (2012). Characterization of Phospholipid Molecular Species by
Means of HPLC-Tandem Mass Spectrometry. In: „Tandem Mass Spectrometry – Applications and
Principles”, editor Jeevan Prasain (ISBN: 978-953-51-0141-3). Rijeka: InTech Europe; 2012. pp. 637-
672.
2. Luckey M. Membrane structural biology with biochemical and biophysical foundations. New York:
Cambridge University Press, 2008. (Fig. 2.14, p.27).
3. Han CZ, Ravichandran KS. (2011) Metabolic connections during apoptotic cell engulfment. Cell.
147(7): 1442-1445. doi: 10.1016/j.cell.2011.12.006.
4. Armstrong A, Ravichandran KS. (2011) Phosphatidylserine receptors: what is the new RAGE?
EMBO Rep. 12(4): 287-288. doi: 10.1038/embor.2011.41.
5. Tung TT, Nagaosa K, Fujita Y, Kita A, Mori H, Okada R, Nonaka S, Nakanishi Y. (2013)
Phosphatidylserine recognition and induction of apoptotic cell clearance by Drosophila engulfment
receptor Draper. J Biochem. 153(5): 483-491. doi: 10.1093/jb/mvt014.
6. Fox JE. (1996) Platelet activation: new aspects. Haemostasis. 26: 102–131.

30
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

7. Zwaal RFA, Schroit AJ. (1997) Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry
in blood cells. Blood. 89: 1121–1132.
8. Kuypers FA. (1998) Phospholipid asymmetry in health and disease. Curr Opin Hematol. 5: 122–131.
9. Kusumi A, Fujiwara TK, Chadda R, Xie M, Tsunoyama TA, Kalay Z, Kasai RS, Suzuki KG.
(2012) Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction:
commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annu Rev Cell
Dev Biol. 28: 215-250. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100809-151736.
10. Pike LJ. (2004) Lipid Rafts: Heterogeneity on the high seas. Biochem. J. 378, 281-292.
11. Sonnino S, Prinetti A. (2013) Membrane domains and the "lipid raft" concept. Curr Med Chem.
20(1): 4-21.
12. Escriba PV. (2006) Membrane-lipid therapy: a new approach in molecular medicine. Trends Mol Med.
12, 34-43.
13. Sheng R, Chen Y, Yung Gee H, Stec E, Melowic HR, Blatner NR, Tun MP, Kim Y, Källberg
M, Fujiwara TK, Hye Hong J, Pyo Kim K, Lu H, Kusumi A, Goo Lee M, Cho W. (2012)
Cholesterol modulates cell signaling and protein networking by specifically interacting with PDZ
domain-containing scaffold proteins. Nat Commun. 3: 1249. doi: 10.1038/ncomms2221.

31
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.3. Proteinele membranare


2.3.1. Consideraii generale asupra prezenei proteinelor în
membrane
Modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice ne arat c,
alturi de lipidele aezate sub form de bistrat, la construcia acestor componente
celulare particip i proteinele. Raportul molecular între lipidele i proteinele ce
alctuiesc membranele celulare este în medie de aproximativ 50/1. Acest raport este
uor de îneles inând cont de faptul c, de regul, compoziia sub aspectul masei de
material organic la nivelul membranelor este de ~40% lipide i ~50% proteine, iar
lipidele sunt molecule cu greutate molecular mic, în timp ce proteinele sunt
macromolecule.
Realitatea biologic este îns divers, existând i excepii de la aceste
procente. De exemplu, la nivelul tecii de mielin, unde funcia de barier este
esenial rolului membranei celulelor Schwann care formeaz înveliul din jurul
axonului, procentul de mas pentru lipide este de ~80, iar cel al proteinelor de
numai ~20. De evideniat, pentru situaia diametral opus, compoziia de la nivelul
membranei mitocondriale interne unde lipidele reprezint ~20%, iar proteinele
~80%. Funcia metabolic a acestei membrane este deosebit de accentuat (vezi în
capitolul volumului al II-lea, destinat membranei mitocondriale interne), chiar dac
ar fi s menionm doar activitatea complexelor proteice implicate în transportul
electronilor (lanul transportor de electroni, numit i lanul respirator), respectiv
activitatea ATP-sintazei, complexul proteic care produce ATP. La nivelul membranei
mitocondriale interne îns, este la fel de important i funcia de barier. Poate de
aceea aici se afl cardiolipinele, fosfolipide deosebite, cu patru lanuri alifatice în
coada hidrofob (patru acizi grai în molecul), deci cu proprieti amfifile a cror
component hidrofob este amplificat.
Comentariile de mai sus, asupra complexitii realitii biologice în privina
raportului lipide/proteine în membrane, ne permit s enunm reguli de principiu
care sugereaz corespondena între acest raport i funcionalitatea membranei.
Aceste reguli sunt:
(i) cu cât funciile metabolice ale unei membrane (sau poriuni – ceea ce se
definesc drept microdomenii sau domenii – dintr-o membran) sunt mai
accentuate, cu atât coninutul de proteine al acelei membrane sau poriuni de
membran este mai ridicat;
(ii) cu cât rolul de barier al unei membrane trebuie s se manifeste mai pregnant,
cu atât coninutul în lipide este mai crescut.
În abordarea studiului proteinelor membranare plecm de la ceea ce tim deja
despre organizarea membranei, cu cele menionate despre caracteristicile fizico-
chimice i comportamentul membranei, aa cum am vzut c sunt induse de însi
prezena lipidelor în elementul de baz, bistratul lipidic. Completarea cu proteine a
organizrii moleculare a membranelor celulare nu anuleaz, ci amplific i/sau
nuaneaz eterogenitatea, asimetria i comportamentul de fluid bidimensional al
structurii. Vom cuta s argumentm, prin prezentarea aspectelor legate de prezena
proteinelor în membrane, afirmaia din fraza anterioar. Proteinele completeaz
bistratul lipidic pentru definitivarea organizrii biomembranelor, în toat grosimea,
ca i pentru asigurarea funcionalitii ultrastructurii.
Pentru argumentarea ideii de eterogenitate, vom utiliza aceeai strategie
folosit la prezentarea eterogenitii lipidelor membranare: discutarea diversitii de
tipuri de proteine din membrane prin clasificarea lor pe diverse criterii.

32
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.3.2. Clasificri ale proteinelor membranare


O prim clasificare a proteinelor membranare se face în funcie de poziia lor
fa de bistratul lipidic, care permite împrirea acestora în dou mari categorii:
1. Proteine periferice sau extrinseci: acele proteine care se afl ataate de o
parte sau de alta a bistratului lipidic, interacionând cu capetele hidrofile ale
lipidelor (dar nu numai, dup cum se va vedea din unele aspecte prezentate mai
jos);
2. Proteine integrale sau intrinseci: acele proteine care sunt cufundate în
bistratul lipidic strbatându-l complet sau parial.
Evidenierea, descrierea i denumirea acestor dou categorii de proteine
membranare au fost fcute în deceniul opt al secolului XX de ctre Theodore L. Steck
i colaboratorii si [1] (la numai doi ani dup introducerea modelului în mozaic fluid
privind organizarea membranelor). Diversitatea de tipuri de proteine membranare
este accentuat i de alte aspecte (Fig. 2.10).
Proteinele periferice reprezint, în general, ~25% din polipeptidele unei
membrane, se extrag cu soluii saline sau ageni chelatori, au caracter hidrofil (dup
extragere nu sunt asociate cu lipide) i îi pstreaz solubilitatea în ap. În funcie de
foia bistratului lipidic creia îi sunt asociate, proteinele extrinseci se clasific în (i)
ectoproteine (proteine periferice asociate foiei externe a bistratului, aadar expuse
la exteriorul membranei celulare sau pe faa luminal a membranelor organitelor) i
(ii) endoproteine (proteine periferice asociate foiei interne a bistratului, aadar
expuse pe faa citoplasmatic a membranelor i endomembranelor).
Au fost evideniate atari mai ferme ale proteinelor periferice la bistratul
lipidic, prin conjugri (stabilirea de legturi covalente) cu componente lipidice.

Fig. 2.10. Diversitatea de proteine membranare i exemplificarea clasificrilor acestora. 1 –


protein periferic, ectoprotein; 2 – ectoprotein ancorat prin glicofosfatidil-inozitol; 3 – protein
periferic, endoprotein; 4 – endoprotein acilat; 5 – protein integral, transmembranar unipas
(prezint i acilare); 6 – protein transmembranar multipas; 7 – protein integral, parial imersat în
bistratul lipidic; fosfolipidele din foia intern, cu sarcin negativ reprezint fosfatidilserine. © Mircea
Leabu, 2014.

33
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Pe de o parte, pentru unele ectoproteine a fost evideniat o cuplare prin


carboxilul terminal la gruparea amino a etanolaminei din captul liber al structurii
glucidice a unor glicofosfatidilinozitoli (Fig. 2.10, exemplul 2). Fenomenul se
numete glipiare [2-4]. Partea lipidic rmâne în foia extern a bistratului i
poart numele de ancor glicofosfatidilinozitolic. Funciile acestor proteine
modificate prin glipiare sunt intens studiate. Exist dovezi experimentale care
confirm rolul acestor modificri într-o multitudine de procese care se petrec la
suprafaa celulei, dar i intracelular. De exemplu, unele din moleculele de adeziune
celular sunt glipiate, unele proteine glipiate sunt implicate în procese imune, exist
ectoproteine cu rol enzimatic ancorate prin glipiare, proteine glipiate rein la nivelul
lor molecule din spaiul extracelular i contribuie la endocitoza lor i a fost
evideniat direcionarea ectoproteinelor ancorate la bistrat prin glipiare ctre
domeniul apical al membranelor din celulele polarizate (celule ale epiteliilor
monostratificate).
Pe de alt parte, unele dintre endoproteine se pot asocia tranzitoriu i
reversibil bistratului lipidic prin reacii de acilare, cum ar fi miristilare, palmitilare,
farnezilare, geranil-geranilare (Fig. 2.10, exemplul 4), radicalul acil fiind cufundat în
foia intern a bistratului [2] (vezi CASETA 2.1). Aceste modificri reversibile sunt
importante pentru exprimarea funciilor acestor proteine. Mai mult, unele dintre ele,
cum ar fi proteinele G mici, numite i proteine G monomerice (vezi ce sunt acestea la
„Semnalizarea celular”) pot tranzita, pe baza acestor modificri, din starea de
protein citosolic în starea de protein periferic pentru exercitarea funciilor (vezi,
de asemenea, detalii la „Semnalizarea celular”). Au fost evideniate modificri prin
acilare i pentru proteine transmembranare (Fig. 2.10, exemplul 5).
De menionat c atât proteinele membranare acilate, cât i cele glipiate au
tendina de a se acumula în caveole sau la nivelul plutelor lipidice (microdomenii de
membran definite i discutate parial, mai sus la seciunea despre lipidele
membranare). Acolo a fost anticipat informaia c asemenea modificri ale
proteinelor le fac candidate la acumularea în microdomenii de membran de tipul
plutelor lipidice.
CASETA 2.1. Ancorarea proteinelor membranare prin intermediul conjugrilor cu
elemente lipidice (acilare)
Proteinele care îi exercit funcia biologic exclusiv pe una din cele dou fee ale bistratului lipidic
sunt adesea asociate mai ferm bistratului prin interaciuni cu lipide din foia expus fie mediului
extracelular, fie celui intracelular. O serie de proteine intracelulare (endoproteine) cu rol în
procese de semnalizare celular se atașeaz, prin modificri covalente, la stratul lipidic dinspre
faa citoplasmatic a membranei. Aceast asociere mai ferm se datoreaz legrii covalente a unor
funciuni chimice din proteine fie la catene ale acizilor grai, fie la grupri prenil (farnezil sau
geranil-geranil). Astfel, au fost evideniate urmtoarele modaliti de ataare la bistratul lipidic a
unor proteine hidrosolubile (dup biosinteza lor în citosol), pe baza unor modificri covalente,
post-traducere: (i) miristilarea, prin formarea unei legturi amidice între gruparea amino-
terminal aparinând unui rest de glicin de la captul catenei polipeptidice i gruparea carboxil a
acidului miristic; (ii) palmitilare, formarea unei legturi tip tioester între un rest de cistein din
interiorul catenei polipeptidice i gruparea carboxil a acidului palmitic; (iii) prenilare, constând
în formarea unei legturi tioeter între un rest de cistein (poziionat iniial în poziia a patra de la
captul carboxi-terminal i ulterior în poziie terminal, dup fixarea de gruparea lipidic i
clivarea celor trei aminocizi de la extremitatea catenei polipeptidice) i o grupare prenil (3-metil-2-
buten-1-il). Deseori ataarea proteinei printr-o singur ancor lipidic nu este suficient de ferm,
fiind necesar fixarea suplimentar de o ancor lipidic secundar. De exemplu, membrii familiei
de proteine Ras (proteine G mici cu funcie GTP-azic, având rol în semnalizare) sunt recrutate la
nivelul membranei plasmatice prin fixarea cu o grupare prenil combinat cu fixarea prin acidul
palmitic. Prenilarea proteinelor este mediat de trei tipuri de enzime, respectiv farneziltransferaza
i geranilgeraniltransferazele de tip I i II. În ultimii ani inhibitorii farneziltransferazei s-au
dovedit candidai terapeutici importani pentru tratamentul unor forme de cancer i al unor
infecii cu parazii aparinînd genului Plasmodium, agentul infecios al malariei, i genului
Trypanosoma (specia T. brucei), agentul infecios al „bolii somnului”.

34
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Proteinele integrale (Fig. 2.10, exemplele 5-7) reprezint, de regul, ~75%


din proteinele unei membrane, se pot extrage din structura bistratului lipidic prin
folosirea de detergeni (adic dup distrugerea integritii bistratului lipidic), dup
extragere rmân asociate cu lipide, sunt insolubile în ap (dializarea detergentului
duce la precipitarea lor prin floculare) i au caracter amfifil (poriunea hidrofob
fiind reprezentat de zona imersat în bistratul lipidic, poriunea/poriunile
hidrofil/hidrofile reprezentând domeniile lanului polipeptidic expuse în afara
bistratului lipidic). Proteinele integrale care traverseaz complet bistratul lipidic sunt
denumite proteine transmembranare (Fig. 1.10, exemplele 5 i 6) i reprezint cea
mai mare parte a proteinelor intrinseci. Cele care sunt parial cufundate în bistratul
lipidic (Fig. 2.10, exemplul 7) nu au primit o denumire specific. Mai mult, acestea
din urm au fost considerate pân prin ultimul deceniu al secolului XX a fi practic
inexistente. Se specula în favoarea acestei idei pe considerente structurale i
termodinamice. Explicaia era c nu putea fi adoptat de ctre aceste proteine o
conformaie care s asigure hidrofobicitate în poriunea de pliere a lanului
polipeptidic în interiorul bistratului lipidic. În momentul de fa sunt cel puin dou
proteine integrale candidate la imersare parial în bistratul lipidic al membranelor
crora le aparin: citocromul b5 din membrana reticulului endoplasmic i
caveolina, la nivelul membranelor celulelor ce pot structura caveole ca formaiuni
specializate de membran (de exemplu, celule musculare netede, celule endoteliale,
enterocite etc.). Schimbarea atitudinii comunitii stiinifice în privina acestei
situaii, dup raportarea dovezilor experimentale legate de aranjamentul celor dou
proteine în membrane, este un exemplu al dinamicii cunoaterii în biologia celular
i al modului rapid în care conceptele pot evolua în acest domeniu.
Revenind la proteinele transmembranare, acestora li se definesc trei domenii
structurale: (i) un ectodomeniu, numit si domeniu extern (poriunea expus pe
faa extern a membranei), (ii) un endodomeniu, numit i domeniu citosolic
(poriunea expus pe faa intern a membranei) i (iii) un domeniu
transmembranar (poriunea ce strbate bistratul lipidic). În ceea ce privete
modul de organizare structural a ecto- i endo-domeniilor, lanurile proteice se pot
împacheta combinat în aceste zone atât ca -helixuri, cât i ca
-pliuri, aa cum se
întâmpl cu toate proteinele. Situaia este oarecum diferit pentru domeniul
transmembranar. Pentru acesta, pân prin deceniul 9 al secolului XX, a existat
accepiunea c nu poate fi structurat decât sub form de -helix, astfel încât s poat
fi mascate ctre axul acestuia poriunile hidrofile ale lanului polipeptidic, iar la
exteriorul su s fie expuse prile hidrofobe, acomodabile cu hidrofobicitatea din
profunzimea bistratului lipidic. Se justifica i în acest caz prin considerente de ordin
structural i termodinamic. Între timp îns, au fost identificate proteine
transmembranare care, la nivelul domeniului transmembranar, prezint
-pliuri
orientate în contrasens care se organizeaz asemenea doagelor unui butoia. În acest
fel fiecare doag (poriune organizat în
-pliuri) expune ctre zonele hidrofobe ale
bistratului suprafaa hidrofob i ascunde ctre interiorul butoiaului componentele
hidrofile din structura lanului polipeptidic. Asemenea proteine se întâlnesc, de
exemplu, în membrana mitocondrial extern formând porine. Descifrarea structurii
porinelor a reprezentat un alt exemplu de schimbare de atitudine pe care evoluia
cunoaterii realitii biologice a impus-o comunitii tiinifice.
Proteinele transmembranare se pot clasifica i pe baza altor criterii. Astfel, în
funcie de numrul de treceri ale lanului polipeptidic prin planul membranei ele se
împart în (i) unipas (o singur trecere; exemplul 5 în Fig. 2.10) i (ii) multipas
(mai multe treceri; exemplul 6 în Fig. 2.10). Este lesne de îneles c proteinele
structurate ca
-pliuri la nivelul domeniului transmembranar (porinele) nu pot fi
unipas.

35
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

În funcie de poziia fa de bistrat a captului amino al lanului polipeptidic,


proteinele transmembranare se clasific în (i) proteine transmembranare de tipul I
(când captul amino se afl în ectodomeniu) i (ii) proteine transmembranare de
tipul II (când captul amino se afl în endodomeniu).
Toate aceste clasificri ne sugereaz marea diversitate de proteine
membranare, astfel încât este clar c prezena proteinelor în structura membranelor
respect caracterul eterogen al organizrii acestora, nuanându-l. În acelai timp,
existena ecto- i endoproteinelor (firesc entiti moleculare diferite, rezultat al unor
fenomene diferite de biosintez i asamblare; vezi la seciunea „Biogeneza
membranelor” din volumul al II-lea) sporete asimetria organizrii moleculare a
membranelor. Mai mult, asimetria membranelor este accentuat i de prezena
proteinelor transmembranare cu ectodomeniul diferit de endodomeniu, ca i prin
caracterul asimetric al organizrii lanului polipeptidic cruia îi putem asocia
caracteristici vectoriale (origine, direcie, sens), chiar dac similitudinea nu trebuie
îneleas în sensul strict algebric. Originea unei proteine poate fi convenional
atribuit captului amino-terminal (cu acesta începe biosinteza proteinelor la nivelul
ribozomilor), direcia nu este deloc una rectilinie, iar sensul este dinspre captul
amino-terminal spre captul carboxi-terminal.
Vom comenta ceva mai jos efectul i importana proprietilor eterogenitate i
asimetrie (care sunt amplificate de prezena proteinelor), asupra funcionalitii
membranelor. De fapt, insistena noastr în prezentarea acestor caracteristici de
organizare a biomembranelor (eterogenitate, asimetrie i comportament dinamic de
fluid bidimensional) nu s-ar justifica dac nu ar fi deosebit de important
semnificaia biologic a lor.

2.3.3. Exemple de proteine membranare


Primele i cele mai detaliate informaii asupra proteinelor membranare au
fost obinute din studiul membranelor eritrocitare [5]. Motivaia este simpl i se
bazeaz pe urmtoarele aspecte:
(i) materialul biologic este uor de obinut în cantitate suficient (eritrocitele
reprezint populaia celular majoritar din sânge);
(ii) omogenitatea populaiei celulare este uor de asigurat (celelalte tipuri celulare
reprezint o mas mic, sunt mai uoare, sedimentând deasupra eritrocitelor
la centrifugare, sau doar în câmp gravitaional, iar eliminarea lor se poate face
chiar cu pierderi de eritrocite, pentru siguran în eliminarea impurificrii
preparatului final);
(iii) membranele se obin fr dificultate printr-un simplu oc hipoton urmat de
centrifugare; membranele obinute (numite i fantome eritrocitare) nu sunt
impurificate cu endomembrane (membrane ale organitelor celulare),
inexistente în hematii.
Proteinele membranelor astfel purificate au fost rezolvate prin electroforez în
gel de poliacrilamid în prezen de dodecilsulfat de sodiu (SDS-PAGE). Avantajele
acestui tip de electroforez constau în faptul c detergentul (dodecilsulfatul de sodiu,
numit i laurilsulfat de sodiu) pe de o parte elibereaz toate proteinele (atât pe cele
periferice, cât i pe cele integrale) din arhitectura membranei, solubilizându-le dup
dezorganizarea bistratului lipidic [6], iar pe de alt parte se adsoarbe unitar pe
lanurile polipeptidice, conferindu-le o densitate de sarcin negativ unitar. În
aceste condiii migrarea proteinelor în câmp electric, prin mediul vâscos de
poliacrilamid, se face numai în funcie de greutatea lor molecular.
Rezultatele unei asemenea abordri pentru descrierea proteinelor membranei
eritrocitare se înfieaz sub forma unui spectru de benzi proteice distribuite între
20 i 250 kDa, care iniial au primit denumiri sub form de cifre (banda 1, banda 2,

36
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

etc.), nuanându-se cu, spre exemplu, banda 4.1, banda 4.2, acolo unde benzile
apreau ca dublete. Ulterior, unele dintre proteine au primit denumiri specifice. În
momentul de fa organizarea i funcionarea membranei eritrocitare poate fi
discutat pe baza informaiilor disponibile referitoare la proteinele ei. Comentariile
asupra proteinelor membranei eritrocitare ne vor ajuta s înelegem mai aprofundat
organizarea acestor macromolecule în arhitectura biomembranelor, care este în
strâns legtur cu funcionalitatea lor.
Vom începe cu o protein, de fapt o glicoprotein (60% din masa molecular a
glicoconjugatului este reprezentat de încrctura glucidic), numit glicoforin
(etimologic însemnând purttoare de glucide), prezent din abunden în membrana
eritrocitului, care migreaz atipic (se dispune electroforetic undeva pe la 90kDa, dei
masa ei molecular este de numai ~30kDa). Exist mai multe izoforme de glicoforin
[7] identificate pân în prezent: A, B, C, D i E. Izoforma glicoforin A a fost prima
protein a membranei eritrocitare cunoscut detaliat [8], sub aspectul structurii
biochimice. Are 131 aminoacizi, cunoscându-i-se integral secvena; este protein
transmembranar unipas, tip I (captul amino în ectodomeniu); domeniul expus la
suprafaa membranei este mare (70 de aminoacizi) i poart 16 lanuri glucidice (15
O-glicozidice i unul N-glicozidic), acestea dublând practic gabaritul acestei molecule
(aceast organizare biochimic a glicoproteinei reprezint o explicaie pentru
migrarea electroforetic atipic; practic densitatea de sarcin negativ pe unitatea de
mas este mai mic decât în mod normal, detergentul SDS adsorbindu-se unitar
numai pe lanul polipeptidic, nu i pe structurile glucidice); endodomeniul este mic
(39 de aminoacizi), purtând captul carboxil al lanului polipeptidic; domeniul
transmembranar este structurat în -helix i conine 22 de aminoacizi, care sunt
identificai.
Paradoxul este c, dei structural glicoforina i-a dezvluit repede secretele,
funcia nu i se cunoate înc exact. Totui, pentru izoforma glicoforin C a fost
dovedit o funcie structural [9] (vezi mai jos la citoscheletul asociat membranei),
iar pentru izoforma glicoforin A un rol de restabilire a funciei unei forme mutante a
proteinei banda 3, prin interaciunea dintre cele dou [10]. Ciudenia este cu atât
mai mare cu cât exist eritrocite (Ena-) din a cror membran glicoforina lipsete,
fr ca funcionalitatea s le fie afectat. Populaiile cu asemenea defecte de
exprimare a glicoforinei sunt în zonele cu malarie endemic, iar exprimarea
deficitar în glicoforin A reprezint un mecanism de adaptare, parazitul
Plasmodium falciparum invadând eritrocitele gazd prin legarea la o structur
glucidic purtat de aceast protein transmembranar [11].
O situaie diametral opus o reprezint proteina banda 3, cunoscut i ca
AE1 (de la numele în englez, „Anion Exchanger 1”) [10], despre care informaia
asupra detaliilor structurale a evoluat mai anevoios, dar a crei funcie a fost repede
i clar stabilit: este proteina care structureaz canalul anionic de schimb între
bicarbonat (HCO3-) i clorur (Cl-). Banda 3 este protein transmembranar, are 911
aminoacizi în lanul polipeptidic i o mas molecular de ~100kDa. Partea N-
terminal a proteinei (aminoacizii 1-359) intr în structurarea endodomeniului,
asigurând interaciuni cu alte proteine membranare. Domeniul transmembranar, la
nivelul cruia se formeaz canalul de schimb anionic, are 12-14 treceri în -helix prin
bistratul lipidic (~50kDa din masa molecular). La endodomeniul mare format în
principal din captul N-terminal se adaug captul C-terminal scurt (format din 33
aminoacizi) aflat tot spre citosol. Aadar, endodomeniul conine ~400 din
aminoacizii care formeaz proteina, adic ~40kDa i poart atât captul N-terminal
(protein transmembranar de tip II), cât i captul C-terminal. Ectodomeniul este
mic, încrctura glucidic este redus (se pare c doar un lan, cu o structur extrem
de eterogen [12]) i este reprezentat de bucle dintre poriunile transmembranare. În
poriunea C-terminal banda 3 leag anhidraza carbonic II, important pentru
37
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

funcia transportorului prin furnizarea anionului bicarbonat [13]. Au fost identificate


forme mutante pentru proteina banda 3 care induc o serie de patologii specifice
eritrocitelor [10], iar glicoforina A pare a fi de ajutor acestor forme mutante în
restabilirea funciei de transport.
Cea de-a treia protein pe care o amintim este spectrina, care, împreun cu
celelalte dou amintite mai sus, reprezint peste 60% (procente de mas) din
proteinele membranei eritrocitare. Spectrina este o protein periferic situat pe faa
intern a membranei (aadar o endoprotein) i reprezint componenta de baz a
ceea ce numim citoschelet asociat membranei sau simplu citoschelet
membranar ori citoscheletul membranei.10
Citoscheletul membranei este o reea de endoproteine cu ochiuri i
noduri, solidar membranei prin ataarea la endodomeniul unor proteine
transmembranare. Grosimea acestei ultrastructuri membranare este de 5-10nm.
Citoscheletul membranei este solidar i cu organitul denumit citoschelet.
Citoscheletul ca organit este reprezentat de filamente sau microtubuli distribuite în
întreg volumul citosolic i este responsabil, între altele, de meninerea i/sau
modificarea formei celulelor, ca i de geometria membranei. La unele tipuri celulare
citoscheletul este implicat în organizarea specializrilor de membran cum ar fi
microvilii, stereocilii, cilii, flagelii. De menionat c la eritrocit forma biconcav i
maleabilitatea acesteia se datoreaz în exclusivitate citoscheletului membranar.
Spuneam c spectrina este componenta de baz a citoscheletului asociat
membranei. Ea este un heterodimer (Fig. 2.11, A) format dintr-o subunitate (-
spectrin, 280kDa) i o subunitate
(-spectrin, 246kDa). Ambele subuniti
sunt formate predominant din multiple uniti repetitive de 106 aminoacizi: 22
pentru D-spectrin i 17 pentru E-spectrin [14]. Cele dou subuniti cu geometrie
fibrilar se rsucesc uor una în jurul alteia într-o structur elicoidal, formând
bastonae flexibile cu lungimea de ~100nm. Rsucirea este în contrasens
(antiparalel), fiecare bastona având la capete gruparea amino-terminal a unei
subuniti i gruparea carboxi-terminal a celeilalte. Captul coninând gruparea
amino-terminal a subunitii i gruparea carboxi-terminal a subunitii
este
numit capul bastonaului, iar cellalt capt este coada acestuia. Bastonaele au
capacitatea de a interaciona câte dou, cap la cap, formând tetrameri lungi de
~200nm (Fig. 2.11, B). Aceti tetrameri formeaz laturile reelei citoscheletului
membranar. Capetele tetramerilor, ce reprezint cozile bastonaelor de spectrin, au
capacitatea de a se asocia, de regul câte 5 sau 6, prin interaciuni cu oligomeri de
actin, formând nodurile reelei, la nivelul crora se gsesc i alte proteine care
controleaz dinamica interaciunilor i, prin aceasta, dinamica citoscheletului
membranar.
Aadar actina este o alt protein ce particip la organizarea citoscheletului
membranei, asigurând solidarizarea componentelor acestuia la nivelul nodurilor. În
forma sa monomeric actina este o protein globular cu masa de ~43kDa i un
diametru de ~5nm. La nivelul citoscheletului membranar formeaz fragmente mici,
de 8-12 monomeri cu rolul de a asigura asocierea cozilor tetramerilor de spectrin în
nodurilor reelei.
Tot în noduri se localizeaz o alt protein periferic, banda 4.1, cu masa de
~80kDa i conformaie globular (diametrul ~6nm). Banda 4.1 interacioneaz
dinamic, pe de o parte cu spectrina i actina în nodurile reelei citoscheletale i, pe de
alt parte, cu endodomeniul glicoforinei C, contribuind la ataarea citoscheletului pe

10 Atragem atenia c noiunea de citoschelet se utilizeaz i pentru organitul nedelimitat de endomembrane


format din filamente de actin, filamente intermediare i microtubuli. Aadar, facem apel la cititori s disjung
între sintagma citoschelet asociat membranei sau citochelet membranar i organitul numit citoschelet.

38
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

faa citosolic a membranei [10]. Rezult de aici un rol structural pentru o izoform a
paradoxalei glicoforine.
Ataarea citoscheletului asociat la membran este îns datorat în principal
unei alte proteine globulare, ankirina (masa molecular ~210kDa, diametrul
~9nm). Ankirina se leag atât la subunitatea
a spectrinei, la cea de-a 15-a unitate
repetitiv [13] (în treimea dinspre cap a heterodimerului), cât i la endodomeniul
benzii 3, asigurând ancorarea reelei citoscheletului membranar, prin intermediul
laturilor ochiurilor acestuia.
Pe scurt, citoscheletul membranei (Fig. 2.12) este format din tetrameri de
spectrin ce organizeaz laturile ochiurilor reelei, unde prin intermediul ankirinei se
leag de banda 3 (protein transmembranar) i din mici filamente de actin care
leag cozile tetramerilor de spectrin la nivelul nodurilor reelei, unde, prin
intermedierea benzii 4.1, reeaua se ataeaz suplimentar la endodomeniul benzii 3,
sau al glicoforinei. Interaciunile de afinitate dintre elementele citoscheletului asociat
membranei sunt într-o dinamic permanent, astfel încât aceast ultrastructur nu
este rigid, ci într-o continu modelare care s satisfac nevoile celulei. În acest fel
eritrocitul îi modeleaz forma pentru a putea s treac prin cele mai subiri capilare
(diametrul acestor capilare este de 5Pm, în timp ce diametrul unui eritrocit este de 7-
8Pm). În timpul strbaterii acestor capilare eritrocitul capt o form concav-
convex (ca o meduz) i astfel se strecoar, cu membrana foarte aproape de cea a
celulei endoteliale din peretele vasului de sânge, favorizându-se schimbul de gaze.
Citoscheletul asociat membranei nu este doar o caracteristic a membranei
eritrocitare. El se gsete în toate celulele i este structurat asemntor, chiar dac
unele dintre componente au fost denumite diferit (spre exemplu echivalenta
spectrinei în celulele nervoase este numit fodrin). Repetm, dac la eritrocit
aceast ultrastructur este singura responsabil de forma celulei, ca i de
maleabilitatea acesteia, deoarece este un element dinamic în permanent
reconstrucie, la celelalte celule pentru asigurarea formei, citoscheletul asociat
membranei este în interrelaie cu organitul denumit citoschelet.

Fig. 2.11. Structurarea i organizarea spectrinei. (A) Ambele subuniti D i E sunt formate din
domenii repetitive de câte 106 aminoacizi i se rsucesc, antiparalel una în jurul alteia, formând un
bastona de 100nm. (B) Heterodimerii DE se leag cap-cap formând tetrameri lungi de 200nm. ©
Mircea Leabu, 2014.

39
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2. 12. Organizarea citoscheletului membranar, ca o reea dinamic de endoproteine cu


ochiuri i noduri. Tetramerii spectrinei formeaz laturile ochiurilor, la nivelul crora ultrastructura se
ataeaz prin ankirin la banda 3 (canalul de schimb anionic), protein transmembranar multipas,
prin aceste interaciuni reeaua solidarizându-se membranei. Nodurile se formeaz prin ataarea
multipl a tetramerilor de spectrin la nivelul cozilor heterodimerilor DE, iar interaciunile acestora sunt
întrite prin participarea oligomerilor de actin i a proteinei benzii 4.1. Banda 4.1 ataeaz
suplimentar citoscheletul membranar la ultrastructur, interacionând cu domeniul citosolic al
glicoforinei (încrctura glucidic bogat a glicoforinei este reprezentat prin norul albastru de
deasupra ectodomeniului proteinei). Traseele contorsionate ale tetramerilor de spectrin sugereaz
maleabilitatea ultrastructurii i se datoreaz punilor flexibile pe care monomerii D, respectiv E le
organizeaz între unitile repetitive de tip spectrinic. © Mircea Leabu, 2014.

Revenind la metodologia electroforetic de studiere a proteinelor


membranare, aceasta a fost dezvoltat, prin combinare cu extragerea i ataarea
proteinelor – rezolvate prin SDS-PAGE – pe membrane adsorbante (din
nitroceluloz sau poli-difluorur de viniliden). Extragerea proteinelor din gelul de
electroforez se realizeaz tot sub aciunea câmpului electric aplicat unui sandvi
format de gelul obinut dup migrarea i rezolvarea proteinelor pe baza greutilor
lor moleculare i membrana adsorbant, iar procesul este numit transfer
electroforetic. Tehnica se finalizeaz cu o etap de imunodetecie a diferitelor specii
proteice prin folosirea de anticorpi, printr-o metod indirect (anticorpi primari,
direcionai specific împotriva unei anumite proteine, urmai de anticorpi secundari,
anti-specia surs a anticorpilor primari, cuplai, de regul, cu peroxidaz de hrean,
pentru reacia de vizualizare prin chemiluminiscen amplificat). Prin aceast
dezvoltare pot fi investigate proteine membranare fr a mai fi nevoie de izolarea
iniial a unor fraciuni pure de membran. Singurul aspect ce trebuie cunoscut
anterior este localizarea membranar a proteinei investigate. Pentru exemplificarea
tehnicii (denumit în literatura de specialitate, fr o semnificaie semantic,
„western blot”) artm variaia exprimrii unor integrine în culturi celulare
obinute din celule musculare netede din peretele de tromp uterin (Fig. 2.13).
Tehnica este deosebit de util în studiul efectelor anumitor condiii experimentale
asupra exprimrii proteinelor studiate, ca i în studii de activare a unor proteine în
diferite procese celulare, dac exist anticorpi specifici pentru domeniile proteinei
care sufer modificri ca urmare a activrii.

40
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.13. Investigare prin „western blot” a


variaiei exprimrii unor diverse subuniti de
integrine în celule musculare netede din tromp
uterin, la diferite pasaje obinute dup iniierea
unei culturi primare. 1 – pasajul 2; 2 – pasajul 4; 3
– pasajul 6; 4 – pasajul 8. Cifrele din partea stâng
a imaginii reprezint masele moleculare ale
standardelor. Evidenierea E-actinei ne ajut s
dovedim încrcarea proteic identic a probelor
supuse electroforezei. © Mircea Leabu, 2014.

Investigrile funcionale i de distribuire/redistribuire ale proteinelor


membranare se pot realiza prin alte tehnici de studiere a celulelor. Microscopia de
fluorescen reprezint o asemenea modalitate de studiu într-o multitudine de
modelri experimentale (Fig. 2. 14 i Fig. 2. 15).

Fig. 2.14. Proteine membranare identificate prin imunofluo-


rescen. (A) Proteina CD31 (abreviaie de la Cluster of Differen-
tiation 31), cunoscut i ca PECAM-1 (de la Platelet Endothelial Cell
Adhesion Molecule 1) este uniform distribuit pe suprafaa celulelor.
(B) Conexina, o protein ce formeaz jonciuni comunicante (acestea
organizându-se ca microdomenii de membran) are o distribuie în
pete în membrana celular. (Imagini puse la dispoziie, cu amabilitate
de Dr. Florea Lupu, University of Oklahoma Health Sciences Center.)
© Florea Lupu, 2014.

41
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 1.15. Evidenieri prin microscopie de fluorescen a organizrii i reorganizrii unor


proteine membranare i a citoscheletului actinic la celule în repaus (A-G), respectiv dup
stimulare cu factor de cretere epidermal, abreviat EGF, (H-N). În verde, este prezentat
distribuia integrinei D2E1 (care se leag de colagen) înainte (A), respectiv dup stimularea celular
(H). Se observ c pe celulele în repaus integrina este distribuit uniform în pete mici, iar dup
expunere la EGF exist o redistribuire cu aglomerarea semnificativ a proteinei la nivelul corpului
celular, în timp ce la nivelul lamelipodiilor, extinse datorit stimulrii celulei, se pstreaz o distribuie
în pete mici. În rou, este reprezentat situaia citoscheletului actinic. Acesta este distribuit
preponderent cortical în celulele aflate în metabolism bazal (B), în timp ce dup stimulare, alturi de o
mai accentuat organizare cortical, se formeaz fibre de stres i o reea de filamente de actin la
nivelul lamelipodiilor (I). În magenta, este evideniat receptorul pentru EGF care se distribuie
respectând citoscheletul actinic în celulele aflate în repaus (C) i se expune amplu pe suprafaa
membranar a celulei stimulate (J). În imaginile D-G se prezint suprapunerile organizrii la celula în
repaus a diferitelor componente investigate pentru identificarea eventualelor co-localizri: integrina i
actina (D), receptorul pentru EGF i integrina (E), receptorul pentru EGF i actina (F) sau pentru
toate proteinele evideniate (G). Aceleai posibile co-localizri pot fi urmrite pentru celulele stimulate
în imaginile K-N: integrina i actina (K), receptorul pentru EGF i integrina (L), receptorul pentru EGF
i actina (M) sau în cazul tuturor proteinelor studiate (N). Celulele supuse modelului experimental au
fost ataate pe suprafee de cultur acoperite cu colagen tip I. © Mircea Leabu, 2014.

Din cele discutate pân aici rezult c proteinele contribuie la caracteristicile


structurale conferite membranelor de bistratul lipidic, nuanându-le. Astfel,
proteinele sporesc eterogenitatea compoziiei membranelor ca i asimetria
structural a acesteia.

42
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Totui, în ciuda complexitii interaciunilor pe care proteinele membranare le


stabilesc între ele, cu lipidele membranare, sau (dup cum vei constata în
numeroase ocazii prin parcurgerea i însuirea informaiilor de biologie celular a
biomembranelor) cu elemente moleculare complexe intracelulare, ori din afara
celulelor, aceste componente responsabile de funciile metabolice sunt mobile,
micându-se în planul membranei. Punctând aspecte legate de dinamica proteinelor
membranare, vom putea înelege posibilitatea redistribuiei lor în funcie de starea în
care celulele se afl (Fig. 2.16). Mai mult, reorganizrile i redistribuirea elementelor
biochimice la nivelul membranei permit celulei s îi adapteze comportamentul la
nevoile impuse de condiiile de mediu sau de propriile necesiti.

2.3.4. Mobilitatea proteinelor membranare


Dinamicitatea proteinelor membranare se bazeaz pe dou tipuri de micri:
micri de rotaie i micri de translaie.
Micarea de rotaie a proteinelor membranare în jurul propriei axe, denumit
i difuzie rotaional, este de cel puin 1000 de ori mai lent decât a lipidelor.
Este lesne de îneles acest lucru gândindu-ne la diferenele de gabarit între lipide i
proteine.
Micarea de translaie, denumit i difuzie lateral, este i ea mult mai
lent decât a lipidelor, fiind în medie de 1Pm/s. Lentoarea difuziei laterale a
proteinelor nu trebuie îneleas numai prin diferenele de mrime între acestea i
lipide, ci i prin interaciunile pe care proteinele le stabilesc în mod dinamic între ele
sau cu alte structuri dinuntrul sau din afara celulei. Astfel aceeai protein, în
aceleai condiii de fluiditate a bistratului lipidic, se poate mica mai repede sau mai
încet în dependen de starea funcional, de moment a ei (interacioneaz sau nu cu
alte componente membranare, celulare sau extracelulare). Pe de alt parte, migrarea
lateral a proteinelor membranare poate fi limitat, din considerente impuse de
nevoile funcionale ale celulelor, numai la anumite domenii ale membranei. De
exemplu, celulele polarizate ale epiteliilor unistratificate îi creeaz i îi pstreaz o
compoziie proteic diferit la nivelul membranei apicale, fa de cea de la nivelul
membranei latero-bazale; asta deoarece cele dou domenii diferite ale membranei
celulare au funcii diferite. Mai mult, micarea proteinelor membranare este limitat
i din cauza îngrdirilor pe care le impun organizarea citoscheletului membranar i a
filamentelor de actin din citoscheletul cortical. Au fost descrise trei niveluri
ierarhice de îngrdire a mobilitii proteinelor pe distane între 2 i 300nm, numite
domenii de mezoscal: domeniul dinamicii complexelor proteice (3-10nm), domeniul
plutelor lipidice (2-20nm) i domeniul compartimentrii prin citoscheletul
membranar/actina organizat cortical [15]. Toate aceste aspecte nuaneaz dinamica
proteinelor membranare într-un mod care se rsfrânge asupra funciilor, iar lipidele
nu par a scpa de împiedicri similare de libertate, chiar dac rigoarea supunerii
acestora nivelelor de restricii menionate este mai puin rigid.
Dovezile experimentale asupra translaiei proteinelor (difuziei laterale a
proteinelor) în planul membranei au venit din observaii colaterale, nu neaprat din
experimente imaginate i conduse special pentru investigarea acesteia.
Prime dovezi au fost aduse în 1970 [16], când se urmrea obinerea de celule
hibride între om i oarece (aa-numiii heterocarioni). Pentru a se monitoriza
fuziunea celulelor i obinerea heterocarionilor, cele dou tipuri de celule au fost
marcate cu anticorpi specifici, ce purtau fluorescene de culori diferite. În celula
hibrid s-a observat c fluorescenele iniial localizate separat, s-au amestecat dup
40 de minute, distribuindu-se uniform în membrana heterocarionului. Aceast
observaie a fost explicat prin capacitatea proteinelor membranare de a difuza în
planul membranelor crora le aparin.

43
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Alte dovezi au venit din observaiile asupra fenomenelor de “patching /


capping” pe care le-am putea denumi în românete ptare (maculare) /
calotare, observate chiar la microscopul electronic în experimente corespunztor
conduse [17]. Iat în ce constau aceste observaii. Limfocitele, a cror suprafa era
marcat iniial uniform cu anticorpi policlonali marcai cu feritin [17] sau cu
fluorocromi [18], prezentau în timp aglomerri în pete, iar în cele din urm feritina
sau fluorescena se adunau în întregime polar, sub forma unei tichii (calote sferice).
Explicaia acestei realiti experimentale nu putea fi dat decât acceptând c
proteinele, distribuite iniial uniform în planul membranei, pot difuza lateral liber,
iar ambivalena i caracterul policlonal al anticorpilor folosii, prin legri încruciate,
contribuiau la unirea partenerilor de reacie în complexe din ce în ce mai mari,
sfârind prin formarea unui complex singular.
Al treilea tip de experimente, de aceast dat destinate studiului difuziei
laterale a moleculelor individuale de rodopsin (cromoprotein cu fluorescen
intrinsec) din membranele discurilor celulelor cu bastonae din retin, sunt cele
care studiaz refacerea fluorescenei dup foto-stingere denumit prescurtat FRAP
(de la “Fluorescence Recovery After Photobleaching”). Asemenea experimente au
permis i estimarea coeficienilor de difuziune, aadar aprecierea cantitativ a
micrii proteinelor membranare [19]. Ele se pot realiza i pentru proteine care nu
sunt fluorescente de la sine, dup ce acestea au fost marcate cu fluorocromi. Pe scurt,
aceste experimente constau în stingerea fluorescenei unei zone micronice din
membran, prin aciunea unui fascicul de lumin intens i puternic focalizat (de
obicei raz laser) i în urmrirea refacerii fluorescenei în acea zon, datorit difuziei
moleculelor fluorescente din celelalte zone, neafectate (nestinse) ale membranei. În
acest fel se pot msura coeficieni de difuziune pentru proteine membranare din
orice tip de celul.

2.3.5. Rolul proteinelor membranare


Ca i în cazul lipidelor membranare, proteinele au atât rol structural, cât i
rol metabolic. Este evident c atâta timp cât proteinele integrale sunt cufundate în
bistratul lipidic rolul lor în organizarea membranei ca ultrastructur celular (rolul
structural) este unul intrinsec. Prezena proteinelor în bistrat nu trebuie s afecteze
funcia de barier selectiv conferit de însui elementul de baz din organizarea
membranelor. O bun exemplificare asupra rolului structural al proteinelor
membranare îl constituie comentariul aferent citoscheletului membranar (vezi mai
sus). Se poate aduga rolul unor proteine transmembranare numite caderine în
stabilirea jonciunilor dintre celule, la nivelul esuturilor sau a celor numite
integrine (vezi CASETA 2.2) implicate, de regul, în interaciunea celulelor cu
componente ale matricei extracelulare (proteine i/sau glicoproteine ce structureaz
diverse componente tisulare între celule). Rolul structural, al unor asemenea
proteine transmembranare, este acela de a menine celulele într-o ordonare coerent
în organizarea esuturilor, dar i de a permite acestora s schimbe informaii pentru
o integrare eficient, iar schimbul de informaii transcede funcia structural; aadar
atât caderinele, cât i integrinele au i funcii metabolice (vezi în capitolul 3, la
subcapitolul ”Semnalizarea celular”). Asta înseamn c nu se poate face o delimitare
între cele dou tipuri de funcii (lucru valabil i pentru lipide de altfel). Aceleai
entiti moleculare pot avea atât rol structural, cât i rol metabolic (vezi mai sus, ca
exemplu, proteina banda 3 din membrana eritrocitar). Aa stau lucrurile i pentru
integrine, respectiv caderine care au atât un important rol structural (ataarea
celulelor la substrat sau unele de altele), cât i rol în culegerea de informaii legate de
ambiana în care celulele se gsesc, ceea ce le implic în declanarea de procese
celulare menite s creeze rspunsuri specifice condiiilor concrete din mediu.

44
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

CASETA 2.2. Integrinele i rolul lor. Integrinele sunt glicoproteine transmembranare,


structurate ca heterodimeri (fiecare subunitate – sau – fiind o protein unipas, de tipul I),
cu rol în aderarea celulelor la matricea extracelular i în transmiterea de informaii legate de
caracteristicile fizico-chimice ale structurilor macromoleculare din mediul extracelular. Exist,
identificate în momentul de fa, 18 subuniti i 8 subuniti , care, prin diverse combinaii,
formeaz (dup informaiile de care dispunem în acest mement) 24 de tipuri distincte de integrine.
Aceti heterodimeri diferii au specificiti diverse, atât sub aspectul partenerului de interaciune
din matricea extracelular pe care îl leag, cât i sub aspectul afinitilor fa de acetia. Altfel
spus, chiar dac specificitatea integrinelor este un parametru degenerat (mai multe proteine de
matrice se pot lega de aceeai integrin i mai multe integrine pot lega aceeai protein de
matrice), afinitatea acestor interaciuni este diferit, iar semnalele pe care celula le primește dup
angajarea integrinelor în interaciunile specifice sunt, de asemenea, diferite. Dac rolul structural
al integrinelor este relativ bine caracterizat, rolul metabolic al lor (procesele de semnalizare pe care
le declaneaz) este departe de a fi cu claritate elucidat, dei nu este contestat de nimeni în
comunitatea tiinific. Integrinele sunt implicate în controlul unor procese celulare ca
diferenierea, moartea celular programat, motilitatea. Toate aceste procese sunt importante atât
în organizarea normal a esuturilor i organelor, cât i în patologii dintre cele mai diverse. În
aceste aspecte de biologie normal sau patologie celular, integrinele coopereaz cel puin cu
receptorii pentru factori de cretere. Cile de semnalizare ce sunt iniiate de integrine se
intersecteaz cu cele iniiate de receptorii pentru factori de cretere [20], nuanând într-o plaj
larg capacitile celulelor de a rspunde factorilor externi i asigurând o multitudine de
posibiliti de adaptare.

În general, atât pentru caderine, cât i pentru integrine se poate afirma c ele
determin celula s se comporte difereniat în funcie de statusul lor: un anumit
comportament, atunci când sunt angrenate în interaciuni cu alte celule, respectiv
componente ale matricei celulare i un alt fel de comportament, atunci când sunt
detaate din astfel de interaciuni, iar gradele lor de libertate sporesc.
Detalii asupra rolurilor metabolice ale proteinelor membranare sunt
prezentate în subcapitolele privind transportul membranar i semnalizarea celular.
Aici vom aminti, doar în linii generale, c rolurile metabolice ale proteinelor
membranare se manifest în ceea ce privete schimburile de substan i informaii
dintre celule sau dintre acestea i mediu. Astfel, proteinele membranare pot fi
receptori (pentru hormoni, factori de cretere, citokine, chemokine),
transportori prin membran (canale ionice, pompe ionice, conexoni, porine)
sau transportori cu membran (clatrin, caveolin: proteine ce structureaz
înveliuri ale unor microdomenii din membran pentru a permite invaginarea
acestora i detaarea sub form de vezicule, realizând procese denumite generic
endocitoz; alte proteine asigur fuzionarea unor vezicule cu membrana celular,
facilitând fenomenul de secreie prin exocitoz; vezi amnunte la transportul
membranar).
Proteinele membranare mai pot funciona ca enzime (metaloproteinaze
pentru componente de matrice extracelular, fosfolipaze – vezi diversitatea acestora,
mai sus, la seciunea despre rolul lipidelor membranare, kinaze, fosfataze) sau ca
proteine implicate în semnalizare (de exemplu, proteine platform/schel, numite
i proteine adaptoare sau proteine G). Detalii asupra mecanismelor prin care aceste
proteine membranare îi realizeaz funciile vei gsi (i trebuie folosite într-o
discuie profesionist despre aceast component molecular a membranei) pe
parcursul însuirii tuturor celorlalte informaii despre celul.
În toate aceste funcii asimetria structurrii membranei este deosebit de
important. Astfel, receptorii, dar i proteinele de adeziune (caderinele i integrinele)
prin asimetria lor structural permit prin ectodomenii interaciunea cu liganzii
specifici, iar prin endodomenii asigur transmiterea informaiei ctre interiorul
celulei i declanarea unor procese celulare care se constituie în rspuns celular la
semnalele receptate. De remarcat c în transmiterea semnalelor prin receptori sau
integrine un rol important revine domeniului transmembranar al acestor proteine

45
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

integrale. Domeniile transmembranare au capacitatea de a suferi rearanjri


conformaionale, induse de legarea ligandului. Aceste rearanjri conformaionale
asigur transmiterea, din afara celulei în citoplasm, a informaiei purtate de ligand
i predate prin interaciunea cu receptorul specific. Fenomenul de transmitere a
informaiei din afara celulei în citoplasm este denumit i transducie a semnalului.
Informaia, ajuns la nivelul endodomeniului receptorului, este preluat, prelucrat
i, de regul, amplificat de participanii la diversele procese de semnalizare
(mesageri secunzi i/sau efectori intracelulari, care vor fi definii la seciunea legat
de semnalizarea celular). De menionat aici c efectele asupra conformaiei
domeniilor transmembranare sunt dependente i de aspectele legate de parametrul
fizic fluiditate a membranei, detaliat mai sus, în seciunea privitoare la starea fizic a
bistratului lipidic.
În rezumat, proteinele membranare sporesc eterogenitatea compoziional i
asimetria membranelor i moduleaz proprietile fluide ale acestora, adic
accentueaz i modeleaz caracteristicile induse de bistratul lipidic. Altfel spus,
proteinele membranare coopereaz cu lipidele atât în structurarea membranei cât i
în perfectarea funcionalitii acesteia, prin rolul lor metabolic, cel care asigur
integrarea celulei cu mediul. În exercitarea rolurilor lor metabolice, proteinele
membranare pot antrena atât lipidele membranare, cât i componente citosolice sau
extracelulare.

Bibliografie selectiv
1. Steck TL. (1974) The organization of proteins in the human red blood cell membrane. A review. J Cell
Biol. 62: 1-19.
2. Schultz AM, Henderson LE, Oroszlan S. (1988) Fatty acylation of proteins. Annu Rev Cell Biol. 4:
611-647.
3. Rodriguez-Boulan E, Powell SK. (1992) Polarity of epithelial and neuronal cells. Annu Rev Cell Biol.
8: 395-427.
4. Spiro RG. (2002) Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease
implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12: 43R-56R.
5. Marchesi VT, Furthmayr H, Tomita M. (1976) The red cell membrane. Annu Rev Biochem. 45:
667-98.
6. Helenius A, Simons K. (1975) Solubilization of membranes by detergents. Biochim Biophys Acta.
415: 29-79.
7. Chasis JA, Mohandas N. (1992) Red blood cell glycophorins. Blood. 80: 1869-1879.
8. Tayyab S, Qasim MA. (1988) Biochemistry and roles of glycophorin A. Biochem Educ. 16: 63-66.
9. Takakuwa Y. (2001) Regulation of red cell membrane protein interactions: implications for red cell
function. Curr Opin Hematol. 8: 80-84.
10. Williamson RC, Toye AM. (2008) Glycophorin A: band 3 aid. Blood Cells Mol Dis. 41: 35-43.
11. Orlandi PA, Klotz FW, Haynes JD. (1992) A malaria invasion receptor, the 175-kilodalton
erythrocyte binding antigen of Plasmodium falciparum recognizes the terminal Neu5Ac(alpha2-3)Gal-
sequences of glycophorin A. J Cell Biol. 116: 901-909.
12. Drickamer LK. (1978) Orientation of the band 3 polypeptide from human erythrocyte membranes.
Identification of NH2-terminal sequence and site of carbohydrate attachment. J Biol Chem. 253: 7242-
7248.
13. Vince JW, Reithmeier RA. (1998) Carbonic anhydrase II binds to the carboxyl terminus of human
band 3, the erythrocyte C1-/HCO3- exchanger. J Biol Chem. 273: 28430-28437.
14. Kennedy SP, Warren SL, Forget BG, Morrow JS. (1991) Ankyrin binds to the 15th repetitive unit
of erythroid and nonerythroid beta-spectrin. J Cell Biol. 115: 267-277.
15. Kusumi A, Fujiwara TK, Chadda R, Xie M, Tsunoyama TA, Kalay Z, Kasai RS, Suzuki KG.
(2012) Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction:
commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annu Rev Cell
Dev Biol. 28: 215-250. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100809-151736.

46
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

16. Frye LD, Edidin M. (1970) The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-
human heterokaryons. J Cell Sci. 7: 319-335.
17. de Petris S, Raff MC. (1973) Normal distribution, patching and capping of lymphocyte surface
immunoglobulin studied by electron microscopy. Nat New Biol. 241(113): 257-259.
18. Schreiner GF, Unanue ER. (1975) The modulation of spontaneous and anti-Ig-stimulated motility of
lymphocytes by cyclic nucleotides and adrenergic and cholinergic agents. J Immunol. 114(2 pt 2): 802-
808.
19. Wey CL, Cone RA, Edidin MA. (1981) Lateral diffusion of rhodopsin in photoreceptor cells measured
by fluorescence photobleaching and recovery. Biophys J. 33(2): 225-232.
20. Leabu M, Uniyal S, Xie J, Xu YQ, Vladau C, Morris VL, Chan BM. (2005) Integrin D2E1
modulates EGF stimulation of Rho GTPase-dependent morphological changes in adherent human
rhabdomyosarcoma RD cells. J Cell Physiol. 202, 754-766.

47
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.4. Componenta glucidic a membranei


În afar de lipide i proteine, în organizarea molecular a membranelor se
întâlnesc i glucide. În ceea ce urmeaz vom folosi termenul de component glucidic
a membranelor i nu de glucide membranare, pentru a fi, prin exprimare, mai
aproape de realitatea biologic. Motivaia acestei preferine este dat de faptul c, în
membranele celulare (ca i în endomembrane) glucidele nu se gsesc ca entiti
individuale, ci sunt grefate pe un purttor lipidic sau proteic, ca structuri în principal
oligozaharidice, dar i polizaharidice. Componentele biochimice complexe formate
din glucide i lipide sau din glucide i proteine poart denumirea generic de
glicoconjugate. Prile glucidice ale glicoconjugatelor sunt dispuse întotdeauna pe
faa extern a membranelor celulare, formând ceea ce denumim glicocalix. Înc de
la început, în baza afirmaiei anterioare i rememorând faptul c pe faa intern a
membranelor se afl citoscheletul asociat, putem puncta faptul c prezena acestor
dou (ultra)structuri sporete asimetria membranelor. În cele ce urmeaz, abordând
aspecte generale referitoare la prezena glucidelor în organizarea membranelor, vom
adânci argumentarea nu numai pentru caracterul asimetric al structurrii acestora,
dar i pentru eterogenitatea compoziional a lor, respectiv pentru efectele asupra
comportamentului fluid manifestat bidimensional.

2.4.1. Definiia glicocalixului i organizarea lui molecular


Glicocalixul reprezint înveliul glucidic al celulelor, constituit din structuri
oligozaharidice sau polizaharidice inserate pe lipide ale foiei externe a bistratului
sau pe proteine (adic pe ectoproteine, respectiv pe ectodomeniile proteinelor
transmembranare). În privina modului de organizare a componentei glucidice a
membranelor punctm c glicolipidele poart doar structuri oligozaharidice, în timp
ce proteinele pot purta atât structuri oligozaharidice, cât i polizaharidice.
Din punctul de vedere al structurii biochimice globale, trei sunt componentele
membranare ce particip la structurarea glicocalixului prin prile glucidice din
compoziia lor: glicolipidele, glicoproteinele i proteoglicanii. Toate cele trei
categorii de componente sunt denumite generic, repetm, glicoconjugate.
Grosimea glicocalixului este, în medie, între 20 i 50nm, variind de la un tip de celul
la altul, dar i pentru aceeai celul de la un domeniu membranar la altul (spre
exemplu la celulele epiteliilor unistratificate între polul apical i cel latero-bazal).
Sunt îns raportri de grosimi ale glicocalixului ce pot ajunge pân la 200 i chiar
2000nm [1]. O regul pe care o aplicm în înelegerea grosimii glicocalixului este c
acesta are o grosime cu atât mai mare, cu cât celulele sunt mai puin implicate în
interaciuni cu alte celule sau cu substrate din matricea extracelular. Aplicând
aceast regul vom intui c glicocalixul cel mai gros îl prezint celulele sanguine. Pe
de alt parte, la celulele epiteliilor monostratificate, polul apical are un glicocalix mai
abundent, fa de polul latero-bazal. La celulele epiteliilor în monostrat definim dou
domenii membranare11: domeniul apical, situat la polul orientat ctre
cavitile pe care aceste epitelii le cptuesc (polul apical al celulei), respectiv
domeniul latero-bazal, situat ctre spaiile dintre membranele a dou celule
învecinate ale epiteliului i, respectiv, ctre membrana bazal, element al matricei
extracelulare prin care aceste epitelii se ataeaz de structurile tisulare (polul latero-
bazal al celulei). Mai mult, acolo unde mediul din cavitatea cptuit de celulele
epiteliale monostratificate este puternic agresiv (de exemplu în stomac, sau în
intestin), glicocalixul este îngroat de secreii glicoproteice de tip mucinic (vezi, mai

11
Atragem atenia a nu se face confuzie între noiunea de domeniu membranar i cea de microdomeniu de
membran.

48
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

jos, prin ce se caracterizeaz glicoproteinele de tip mucinic, numite mai scurt


mucine, din mucusul diferitelor structuri).
În cele ce urmeaz vom discuta aspectele cu caracter general legate de
organizarea glicocalixului. În privina argumentrii pentru participarea componentei
glucidice la sporirea eterogenitii biochimice a membranei, nu vom proceda la
metoda clasificrii structurilor zaharidice din glicocalix. Ar fi o munc greu de dus la
bun sfârit, întrucât complexitatea i diversitatea structural a lanurilor
oligozaharidice de la nivelul acestui înveli glucidic al celulelor face abordarea
detaliilor dificil, dar i ineficient i fr justificare în raport cu scopul nostru:
cunoaterea organizrii membranei la nivel molecular, pentru a înelege funcionarea
ei ca un sistem integrat. Aceast modificare a modalitii de abordare nu va afecta cu
nimic înelegerea organizrii acestei componente moleculare a membranelor i a
rolului ei, ci doar va simplifica transmiterea cunotinelor în toat diversitatea lor.
În structurarea glicocalixului nu particip toate monozaharidele existente în
natur. Numai apte intr, de regul, în alctuirea lanurilor oligozaharidice ale
glicolipidelor i glicoproteinelor. Acestea sunt, într-o ordine lipsit de o anumit
semnificaie: glucoza (Glc), galactoza (Gal), manoza (Man), fucoza (Fuc), N-
acetil-glucozamina (GlcNAc), N-acetil-galactozamina (GalNAc) i acizii
sialici (SA). Spunem acizi sialici (la plural) i nu folosim singularul deoarece ne
referim la o clas de glucide ce deriv din structura de baz a acidului neuraminic
(Fig. 2.16), un glucid cu 9 atomi de carbon în molecul, cel din poziia 1 aflându-se
într-o grupare carboxil (de unde i numele de acid). De la acidul neuraminic deriv
primii reprezentani a dou serii: acidul N-acetil-neuraminic (NANA), cel mai
rspândit i acidul N-glicolil-neuraminic. Dar diversitatea acizilor sialici nu se
oprete aici, deoarece reprezentanii de baz pot fi O-acetilai la hidroxilii de la
carbonii 4, 7, 8 i/sau 9. inând cont c pot fi mono-, di- sau, mai rar, chiar tri-
acetilai ne facem o idee mai exact asupra diversitii entitilor moleculare incluse
sub numele de clas acizi sialici. Speciile tetra-acetilate nu se întâlnesc în glicocalix i
este lesne s raionm de ce: sunt componente deosebit de hidrofobe i nu pot fi
acomodate acolo, într-o formaiune ultrastructural prin excelen hidrofil. Aceast
diversitate enorm de tipuri de acizi sialici se constituie, iat, ca o prim
argumentare a eterogenitii structurilor glucidice ale glicocalixului.
În afar de cele apte monozaharide menionate, în proteoglicani întâlnim i
xiloza (monozaharidul prin care se poate lega structura glucidic de o serin din
partea proteic), precum i acizi uronici (acid glucuronic i acid iduronic).
Dac ar fi s ne referim la detalii fizico-chimice care caracterizeaz
monozaharidele menionate, putem afirma c numai Fuc este din seria L, toate
celelalte aparinând seriei D.

Fig. 2.16. Structurile de baz ale seriilor de acizi sialici. Acidul neuraminic nu a fost identificat ca
atare în componenta glucidic a biomembranelor, ci doar derivaii N-acetil- i N-glicolil- ai si.

49
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Prin enumerarea monozaharidelor ce particip la structurarea lanurilor


oligo- sau poli-zaharidice ce organizeaz glicocalixul accentum ideea de
eterogenitate structural a membranelor celulare i, în general, a biomembranelor.
Dar lucrurile nu se opresc doar la acest nivel. Pentru argumentarea caracterului
eterogen al structurrii membranelor (indus de lipide, apoi amplificat de proteine,
dar i de structurile glucidice) trebuie s subliniem c îniruirea glucidelor în
lanurile oligozaharidice nu este aceeai, diferind între glicolipide i glicoproteine,
diferind între diversele glicolipide, diferind între diversele glicoproteine. Mai mult,
legarea monozaharidelor între ele se poate face în mai multe moduri, întrucât exist
mai multe grupri hidroxil disponibile. E drept c nu toate din aceste posibiliti sunt
utilizate de celule. Diversitatea de posibiliti teoretice este limitat de tipurile de
glicoziltransferaze (numele generic pentru enzimele care biosintetizeaz structuri
glucidice în celule) pe care o anumit celul le are în reticulul endoplasmic i în
complexul Golgi, organitele unde structurile glucidice din glicolipide, glicoproteine,
sau proteoglicani sunt biosintetizate. Glicoziltransferazele sunt enzime cu
stereospecificitate foarte ridicat, astfel încât legarea, pas cu pas, a glucidelor unul de
altul în structurile oligozaharidice, din glicolipide i glicoproteine, nu este
întâmpltoare.
Între glicolipide, glicoproteine i proteoglicani exist însemnate diferene
structurale la nivelul componentei glucidice.
Glicolipidele, care constituie ~10% dintre lipidele membranare, conin un
singur lan oligozaharidic, de regul neramificat. Lanurile glucidice din glicolipide
conin, în general, mai puine monozaharide (rar peste 13-15). Pentru a avea o
imagine corect a organizrii spaiale a lanurilor, vom meniona c acestea nu au
traiect liniar ci sunt “contorsionate”, tocmai datorit orientrii gruprilor hidroxil
utilizate la lungirea oligomerului glucidic (rezultat al stereospecificitii
glicoziltransferazelor).
Glicoproteinele conin uzual mai multe lanuri oligozaharidice grefate pe
lanul polipeptidic. Inserarea se poate face la azotul amidic al unei asparagine
aflate întotdeauna într-o secven consens (vezi la seciunea despre biogeneza
membranelor, în volumul al II-lea) sau la hidroxilul dintr-o serin ori dintr-o
treonin. În primul caz structurile glucidice se numesc N-glicozidice, în cel de-al
doilea O-glicozidice. Structurile O-glicozidice (legate la serin sau treonin) sunt
abundente în glicoproteinele de tip mucinic. De aceea aceste tipuri de oligozaharide
din proteine sunt denumite i structuri mucinice. Structurile N-glicozidice conin
Man, cele O-glicozidice nu. Lanurile oligozaharidice ale glicoproteinelor sunt
ramificate. Ramificarea se face dup principiul dihotomic (adic din fiecare punct de
ramificare pleac numai dou ramuri). De regul, din câte se cunoate pân în
prezent, exist unul sau dou puncte de ramificare, astfel încât fiecare structur
oligozaharidic din glicoproteine poate fi biantenar sau triantenar. Structurile
oligozaharidice ale glicoproteinelor conin, de regul, un numr semnificativ mai
mare de monozaharide, în comparaie cu cele ale glicolipidelor.
Privind succesiunea monozaharidelor în lanurile oligozaharidice din
glicolipide i glicoproteine, se pot face urmtoarele afirmaii cu caracter de regul: (i)
glucoza, atunci când se afl, nu se gsete niciodat în poziie terminal a lanului;
(ii) acizii sialici, atunci când se afl (i de regul se afl), se gsesc întotdeauna în
poziia terminal a lanului. Regula nu este înclcat nici atunci când o molecul de
acid sialic se afl subterminal. Aceasta înseamn c lanurile se pot termina cu acizi
sialici legai unul de altul. Un aspect cu semnificaie biologic (vezi mai jos la
seciunea despre rolul glicocalixului) ce trebuie punctat aici este faptul c, de regul,
structurile glucidice din glicolipide i glicoproteine se termin cu elemente
purttoare de sarcin negativ (dac nu cu acid sialic, cum se întâmpl cel mai
adesea, atunci cu un glucid care sufer o sulfatare la unul dintre hidroxili).
50
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Dei proteoglicanii sunt mai slab reprezentai la nivelul membranelor celulare,


ceea ce a determinat i evidenierea mai târzie a prezenei lor în glicocalix,
contribuia acestora la structurarea componentei glucidice a membranelor nu poate
fi neglijat, din cel puin dou motive. În primul rând încrctura lor glucidic
depete cu mult componenta proteic (90-95% de mas glucide, 5-10% maxim
protein în structura proteoglicanilor, în timp ce în glicoproteine raportul masic
glucide/proteine este subunitar) i, în al doilea rând, structurile glucidice
(polizaharidice) sunt cele mai lungi dintre toate cele întâlnite la nivelul glicocalixului.
Diferenele de organizare la nivel chimic dintre glicoproteine i proteoglicani
îndreptesc biochimitii s le considere dou tipuri diferite de glicoconjugate, dei
ambele au în structur lan polipeptidic i glucide. Lanurile polizaharidice ale
proteoglicanilor poart denumirea de glicozaminoglicani. Glicozaminoglicanii
sunt structuri polizaharidice neramificate, formate din uniti dizaharidice repetitive
alctuite dintr-un zahar sau aminozahar i un acid uronic (acid glucuronic sau
iduronic). Excepia de la aceast descriere de principiu a compoziiei moleculare o
prezint keratan-sulfaii în care unitile dizaharidice repetitive conin Gal (un zahar)
i GlcNAc (derivat de aminozahar). De subliniat i în acest context, puternica
încrctur negativ a proteoglicanilor provenit atât de la acizii uronici coninui,
cât i de la sulfatrile pe care le pot conine zaharurile sau aminozaharurile prezente
în moleculele glicozaminoglicanilor. Aceast puternic încrctur negativ se
rsfrânge asupra caracteristicilor fizice ale suprafeei celulare. Toate celulele din
organism poart o sarcin negativ net pe suprafaa lor, iar aceasta se datoreaz, în
principal, structurilor glucidice din glicocalix.

2.4.2. Metodologia de studiu a glicocalixului


Prezena glicocalixului la suprafaa celulelor a fost evideniat la microscopul
electronic prin metode de citochimie ultrastructural atât nespecifice (adic
metode care evideniaz structura, fr a aduce indicii referitoare la compoziia ei
biochimic), cât i specifice (metode care permit descrierea, cel puin parial, a
biochimiei structurii).
Ca un prim exemplu de metod nespecific amintim folosirea roului de
ruteniu (Fig. 2. 18, A). Acest compus interacioneaz cu sarcinile negative de la
nivelul glicocalixului impregnându-i grosimea cu nucleii grei ai ruteniului i
conferind structurii electrono-opacitate. Putem caracteriza prin aceast metod
glicocalixul sub aspectul grosimii sale i al densitii lanurilor glucidice care îl
formeaz.
O alt modalitate nespecific de a evidenia glicocalixul este aceea de a
vizualiza densitatea de sarcini negative de la suprafaa celulelor, prin folosirea de
trasori electrono-deni purttori de sarcini pozitive. Acest lucru se poate face cu
proteine cationizate (care la pH fiziologic poart sarcin net pozitiv) adsorbite pe
particule de aur coloidal (Fig. 2. 17, B i C). Caracterul particulat al trasorilor
electrono-opaci cu aur coloidal permite evidenierea mai multor aspecte legate de
organizarea înveliului exterior al membranelor, cum ar fi: abundena de elemente
purttoare de sarcini negative, distribuia lor pe diverse microdomenii de membran,
dar i grosimea ultrastructurii purttoare a sarcinilor negative. În ciuda acestor
detalii, metodele cu rou de ruteniu i cu trasori electrono-deni cationizai rmân
nespecifice, deoarece nu se adreseaz tipurilor de elemente biochimice care
determin marcrile. tim acum c ele sunt componente glucidice purttoare de
funciuni negative (grupri carboxil sau grupri sulfat esterificate pe hidroxili ai
glucidelor).
Ca metod specific pentru studiul glicocalixului prezentm citochimia
ultrastructural cu lectine [2, 3].

51
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2. 17. Identificarea nespecific a glicocalixului de la suprafaa celulelor pe baza încrcrii


negative pe care o poart multe din glucidele componente. A. Decorarea suprafeei celulare cu
rou de ruteniu. B, C. Evidenierea încrcrii negative a suprafeei luminale a celulelor endoteliale din
capilarele creierului (B), respectiv pancreasului endocrin (C) cu ajutorul albuminei serice bovine
cationizate, adsorbit pe aur coloidal de 10nm. Calitatea preparatelor ne permite s evideniem
limpede i aspectul trilaminat al membranelor în microscopia electronic de transmisie standard.
(Imagini puse la dispoziie, cu amabilitate, de Dr. Nicolae Ghinea, Département Recherche
Translationnelle, Institute Curie, Paris.) © Nicolae Ghinea i Mircea Leabu, 2014.

Lectinele12 sunt proteine sau glicoproteine ce leag specific structuri


glucidice, au cel puin dou situri de legare identice i nu sunt de origine imun
(adic nu sunt anticorpi împotriva unor epitopi ce conin glucide). Pentru fiecare
lectin exist un monozaharid determinant al specificitii, dar ambiana molecular
în care acesta se afl este, de asemenea important. Lectinele mai sunt cunoscute i
sub denumirea de aglutinine deoarece, mulumit capacitii lor de a interaciona cu
structurile glucidice, cât i datorit faptului c prezint cel puin dou situri identice
de legare, pot aglutina celulele sanguine. Lectinele au fost iniial identificate în plante
i extrase din acestea (de regul din semine). Ulterior, activiti de tip lectinic au fost
evideniate i în organismele animale, fiind implicate într-o multitudine de procese
celulare (vezi câteva exemplificri, mai jos, la seciunea referitoare la rolul
glicocalixului).
În citochima ultrastructural lectinele pot fi folosite dup cuplare cu trasori
electrono-opaci (feritin, peroxidaz de hrean, hempeptizi, aur coloidal),
în tehnici directe sau sub form nativ, în tehnici indirecte (în sandvi), metode în
doi pai. La primul pas, suprafaa celulelor este incubat cu lectina aflat în exces în
soluia folosit, pentru saturarea interaciunilor de afinitate. Excesul de molecule de
lectin este apoi îndeprtat, rmânând numai cele ataate specific de componente
glucidice ale membranei (prin unul din siturile de legare), care sunt vizualizate, în
pasul al doilea al metodei, prin legarea de glicoproteine corespunztoare, cuplate cu
trasori electrono-opaci. Tehnicile indirecte, în doi pai, pentru citochimia
ultrastructural cu lectine exploateaz existena celor dou situri identice de legare

12 Atragem atenia a nu se confunda termenul lectin cu cel de lecitin (nume generic pentru fosfatidilcoline).

52
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

ale uneltei de investigare. Glicoproteinele marcate cu trasorul electrono-opac se


fixeaz pe siturile de interaciune ale lectinelor rmase disponibile, dup legarea cu
unul din situri la componentele glicocalixului. Avantajul acestor metode este c
lectinele sunt folosite cu capacitile de legare (afinitatea i specificitatea) nealterate.
Afinitatea i specificitatea acestor unelte de studiu pot fi afectate în cazul folosirii
unor conjugate lectin-trasor electrono-opac, din cauza reaciilor chimice petrecute
în timpul cuplrii sau posibilelor împiedicri sterice care pot aprea în conjugat.
A fost folosit o mare gam de lectine pentru caracterizarea parial a
glicocalixului diverselor tipuri de celule (Fig. 2. 18). Amintim aici pe cele mai des
utilizate, cu glucidul determinant al specificitii lor.
Concanavalina A (ConA), o lectin din Concanavalia ensiformis, care leag -
Man dintr-un miez trimanozidic al structurilor N-glicozidice sau -Glc aflat în
poziie terminal. Rezult c la nivelul glicocalixului ConA nu se leag de Glc, aceasta
nefiind situat în poziie terminal (Fig. 2.18, A i E).
Lectina I din Ulex europaeus (UEA I),13 care recunoate -Fuc aflat în poziie
terminal a lanului oligozaharidic.
Lectina din Dolichos biflorus (DBA) interacioneaz cu structuri ce conin -
GalNAc legat de o alt GalNAc.
O alt lectin ce leag -GalNAc, îns inserat pe o Gal, este cea din Helix
pomatia (HPA).
Pentru
-Gal sunt folosite lectina din arahide (PNA) i/sau lectina I din
Ricinus communis (RCA I). Specificitile celor dou lectine sunt îns diferite. PNA
(Fig. 2.18, D) se leag exclusiv de Gal aflat în poziie terminal, în timp ce RCA I
(Fig. 2.18, C i G) poate recunoate i Gal aflat în poziie subterminal, dac acidul
sialic terminal este inserat la hidroxilul de la carbonul ase al acesteia. Mai mult,
ambiana în care galactoza terminal se afl în cadrul secvenei glucidice este diferit
pentru ce leag PNA, fa de ce leag RCA I. Aadar specificitile celor dou lectine
sunt nuanate.
Au fost folosite dou lectine i pentru evidenierea citochimic a acizilor
sialici. Acestea sunt lectina din germeni de grâu (WGA) i lectina din Limulus
polyphemus (LPA). WGA (Fig. 2.18, B i F) recunoate acidul N-acetil-neuraminic-4-
O-acetilat, dar i
-GlcNAc. LPA se leag de acizi sialici atât din categoria celor N-
acetilai, cât i din categoria celor N-glicolilai.
Nuanrile din specificitile acestor lectine sunt bine cunoscute sub aspectul
secvenelor în care trebuie s se afle glucidul determinant al specificitii. Utilizarea
lor aduce astfel informaii nu numai asupra prezenei i abundenei tipurilor de
glucide din compoziia glicocalixului, dar i în ceea ce privete caracterizarea parial
a structurilor oligozaharidice, a secvenelor acestora. Cu cât spectrul lectinelor
folosite este mai larg, cu atât imaginea asupra glicocalixului este mai detaliat. În
plus, combinarea acestor metode cu folosirea exo- sau endo-glicozidazelor,
pentru degradarea specific secvenial sau global a lanurilor glucidice,
completeaz fericit caracterizarea citochimic a glicocalixului. Trebuie îns
menionat c informaiile complete asupra structurilor glucidice ale glicocalixului le
aduc tot metodele biochimice, prin care putem segrega între glicolipide, glicoproteine
i proteoglicani, putem izola i caracteriza entitile moleculare. Mai mult, subtilele
implicaii ale structurilor glucidice din glicocalix asupra funcionrii membranelor se
vor putea descifra numai prin folosirea metodelor de manipulare genetic asupra
enzimelor care elaboreaz lanurile glucidice ale suprafeelor membranare. Acestea
sunt provocri ale timpurilor (nu prea îndeprtate) ce vor s vin în cercetarea de
biologie celular i molecular.

13În toate abreviaiile care urmeaz pentru lectine, ”A” vine de la termenul aglutinin. Toate abreviaiile sunt cele
folosite internaional.

53
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.18. Caracterizarea glicoca-


lixului pentru celule endoteliale
(A-D), respectiv monocite sangu-
ine (E-G), prin citochimie ultra-
structural cu lectine, utilizând
tehnici indirecte. Trasorii elec-
trono-opaci reprezint aur coloidal
de 5nm, adsorbit cu glicoproteine
corespunztoare specificitii lecti-
nelor utilizate. Observm c struc-
turile N-glicozidice, evideniate cu
ConA sunt abundente i uniform
distribuite pe suprafaa endote-
liului (A) i a monocitelor (E), dar în
numr mai mare pe celulele san-
guine. Acizii sialici identificai de
WGA sunt slab reprezentai pe su-
prafaa luminal a celulelor endote-
liale (B), dar abundeni la suprafaa
monocitelor (F). Structurile glucidi-
ce recunoscute de RCA I sunt
abundente atât pe suprafaa endo-
teliului (C), cât i pe cea a mono-
citelor circulante (G). Comparând
legarea abundent a RCA I pe su-
prafaa luminal a celulelor endote-
liale (C), cu legarea relativ srac a
PNA (D), deducem c la suprafaa
endoteliului avem abunden de
galactoz ce poart la hidroxilul
carbonului ase acid sialic i
srcie de structuri oligozaharidice
terminate în galactoz. © Mircea
Leabu, 2014.

54
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Aadar, sperana în ceea ce privete rezolvarea problemei caracterizrii


glicocalixului i în general a biologiei glucidelor celulare, sub aspectul funciilor lor, o
reprezint biologia molecular prin capacitatea de a identifica i modela bagajul
enzimatic celular implicat.
Pentru a integra informaiile structurale prezentate mai sus, cu scopul de a
înelege organizarea spaial a glicocalixului, putem rezuma c acest înveli celular
trebuie perceput ca o lizier, ca un lstri din ce în ce mai des pe msur ce
ptrundem de la exteriorul structurii ctre bistratul lipidic. El se caracterizeaz prin
eterogenitate compoziional i de organizare, sporind asimetria membranelor,
deoarece este prezent numai pe versantul extern. Aceast organizare a sugerat i
primele idei asupra funciilor glicocalixului.

2.4.3. Rolul glicocalixului


Prin asemnare cu rolul protector al prii glucidice din glicoproteine
împotriva aciunii proteazelor, se poate afirma c glicocalixul protejeaz structura
membranei celulare împotriva agresiunilor fizico-(bio)chimice. Lucrul acesta nu este
departe de realitatea biologic. Modul în care glicocalixul este organizat, confer
membranei rezisten mecanic, controlând accesul oricror factori de agresiune
ctre straturile profunde ale ultrastructurii, deci ctre bistratul lipidic i ctre
componentele proteice ale acesteia. Rolul acesta este cu atât mai important cu cât
prezena factorilor agresivi este mai mare. Aceasta este o motivaie pentru care
celulele sanguine sau polii apicali ai celulelor epiteliale dispuse în monostrat au
glicocalixul abundent. Mai mult, în anumite situaii în care agresiunile pot fi mai
accentuate, membranele sunt protejate de secreii glicoproteice abundente (de
exemplu în mucoasele gastrice i intestinale).
Dar glicocalixul nu este, nici pe departe, important numai pentru acest aspect.
Prin componentele acide din structura lor (acizii sialici, acizii uronici, gruprile
sulfat), lanurile oligo-/poli-zaharidice ale glicocalixului particip la asigurarea
sarcinii negative a suprafeei celulare. Încrctura negativ a suprafeei celulare, o
caracteristic general valabil tuturor celulelor, face ca interaciunile dintre acestea
s nu se poat realiza decât sub control celular, în zone (microdomenii) ale
membranelor înalt specializate în realizarea acestei funcii. În aceste zone, se
formeaz ceea ce numim jonciuni celulare (vezi în volumul al II-lea, la subcapitolul
despre jonciunile celulare), structuri specializate ale membranelor cu organizri i
funcii diverse. Stabilirea jonciunilor celulare are la baz fenomene de recunoatere
celular în care sunt implicate i componente glucidice ale membranelor.
Participarea structurilor glucidice (de regul prin glucidul terminal) în fenomenele
de recunoatere celular reprezint o explicaie pentru care glucoza nu se gsete în
poziie terminal; glucoza este glucidul aflat liber în umorile organismelor i ar
competiiona structurile glucidice ale glicocalixului în interaciunile pe care ar trebui
s le stabileasc în diferitele procese de recunoatere, interferând cu funciile
acestora i împiedicând celula s le controleze eficient.
Aadar, componentele structurale ale glicocalixului (componentele glucidice
ale membranelor) sunt implicate în fenomene de recunoatere celular, cu rol în
organizarea de esuturi i organe, atât prin interaciuni ale celulelor între ele, cât i
prin aderarea acestora la substrate extracelulare (la componente ale matricei
extracelulare). Se formeaz astfel ultrastructuri cu caracter permanent sau cu
existen de lung durat. În ciuda caracterului lor permanent sau de lung durat,
aceste elemente ultrastructurale de la nivelul membranelor nu trebuie înelese ca
rigide i imuabile. Ele sunt într-o permanent dinamic, rspunzând nevoilor celulei
în ceea ce privete amploarea lor, capacitatea de a se forma i desface în diferite zone
ale membranelor celulare sau capacitatea de a implica în momente diferite
componente moleculare diverse, pentru a-i nuana funcia. Caracterul permanent

55
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

sau de lung durat al existenei lor trebuie îneles în sensul c întotdeauna celulele
prezint asemenea ultrastructuri necesare organizrii esuturilor.
Aspectele menionate mai sus ne pot da o semnificaie biologic a faptului c
toate celulele din organism poart la suprafa o sarcin negativ net. Aceast
realitate face imposibil interaciunea i agregarea nespecific (doar pe baza unor
posibile interaciuni electrostatice) a celulelor. Ca s înelegem i mai pregnant
importana acestei încrcturi electrice a suprafeei celulelor, s ne gândim ce s-ar
întâmpla dac în sânge unele celule ar purta sarcin electric de suprafa pozitiv,
iar altele negativ. Celulele ar agrega nespecific, iar circulaia sanguin ar fi blocat,
aprând fenomene de embolie; organismul nu ar putea supravieui.
Exist fenomene fiziologice care se desfoar pe baza unor modificri ale
structurilor glucidice ale suprafeei celulare. De exemplu, eritrocitele de mamifer
dup desialilarea structurilor din glicocalix sunt eliminate din circulaie la nivelul
ficatului i splinei [4]. Pierderea de acid sialic din poziia terminal a structurilor
glucidice din glicocalix reprezint semnal de îmbtrânire a acestor celule. De
asemenea, plachetele sanguine desialilate îi micoreaz timpul de via în circulaie
i determin sporirea trombocitopoiezei [5]. Eliminarea din circulaie a celulelor cu
structurile glucidice desialilate implic receptori cu activitate lectinic îndreptat
împotriva galactozei ajuns în poziie terminal, receptori aflai în membrana i
expui la suprafaa celulelor cu rol de macrofage din organele curitoare.
Fenomenele de recunoatere celular sunt implicate i în procese biologice în care
interaciunile dintre celulele participante sunt temporare i tranzitorii. Exemplificm
prin (i) ceea ce se întâmpl la extravazarea leucocitelor în zonele de inflamare
tisular i (ii) prin implicarea structurilor glucidice în procesul de fertilizare.
(i) Extravazarea celulelor sanguine (leucocitelor) are loc printr-un
proces al crui efect este trecerea lor printre celulele endoteliale, din fluxul sanguin
în esuturi, fenomen denumit diapedez. Diapedeza se produce sub aciunea unei
varieti de stimuli, care depind de i difereniaz procesele biologice ce duc la
extravazarea diferitelor tipuri de celule sanguine [6-8]. Recrutarea leucocitelor aflate
marginal în fluxul sanguin din vasele de sânge aflate la nivelul zonelor inflamatorii,
implic structurile glucidice ale glicocalixului acestora (Fig. 2.19, A). Este vorba de
interaciunea dintre o protein membranar cu activitatea de tip lectin (protein
care apare tranzitoriu la suprafaa celulei endoteliale) i o structur glucidic din
glicocalixul leucocitelor antrenate de fluxul sanguin în capilarele din zonele
inflamatorii. Cum se petrec, în linii mari, fenomenele (Fig. 2.19) descriem în cele ce
urmeaz, încercând s punctm elementele eseniale ale fenomenelor.
____________________________________________________________________________________________________________________________

Fig. 2. 19. Fenomenele celulare i moleculare care se petrec în cursul extravazrii limfocitelor
în zonele inflamatorii. Procesul este iniiat de interaciuni care implic glicocalixul limfocitului i
anume a unor structuri oligozaharidice numite antigene Lewis X (A), care sunt purtate atât de proteine
(glicoproteine), cât i de lipide (glicolipide). Aceste oligozaharide sunt legate de selectine expuse la
suprafaa celulelor endoteliale activate din zonele inflamatorii (A i B-1). Aceste interaciuni, de joas
afinitate, încetinesc limfocitele marginale i le determin o rostogolire la suprafaa luminal a
endoteliului. Evenimentul faciliteaz interaciunea unui receptor specific cu factorul de activare
plachetar (PAF), care este produs de celulele endoteliale sub aciunea stimulilor eliberai de procesul
inflamator (B-2). Interaciunea receptorului cu PAF stimuleaz limfocitul, prin aceasta rezultând ac-
tivarea integrinei DLE2, care se leag de partenerul expus constitutiv la suprafaa celulelor endo-
teliale i anume cu molecule de adeziune celular din familia imunoglobulinelor (ICAM), determinând
o ataare mai ferm a limfocitului la endoteliu (B-2). Interaciunile integrin-ICAM, de înalt afinitate,
induc etalarea limfocitului la suprafaa endoteliului i migrarea activ (sub control celular), ctre zone
joncionale dintre dou celule endoteliale (B-3), pe unde declaneaz procesul de diapedez (B-4).
Dup extravazare, limfocitul îi continu migrarea ctre locul inflamaiei pentru a-i îndeplini rolul (B-
5). © Mircea Leabu, 2014.
____________________________________________________________________________________________________________________________

56
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

57
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Procesele inflamatorii duc la eliberarea de stimuli care acioneaz asupra unor


receptori din membranele celulelor endoteliale, conducând la expunerea pe suprafaa
luminal a acestora (în ariile inflamate) a unor glicoproteine cu activitate lectinic,
denumite P-selectine. P-selectinele, care fac parte din familia selectinelor, nu se
afl permanent la suprafaa endoteliului, în condiii de repaus ele fiind stocate în
membrana unor structuri veziculare din interiorul celulelor endoteliale. Expunerea
tranzitorie a P-selectinelor la suprafaa membranelor apicale ale celulelor endoteliale
se face numai ca rezultat al stimulilor eliberai în procesele inflamatorii, stimuli care
activeaz celulele ce cptuesc peretele vasului sanguin. P-selectinele au parteneri de
aciune expui permanent pe suprafaa limfocitelor i anume structuri glucidice din
glicocalixul acestora, numite antigene sialilate Lewis-X (Fig. 2.19, A).
Interaciunile dintre P-selectine i leucocite, care au loc în zonele inflamatorii, sunt
de joas afinitate, fcându-se i desfcându-se, asigurând dinamica unui proces de
rostogolire a leucocitelor pe suprafaa endoteliului i încetinindu-le deplasarea.
Simultan cu expunerea P-selectinelor la suprafaa endoteliului, celulele endoteliale,
activate de stimulii eliberai în procesele inflamatorii, expun factorul de activare
plachetar (PAF) 14, un compus de natur fosfolipidic, produs prin fenomene de
metabolizare a fosfatidilcolinelor.
Cele ce urmeaz descriu fenomenele ce se petrec în cazul particular al
extravazrii limfocitelor T (Fig. 2.19, B). Prin legarea de receptorii de pe suprafaa
limfocitelor, PAF activeaz integrina L2, prin mecanisme de semnalizare
dependente de RhoGTP-aze (din familia proteinelor G mici, vezi la semnalizarea
celular). Integrinele sunt compui glicoproteici transmembranari cu rol în
adeziunea celular, au afinitate ridicat i sunt structurate ca heterodimeri
. Au
specificitate pentru proteine ale matricei extracelulare sau pentru proteine
transmembranare expuse pe suprafaa unor celule partenere. În starea inactiv,
domeniul extracelular al integrinelor este pliat (precum lama unui briceag în teac),
iar dup activare ectodomeniul se extinde la lungimi de 20nm (atingând zonele
superficiale ale glicocalixului i fcând siturile de interaciune accesibile), putând
astfel interaciona cu partenerii specifici. Integrina L
2 activat se leag la
molecule de adeziune celular (CAM) din superfamilia imunoglobulinelor
ICAM-1 i ICAM-2, expuse constitutiv la suprafaa celulelor endoteliale.
Interaciunile integrin L
2-ICAM duc la ataarea ferm a limfocitelor la suprafaa
endoteliului i la oprirea lor din micarea în care fluxul sanguin le antreneaz.
Totodat are loc etalarea i migrarea activ a lor pe suprafaa celulelor endoteliale
pân în zonele joncionale dintre acestea. Ajunse aici, limfocitele se insinueaz
printre dou celule endoteliale prsind lumenul vasului i trecând în esut pentru a-
i îndeplini menirea în zona tisular inflamat.
Fenomene similare se petrec i la extravazarea monocitelor (Fig. 2.20). În
acest caz integrina implicat este M
2. Aceste fenomene de extravazare nu se petrec
numai în cazul afeciunilor inflamatorii, ci i în alte situaii patologice, cum ar fi în
procesul de aterogenez, când monocitele circulante ptrund în intima arterelor
unde încearc s curee peretele vaselor de depunerile lipidice nefiziologice,
devenind celule spumoase [2, 3].
În general, orice celul sanguin imunocompetent trece, prin asemenea
fenomene, din circulaia sângelui în esuturi, pentru a se achita de sarcinile de
aprare a organismului, atunci când este cazul. Aa se explic de ce studiul acestor
fenomene a reprezentat o provocare tiinific, atât pentru fiziologia, cât i pentru
patologia celular.

14PAF rezult din derivai alchilai ai fosfatidilcolinei (alcool gras în loc de acid gras la hidroxilul 1 al glicerinei),
dup aciunea fosfolipazei A2 i acetilarea hidroxilului 2 astfel eliberat din legtura esteric iniial. Altfel spus,
PAF este 1-alchil-2-acetil-3-fosfocolino-glicerol.

58
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 2.20. Monocit circulant surprins la nivelul unei zone joncionale dintre dou celule
endoteliale, pregtit s iniieze un proces de diapedez. Suprafaa ambelor tipuri celulare este
marcat pentru evidenierea structurilor glucidice N-glicozidice (manozele au legat ConA, care ulterior
a fost marcat cu o glicoprotein adecvat, adsorbit pe aur coloidal de 5nm). © Mircea Leabu, 2014.

(ii) Fertilizarea este procesul prin care spermatozoidul fuzioneaz cu


ovocitul [9-11]. Pentru realizarea acestui proces, spermatozoizii trebuie s ajung în
tractul reproductor feminin, unde sufer un fenomen de capacitare, ce dureaz 5-
6 ore la om. Capacitarea const în modificri ale compoziiei lipidice i glicoproteice
a suprafeei capului spermatozoidului, ca i în creterea metabolismului i motilitii
celulare a acestuia. Mecanismele acestor transformri structurale i funcionale nu
sunt cunoscute înc în detaliu. Ele sunt declanate de ptrunderea anionului
bicarbonat prin membrana spermatozoidului i activarea unei adenilatciclaze.
Spermatozoidul astfel capacitat poate traversa stratul celulelor foliculare ce
înconjoar ovocitul, pentru a ajunge la zona pellucida, un înveli glicoproteic al
ovocitului, format din trei glicoproteine denumite ZP1, ZP2 i ZP3. Ajuns aici, el se
leag de structuri O-glicozidice ale ZP3, prin componente ale membranei zonei
acrozomale. Zona pellucida acioneaz ca o barier ce confer specificitate de
specie fertilizrii, astfel încât aceasta nu se poate realiza între celule ale unor specii
diferite. Acest lucru a fost evideniat prin faptul c eliminarea zonei pellucida a
ovocitului permite fertilizarea elementelor aparinând unor specii diferite. Zigoii
hibrizi astfel obinui nu sunt îns viabili. Interaciunea descris mai sus între
spermatozoid i ZP3, declaneaz ceea ce se numete reacie acrozomal. Aceasta
const în eliberarea prin exocitoz a coninutului vacuolei acrozomale, ca urmare a
unui complex proces de semnalizare, indus de legarea spermatozoidului la zona
pellucida i care are ca efect creterea concentraiei Ca2+ în citosolul
spermatozoidului. Enzimele eliberate ca urmare a reaciei acrozomale (proteaze i
hialuronidaze) degradeaz local zona pellucida permiând spermatozoidului s o
penetreze ca s ajung la membrana ovocitului de care se leag i cu care fuzioneaz.
Fuziunea are la baz activitatea unei proteine de fuziune din membrana
spermatozoidului expus ca urmare a modificrilor induse de reacia acrozomal.

59
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fertilizarea se sfârete cu ceea ce se numete reacia cortical a ovocitului, care


împiedic polispermia, adic fuziunea mai multor spermatozoizi cu acelai ovocit.
Aceast reacie cortical confer protecia secundar (de lung durat) împotriva
polispermiei. O blocare primar (de scurt durat) a polispermiei are loc pe baza
depolarizrii rapide a membranei ovocitului în momentul fuziunii cu
spermatozoidul. Reacia cortical const în activarea, în momentul fuziunii ovocit-
spermatozoid, a unei ci de semnalizare prin fosfoinozitide (fosfatidilinozitoli) care
are ca efect creterea concentraiei Ca2+ în citosolul ovocitului i exocitarea
coninutului enzimatic al granulelor corticale ale acestuia. Enzimele eliberate prin
reacia cortical modific biochimic structura zonei pellucida, prin clivarea ZP2 i
degradarea componentei glucidice a ZP3. Aceste modificri asigur rezistena zonei
pellucida la legarea altor spermatozoizi. Aadar dou dintre evenimentele eseniale
ale procesului de fertilizare (reacia acrozomal a spermatozoidului i reacia
cortical a ovocitului) implic participarea direct a unor structuri glucidice.
Complexitatea celor dou fenomene prezentate mai sus ne îndreptete s
considerm c suntem departe de a întrevedea diversitatea i subtilitatea
fenomenelor celulare dependente de structurile glucidice atât de atent i cu mare
efort elaborate de celul. Fr îndoial c, odat cu dezvoltarea unor metode i
tehnici noi de investigaie a rolului structurilor glucidice, cunotinele noastre despre
celul vor avea de câtigat, cu rsfrângere în capacitatea utilizrii fenomenelor
celulare în activitatea medical.
Pe fenomene de recunoatere celular care implic structurile glucidice ale
glicocalixului se bazeaz i compatibilitile de grup sanguin ale sistemului
ABO. Purttoarele antigenelor de grup sanguin sunt structuri oligozaharidice cu
poriuni terminale identice purtate de glicolipide i glicoproteine din membranele
celulelor sanguine. Lanurile glucidice responsabile de compatibilitile de grup
sanguin au urmtoarele structuri:

Grupa O: Fuc 12Gal


14GlcNAc…

Grupa A: Fuc 12Gal


14GlcNAc…
( 13)
GalNAc

Grupa B: Fuc 12Gal


14GlcNAc…
( 13)
Gal

Grupa AB poart în amestec ambele antigene ale grupelor A i B. Bineîneles


c apartenena la una dintre grupe este dependent de tipul de glicoziltransferaze
disponibile, ca urmare a exprimrii genelor corespunztoare. Compatibilitile de
grup sanguin sunt determinate de prezena în sânge a anticorpilor anti-antigene de
grup. Indivizii din grupa A conin în plasma lor anticorpi anti-B care vor aglutina
celulele din grupele B i AB datorit legrii de structurile glucidice împotriva crora
sunt îndreptai. Indivizii din grupa B conin anticorpi anti-A, care aglutineaz
celulele din grupele A i AB. Indivizii din grupa AB nu conin nici un fel de anticorpi
i sunt primitori universali, deoarece nu exist riscul de a aglutina celulele, indiferent
crui grup ar aparine. În sfârit, indivizii din grupa O, neavând nici structurile
glucidice specifice grupei A, nici pe cele specifice grupei B sunt donatori universali,
celulele lor sanguine nefiind aglutinate indiferent de anticorpii anti-antigene prezeni
la primitor. Este de menionat, odat în plus cât de importante pot fi mici variaii ale
structurrii componentelor glicocalixului. Pentru aspectele legate de riscurile

60
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

medicale ale eventualelor ignorri a grupelor sanguine, responsabilitatea (pentru


dramaticele fenomene care se pot produce) o poart doar câte un monozaharid (Gal,
respectiv GalNAc) legat în aceeai poziie a unei structuri de baz.
În încheierea prezentrii aspectelor legate de rolul componentei glucidice a
(bio)membranelor, nu putem s nu facem câteva referiri i la receptorii celulari.
Structurile glucidice sunt necesare, dar nu neaprat suficiente funcionrii
receptorilor din membranele celulare. Cea mai mare parte dintre receptorii
suprafeelor celulare, evideniai pân în prezent, sunt glicoproteine. Pentru
unii dintre ei eliminarea componentei glucidice nu afecteaz esenial capacitatea de
legare a liganzilor, pentru alii da. Pentru cei care îi pierd afinitatea fa de liganzi,
nu se poate afirma cu certitudine c structura glucidic este implicat în formarea
locului de legare. Mai degrab se speculeaz c ar fi vorba de modificri
conformaionale induse de pierderea componentei glucidice, modificri ce ar avea ca
efect distrugerea geometriei sitului de legare.
Componentele glucidice ale suprafeei celulare reprezint interes deosebit
pentru înelegerea atât a fiziologiei, cât i a patologiei celulare. De exemplu, acizii
sialici terminali din glicocalixul limfocitelor T sunt implicai în aproape toate
fenomenele ce in de destinul i funciile celulei. Supravieuirea celular însoit de
fenomenele de maturare, difereniere, motilitate i moartea celular sunt dependente
de acizii sialici i de interaciunile acestora cu proteine cu activiti lectinice,
îndreptate ctre aceste glucide terminale [12]. Modificri în glicozilarea suprafeei
celulare însoesc diferite patologii, cum ar fi în cazul celulelor canceroase, cu
implicaii asupra progresiei tumorale i metastazrii [13].
Implicarea glicocalixului în fiziologia i patologia celular a fcut ca acesta s
fie considerat int terapeutic în tratamentele multor boli [1, 14-17], ca i în
modularea unor fenomene celulare dintre cele mai diverse [18, 19].
În concluzie, se poate spune despre componenta glucidic a membranelor c
nuaneaz, uneori într-o manier de mare subtilitate, funcionarea acestei
ultrastructuri care separ, dar i unete celula cu mediul.

Bibliografie selectiv
1. Becker BF, Chappell D, Bruegger D, Annecke T, Jacob M. (2010) Therapeutic strategies
targeting the endothelial glycocalyx: acute deficits, but great potential. Cardiovasc Res. 87: 300-310.
2. Leabu M, Ghinea N, Muresan V, Colceag J, Hasu M, Simionescu N. (1987) Cell surface
chemistry of arterial endothelium and blood monocytes in the normolipidemic rabbit. J Submicrosc
Cytol. 19: 193-208.
3. Ghinea N, Leabu M, Hasu M, Muresan V, Colceag J, Simionescu N. (1987) Prelesional events
in atherogenesis. Changes induced by hypercholesterolemia in the cell surface chemistry of arterial
endothelium and blood monocytes, in rabbit. J Submicrosc Cytol. 19: 209-227.
4. Aminoff D, Bell WC, VorderBruegge WG. (1978) Cell surface carbohydrate recognition and the
viability of erythrocytes in circulation. Prog Clin Biol Res. 23: 569-581.
5. Karpatkin S, Shulman S. (1980) Asialo platelets enhance thrombopoiesis. Trans Assoc Am
Physicians. 93: 244-250.
6. Hynes RO, Lander AD. (1992) Contact and adhesive specificities in the associations, migrations, and
targeting of cells and axons. Cell. 68: 303-322.
7. Ebnet K, Vestweber D. (1999) Molecular mechanisms that control leukocyte extravasation: the
selectins and the chemokines. Histochem Cell Biol. 112: 1-23.
8. van Buul JD, Hordijk PL. (2004) Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler
Thromb Vasc Biol. 24: 824-833.
9. Wassarman PM, Jovine L, Litscher ES. (2001) A profile of fertilization in mammals. Nat Cell Biol.
3: E59-E64.
10. Wassarman PM, Jovine L, Qi H, Williams Z, Darie C, Litscher ES. (2005) Recent aspects of
mammalian fertilization research. Mol Cell Endocrinol. 234: 95-103.
11. Wassarman PM, Litscher ES. (2008) Mammalian fertilization: the egg's multifunctional zona
pellucida. Int J Dev Biol. 52: 665-676.

61
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

12. Bi S, Baum LG. (2009) Sialic acids in T cell development and function. Biochim Biophys Acta. 1790:
1599-1610.
13. Dafik L, d'Alarcao M, Kumar K. (2010) Modulation of cellular adhesion by glycoengineering. J Med
Chem. 53: 4277-4284.
14. Drake-Holland AJ, Noble MI. (2009) The important new drug target in cardiovascular medicine –
the vascular glycocalyx. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 9: 118-123.
15. Du J, Yarema KJ. (2010) Carbohydrate engineered cells for regenerative medicine. Adv Drug Deliv
Rev. 62: 671–682.
16. Schwardt O, Kelm S, Ernst B. (2013) SIGLEC-4 (MAG) Antagonists: From the Natural
Carbohydrate Epitope to Glycomimetics. Top Curr Chem. Nov 26. [Epub ahead of print] DOI:
10.1007/128_2013_498
17. Suzuki O, Abe M. (2013) Recent progress and new perspectives in lymphoma glycobiology.
Fukushima J Med Sci. 59(1): 1-14.
18. Ryan JM, Rice GE, Mitchell MD. (2013) The role of gangliosides in brain development and the
potential benefits of perinatal supplementation. Nutr Res. 33(11): 877-887. DOI:
10.1016/j.nutres.2013.07.021.
19. Pshezhetsky AV, Ashmarina LI. (2013) Desialylation of surface receptors as a new dimension in cell
signaling. Biochemistry (Mosc). 78(7): 736-745. DOI: 10.1134/S0006297913070067.

62
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2.5. Consideraii finale asupra organizrii mo-


leculare a membranelor celulare
2.5.1. Modelul în mozaic fluid este înc actual i adaptabil
Organizarea membranelor celulare (ca i a endomembranelor) are la baz un
bistrat lipidic eterogen, asimetric, cu proprieti fluide manifestate bidimensional.
Acestuia i se adaug proteine care îi confer caracterul unui mozaic (proteine plutind
pe sau cufundate în marea lipidic ce formeaz bistratul). O asemenea organizare a
fost denumit în mozaic fluid, dup modelul introdus in 1972, de Singer i Nicolson.
Modelul mozaicului fluid pentru organizarea biomembranelor a fost
completat prin evidenierea i descrierea unor structuri adiacente: citoscheletul
asociat membranei (ultrastructur aflat pe faa intern a membranelor) i
glicocalixul (ultrastructur expus pe faa extern a membranelor, alctuit din
lanuri oligo-/poli-zaharidice din compoziia glicolipidelor, glicoproteinelor i
proteoglicanilor din membran). Aceste elemente adiacente susin asimetria
organizrii membranelor. Aadar, atât proteinele ce intr în organizarea lor, cât i
componenta glucidic a membranelor nu diminueaz, ci accentueaz i nuaneaz
caracterul eterogen, asimetric i de fluid bidimensional al structurrii membranelor
celulare.
Tot în completarea modelului în mozaic fluid sub aspect ultrastructural, dar i
funcional au fost definite noiunile de domenii i/sau microdomenii de membran.
Acestea sunt regiuni mai extinse (domeniile) sau mai reduse (microdomeniile) din
suprafaa membranelor a cror compoziie este diferit de a altor zone. Compoziiile
diferite ale domeniilor de membran (apical versus latero-bazal) sunt riguros
controlate i pstrate de celul. Compoziia i existena microdomeniilor (caveole,
plute lipidice, structuri cu înveli de clatrin i altele pe care le vei întâlni pe msur
ce vom avansa în cunoaterea celulei) au o dinamic mai accentuat, rspunzând
nevoilor în continu schimbare ale celulelor, nevoi impuse de considerente interne
ale celulei sau de stimuli externi la care celulele trebuie s rspund.
De fapt, tot ce a însemnat dezvoltarea cunoaterii legate de organizarea i
funcionarea biomembranelor, dup elaborarea modelului în mozaic fluid, nu a
contrazis, ci a dovedit valabilitatea celor stipulate de Singer i Nicolson, în 1972 [1-3].
Orice nou informaie, care a fost adugat cunotinelor despre modul în care
biomembranele sunt organizate i despre cum se comport biocomponentele la
nivelul acestora pe considerente fizice, chimice i biologice, a contribuit la rafinarea
modelului [4], dei uneori el este superficial prezentat în manuale [5]. Este îns
datoria celor care iniiaz în cunoaterea biomembranelor pe noii venii s prezinte
modelul de aa manier încât orice confuzie s fie eliminat, iar mintea s rmân
deschis noutilor. Modelul mozaicului fluid asupra organizrii biomembranelor are
o capacitate de adaptare nelimitat.
Componentele membranelor fie ele lipide, proteine, componente glucidice au
atât roluri structurale, cât i metabolice. Aceast dualitate a rolurilor este valabil, pe
de o parte, pentru clasele de componente biochimice ale membranelor i, pe de alt
parte, pentru entiti moleculare (aceeai molecul poate îndeplini atât funcii
structurale cât i metabolice).
În ciuda acestei organizri moleculare complexe (puternic eterogen i
asimetric), sau mai degrab tocmai datorit ei, biomembranele acioneaz/trebuie
s acioneze ca sisteme integrative. Detalii asupra funcionrii biomembranelor ca
atare se vor prezenta, în primul rând, la seciunile legate de transportul membranar
i de semnalizarea celular. Aspecte legate de comportamentul biomembranelor ca
sisteme integrative sunt valabile i în legtur cu alte biomembrane, cu precdere
cele care delimiteaz o serie de organite celulare, numite endomembrane.
63
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

În sfârit, nu putem termina prezentarea organizrii moleculare a


membranelor fr a puncta câteva lucruri legate de semnificaia biologic a
caracteristicilor fizico-chimice ale organizrii biomembranelor (eterogenitate,
asimetrie i fluiditate manifestat bidimensional) cu rsfrângere asupra
comportamentului lor.

2.5.2. Semnificaia biologic a modului de organizare


molecular a membranelor
În toate informaiile utilizate pân acum pentru înelegerea modului de
organizare a membranelor am inut permanent seama de modelul mozaicului fluid
introdus de Singer i Nicolson, în 1972. Am parcurs o multitudine de aspecte legate
de: a) diversitatea de componente moleculare de la nivelul membranelor (ceea ce
induce eterogenitate compoziional), b) distribuia inegal i/sau aranjamentul
difereniat al componentelor între cele dou fee ale membranei (ce confer asimetrie
ultrastructurii) i c) dinamicitatea componentelor la nivelul membranelor care, îns,
implic numai micri pe dou direcii (definit ca fluiditate bidimensional). Toate
aceste detalii nu le-am discutat nici de dragul (bio)chimiei, nici de dragul (bio)fizicii
la care am fcut apel, ci pentru c aceste caracteristici fizico-chimice de organizare i
de comportament al componentelor – eterogenitate, asimetrie, fluiditate manifestat
bidimensional – au semnificaii biologice, adic se rsfrâng i sunt exploatate în mod
fericit în ceea ce membrana trebuie s fac în interesul celulei, adic s o separe de,
dar s o i uneasc cu mediul. S lum pe rând aceste caracteristici i s încercm s
extragem elementele eseniale referitoare la semnificaia biologic a realitii lor,
altfel spus s înelegem de ce este important c (bio)membranele sunt organizate aa
cum sunt, sau, dac vrei, ce s-ar întâmpla dac nu ar fi aa, deoarece, din punct de
vedere logic, în acest fel trebuie s operm pentru extragerea semnificaiei a ceva.
De ce este important faptul c în membrana celular avem o diversitate uria
(putem spune fr temere) de componente biochimice? Altfel spus, la ce folosete
celulei aceast compoziie eterogen? S nu ne sfiim aici s facem o comparaie cu ce
putem percepe referitor la capacitatea unui grup de oameni de a realiza lucruri
complexe. Pentru aceasta este necesar ca în acel grup de oameni s se afle persoane
cu capaciti, înclinaii, talente, abiliti diferite, corespunztoare nevoilor impuse de
complexitatea problemelor ce trebuie rezolvate. Lucrurile nu stau altfel nici în
contextul membranei i al complexitii de fenomene prin care aceasta îi realizeaz
menirea: separarea interiorului celular de mediu, dar i conectarea celulei cu ceea ce
se afl în afara ei cu scopul determinrii unui comportament adecvat, pentru
asigurarea supravieuirii sale i a „angrenajului” (citete esutului) din care face
parte. Aadar: multitudinea de biocomponente asigur multitudinea de posibiliti
de aciune, adic diversitatea de funcii. Exist o corelaionare direct între
complexitatea de funcii pe care membrana unei celule trebuie s o asigure i
diversitatea de biocomponente de la nivelul acesteia. Cu alte cuvinte, ca s operm cu
termeni învai la matematic, dependena dintre complexitatea de funcii a
membranei unei celule i diversitatea componentelor din organizarea acesteia (adic
gradul de eterogenitate biochimic a acelei membrane) este una de proporionalitate
direct. Aceast regul odat stabilit i îneleas în semnificaia ei biologic ne
determin s putem deduce c organizarea la nivelul biocomponentelor
membranelor a dou celule diferite este diferit, chiar dac se respect principiul
organizrii în mozaic fluid, necesitatea prezenei lipidelor amfifile, aranjate sub
form de bistrat, la care se adaug proteine i o component glucidic orientat spre
exterior. Dincolo de respectarea acestor aspecte generale, tipurile de lipide sau
proporiile dintre acestea difer, exist bagaje de entiti moleculare proteice diferite
(chiar dac unele dintre proteine se pot gsi într-o mare diversitate de tipuri de

64
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

membrane), iar structurile glucidice difer cel puin în anumite limite care fac
membranele s difere sub aspectul biocomponentelor.
Cum se rsfrânge aranjarea asimetric a biocomponentelor membranei asupra
intereselor celulei? Adic, ce putem spune despre semnificaia biologic a asimetriei
membranelor? Faptul c cele dou fee ale membranelor expun elemente biochimice
diferite, adic asigur proprieti fizico-chimice diferite celor dou suprafee (cea
expus la exterior, respectiv cea expus ctre interiorul celulei) permite desfurarea
de fenomene diferite de o parte sau de cealalt a acestei ultrastructuri. Mai mult,
celula are mecanisme prin care poate permite acestor fenomene diferite s se
desfoare independent sau s se coreleze, în funcie de nevoile ei de supravieuire i
funcionare „ireproabil”. Altfel spus, celula poate rmâne mai mult sau mai puin
indiferent la ce se petrece în exteriorul ei, dar poate s i fie deosebit de sensibil la
ce se afl sau se petrece în afara ei pe baza informaiilor pe care le primete, le
analizeaz i le ia în consideraie.
Pentru înelegerea semnificaiei biologice a fluiditii bidimensionale a
membranei revin la exemplul utilizat la începutul acestei seciuni (cel legat de
abilitatea unui grup de oameni de a rezolva probleme complexe), dar vom extinde
exemplul la ce se întâmpl într-o instituie. De fapt încercm aici s rspundem la
întrebarea: de ce este important c în membran biocomponentele sunt într-o
permanent micare? S nu uitm c aceast micare permanent a componentelor
individuale prezint grade de libertate mai mari sau mai mici, în funcie de condiiile
concrete în care celula se poate afla. Mai întâi s punctm de ce este important c
micrile au loc în doar dou dimensiuni, adic în numai dou direcii,
corespunztoare micrii planare (adic bidimensionale). Aceast micare
bidimensional asigur meninerea asimetriei din organizarea membranei, iar
semnificaia biologic a acestui aranjament asimetric am punctat-o deja în paragraful
precedent. Dincolo de faptul c aceast micare este bidimensional, ea este
important pentru celul chiar prin faptul c exist. Ne întoarcem la exemplul
invocat, chiar dac poate prea banal; îl considerm sugestiv. Pentru ca oamenii unui
grup s realizeze activiti practice ei trebuie s fie adui în acelai loc. Pentru asta
trebuie s se deplaseze de acas la instituia unde lucreaz i s îi fac treaba cât
dureaz programul de lucru. Asta trebuie s se întâmple i cu biocomponentele
(molecule, macromolecule) dintr-o membran. Ele trebuie s se poat mica pentru a
se întâlni ca s îi fac, împreun, treaba. Spunem c ele organizeaz microdomenii
(echivalentul unor secii sau departamente într-o instituie). Numai c pentru buna
funcionare a instituiei seciile sau departamentele nu sunt total independente, ele
trebuie s interacioneze, deci trebuie s existe persoane care s se mite dintr-un loc
în altul, iar uneori este nevoie s se creeze grupuri interdepartamentale pentru
rezolvarea unor probleme. Asta se întâmpl i în membran: microdomeniile sunt
dinamice; elementele din unele se pot mica i intra în componena altor
microdomenii pentru a se implica în altceva în interesul bunei funcionri a
întregului (membrana, respectiv, mai departe, celula). Aadar, semnificaia biologic
a faptului c, în membran, componentele biochimice sunt într-o permanent
micare este aceea c pemite acestora s se asocieze într-o diversitate de modaliti,
pentru a îndeplini o multitudine de activiti. Mai mult, în membrane aceeai
component poate induce efecte multiple prin rolul su care se poate manifesta
difereniat, în funcie de partenerii de interaciune cu care se întâlnete temporar, pe
perioade mai lungi sau mai scurte de timp.
Cred c acum putem spune, în sfârit, c avem suficiente informaii care s ne
permit s credem c am îneles principial membrana celular (cum este organizat
i de ce este astfel organizat) i ne putem detaa ca s o privim cu înelepciune i s
putem aplica aceast înelegere de principiu la orice situaie particular am întâlni.
Aceast poziie va fi util în abordarea aspectelor care urmeaz, legate de
65
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

aprofundarea cunotinelor despre membrane, adic aspectele ce ne vor ajuta s


înelegem mai bine cum funcioneaz membranele ca sisteme integrative. De fapt, se
vor aborda aspectele legate de mecanismele prin care membrana conecteaz celula la
mediu, nefiind o barier absolut. Fenomenele prin care membrana celular
realizeaz aceast conectare a celulei cu mediul sunt de dou tipuri: fenomene de
transport membranar i fenomene de semnalizare.

Bibliografie selectiv
1. Morange M. (2013) What history tells us XXX. The emergence of the fluid mosaic model of
membranes. J Biosci. 38(1): 3-7.
2. Nicolson GL. (2013) The Fluid-Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding
the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochim
Biophys Acta. Nov 1. pii: S0005-2736(13)00393-3. DOI: 10.1016/j.bbamem.2013.10.019. [Epub ahead
of print]
3. Bagatolli LA, Mouritsen OG. (2013) Is the fluid mosaic (and the accompanying raft hypothesis) a
suitable model to describe fundamental features of biological membranes? What may be missing? Front
Plant Sci. Nov 13; 4: 457.
4. Nicolson GL. (2013) Update of the 1972 Singer-Nicolson Fluid-Mosaic Model of Membrane Structure.
Discoveries. 1(1): e3. DOI: 10.15190/d.2013.3
5. Leabu M. (2013) The still valid fluid mosaic model for molecular organization of biomembranes.
Accumulating data confirm it. Discoveries. 1(1): e7. DOI: 10.15190/d.2013.7

66
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

3.1. Consideraii generale asupra funcionrii


biomembranelor
Dei, dup cum am constatat în capitolul anterior, organizarea molecular a
biomembranelor se caracterizeaz prin mare diversitate de biocomponente, aflate
într-o agitaie permanent, complexitatea acesteia nu complic, ci eficientizeaz
funcionarea ultrastructurii care separ, dar i unete celula cu mediul. Ceea ce se
complic este calea noastr de a elucida mecanismele prin care membranele îi
îndeplinesc menirea. Totui, pe msur ce reuim s descifrm ceea ce se întâmpl,
din punct de vedere molecular, la nivelul biomembranelor ne dm seama cât de
important este faptul c ele sunt aa cum sunt.
Toate componentele membranare coopereaz în asigurarea funciei
ultrastructurii, iar colaborarea dintre biocomponentele ce o organizeaz asigur o
combinatorie larg, ce permite celulei ci dintre cele mai diverse de a schimba
substane i/sau de a comunica între ele, ori cu mediul extracelular. Complexitatea
molecular a membranelor se rsfrânge într-o complexitate funcional care asigur,
pe de o parte, investigarea a tot ceea ce se afl împrejurul celulei (spaiul extracelular
sau alte celule) i, pe de alt parte, declanarea rspunsurilor celulare adecvate
adaptrii la mediul înconjurtor. În toat aceast aciune, caracteristicile organizrii
moleculare a membranei (eterogenitate, asimetrie, comportament de fluid
bidimensional) capt o deosebit importan. Departe de a fi doar o structur
eterogen sumativ (elemente aruncate acolo, la grmad), coninând o multitudine
de tipuri de lipide/glicolipide i proteine/glicoproteine, membrana celular se
constituie ca un sistem biologic ce integreaz marea diversitate de biomolecule
exploatând-o în scopul rezolvrii problemelor pe care le impun existena i
supravieuirea celulei în condiiile concrete ale mediului înconjurtor. Aadar, prin
toat discuia referitoare la funcionarea membranei ca sistem integrativ,
cunotinele referitoare la organizarea molecular a acestei ultrastructuri vor sta la
baza înelegerii fenomenelor. Cum menirea membranei este aceea de a separa, dar a
i uni celula cu mediul, aceste roluri implic asigurarea unui schimb de substan
i/sau informaie cu exteriorul, riguros controlat. Asta înseamn c biomembranele
trebuie s îndeplineasc rolul de barier selectiv, în interesul adaptrii i
supravieuirii celulelor.
Pentru o sistematizare a proceselor, vom include ceea ce ine de schimbul de
substane dintre celul i mediu într-o seciune intitulat “Transportul
membranar”, iar ceea ce ine de schimbul de informaie sub titlul “Semnalizarea
celular”. Trebuie subliniat faptul c în realitate nu se poate face, de fapt, o
separaie între cele dou tipuri de fenomene, ele coexistând i cooperând în
realizarea eficient a funciilor membranelor. Mai concret spus, transportul
membranar este dependent (controlat i modulat) de fenomene de semnalizare
celular, iar semnalizarea celular implic adesea fenomene de transport
membranar.
Aadar, nimic din ceea ce se întâmpl la nivelul membranei nu poate fi scos
din context (ca de altfel tot ce se întâmpl în celul, în ansamblul su). Membrana
asigur celulei informaiile necesare pentru supravieuire i aciune în funcie de ce
se întâmpl în jurul su. Astfel, simultan, celula primete informaii pe multiple ci,
pe care le prelucreaz i apoi, inând cont de toate, rspunde printr-un
comportament adecvat. Aceast capacitate a celulei de a primi i analiza informaii
multiple, culese prin diverse componente, din variate surse poate fi denumit în
românete diafonie (termenul în englez, folosit pentru a denumi aceste fenomene
este „cross-talk”). Este vorba de interferene între cile de semnalizare, care
moduleaz reciproc efectele diverselor informaii primite de celule i prin care se
realizeaz rspunsul cel mai optim i cea mai adecvat comportare a celulelor în

69
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

contextul dat. Un exemplu de diafonie este cel ce determin motilitatea celular, care
se desfoar sub aciunea semnalelor primite prin factori de cretere, citokine sau
chemokine, semnale care influeneaz activitatea integrinelor [1-5]. Astfel, pentru a
decide s migreze dintr-un loc în altul în esuturi, celulele utilizeaz informaiile
primite prin receptori pentru diveri factori chemo-/cito-tactici, ca i prin integrine a
cror interaciune cu substratul (biocomponente din matricea extracelular) i
distribuie membranar sunt modulate i adaptate, pentru a favoriza complexele
procese ce însoesc micarea celulei. Analiza semnalelor ce vin de la receptori i
integrine conduce la declanarea unor reorganizri ale citoscheletului, cu efecte
asupra morfologiei celulare i forelor necesare deplasrii. Mai mult, dincolo de
semnificaia fiziologic a ceea ce se întâmpl la nivelul membranei, procese
patologice dintre cele mai diverse sunt însoite de alterri ale acestor colaborri [5-7].
În cele ce urmeaz vom detalia mai întâi aspecte legate de transportul
membranar, dup care ne vom direciona atenia asupra complexitii proceselor de
semnalizare celular.

Bibliografie selectiv
1. Ciobanasu C, Faivre B, Le Clainche C. (2013) Integrating actin dynamics, mechanotransduction
and integrin activation: The multiple functions of actin binding proteins in focal adhesions. Eur J Cell
Biol. 92(10-11): 339-348. DOI: 10.1016/j.ejcb.2013.10.009.
2. Sasaki AT, Firtel RA. (2006) Regulation of chemotaxis by the orchestrated activation of Ras, PI3K,
and TOR. Eur J Cell Biol. 85(9-10): 873-895.
3. Ayuso-Sacido A, Graham C, Greenfield JP, Boockvar JA. (2006) The duality of epidermal
growth factor receptor (EGFR) signaling and neural stem cell phenotype: cell enhancer or cell
transformer? Curr Stem Cell Res Ther. 1(3): 387-394.
4. Leabu M, Uniyal S, Xie J, Xu YQ, Vladau C, Morris VL, Chan BM. (2005) Integrin D2E1
modulates EGF stimulation of Rho GTPase-dependent morphological changes in adherent human
rhabdomyosarcoma RD cells. J Cell Physiol. 202, 754-766.
5. Bershadsky A, Chausovsky A, Becker E, Lyubimova A, Geiger B. (1996) Involvement of
microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction. Curr Biol. 6(10): 1279-1289.
6. Miyazono K. (2009) Transforming growth factor-beta signaling in epithelial-mesenchymal transition
and progression of cancer. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85(8): 314-323.
7. Bierie B, Moses HL. (2010) Transforming growth factor beta (TGF-beta) and inflammation in cancer.
Cytokine Growth Factor Rev. 21(1): 49-59. DOI: 10.1016/j.cytogfr.2009.11.008.

70
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

3.2. Transportul membranar


Prin transport membranar1 înelegem totalitatea proceselor prin care celula
folosete componentele membranei pentru schimbul de substan pe care îl
efectueaz cu mediul. În funcie de felul în care substanele anorganice sau organice
solubilizate ori unele materiale insolubile (cum ar fi bacterii, debriuri celulare etc.)
ptrund în sau ies din celul, adic în funcie de calea pe care substanele/materialele
o urmeaz în cursul schimbului dintre celul i mediu, ca i de mecanismele
implicate, transportul membranar poate fi clasificat în dou categorii principale:
1. Transport prin membran, atunci când substanele strbat membrana (din
exterior spre interior sau invers) fie direct printre lipidele bistratului, fie prin
biostructuri specializate organizate de proteinele transmembranare;
2. Transport cu membran (transport vezicular), atunci când substanele
sunt introduse în celul sau eliminate din aceasta prin intermediul unor
vezicule delimitate de (endo)membrane care se desprind de membrana celular
sau fuzioneaz cu ea, pentru a efectua schimbul.
Transportul prin membran este specific ionilor i moleculelor mici (< 10Å;
M < 800Da). Transportul cu membran realizeaz schimbul de molecule mari (>
10Å; M > 800Da), de macromolecule, respectiv de particule. Indiferent de sensul în
care are loc schimbul (din exterior în celul sau din celul ctre exterior), aceast
selectare rmâne valabil între cele dou tipuri de transport. De remarcat c
parametrii referitori la gabaritul compuilor transportai sunt valori mediate i ar fi
valabile la modul absolut doar pentru structuri sferice/globulare. În realitate,
procesul de transport al moleculelor mici prin membran depinde i de geometria
acestora, molecule alungite, care depesc 800Da, putând fi transportate prin
membran (spre exemplu prin jonciunile comunicante; vezi în volumul al II-lea).

3.2.1. Transportul prin membran


Fenomenele de transport prin membran sunt de o mare diversitate, ceea ce
impune, pentru o mai uoar abordare i înelegere, sistematizri pe mai multe
niveluri. Calea cea mai util pentru sistematizare e reprezentat de clasificarea pe
criterii din ce în ce mai de detaliu.
În funcie de necesarul de energie care se consum pentru desfurarea sa,
transportul prin membran se clasific în urmtoarele dou mari categorii (Fig. 3.1.):
1. Transport pasiv, care nu necesit consum energetic concomitent pentru
trecerea de substan prin membran;
2. Transport activ, care necesit consum de energie în momentul trecerii prin
membran a substanei transportate.
Pe de alt parte, transportul prin membran se poate face direct printre lipidele
bistratului (ceea ce se mai numete difuziune simpl; Fig. 3.1, exemplul 1) sau prin
structuri organizate de proteine (transport facilitat; Fig. 3.1, exemplele 2 i 3).
Transportul prin membran care necesit proteine specific organizate
transmembranar se poate desfura fie de la concentraie mare la concentraie mic,
acesta numindu-se difuziune facilitat (Fig. 3.1, exemplul 2), fie de la concentraie
mic spre concentraia mare, ceea ce necesit consum energetic (Fig. 3.1, exemplul
3), acesta numindu-se transport activ, tocmai pentru c necesit energie (în greaca

1 Suntem nevoii s facem specificaia nuanrii în limba român a denumirilor: fenomenele de transport ce se
petrec la nivelul membranelor le denumim global prin sintagma ”transport membranar”. Aceasta deoarece prima
clasificare, legat de criteriul cii urmate de substanele transportate i mecanismele implicate, aduce expresia
”transport prin membran”, care ar putea fi confundat cu termenul general (într-un limbaj simplist), dar care
are o definire concret ce respect complexitatea de fenomente de transport de la nivelul membranelor.

71
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

veche 
înseamn activitate). Dup aceast nuanare a viziunii asupra
complexitii fenomenelor de transport prin membran, vom detalia informaiile
legate de acesta urmând clasificarea dup criteriul consumului de energie. Aadar
vom aborda mai întâi transportul pasiv, dup care vom completa cunotinele cu
aspecte legate de transportul activ.
3.2.1.1. Transportul pasiv
Transportul pasiv mai este denumit i transport disipativ, deoarece implic
difuziunea care reprezint micarea de substan de la concentraie mare la
concentraie mic. În contextul discuiei noastre, transportul pasiv disipeaz practic
gradiente de concentraie aflate de o parte sau de alta a barierei pe care membranele
o reprezint; tocmai de aceea transportul pasiv nu necesit energie. Cum trebuie
îneles acest transport i cum îl putem sistematiza prin clasificri, pentru
simplificarea înelegerii?
Unele molecule mici (în limita de gabarit specificat mai sus) pot strbate
membrana strecurându-se printre lipidele membranare (Fig. 3.1, exemplul 1). Acest
lucru este uor de îneles dac ne gândim c lipidele, aezate în bistrat, au micri de
o mare diversitate i nu organizeaz o structur cu o compactitate rigid, lsând în
permanen între ele spaii de dimensiuni i geometrii variabile. În aceste spaii, o
serie de molecule mici se pot insinua (dac dimensiunile le permit) i în felul acesta
pot trece mai repede sau mai încet dintr-o parte în cealalt a membranei. Acest tip de
trecere se face fr a necesita consum concomitent de energie i este, de aceea,
transport pasiv.

Fig. 3.1. Clasificri ale transportului prin membran în termeni vizuali. Poziiile 1 i 2 reprezint
situaii de transport pasiv, adic difuziune simpl (1) care se desfoar direct printre lipidele
bistratului, respectiv difuziune facilitat (2) care se desfoar prin structuri transmembranare
organizate de proteine (transportori sau canale). Poziia 3 reprezint transport activ, facilitat de
asemenea de structuri transmembranare organizate de proteine specializate în a folosi energie pentru
trecerea de substane dintr-o parte în alta a membranei, împotriva gradientelor de concentraie.
Sgeile indic sensuri dependente de condiiile concrete în care fenomenele de transport se petrec.
© Mircea Leabu, 2014.

72
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Calea transportului pasiv printre moleculele lipidelor membranare poate fi


urmat de moleculele nepolare sau hidrofobe (spre exemplu: molecule de gaze – O2,
N2, CO2, NO, CO, eter etilic, benzen i asemntoare), dar i de moleculele polare
mici (cu masa molecular sub 100Da; de exemplu: H2O, etanolul, ureea, glicerina),
care se pot strecura în i prin spaiile dintre lipide. Acest transport, care se
desfoar prin trecerea substanelor printre lipidele membranare, este numit i
difuziune simpl.
Pentru moleculele polare mari (cu greutatea molecular între 100 i 800Da),
cât i pentru ioni, transportul prin membran se face numai cu implicarea unor
proteine transmembranare ale cror domenii ce strbat bistratul organizeaz
structuri specifice care se constituie drept ci de traversare a planului membranei
pentru compuii transportai. Aceste proteine poart denumirea de transportori
(pentru molecule polare mari: glucoz, aminoacizi, nucleotide) sau canale ionice
(firete, pentru ioni: H+, Na+, HCO3-, K+, Ca2+, Cl-, Mg2+). Transportorii menionai
precum i canalele ionice efectueaz tot un transport pasiv (fr consum concomitent
de energie), deoarece trecerea se face de la concentraie mare ctre concentraie
mic. Transportul pasiv prin transportori sau prin canale ionice se numete i
difuziune facilitat.
În funcie de numrul tipurilor de substan transportate simultan,
transportul facilitat (inclusiv difuziunea facilitat) poate fi clasificat în (Fig. 3.2): (i)
transport singular numit i transport uniport (Fig. 3.2, exemplul 1), când este
transportat o singur entitate (bio)chimic (ion sau molecul) sau (ii) transport
cuplat, numit i co-transport, când sunt transportate simultan (adic într-un
singur ciclu) dou sau mai multe entiti (bio)chimice (ioni, molecule sau ioni i
molecule). La rândul su, transportul cuplat se poate clasifica în dou tipuri, în
funcie de sensul în care sunt transportate diferitele substane. Când toate
substanele sunt transportate în acelai sens, transportul cuplat este numit simport
(Fig. 3.2, exemplul 2). Dac cel puin una dintre substanele transportate este purtat
în sens opus celorlalte, co-transportul este numit antiport (Fig. 3.2, exemplul 3).

Fig. 3.2. Tipuri de tran-


sport pasiv prin mem-
bran, facilitat de pro-
teine (difuziune facilita-
t), definite în funcie
de numrul de entiti
(bio)chimice transporta-
te simultan (adic în de-
cursul unui ciclu de
transport). 1 – uniport; 2
– simport; 3 – antiport.
Sgeile colorate indic,
în parte, sensul de mi-
care al fiecrei entiti
chimice transportate.
© Mircea Leabu, 2014.

73
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.3. Co-transportorul de glucoz i sodiu din membrana apical a enterocitelor, ca


exemplu de simport. Proteina transmembranar care structureaz transportorul leag doi ioni de
sodiu (concentraie mare) i o molecul de glucoz (concentraie mic) din lumenul intestinal (1).
Legarea entitilor transportate atrage modificri în conformaia proteinei, cu trecerea ionilor i
glucidului prin cile transmembranare de transport, organizate de protein i cu asigurarea blocrii
trecerii altor elemente (2). Eliberarea compuilor transportai în citosol determin rearanjri în
conformaia transportorului cu refacerea, în ectodomeniu, a siturilor de legare a ionilor i glucozei (3),
un nou ciclu de transport putând fi iniiat. © Mircea Leabu, 2014.

Ca exemplu de transportor uniport, amintim transportorul de glucoz din


membrana eritrocitar (GLUT1) [1]. Este o protein multipas, cu masa molecular de
~45kDa, având 12 treceri în D-helix prin planul membranei, la nivelul crora, alturi
de aminoacizi hidrofobi, gsim i Ser, Thr, Asn i Gln, aminoacizi polari responsabili,
în timpul procesului de transport, de interaciunea cu molecula de glucoz pentru
trecerea ei prin membran. Ambele capete terminale ale lanului polipeptidic sunt
expuse în citosol. În membrana eritrocitar exist peste 200 000 de molecule de
transportor GLUT1 pentru o celul. GLUT1 face parte dintr-o familie de transportori
de glucoz cu 14 membri (GLUT1-14), toi cu câte 12 treceri în D-helix prin planul
membranei i cu capetele N- i C-terminale în endodomeniu. Transportorii GLUT
sunt întâlnii i în membranele altor tipuri de celule animale, nu numai în eritrocite
sau în linia hematopoietic eritroid [2-5]. În condiii bazale, în celulele musculare i
în adipocite GLUT4 sufer un proces continuu, dar cu dinamic sczut de reciclare
între membran i câteva compartimente intracelulare, cu numai 5% din totalitatea

74
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

moleculelor expuse în membrana celular. Dup stimulare cu insulin, în 2-3


minute, celulele modific echilibrul între cantitatea de GLUT4 aflat în
compartimente intracelulare i cea expus în membran, care crete la 50% [5].
Aceste observaii susin afirmaia fcut mai sus cum c transportul i semnalizarea
sunt procese membranare ce se influeneaz reciproc.
Ca transportor simport (Fig. 3.3), merit amintit co-transportorul de
sodiu/glucoz (SGLT1) din membrana apical a enterocitelor (celulele absorbante
din intestin) [6, 7]. De remarcat faptul c acest transportor folosete disiparea
gradientului de Na+, pentru a prelua glucoza din lumenul intestinal în citosolul
enterocitelor, împotriva gradientului de concentraie a glucidului. Un asemenea
transport mai este numit i transport activ secundar, deoarece se bazeaz
practic pe energia consumat anterior de celul pentru meninerea gradientului de
Na+ (12mM în celul, 145mM în exterior), ceea ce se realizeaz prin activitatea
pompei de sodiu i potasiu, un antiport (vezi mai jos la 3.2.1.3. Transportul
activ). Asta înseamn c glucoza, transportat împotriva gradientului de
concentraie prin disiparea celui al sodiului, este eficient absorbit din lumenul
intestinal ctre spaiul de sub epiteliu de unde este preluat în circulaia sanguin.
SGLT1 este protein transmembranar multipas cu 14 treceri în D-helix prin planul
membranei, dintre care trecerile 10-14 au fost dovedite ca structurând calea de
trecere a glucozei. Ambele capete ale lanului polipeptidic sunt în ectodomeniu. În
bucla hidrofil N-terminal SGLT1 este glicozilat, dar structurile glucidice nu sunt
necesare activitii biologice. Lanul polipeptidic al SGLT1 are 664 de aminoacizi i o
mas molecular de ~73kDa. Un ciclu al mecanismului de transport co-transport 2
ioni de sodiu i o molecul de glucoz. În membranele latero-bazale ale enterocitelor
se gsete un transportor uniport de glucoz (GLUT2) prin care glucoza introdus în
celul de SGLT1 este transportat în spaiul subepitelial [7]. SGLT1 face parte dintr-o
familie de co-transportori sodiu/glucoz ce conine peste 220 de membri în celulele
eucariote i procariote, iar la om 11 membri [6]. Genele ce codific cei 11 membri duc
predictibil la proteine cu greuti moleculare între 60 i 80kDa, coninând de la 580
pân la 718 aminoacizi. Cu excepia a doi dintre membri, ceilali realizeaz 14 treceri
în D-helix prin planul membranei.
Ca exemplu de transport antiport, readucem în atenie canalul de schimb
anionic HCO3-/Cl- din membrana eritrocitar [8, 9], denumit simbolic prin banda
3, dar pentru care se folosete i abreviaia AE1 (vezi detalii structurale la
subcapitolul „Proteine membranare”, seciunea „Exemple de proteine
membranare”). Schimbul anionic (1:1) poate fi inversat în funcie de concentraiile
bicarbonatului în celul, respectiv mediul extracelular. Proteine similare se întâlnesc
i în alte tipuri de celule, iar familia acestora poart denumirea de schimbtori
anionici (prescurtat AE, de la sintagma englezeasc Anion Exchanger). În celulele
noneritroide au fost identificate AE2 i AE3 [10, 11]. Alturi de controlul
homeostaziei eritrocitare i tisulare a CO2, prin schimbul HCO3-/Cl-, aceste canale
acioneaz i în controlul i reglarea pH-ului celular i al sângelui [11]. Aceast
activitate de reglare a pH-ului sângelui (respectiv urinei) se manifest i la nivelul
nefrocitelor, unde la schimbul pasiv HCO3-/Cl- se adaug activitile unui canal
uniport de Cl-, necesar meninerii homeostaziei intracelulare a anionului i ale unei
pompe protonice, destinat eliminrii H+ rezultat din hidroliza acidului carbonic,
obinut prin hidratarea CO2.
Un alt antiport, prezent în membrana celor mai multe celule excitabile sau
secretoare [12], este schimbtorul de Ca2+/Na+, care efectueaz tot un transport
activ secundar, eliminând un ion Ca2+ prin introducerea a 3 ioni Na+. (De fapt sunt
raportate valori diferite de ioni Na+ schimbai cu un ion Ca2+, astfel încât mai
circumspect ar fi s spunem c stoichiometria antiportului este mai mult de 2 Na+,
pentru 1 Ca2+ [13]). Familia de proteine transmembranare cu aceast funcie este
75
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

notat prescurtat cu NCX (de la Natrium-Calcium eXchanger), fiind identificai la


mamifere trei membri: NCX1, NCX2 i NCX3. NCX1 se afl în aproape toate
esuturile, dar este exprimat mai abundent în inim, creier i rinichi [14]. NCX1 are
938 aminoacizi (110kDa, mas deductibil din secvena de aminoacizi) i are 9
domenii transmembranare în D-helix [15]. Captul amino terminal al lanului
polipeptidic se afl la suprafaa membranei, aadar NCX1 este protein
transmembranar tip I, iar între segmentele transmembranare 5 i 6 se structureaz
o bucl citosolic (adic pe faa intern a membranei) de 550 de aminoacizi (mai
mult de jumtate din lungimea lanului polipeptidic) esenial pentru reglarea
activitii canalului. Activitatea schimbtorului Na+/Ca2+ este dependent de
concentraiile extracelular, respectiv citosolic ale cationilor schimbai, dar i de
concentraia H+, a ATP i a fosfoinozitidelor bis-fosforilate [13]. În funcie de
potenialul de membran i de concentraiile aflate de o parte sau de cealalt a
membranei pentru cationii transportai, schimbul poate fi inversat. De remarcat este
faptul c în celula muscular cardiac, unde contribuia de calciu citosolic necesar
contraciei se datoreaz masiv (~70%) eliberrii din reticulul sarcoplasmic, iar numai
în mic msur (~30%) invaziei de calciu extracelular, eliminarea procentelor de
Ca2+ din citosol, necesar procesului de relaxare se face în principal prin NCX i nu
prin pompa de calciu sarcolemal (adic pompa de calciu din membrana celulei
musculare). În cazul reintroducerii Ca2+ în reticulul sarcoplasmic, contribuia revine
în exclusivitate pompei de calciu din membrana organitului [16]. De regul NCX
transport de 10, 15 ori mai mult Ca2+ în afara celulei decât pompa membranar de
calciu [14].
Transportul pasiv, oricum s-ar desfura, se petrece în sensul de diminuare a
gradientului de concentraie al componentei transportate. De aceea se mai numete
i transport disipativ, transport entropic sau transport la vale (de la
concentraie mare, la concentraie mic). Acest tip de transport se poate desfura,
teoretic, pân când concentraia componentei transportate se egalizeaz de cele dou
pri ale membranei prin care se desfoar. Aceast situaie ipotetic nu se
realizeaz în realitate, în cazul ionilor, datorit mecanismelor de control al activitii
canalelor.
Asupra acestor aspecte, legate de activitatea canalelor ionice membranare, se
pot face comentarii suplimentare. Canalele nu sunt permanent deschise, iar celula
poate controla/comanda funcionarea lor. În funcie de mecanismul prin care este
controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot împri în trei categorii
(Fig. 3.4):
1. Canale ionice controlate (operate) electric (prin voltaj), adic prin
modificarea potenialului de membran (Fig. 3.4, exemplul 1). Acestea sunt
închise (Fig. 3.4, 1a) atunci când potenialul membranei este cel normal (adic
50 – 70mV, cu minus pe partea citosolic). Canalele controlate electric se
deschid atunci când potenialul de repaus al membranei se modific (Fig. 3.4,
1b).
2. Canale ionice controlate (operate) chimic (prin liganzi) (Fig. 3.4,
exemplul 2), adic se deschid atunci când proteina, care formeaz structura
transmembranar destinat transportului, leag un compus chimic (ligandul)
care schimb conformaia complexului (Fig. 3.4, 2b). Ligandul se poate lega în
ectodomeniul proteinei care structureaz canalul (sau al uneia dintre
subuniti, dac este multimer) fiind ligand extracelular sau, pentru alte tipuri
de canale, la endodomeniu (ligand intracelular sau citosolic).
3. Canale ionice controlate mecanic, adic a cror stare deschis/închis
este dependent de exercitarea unor tensiuni mecanice asupra membranei (Fig.
3.4, exemplul 3).

76
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.4. Tipuri de canale ionice i strile lor. 1 – canal controlat electric: închis (a), în condiii de
repaus (potenialul membranei normal); deschis (b), când potenialul membranei este modificat;
inactiv (c), devenit refractar la persistena modificrii potenialului membranei. 2 – canale controlate
chimic (prin ligand): închis (a), în absena ligandului legat de complexul proteic transmembranar;
deschis (b), ca urmare a legrii ligandului; inactiv (c), în conformaie închis, dei ligandul este legat.
Este evideniat faptul c, pentru canalele comandate chimic, ligandul poate fi extracelular sau
citosolic. 3 – canale controlate mecanic: închis (a), în absena tensiunii/stresului mecanic; deschis (b),
atunci când se exercit o tensiune mecanic asupra membranei; inactiv (c), când dei stresul
mecanic persist, canalul adopt conformaie închis, devenind refractar la stimul. Este reprezentat
faptul c, la inactivare, închiderea se realizeaz (de regul) în zona endodomeniului, ca urmare a
schimbrilor citosolice locale în homeostazia ionilor transportai. © Mircea Leabu, 2014.

Trebuie menionat c activarea canalelor respect un mecanism ciclic. Acesta


asigur inactivarea lor chiar în condiiile care au determinat deschiderea (adic în
condiiile persistenei stimulului), deoarece pot prezenta trei stri:
- starea închis (Fig. 3.4, situaiile a), de repaus, în absena stimulului
(modificarea potenialului, legarea ligandului sau tensiunea mecanic);
- starea deschis, care permite trecerea ionilor, dup apariia stimulului (Fig. 3.4,
situaiile b);
- starea inactiv, închis la prezena prelungit a stimulului (Fig. 3.4, situaiile c);
aceasta înseamn pentru cele trei tipuri de canale: (i) conformaie închis sub
potenial de membran modificat (alt conformaie decât cea închis de
repaus), (ii) ocupat de ligand dar închis i (iii) închis în prezena tensiunii
mecanice care a determinat deschiderea.

77
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Aceast trecere într-o stare refractar a canalelor ionice asigur meninerea


homeostaziei ionice intracelulare în condiiile de persisten a semnalelor, refacerea
potenialului membranar, desprinderea ligandului i, eventual, metabolizarea sa, cu
revenirea celulei la starea bazal, adic starea de neexcitaie, astfel încât s devin
sensibil la o nou stimulare. De remarcat c trecerea în stare refractar se petrece
datorit modificrilor spaio-temporale în homeostazia ionic din citosolul
subcortical (de regul), ceea ce atrage schimbri de conformaie a endodomeniilor
transportorilor [17-19]. Aceste schimbri care induc inactivarea canalelor pot fi sau
nu însoite de modificri chimice ce se petrec asupra lanului polipeptidic [20, 21].
Dintre cele trei tipuri de canale ionice, cele controlate mecanic (Fig. 3.4,
exemplul 3) au fost ultimele descoperite i sunt i cele mai dificil de investigat,
începând chiar cu stabilirea faptului c sunt controlate mecanic. Dificultile se
datoreaz urmtoarelor aspecte [22]:
(i) celulele mecano-senzitive nu sunt numeroase în organism i sunt împrtiate
printre multe alte tipuri celulare, spre deosebire de celulele care conin canale
din celelalte tipuri;
(ii) numrul de canale controlate mecanic în membranele celulelor mecano-
senzitive este de câteva ordine de mrime mai sczut decât numrul canalelor
comandate electric sau chimic (de exemplu, eritrocitele au 1,2x106 molecule de
banda 3, membrana celulelor cu bastonae conine aproximativ 4x107
molecule de rodopsin, celulele olfactive în jur de 1,7x107 receptori olfactivi, în
timp ce celulele proase din organul lui Corti au între 50 i 100 de canale
controlate mecanic);
(iii) dovedirea proprietilor mecano-senzitive ale eventualilor candidai este
dificil cu tehnicile clasice.
În ciuda acestor dificulti, interesul pentru studiul canalelor controlate
mecanic este deosebit de actual, atâta timp cât dorim s cunoatem mecanismele
celulare i moleculare ale receptrii, controlrii i reglrii presiunii sanguine, ale
senzaiilor tactile, ale percepiei sunetelor, gravitaiei i acceleraiei. Din ceea ce se
cunoate pân în prezent, canalele controlate mecanic sunt împrite în patru tipuri
[22]: degenerine/canale epiteliale de sodiu (abreviere DEG/ENaC, de la
DEGenerin/Epitelial Natrium Channel), canale receptor tranzient de potenial
(prescurtat canale TRP, de la Transient Receptor Potential), canale de potasiu cu
doi pori (notate K2P) i canale mecano-senzitive de conductan mic (abreviat MscS,
de la Mechanosensitive channel of Small conductance). O trstur comun a
acestor canale controlate mecanic este aceea c genereaz semnale electrice foarte
rapide, cu o laten de sub 1ms.
Suntem la un capitol destinat înelegerii funcionrii biomembranelor ca
sisteme integrative, ceea ce înseamn nu doar c toate tipurile de componente ce le
organizeaz (lipide, proteine i componenta glucidic) particip la funciile
membranelor, dar i c putem exemplifica modul în care coopereaz elemente cu
funcii variate în fenomene celulare complexe. Pentru înelegerea faptului c
evenimentele celulare nu se petrec individual, ci într-o permanent cooperare i
completare, ca i pentru contientizarea faptului c celulele se comport adecvat
situaiilor în care sunt puse numai datorit acestei conlucrri a componentelor lor,
inclusiv a componentelor membranare, putem exemplifica prin ceea ce se petrece la
nivelul jonciunilor neuro-musculare în momentul stimulrii celulei musculare
pentru contracie, de ctre sistemul nervos (Fig. 3.5). Este vorba aici de o cooperare
eficient între diferite tipuri de canale (în cazul acesta între canale comandate
electric i canale comandate prin ligand).

78
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.5. Cooperarea diferitelor tipuri de canale la nivelul jonciunii neuro-musculare. A.


Jonciunea aflat în repaus, deoarece impulsul nervos nu a ajuns la butonul terminal. Canalele de
calciu controlate electric, care comand exocitarea acetilcolinei, sunt închise. Sgeile roii sugereaz
direcia de propagare a semnalului. B. Jonciunea neuro-muscular activat. Stimularea nervoas a
ajuns la butonul terminal, canalele de calciu operate electric sunt deschise, iar creterea concentraiei
de Ca2+ în citosolul de la nivelul butonului terminal determin secreia de acetilcolin. Acetilcolina
secretat în fanta sinaptic se leag de canalele de sodiu pe care le comand, le deschide i
determin, prin depolarizarea local a membranei, activarea unor canale de sodiu comandate
electric. În acest fel se extinde depolarizarea sarcolemei, ceea ce induce deschiderea unor canale de
calciu comandate electric, iar calciul extracelular intrat în citosolul celulei musculare, duce i la
afectarea canalelor de calciu de la nivelul reticulului sarcoplasmic, determinând eliberarea de calciu i
crescând concentraia de Ca2+ în citosolul miocitului. Unele fenomene sunt mai complexe decât se
prezint în aceast figur. © Mircea Leabu, 2014.

Jonciunea neuro-muscular, numit i sinaps neuro-muscular, reprezint


o apoziie dintre membrana butonului terminal al unui axon i un microdomeniu al
membranei celulei musculare. Între cele dou membrane, aflate în apoziie la nivelul
sinapsei, în spaiul numit fant sinaptic, se creeaz un microclimat favorabil
transmiterii de semnale între celula nervoas i celula muscular. Ce se întâmpl la
acest nivel, când un semnal nervos ajunge la butonul terminal al axonului?
Propagarea semnalului nervos de-a lungul axonului se materializeaz prin
depolarizarea membranei axonale secvenial, de-a lungul acestuia. Când semnalul,

79
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

deci depolarizarea membranei axonale, ajunge la butonul terminal, are loc


deschiderea unor canale de Ca2+ operate electric. Deschiderea acestor canale permite
ionilor de calciu din spaiul extracelular (unde concentraia este cu patru ordine de
mrime mai ridicat, adic 10-3M) s intre în citosolul de la nivelul butonului axonal
(unde concentraia este mic, de ordinul 10-7M). Creterea concentraiei de Ca2+ în
butonul axonal induce secreia de acetilcolin (depozitat în vezicule de secreie de la
nivelul butonului axonal) în fanta sinaptic. Acetilcolina secretat în fanta sinaptic
se leag de canalele de sodiu controlate chimic prezente în membrana sinaptic a
celulei musculare pe care le deschide. Ionii Na+ ptrund în celula muscular
depolarizând membrana acesteia la nivelul jonciunii neuro-musculare.
Depolarizarea membranei la nivelul sinapsei duce la deschiderea unor alte canale de
Na+ comandate electric, extinzând modificarea potenialului membranei celulei
musculare. Aceast depolarizare extins duce la deschiderea la nivelul membranei
celulei musculare a unor canale de Ca2+ operate electric, ca i a unor canale de calciu
din membrana reticulului sarcoplasmic. Ptrunderea Ca2+ (atât din exteriorul celulei,
cât i din reticulul sarcoplasmic) în citosolul celulei musculare determin contracia
celulei. Relaxarea celulei musculare presupune eliminarea ionilor de Ca2+ din citosol,
prin aciunea canalelor de schimb Na+/Ca2+ i a unor pompe de Ca2+. Dup
transmiterea semnalului, la nivelul fantei sinaptice acetilcolina este fie metabolizat
la colin i acid acetic de o colinesteraz, fie reintrodus în vezicule de secreie, în
butonul axonal prin endocitoz. Scderea concentraiei de acetilcolin în fanta
sinaptic, alturi de relaxarea celulei musculare prin scderea concentraiei citosolice
de Ca2+ asigur pregtirea celulei pentru reluarea ciclului. Este evident, celulele fac
toate aceste lucruri mult, mult mai repede decât descriem noi în cuvinte. (Din
fericire!)
3.2.1.2. Transportul apei prin membrana celular
Nu putem încheia aspectele legate de transportul pasiv prin membrane fr s
vorbim despre transportul apei, solventul fiziologic. De acest transport depinde
echilibrarea presiunilor coloidosmotice i supravieuirea celulelor. Trecerea apei
printr-o membran poart denumirea de osmoz. Acesta este un termen util în
biofizic, unde mecanismele care se ascund în spatele acestei treceri nu conteaz. În
biologia celular, îns, unde vrem s desluim mecanismele care se petrec în celul
sau la nivelul diferitelor componente celulare (cum este acum membrana celular) în
toat diversitatea i complexitatea lor, termenul osmoz (chiar dac nu trebuie
ignorat) nu este deosebit de util. Mai degrab poate crea confuzie, dac nu este corect
îneles. Mult vreme s-a considerat c osmoza implic numai trecerea apei printre
lipidele bistratului (intrarea apei în celul sau prsirea celulei de ctre moleculele
polare, mici ale apei). Ei bine, prin membrana celular apa trece atât prin difuziune
simpl (adic printre lipidele bistratului), cât i prin difuziune facilitat, deoarece
multe celule i-au produs complexe proteice transmembranare destinate
transportului pasiv al apei. Aceste complexe proteice transmembranare, destinate
transportului facilitat al apei prin membranele celulare, poart denumirea de
aquaporine.2 Termenul osmoz implic trecerea apei prin biomembrane prin
ambele mecanisme, cumulat. Rolul aquaporinelor este acela de a eficientiza trecerea
apei prin membrane, astfel încât, pe de o parte, fenomenele fiziologice s se petreac
dup o dinamic adecvat i, pe de alt parte, la apariia unor dezechilibre osmotice
accidentale homeostazia celular s nu sufere dramatic i s pun în pericol
supravieuirea.

2 Proteinele care structureaz aquaporine au fost pentru prima dat identificate în membrana eritrocitar, iar
rolul lor a fost intuit de românul Gheorghe Benga. Studii consecvente referitoare la aceti transportori ai apei prin
membrane au fost efectuate ulterior de grupul lui Peter Agree, acesta primind, în 2003, Premiul Nobel pentru
chimie cu urmtoarea motivaie a juriului: "for the discovery of water channels".

80
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Aquaporinele sunt proteine identificate în toate organismele (de la bacterii, la


mamifere i în plante) i sunt ubicuitare în organismele multicelulare, fiind
exprimate în diferite grade în toate tipurile de celule [23, 24]. La om au fost
identificai cel puin 13 membri ai familiei proteice a aquaporinelor [24], desemnate
abreviat prin AQPx (cu x începând de la 0, AQP0 fiind aquaporina din cristalin,
numit iniial proteina integral major, abreviat MIP, de la Major Integral
Protein, de unde i tendina de a denumi astfel superfamilia de proteine creia îi
aparin i aquaporinele). Identitatea molecular a primei aquaporine (AQP1) a fcut
obiectul articolului publicat de echipa lui Peter Agree în 1992. Agree i colaboratorii,
microinjectând ovocite de Xenopus laevis cu ARNm al proteinei CHIP28, abundent
exprimat în membrana eritrocitar, au constatat o cretere semnificativ a
permeabilitii osmotice a apei [25]. Aquaporinele (Fig. 3.6) sunt proteine
transmembranare cu masa molecular de ~30kDa (masa molecular predictibil a
monomerilor de aquaporine este între 26 i 34kDa), au ase treceri în D-helix prin
bistratul lipidic (Fig. 3.6, notaiile TM1-TM6) i dou segmente scurte, tot
helicoidale, care strjuiesc vestibulele citoplasmatic (Fig. 3.6, notaia B1), respectiv
extracelular (Fig. 3.6, notaia B2) ale canalului organizat de cele ase domenii
transmembranare [25-27]. Capetele amino- i carboxi-terminale ale lanului
polipeptidic se afl pe faa citosolic. În membrane, monomerii astfel organizai
transmembranar se asociaz câte patru formând homotetrameri. Fiecare monomer al
complexului tetrameric reprezint uniti funcionale. Pentru AQP4 homotetramerii
se asociaz la un nivel superior în reele octogonale prin interaciuni ale unor motive
(secvene mici de aminoacizi) specifice din regiunea capetelor amino-terminale ale
monomerilor.
Apa poate trece prin canalele aquaporinelor în ambele sensuri, depinzând de
presiunile coloidosmotice existente de cele dou pri ale membranei. Reglarea
activitii aquaporinelor i importana acestora în controlul presiunilor
coloidosmotice reprezint teme tiinifice de interes în momentul de fa [27, 28]. În
prezent, cunoatem c reglarea activitii se face prin protonare, dar i prin
fosforilare sau legare de ali cationi [27], fr ca mecanismele de control i reglare s
fie deplin elucidate, alte modaliti de reglare sugerate fiind în studiu. Exprimarea
adecvat a aquaporinelor în celule este important pentru multe fenomene
fiziologice: absorbia adecvat la nivelul cilor urinare pentru formarea urinei,
semnalizare neuronal prin modularea transportului prin canale ionice, motilitate
celular prin asigurarea dinamicii lamelipodiilor, hidratarea pielii, proliferarea
celular, metabolismul lipidic (implicarea aquagliceroporinelor, aquaporine cu
transport dual pentru ap i glicerin) [24]. Mai mult, deficiene în exprimarea
aquaporinelor pot induce sau însoi diverse patologii: cataract, diabet insipid, edem
cerebral, obezitate [23].

Fig. 3.6. Aranjarea lanului polipep-


tidic al aquaporinelor în bistratul
lipidic. Cele 6 domenii transmem-
branare (TM1-TM6) formeaz canalul
de trecere a apei/glicerinei, iar cele
dou bucle, citosolic (B1), respectiv
extracelular (B2), asigur selectivita-
tea primar a complexului, strjuind
vestibulele intern, respectiv extern ale
cii de trecere. © Mircea Leabu, 2014.

81
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

3.2.1.3. Transportul activ


Pân aici am detaliat aspecte legate de transportul în sensul diminurii
concentraiei componentei/componentelor transportate, adic transportul pasiv sau
entropic. Celulele au îns nevoie de transport de molecule mici i/sau ioni i
împotriva gradientelor de concentraie existente la un moment dat sau existente
permanent la nivelul membranelor. Pentru rezolvarea acestor nevoi, în membrane
sunt organizate biostructuri proteice capabile s transporte molecule mici i ioni
împotriva gradientului de concentraie al acestora, prin consum de energie provenit
din scindarea unor molecule macroergice (de regul ATP). Aceste structuri proteice
membranare poart denumirea de pompe. Transportul efectuat de ele se numete
transport activ, transport antientropic sau transport la deal.
Ca exemplu de transport activ vom aborda pompa de Na+/K+, numit i
Na+/K+-ATPaz3. Pompa este o structur complex din punct de vedere biochimic
[29], organizat ca un tetramer format din dou subuniti D, mari (care reprezint
unitatea catalitic i transportoare) i dou subuniti E, mici (glicoproteice,
reglatoare, neimplicate direct în pomparea ionilor, dar necesare pentru împachetarea
conformaional corect a subunitilor D în reticulul endoplasmic, în momentul
biosintezei, asamblrii în membran i maturrii). În unele organe, se altur un al
treilea tip de lan polipeptidic, subunitatea J (un polipeptid foarte mic, capabil s
moduleze afinitatea pentru ionii transportai i pentru ATP). Toate cele trei tipuri de
subuniti sunt proteine transmembranare.
Subunitile D (Fig. 3.7) sunt neglicozilate. Ele au o mas molecular de
~110kDa (putând conine între 1014 i 1028 de aminoacizi), au 10 treceri în D-helix
prin bistratul lipidic membranar (notate abreviat cu TM1 – TM10; în Fig. 3.7. sunt
numerotate în ordine, cu cifrele 1-10), iar ambele capete amino- i carboxi-terminale
ale lanului polipeptidic se afl în endodomeniu [29]. Exist patru izoforme de
subuniti D: D1, care are un lan polipeptidic format din 1024 aminoacizi, D2, cu
1021 aminoacizi, D3, cu doar 1014 aminoacizi i D4, cu cel mai lung lan polipeptidic,
coninând 1028 de aminoacizi [29, 30]. Domeniul extracelular este minor i format
din dou bucle mici, prima între domeniile transmembranare TM1 i TM2 (cam 12
aminoacizi, responsabil de interaciunea cu ouabaina, care inhib activitatea
pompei) i o a doua între TM7 i TM8 (în jur de 39 de aminoacizi). Celelalte bucle
extracelulare sunt nesemnificative (câte 3-4 aminoacizi) în privina participrii la
organizarea domeniului extracelular al proteinei. Domeniul citosolic este abundent,
fiind format din: (i) poriunea N-terminal a subunitii (primii 90-97 de aminoacizi
ai lanului polipeptidic), (ii) o bucl de lungime medie, între domeniile
transmembranare TM2 i TM3 (format din ~143 de aminoacizi), (iii) bucla mare
format de lanul polipeptidic între TM4 i TM5 (are în jur de 439 de aminoacizi i
conine atât acidul aspartic ce se fosforileaz în ciclul de activitate a pompei, cât i
situl de legare a ATP), (iv) alte dou bucle semnificativ mai mici între TM6, TM7 (28
de aminoacizi) i între TM8, TM9 (27 de aminoacizi) i (v) captul C-terminal, mic
(format din ultimii 21 de aminoacizi ai lanului polipeptidic) [31]. La nivelul acestui
complex endodomeniu sunt prezente siturile de legare a sodiului (sunt legai
simultan 3 ioni), care au mare afinitate pentru cation. Siturile de legare a ionului de
sodiu sunt accesibile numai în starea în care pe endodomeniu, la nivelul buclei mari
se afl legat ATP. Starea în care subunitatea D prezint legai concomitent ATP i cei
trei ioni de sodiu reprezint iniierea ciclului de pompare (vezi mai jos etapele
mecanismului de pompare).

3 Pompa de sodiu a fost descoperit în 1950 de chimistul danez Jens Christian Skou, care 47 de ani mai târziu, în

1997, a fost distins cu Premiul Nobel în chimie cu urmtoarea motivaie a juriului: "for the first discovery of an
ion-transporting enzyme, Na+,K+-ATPase". Denumirea de Na+/K+-ATPaz se datoreaz faptului c scindeaz
enzimatic ATP pentru energia necesar transportului antientropic.

82
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.7. Elementele din organizarea în membran a domeniilor subunitii D (subunitatea


transportoare) a pompei de sodiu i potasiu. Cele 10 domenii transmembranare organizate în D-
helix (TM) sunt numerotate, în ordine, de la 1 la 10. Se observ ectodomeniul slab reprezentat, format
în principal de dou bucle mici: prima între TM1 i TM2, iar a doua între TM7 i TM8. Endodomeniul
este foarte bogat coninând captul N-terminal al subunitii, pe lungimea primilor 97 de aminoacizi ai
proteinei, captul C-terminal, relativ scurt (ultimii 21 de aminoacizi ai proteinei), dou bucle mici între
TM6 i TM7, respectiv TM8 i TM9, o bucl de lungime medie între TM2 i TM3 i bucla citosolic
major, realizat de lanul polipeptidic între TM4 i TM5, care conine situl de legarea a ATP i acidul
aspartic ce se fosforileaz în cursul ciclului de funcionare a pompei. © Mircea Leabu, 2014.

Rolul celorlalte subuniti E (respectiv J, când aceasta exist) este destul de


controversat, înc, deoarece i rezultatele experimentale sunt destul de diverse în
semnificaia lor.
Subunitatea E este glicoprotein transmembranar unipas, tip II cu un
endodomeniu mic format dintr-o poriune scurt a captului N-terminal i un
ectodomeniu mare format din mai mult de jumtate din întregul lan polipeptidic cu
captul C-terminal. Exist trei izoforme de subuniti E: E1, care are 304 aminoacizi
i trei situri de posibil N-glicozilare, E2 cu 290 de aminoacizi în structur i 4 pân
la 9 situri de glicozilare, depinzând de specie (4 la pasre, 7 la obolan, 8 la om, 9 la
oarece) i E3, având 279 de aminoacizi [29]. Nu se cunoate dac toate aceste
posibile situri de glicozilare sunt utilizate ca atare, dar toate izoformele sunt, cu
certitudine, mai puternic sau mai slab glicozilate. Dei inhibarea glicozilrii cu
tunicamicin nu blocheaz activitatea pompei i nici sensibilitatea acesteia la
ouabain, este totui dovedit, pentru subunitile E neglicozilate, afectarea
echilibrului de asamblare DE. Aceste rezultate experimentale sugereaz rolul
subunitii E în corecta împachetare a subunitii D în timpul biosintezei, la nivelul
reticulului endoplasmic i formarea eficient a complexelor proteice ale pompei [29].
O alt caracteristic structural important a subunitii E este capacitatea de a
forma trei puni disulfidice în ectodomeniu. La obolan aceste puni, ce asigur
împachetarea corect a subunitii E1, se formeaz între Cys125-Cys148, Cys158-Cys174 i
Cys212-Cys275. Chiar dac poziiile relative ale cisteinelor implicate în formarea
punilor nu sunt conservate la izoformele E2 sau E3, punile sunt prezente, ceea ce

83
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

sugereaz importana lor pentru o aranjare tridimensional corect, funcional.


Desfacerea celor trei puni disulfidice cu ageni reductori duce la pierderea funciei
pompei, iar o singur mutaie punctiform care elimin numai una dintre cisteinele
în discuie împiedic asamblarea corect a heteromerilor DE [32].
Referitor la asamblarea complexelor proteice ale Na+,K+-ATPazei se cunoate
c subunitile E au domeniul transmembranar în apropierea domeniilor TM7 i
TM10 ale subunitii D i c mai interacioneaz cu bucla dintre TM7 i TM8 a
ectodomeniului subunitii catalitice [33]. Cât privete asamblarea subunitii J(la
complexele de transport în care ea exist), domeniul transmembranar al acesteia se
localizeaz într-un an dintre TM2, TM6 i TM9 al subunitii D, dar interacioneaz
i cu subunitatea E la nivelul ectodomeniului, respectiv cu endodomeniul subunitii
D la nivelul buclelor dintre domeniile transmembranare TM6/TM7 i TM8/TM9 [33-
35]. Toate aceste interaciuni ce sunt nuanate prin asocierile diferite dintre cele 4
izoforme de subuniti D, trei izoforme de subuniti E i apte izoforme de
subuniti J asigur modulri de mare finee ale funciei pompei în diverse tipuri
celulare [29, 33].
Cât privete structura biochimic a subunitii J, aceasta este o protein
transmembranar unipas, tip I i au fost identificate 7 izoforme, cu mase moleculare
între 8 i 14kDa [29, 33]. Toate aceste izoforme au fost dovedite a se asocia cu
pompele de Na+/K+ [33], modulând activitatea acestora. Subunitatea J se exprim în
special la nivelul rinichiului, având rol i în adaptarea, respectiv supravieuirea
celulelor în condiii hipertone [36].
Ce se cunoate despre mecanismul de aciune al Na+,K+-ATPazei? Ciclul de
pompare are 7 etape i duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ i introducerea a 2 ioni de
K+ în celul, pe baza unor modificri de conformaie între dou forme: E1 cu acidul
aspartic din situl catalitic nefosforilat i E2 cu acidul aspartic fosforilat [37]. Etapele
ciclului de pompare sunt (Fig. 3.8):
1. Legarea ATP pe endodomeniul subunitii D i expunerea siturilor de legare a
ionilor Na+;
2. Legarea a trei ioni Na+ în poriunea citosolic (endodomeniul) subunitii D a
pompei, pe situri de înalt afinitate;
3. Fosforilarea unui aspartat prin scindarea ATP la ADP (consumul energetic
necesar activitii pompei), cu schimbarea conformaiei proteinei, ceea ce duce la
conducerea celor trei ioni Na+ în ectodomeniul subunitii D, pe situri de
interaciune de joas afinitate;
4. Disocierea i expulzarea în exterior a ionilor Na+ i legarea pe ectodomeniul
subunitii D a doi ioni de K+, pe situri de mare afinitate expuse prin modificrile
de conformaie ce se petrec în etapele 2 i 3;
5. Hidrolizarea aspartilfosfatului i schimbarea conformaiei subunitii D, ceea ce
atrage transferul ionilor K+ în endodomeniu pe situri de joas afinitate;
6. Eliberarea ionilor K+ de pe endodomeniul subunitii D, în citosol;
7. Încheierea ciclului prin refacerea sitului specific i legarea ATP, pentru refacerea
conformaiei cu expunerea siturilor de mare afinitate pentru ionii Na+ i
pregtirea unui nou ciclu de pompare.
Pompa de Na+/K+ este electrogenic, adic prin eliminarea a 3 ioni de Na+ i
introducerea a numai 2 ioni K+, contribuie la realizarea i/sau meninerea
potenialului membranar. Se întâlnete în membranele tuturor celulelor animale.
Importana prezenei i activitii sale poate fi probat i de faptul c adesea ea
consum jumtate din cantitatea celular de ATP. Inhibarea activitii ei prin
ouabain duce la incapacitatea celular de a menine echilibrul Na+/K+, cu afectarea
potenialului membranar i din asta rezult complicaii asupra fiziologiei celulare.

84
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.8. Etapele unui ciclu funcional pentru subunitatea  a pompei de sodiu si potasiu. În
fazele 1, 2, 6 i 7 subunitatea D are conformaii corespunztoare formei E1, în timp ce în fazele 3, 4 i
5 conformaiile sunt pentru forma E2. Ciclul începe cu legarea celor trei ioni de sodiu pe siturile de
mare afinitate din endodomeniu (1), ceea ce atrage lizarea ATP cu fosforilarea restului aspartat i
eliberarea ADP (2); fosforilarea (P) acidului aspartic duce la modificri conformaionale ale subunitii
D, cu transferarea celor trei ioni de sodiu în ectodomeniul proteinei transmembranare, pe situri de
joas afinitate (3), de unde sunt expulzai cu expunerea siturilor de mare afinitate pentru ionii de
potasiu (4); ectodomeniul leag cei doi ioni de potasiu (5) ceea ce conduce la hidroliza aspartil-
fosfatului, cu eliberarea de acid fosforic i schimbarea conformaiei, care favorizeaz transferul ionilor
de potasiu pe situri de joas afinitate din endodomeniu (6); eliberarea ionilor de potasiu în citosol
duce la refacerea sitului de legare a ATP (7), iar legarea compusului macroergic pe endodomeniu
reface siturile de mare afinitate pentru sodiu, ciclul putând reîncepe. © Mircea Leabu, 2014.

Pompa discutat mai sus face parte din tipul P de ATPaze (ATPaze de tip
plasmalemal), alturi de pompa protonic (H+-ATPaz), pompa H+/K+ (H+,K+-
ATPaz) i de pompa de calciu (Ca2+-ATPaz). P-ATPazele au aceeai structur
catalitic i mecanisme asemntoare celui descris pentru pompa de Na+/K+.
La nivelul endomembranelor a fost evideniat i tipul V de ATPaze (ATPaze
de tip vacuolar), care pompeaz protoni în endozomi sau lizozomi. Organizarea
acestora este mult mai elaborat, având nevoie de cel puin 11 subuniti ca s îi
îndeplineasc funcia, ceea ce duce la formarea unor complexe proteice de ~1000kDa
[38].
În sfârit, menionm c la nivelul celulelor eucariote mai exist tipul F de
ATPaze (cu F de la „phosphorilation Factor”), care sintetizeaz ATP folosind
energia rezultat din disiparea unui gradient protonic existent la nivelul membranei

85
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

în care sunt organizate i tipul E de ATPaze (cu E de la „Extracellular ATP”), care


sunt enzime ale suprafeei celulare cu rol în hidroliza diverilor nucleozid-trifosfai
(inclusiv ATP) extracelulari, cu implicare în diferite fenomene de semnalizare i nu în
transportul activ. V-ATPazele i F-ATPazele au similitudini de organizare (complexe
proteice cu numr mare de subuniti) i reprezint, pe baza mecanismului de
funcionare, ceea ce numim motoare moleculare [38, 39].
Pentru argumentare suplimentar a imaginii cooperrilor dintre diversitatea
de componente ale membranei celulare prin funciile lor, la cele prezentate mai sus
(Fig. 3.5) adugm prezentarea unor fenomene care se completeaz reciproc în
interesul bunei funcionri a celulei, exemplificând colaborarea dintre diveri
transportori la nivelul celulelor intestinale absorbante denumite enterocite (Fig. 3.9).
Enterocitele sunt celulele responsabile de preluarea din hrana digerat a
compuilor biochimici utili rezultai (între alii glucoza). Aceste celule formeaz
epiteliul simplu columnar care delimiteaz lumenul intestinal. Enterocitele sunt
celule polarizate, adic celule ale cror membrane au organizare molecular (cel
puin ca tipuri de proteine) diferit la nivelul lumenului intestinal (pol apical, unde
suprafaa membranei este mult sporit prin structurarea unor digitaii numite
microvili), fa de zonele dinspre esuturi (pol latero-bazal).

Fig. 3.9. Cooperarea proceselor de transport


activ (transport activ secundar, respectiv
transport activ primar) i pasiv la nivelul
enterocitului. La nivelul membranei apicale se
afl transportorul simport pentru glucoz i sodiu
(SGLT) care faciliteaz preluarea glucozei prin
transport activ secundar pe baza disiprii
gradientului ionilor de sodiu. Glucoza, astfel
introdus în citosolul enterocitului, este eliminat în
spaiul interstiial subepitelial, printr-un uniport de
glucoz (GLUT) aflat în membrana latero-bazal,
care efectueaz transport pasiv (concentraia de
glucoz absorbit din lumenul intestinal creeaz
un gradient al monozaharidului, care este mai
abundent în citosol, decât în spaiul bazal). Sodiul
preluat din lumenul intestinal, aparent din
considerente energetice impuse de activitatea
antiportului SGLT, este eliminat activ din enterocit
tot în spaiul subepitelial prin aciunea pompei de
sodiu i potasiu. Asta înseamn c fenomenele
asigur preluarea concomitent a glucozei i
sodiului din alimentaie. N.B. Sgeata cu
traiectorie întoars, îndreptat dinspre glucoz
ctre zona jonciunilor ocludente, semnific faptul
c pe acolo monozaharidul nu poate s treac (ca
de altfel nici alte substane, în afar de unii ioni,
acetia cu mari restricii). © Mircea Leabu, 2014.

86
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Aadar, membrana apical conine, cel puin în parte, o serie de proteine care
nu sunt localizate în membranele lateral, respectiv bazal, ca de altfel i reciproc
(anumite proteine nu se gsesc decât în membranele latero-bazale). De menionat c
celula controleaz eficient aceast polarizare, chiar din momentul biogenezei acestor
domenii de membran (apical, respectiv latero-bazal) i este ajutat în meninerea
acestui caracter polarizat prin jonciunile ocludente pe care le organizeaz.
Care sunt procesele care coopereaz în asigurarea funciei enterocitului în
contextul exemplului nostru? La nivelul membranei apicale se afl transportorul
simport SGLT1, care introduce glucoza în citosolul enterocitului, alturi de 2 ioni Na+
prin mecanismul de transport activ secundar, prezentat anterior la seciunea 3.2.1.1.
Transportul pasiv. Acest proces de transport are o parte bun (preluarea glucozei
i sodiului din alimente), dar i una periculoas (introducerea de Na+ în exces în
citosolul enterocitelor, ceea ce ar afecta potenialul membranar). Glucoza, preluat
prin activitatea SGLT1, este mai departe expulzat în spaiul subepitelial de
transportorul uniport GLUT2 aflat în membrana latero-bazal, pentru a fi predat
circulaiei sanguine i transportat acolo unde organismul are nevoie de ea. De
excesul de Na+ se ocup pompa de Na+/K+ aflat tot în membrana latero-bazal a
enterocitului, care eliminând 3 ioni de Na+ din enterocit i introducând 2 ioni K+ în
celul asigur meninerea homeostaziei ionice intracelulare, ca i potenialul
membranar în limite normale. Prin aceste cooperri ale transportorilor din
membranele apical, respectiv latero-bazal ale enterocitului se asigur preluarea
glucozei din intestin chiar împotriva gradientului de concentraie, ceea ce conduce la
creterea concentraiei de glucoz în citosolul enterocitului, cretere care asigur
funcionarea transportorului pasiv GLUT2, deoarece concentraia glucozei în
interstiiul peretelui intestinal este mai mic decât în enterocit, dar se asigur i
meninerea homeostaziei Na+ în enterocit, deoarece ceea ce introduce simportul
SGLT1 este compensat de expulzarea efectuat de pompa Na+/K+.
Încheiem discuiile referitoare la transportul activ prin membran, amintind
de o clas de transportori cu deosebit semnificaie fiziologic i, mai larg, medical,
cunoscui sub denumirea de transportori ABC (cu ABC de la ATP-Binding
Casette). Semnificaia fiziologic i medical a acestor transportori activi rezid în
faptul c induc rezisten multipl la medicamente („multidrug-resistance”), fiind
capabili s elimine din celule o multitudine de compui cu utilitate terapeutic,
indiferent de modul prin care acetia pot ptrunde în celula int. Se gsesc atât la
procariote, cât i la eucariote. La procariote, transportorii ABC permit adaptare i
rezisten la antibiotice. La eucariote, menirea lor principal este aceea de a elimina
substane inutile, toxice. De menionat c transportorii ABC sunt principalii
responsabili de inducerea rezistenei celulelor canceroase la chimioterapie [40, 31].
Transportorii ABC sunt de o mare diversitate i au capacitatea de a transporta
o mare varietate de substane plecând de la ioni, glucide, aminoacizi, vitamine,
lipide, antibiotice i medicamente (inclusiv xenobiotice) i ajungând pân la
oligozaharide, oligopeptide sau chiar proteine cu mas molecular mare [40-44]. În
ciuda acestei mari diversiti de tipuri, se pstreaz câteva reguli în organizarea
structurilor proteice transmembranare care reprezint transportorii ABC. În funcie
de modul în care sunt respectate aceste reguli, transportorii ABC se pot împri în: (i)
sisteme importatoare mici, la care fiecare element de organizare structural este
asigurat de un alt polipeptid; (ii) sisteme importatoare mari, la care organizarea
implic dou subuniti proteice identice (homodimeri) sau diferite (heterodimeri);
(iii) sisteme exportatoare organizate ca dimeri (numite i hemi-transportori, half-
transporter în englez) sau ca monomeri (numite i transportori întregi, full-length
transporter) [38, 41]. La om sunt identificate aproape 50 de tipuri de transportori
ABC [44].

87
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3. 10. Organizarea pe dome-


nii a transportorilor ABC. Este
prezentat organizarea unui sis-
tem importator mare, cu dou sub-
uniti. Cele 12 domenii trans-
membranare (câte 6 pentru fiecare
subunitate), notate TMD, asigur
structurarea V-ului care, prin ori-
entarea deschiderii ctre citosol,
respectiv ctre suprafaa membra-
nei, asigur funcionalitatea trans-
portorului. Orientarea deschiderii
în V este dependent de legarea
ATP pe endodomeniile celor dou
subuniti notate cu NBD. În apo-
ziie cu ectodomeniile subunitilor
transportoare este prezent unita-
tea de legare a solutului (SBD).
Sgeile verzi, mediene din dese-
nul complexului proteic, arat
direcia de micare a moleculei
transportate. © Mircea Leabu,
2014.

În încercarea de a înelege cum funcioneaz transportorii ABC s detaliem,


într-o oarecare msur, modul cum sunt ei structurai i organizai la nivelul
membranei (Fig. 3.10). Toate cele trei tipuri de sisteme de transportori ABC conin
domenii transmembranare (notate abreviat cu TMD, de la TransMembrane
Domains) care realizeaz canalul prin care trece compusul transportat i domenii
de legare a nucleotidelor (abreviat NBD, de la Nucleotide-Binding Domains),
pe faa citosolic a membranei, cu rol în legarea i hidrolizarea catalitic a ATP.
Alturi de aceste domenii, sistemele importatoare mai conin domenii de legare a
soluilor transportai (abreviat SBD, de la Solute-Binding Domains), pe faa
extern a membranei, cu rol în preluarea i transferarea compusului transportat
ctre TMD [38]. Complexele proteice funcionale conin dou TMD miez, a cror
asociere sub forma unui V rsturnat (adic având deschiderea ctre citosol)
determin formarea canalului de transport a solutului i dou NBD care leag dou
molecule de ATP i le poziioneaz în vecintate, dar antiparalel [38, 41].
De regul, sistemele importatoare mici au fiecare dintre domeniile menionate
formate din polipeptide independente ce se asociaz conducând la formarea
complexului funcional [38, 41]. Sistemele importatoare mari i sistemele
exportatoare sunt formate fie din dou subuniti (formând complexe homo- sau
hetero-dimerice la hemi-transportori), fie dintr-o singur protein (la transportorii
întregi). La hemi-transportori cele dou subuniti structureaz pe baza aceluiai lan
polipeptidic atât un TMD, cât i un NBD, iar la transportorii întregi se structureaz în
prima jumtate a lanului polipeptidic un TMD i un NBD, iar în cea de-a doua
jumtate a lanului a doua pereche TMD, NBD. TMD miez respect regula organizrii
cu 6 segmente transmembranare în D-helix, dei exist i sisteme care au TMD
format din numai 5 segmente transmembranare sau altele care au 10 segmente
transmembranare pentru fiecare TMD [38]. La transportorii cu mai mult de 6
segmente transmembranare pe TMD exist dovezi experimentale care sugereaz
rolul segmentelor suplimentare în reglarea i modularea funciei.
Cum funcioneaz aceste complexe transmembranare în procesul de
transport? Mecanismul de aciune presupune modificri ciclice ale conformaiei i

88
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

poziiei relative a celor dou TMD datorate hidrolizei ATP legat la nivelul NBD [38,
41]. Etapele ciclului de transport pentru sistemele importatoare sunt:
1. Legarea i acostarea la nivelul complexului transportor a solutului, prin SBD;
2. Legarea ATP la NBD i adoptarea conformaiei acestor domenii care s plaseze
în poziie antiparalel cele dou molecule de nucleotid;
3. Modificarea poziiei TMD i inversarea deschiderii V ctre suprafaa
membranei, datorit interaciunilor de la nivelul NBD ocupate de ATP;
4. Avansarea solutului în profunzimea deschiderii V a celor dou TMD;
5. Hidrolizarea ATP cu eliberarea de pe NBD a ADP rezultat i inversarea
deschiderii V a TMD cu eliberarea solutului în citosol, ceea ce readuce
conformaia complexului la cea iniial, capabil s intre într-un ciclu nou.
Ciclul de aciune pentru sistemele exportatoare are un numr mai mic de etape:
1. Intrarea solutului în adâncitura V a TMD;
2. Legarea ATP pe endodomenii i interaciunea dintre cele dou NBD pentru
aezarea antiparalel a moleculelor de nucleotid;
3. Modificarea poziiei TMD cu inversarea deschiderii V i eliberarea solutului în
spaiul extracelular;
4. Hidrolizarea ATP i inversarea deschiderii V, cu formarea conformaiei iniiale
a complexului transportor.
În cele mai bine de trei decenii de când au fost identificai, transportorii ABC au
reprezentat biostructuri membranare pentru care interesul tiinific a fost în
permanent cretere. Suntem departe de a cunoate suficiente detalii legate de
funcionarea acestora, care s ne permit s îi exploatm eficient în medicin.
Transportorii ABC rmân mai departe structuri ale membranei celulare de mare i
acut interes pentru ceea ce numim medicin translaional, adic acele cercetri din
bio-medicin care s duc la o cât mai eficient aplicare a rezultatelor în clinic.

3.2.3. Transportul cu membran


Transportul cu membran este dependent fie de capacitatea unor
microdomenii membranare de a se invagina sub forma unor vezicule, urmat de
desprinderea (fisionarea) membranei lor de cea la nivelul creia se formeaz i
introducerea în celul a substanelor captate în volumul veziculei, fie de capacitatea
endomembranelor veziculelor/vacuolelor de secreie de a fuziona cu membrana
celular i eliberarea în spaiul extracelular a substanelor din interior. Transportul
cu membran permite celulelor s fac schimb de substan cu exteriorul, ca i
transportul prin membran detaliat în subcapitolul anterior, dar folosind mecanisme
diferite, care implic nu doar proteinele membranare, ci microdomenii membranare
(adic poriuni de membran ce solidarizeaz structural i funcional anumite
lipide/glicolipide i anumite proteine/glicoproteine cu scopul de a le facilita
funcionarea împreun).
În funcie de sensul în care se efectueaz, transportul cu membran se împarte
în trei tipuri:
1. Endocitoz, atunci când componentele transportate sunt preluate din exterior
i introduse în celul;
2. Exocitoz, prin care se elimin componente din interiorul celulelor în afara
lor;
3. Transcitoz, care este specific celulelor ce organizeaz epitelii unistratificate
i presupune preluarea de substane din exteriorul celulei pe una din feele
epiteliului (la polul apical, adic din lumenul delimitat de epiteliu, sau la polul
latero-bazal, adic din spaiul interstiial subepitelial), transportarea lor dintr-o

89
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

parte în cealalt a celulei epiteliale i eliminarea materialului transportat trans-


epitelial în exteriorul celulei, pe cealalt fa a epiteliului.
3.2.3.1. Endocitoza
Procesele de preluare de substan de ctre celul din spaiul extracelular se
pot clasifica în funcie de caracteristicile fizico-chimice ale materialelor endocitate
sau în funcie de mecanismele prin care se desfoar.
În funcie de caracteristicile materialelor preluate de celul, endocitoza se
împarte în dou categorii:
1. Fagocitoz (de la termenii greceti  – a mânca + ky – vas,
recipient, celul + 
 – sufix pentru proces, fenomen), atunci când sunt
endocitate materiale particulate (de exemplu bacterii, fragmente celulare,
virusuri), adic celula mnânc.
2. Pinocitoz (de la termenii greceti  – a bea + ky – vas, recipient,
celul + 
 – sufix pentru proces, fenomen), când sunt endocitate substane
solubilizate în fluidul extracelular, adic celula bea.
Diferena între cele dou tipuri de endocitoz nu const numai în tipul de
material transportat în celul, ci i în mecanismele prin care acestea se desfoar,
chiar dac nu mecanismele au reprezentat criteriul pentru clasificare.
Fagocitoza a fost descris cu mai bine de un secol în urm de Ilia Iliici
Mechinikov4 în 1882, iar denumirea ei a aprut pentru prima dat într-un articol al
acestuia din 1884. O scurt istorie a evoluiei cunotinelor despre fagocitoz este
prezentat într-un relativ recent articol de sintez [45]. Subtilitile fenomenului de
fagocitoz sunt departe de a fi pe deplin elucidate. Ceea ce se întâmpl de regul,
chiar dac exist variaii ale mecanismelor, pare a fi general valabil (Fig. 3. 11). Dei
fenomenele care se petrec în timpul proceselor de fagocitoz sunt complexe i
deosebit de bine controlate de celul, ele se pot sistematiza prin câteva consideraii
de principiu. Procesul presupune capacitatea membranei celulei fagocitare de a
recunoate particula de endocitat, prin proteine membranare destinate, ceea ce
declaneaz fenomene care implic atât alte componente ale membranei, cât i
elemente din citosol. Fagocitoza presupune extinderea de pseudopode (prelungiri
citoplasmatice delimitate de domenii de membran a cror dinamic este controlat
de rearanjri ale citoscheletului de actin) de-a lungul particulei care urmeaz s fie
endocitat. În acest proces rolul filamentelor de actin este acela de a antrena, din
interiorul celulei, membrana pentru formarea prelungirilor care învluie particula de
endocitat prin formarea a ceea ce se numete cup fagocitar sau cup de
fagocitare.
La nivelul membranei sunt implicai receptorii de fagocitare care se ataeaz
de componente de pe suprafaa particulei care urmeaz a fi endocitat, componente
care se numesc opsonine. De regul aceste componente sunt anticorpi care
recunosc proteine ale suprafeei structurii fagocitate. Aceast decorare a particulelor
fagocitate cu anticorpi poart denumirea de opsonizare. În momentul în care
particula fagocitat este complet îmbrcat de prelungirile celulei care fagociteaz,
membrana fuzioneaz i particula este inclus într-o vacuol, în interiorul celulei
fagocitante. Vacuola poart denumirea de endozom, în general, sau fagozom în cazul
particular al fagocitozei. Fagozomul fuzioneaz ulterior cu lizozomul, componenta
fagocitat este digerat, iar elementele biochimice rezultate sunt utilizate de celula
fagocitar. De menionat c organismul este dispus i la „pierderi”; în cile aeriene,
macrofage tisulare migreaz în spaiile echivalente exteriorului organismului, cur
sacii alveolari i traiectele respiratorii de materialele insolubile i sunt expectorate.

4Ilia Iliici Mecinikov este laureat al Premiului Nobel în fiziologie sau medicin în 1908, premiul fiind împrit cu
Paul Ehrlich. Motivaia juriului a fost: „in recognition of their work on immunity”.

90
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3. 11. Evenimente celulare ce se petrec în fenomenul de fagocitare a unei bacterii. A.


Detalii moleculare asupra iniierii fenomenului: 1 – Fenomenul de opsonizare se petrece prin legarea
de anticorpi (ac) de proteine expuse la suprafaa bacteriei (ag), ducând la învelirea ei în domenii Fc
cu receptori pe suprafaa macrofagelor. 2 – Bacteria opsonizat este recunoscut de macrofage, prin
receptorii pentru Fc (RFc), fiind fixat pe suprafaa celulelor destinate s curee organismul de
invadatori. Dup primele interaciuni, ali RFc sunt mobilizai ctre locul de fixare a bacteriei pentru a
spori interaciunile. 3 – Prin interaciunile dintre RFc i opsoninele de la suprafaa bacteriei, începe
emiterea prelungirilor citoplasmatice (pseudopode) ale macrofagului cu iniierea formrii cupei de
fagocitare, la care particip filamente de actin prin dinamicitatea lor. B. Continuarea procesului în
contextul întregii celule. 1 – Procesele iniiate conform celor prezentate detaliat continu cu
definitivarea formrii cupei fagocitare în care este înglobat bacteria. 2 – În final, prelungirile
citoplasmei ajung s conflueze, iar bacteria este internalizat într-o structur delimitat de membran
numit fagozom, care este direcionat ctre lizozomi, unde are loc degradarea tuturor materialelor
care formeaz celula procariot, iar compuii de baz (aminoacizi, glucide, nucleotide etc.) eliberai
prin digestie sunt folosii de celula fagocitar pentru propriul metabolism. © Mircea Leabu, 2014.

Fenomenele prezentate mai sus succint, principial sunt în realitate mult mai
complexe. Ele implic pe de o parte fluidizarea membranelor pentru facilitarea
relocaiei receptorilor la opsonine (adic la imunoglobuline, prin legarea la domeniile
Fc ale acestora), ca i depolarizri ale membranelor prin activarea unor canale de
calciu care modific tranzitoriu potenialul de membran pentru receptori (canale
sensibile la o multitudine de stimuli [46]), alturi de activri de kinaze pentru
fosfoinozitide [47, 48]. Toate aceste componente se implic în facilitarea formrii
cupei de fagocitoz i realizarea procesului de endocitare a bacteriilor. Fagocitoza
este un fenomen specific proceselor vitale de aprare/curare a esuturilor de
materiale insolubile periculoase (de exemplu în procese imune anti-bacteriene) sau
de prisos (în cazul currii corpilor apoptotici). Cum ceea ce este fagocitat ajunge s
91
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

fie degradat în lizozomi i refolosit de celul, putem spune c fagocitoza este o


exprimare în lumea vie a legii conservrii materiei: ”În natur nimic nu se pierde,
nimic nu se creeaz, totul se transform”, învat la chimie, în contextul legii
conservrii masei, lege datorat lui Antoine-Laurent de Lavoisier care a postulat-o în
cartea sa Traité élémentaire de chimie, publicat în 1789, dar anticipat de
Mihail Vasilievici Lomonosov care, într-o scrisoare ctre Leonhard Euler din 5 iulie
1748, a stipulat: ”Orice schimbare în natur are loc astfel încât atâta cât se ia dintr-un
corp, atâta se adaug altuia. Astfel, dac o cantitate de materie descrete într-un loc,
ea crete altundeva.”
Fagocitoza este un fenomen specific unor anumite tipuri de celule din
organism cum sunt macrofagele, dar i polimorfonuclearelor, numite i microfage.
De menionat c pentru moartea celular programat, corpii apoptotici care se
formeaz declaneaz procesul de fagocitoz la celulele din jur, fr ca acestea s fie
neaprat macrofage profesioniste, ducând la o curare a esutului, fr a se produce
inflamaii [49, 50]. Dei fenomenele care se petrec sunt principial asemntoare, la
nivel molecular exist diferene semnificative [51]. Atragerea macrofagelor, respectiv
activarea pentru fagocitoz a celulelor înconjurtoare (neprofesioniste în fagocitoz)
este determinat de factori chemotactici eliberai de celulele intrate în apoptoz (de
exemplu lizofosfatidilcolinele sau sfingozin 1-fosfatul, derivat al echivalentului
acidului fosfatidic din categoria sfingolipidelor, care rmâne fr acidul gras amidat).
Fagocitoza propriu-zis (formarea cupei fagocitare) este declanat de prezena la
suprafaa corpilor apoptotici a fosfatidilserinelor, ”flopate”5 din foia intern a
bistratului lipidic membranar în momentele de iniiere a apoptozei i care acioneaz
ca semnale denumite sugestiv (chiar metaforic) ”mnânc-m”. Aceasta în linii mari,
deoarece i în acest caz al fagocitrii corpilor apoptotici mecanismele sunt mai
complexe i implic participarea i a altor componente membranare care sunt
exprimate de celula curitoare în momentele eseniale.
Pinocitoza, adic endocitoza de compui macromoleculari solubilizai, pare
a fi mult mai divers din punctul de vedere al mecanismelor prin care se realizeaz.
De aceea, se definesc mai multe tipuri de pinocitoz, pe baza mecanismelor prin care
se efectueaz.
O prim form este pinocitoza constitutiv. Aceasta presupune preluarea
în vezicule de endocitoz a unor volume de lichid extracelular, cu tot ce conine
acesta solubilizat, printr-un proces ce se desfoar de la sine, continuu, asemenea
unui act reflex, cum ar fi respiraia organismului. Evident, printr-un asemenea
proces, cantitile de substane endocitate sunt proporionale cu concentraiile în
care acestea se afl în mediul extracelular. Referitor la intensitatea cu care se
desfoar pinocitoza constitutiv, putem s gândim c aceasta poate fi modulat de
celul în conformitate cu nevoile ei concrete, fr a exista în momentul de fa dovezi
experimentale în aceast direcie i fr s se schimbe caracterul ei constitutiv, dac
aceast modulare a frecvenei s-ar întâmpla.
O a doua form este pinocitoza mediat de receptori, numit mai uzual
endocitoz mediat de receptori, cum vom face i noi pe mai departe.
Termenul a fost introdus în 1976 de Joseph L. Goldstein i Michael S. Brown,6
preocupai de metabolizarea LDL (lipoproteinelor de densitate joas; prescurtarea
vine de la termenul englezesc Low Density Lipoprotein) i rolul acestor lipoproteine
în controlul i modularea colesterolemiei i în ateroscleroz [52]. Ei au descris
5 Aa cum la rsturnarea fosfolipidelor în membran, cu trecerea dintr-o foi a bistratului în cealalt, am preluat

termenul din limba englez ”flip-flop” fr ezitare, aici, numim ”flopare” trecerea fosfatidil-serinelor din foia
intern (unde este localizat în condiii normale) în cea extern a bistratului. Nu exist nici o temere de confuzie,
deoarece aceste cuvinte nu exist în limba român, dar nici alte cuvinte care s defineasc succint i sugestiv
procesele nu avem în lexic. Aadar, considerm justificate aceste preluri de termeni.
6 Joseph L. Goldstein i Michael S. Brown sunt laureai ai Premiului Nobel pentru fiziologie sau medicin în 1985,

iar motivaia juriului a fost: „for their discoveries concerning the regulation of cholesterol metabolism”.

92
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

preluarea LDL prin endocitoz mediat de receptori de ctre fibroblaste [53, 54].
Prin acest proces sunt internalizate de ctre celul proteine (liganzi) care mai întâi
sunt recunoscute i legate de receptori specifici expui la suprafaa membranei (Fig.
3. 12).

Fig. 3. 12. Endocitoza mediat de receptori: mecanism i ultrastructur. A. Unitatea de clatrin


(un heterodimer) conine un lan greu (subunitatea mare), reprezentat în verde închis i un lan uor
(subunitatea mic), în verde deschis. Heterodimerii clatrinei se asociaz în trischelioni care, prin
interaciuni reciproce, pot forma ochiuri hexagonale sau pentagonale, prin jocul dintre acestea
realizându-se cuca de clatrin a unei vezicule de endocitoz mediat de receptori. Asocierea
trischelionilor la endodomeniile receptorilor ce internalizeaz liganzii se face prin intermediul unor
proteine adaptoare (AP), în cazul prezentat AP2. B. Dinamica procesului de endocitoz mediat de
receptori. Dup interaciunea cu liganzii, receptorii sunt adunai în structuri cu înveli de clatrin de la
nivelul membranei, având loc un fenomen de nucleaie. Zona de nucleaie se constituie ca
microdomeniu care concentreaz receptorii purttori de liganzi, conducând la sporirea ariei acoperite
cu clatrin i la adâncirea poriunii de membran din ce în ce mai puternic, datorit organizrii cutii
de clatrin. În final, poriunea de membran capt o form sferic, se desprinde de membran i îi
pierde înveliul de clatrin (aceasta i proteinele adaptoare reciclându-se). Vezicula fr clatrin se
transform în endozom timpuriu. C. Imagini de microscopie electronic de transmisie, tehnica de
îngheare-fracturare-sublimare, aezate sugestiv în relaie cu evenimentele prezentate în B, prin care
se evideniaz creterea cutii de clatrin. D. Imagini ale structurilor cu înveli de clatrin, aa cum se
pot vedea în microscopie electronic de transmisie, tehnica standard. © Mircea Leabu, 2014.

93
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Dup ce receptorul interacioneaz cu ligandul, complexele receptor-ligand


sunt adunate în adâncituri ale membranei tapetate pe faa intern cu un complex de
endoproteine a crui component de baz este clatrina [55]. Clatrina este un
heterodimer cu un lan greu i un lan uor, fiind capabil s se autoasocieze în
structuri ternare numite trischelioni (Fig. 3.12, A).
Microdomeniile adâncite ale membranei învelite cu clatrin sunt denumite
structuri cu înveli (în englez, „coated pits”). Acestea se formeaz permanent,
aglomerând fie receptorii în ateptarea liganzilor, fie complexele ligand-receptor,
dup formare. Pe msur ce receptorii expui la suprafaa celulelor sau complexele
receptor-ligand se aglomereaz în microdomeniul corespunztor al membranei, iar
înveliul de clatrin se formeaz, adâncitura membranei crete pân la definitivarea
formei sale sferice i desprinderea de membrana la nivelul creia s-a format, sub
forma unei vezicule cu înveli. Rolul clatrinei este acela de a aglomera complexele
ligand-receptor în zona membranar destinat endocitrii (pentru unii dintre
receptori), de a controla adâncirea microdomeniului membranar, care devine
structur cu înveli i de a definitiva formarea veziculei cu înveli. Acest rol are la
baz capacitatea clatrinei de a se asambla în trischelioni [56, 57], care mai departe
pot forma ochiuri hexagonale i pentagonale într-o geometrie asemntoare peticelor
mingii de fotbal, care duc la formarea veziculei. Formarea trischelionilor i
înreelarea acestora se realizeaz prin participarea unor molecule proteice ajuttoare,
numite proteine adaptoare, prescurtat AP (de la numele englezesc Adaptor
Protein). Proteinele adaptoare sunt complexe heterotetramerice formate din dou
subuniti mari (D i E de ~100kDa) i dou subuniti mai mici (P i V, de ~50kDa,
respectiv ~19kDa). Au fost identificate patru tipuri de AP, notate de la AP1 la AP4.
Subunitile sunt notate la rândul lor cu D1 – D4, E1 – E4, P1 – P4, respectiv V1 – V4.
Maleabilitatea complexelor AP este conferit de organizarea lor, având un corp cu
dou urechi i elemente balama care le conexeaz (Fig. 3.12, A). Înveliul de clatrin
al veziculelor de endocitoz mediat de receptor se dezasambleaz imediat dup
desprinderea veziculei de membrana celular, iar structura membranar devine
endozom timpuriu. La nivelul endozomului au loc diverse fenomene de sortare a
ceea ce a fost internalizat pentru a fi direcionat, difereniat, mai departe. Una dintre
cile de direcionare o reprezint calea lizozomal, prin fuzionarea cu organitul
preexistent în celul.
Analizând dinamica procesului de endocitoz mediat de receptori, deducem
c acest tip de transport cu membran este unul care se caracterizeaz prin
concentrarea componentei endocitate, ceea ce o deosebete de pinocitoza
constitutiv. Ligandul este introdus în celul la o concentraie mai mare decât cea în
care el se afl în mediu. Aceast caracteristic se datoreaz faptului c, înainte de a fi
endocitat, ligandul este acumulat i concentrat la nivelul structurii cu înveli prin
complexele receptor-ligand. Endocitoza mediat de receptori a fost descris pentru
unele lipoproteine plasmatice, pentru transferin sau pentru unii factori de cretere.
Destinaia materialului endocitat prin medierea receptorilor este diferit,
fenomenele de sortare de la nivelul endozomilor timpurii fiind eseniale în destinul
materialului endocitat. LDL se elibereaz în endozom, sub aciunea pH-ului acid i
este direcionat ctre lizozomi, în timp ce receptorul este reciclat la suprafaa celulei
pentru un nou ciclu de endocitoz. Sub aciunea aceluiai mediu acid din endozom,
transferina pierde fierul, iar eliberarea ionului metalic face proteina s rmân
ataat de receptor, ca apotransferin. Întoars ca apotransferin la suprafaa celulei,
unde gsete un pH neutru, se desprinde de receptor pentru a reintra într-un nou
ciclu de transport al fierului. Reciclarea receptorului la LDL i a complexului
receptor-transferin se face prin intrarea lor în apendice tubulare ale endozomilor
timpurii. Procesele de aglomerare i sortare din endocitoza mediat de receptori sunt
riguros reglate de celul. În aceste fenomene de reglare particip i ubiquitina (vezi i
94
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

CASETA 3.2) care conjug receptorii prin ceea ce se numete mono-ubiquitinilare


sau multi-ubiquitinilare (mai multe ubiquitine ataate în poziii diferite ale lanului
polipeptidic), acestea fiind diferite de fenomenul de poli-ubiquitinilare a proteinelor
citosolice care urmeaz s fie degradate în proteazomi (organite nedelimitate de
endomembrane specializate în degradarea proteinelor citosolice nefuncionale).
Merit reinute aceste funcii diferite ale ubiquitinei în celul bazate pe mecanisme
difereniate sensibil.
Relativ recent a fost evideniat i o a treia form de pinocitoz, tot mediat de
receptori, dar pentru molecule mici. Acest proces de transport membranar a fost
denumit potocitoz (de la termenii greceti  – a bea + ky – vas, recipient,
celul + 
 – sufix pentru proces, fenomen). Ca i pinocitoza constitutiv,
potocitoza se efectueaz prin intermediul caveolelor, invaginri ale membranei
organizate prin implicarea caveolinei (Fig. 3.13). Potocitoza a fost evideniat prima
dat pentru acidul folic i denumit astfel în 1992 de Richard G. W. Anderson [58,
59]. Procesul de potocitoz, dup legarea moleculelor mici la receptori (ectoproteine
cu ancor glicofosfatidilinozitolic [60]) i sechestrarea lor în caveole, pentru a fi
astfel transportate, permite trecerea liganzilor direct în citoplasm prin anumite
canale din membrana caveolar. Aceste canale se deschid în momentul în care
caveolele îi închid comunicarea cu exteriorul. În momentul de fa, Anderson i ali
cercettori care studiaz funciile caveolelor încearc s extind procesul de
potocitoz la toate fenomenele de transport care sunt efectuate de caveole prin
evitarea cii ctre lizozom [61].
Exist în prezent o preocupare susinut pentru înelegerea la nivel molecular
a diverselor forme de pinocitoz ceea ce a condus la o clasificare a lor în endocitoz
dependent de clatrin i endocitoz independent de clatrin (ceea ce
înseamn o difereniere la nivelul mecanismelor ce erau incluse în pinocitoza
constitutiv) [62, 63]. La rândul ei endocitoza independent de clatrin poate fi
endocitoz dependent de caveolin sau endocitoz independent de
caveolin, dar dependent de alte tipuri de proteine care s asigure invaginarea i
desprinderea veziculelor de membran. Dac majoritatea tipurilor de endocitoz
sunt efectuate de structuri veziculare, au fost evideniate i procese de endocitoz ce
implic invaginri membranare sub forma de structuri tubulare [62, 63].
Departe de a fi doar o cale de a prelua materie din spaiul extracelular,
endocitoza este un fenomen care permite celulei s controleze funciile membranei,
prin modularea componentelor acesteia [62, 64].

Fig. 3.13. Aspectul caveolelor în imagini de


microscopie electronic de transmisie. Fr
investigaii specifice nu se pot face diferenieri
între caveolele implicate în pinocitoz con-
stitutiv, potocitoz sau transcitoz (exist do-
vezi experimentale cum c procesele pot implica
aceleai caveole, cu sortarea i direcionarea
ulterioar, în endozomi). © Mircea Leabu, 2014.

95
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Prin endocitoz, celula poate ascunde componente ale organizrii membranei,


permiând reciclarea acestora în funcie de nevoile celulei sau le poate elimina
temporar degradându-le, pentru a le biosintetiza din nou i expune la suprafaa
celulei atunci când este cazul [65]. Aa se întâmpl cu o mare parte dintre
componentele implicate în semnalizarea celular (vezi mai jos), iar aceast realitate
este un alt exemplu de cooperare între fenomenele ce definesc cele dou mari roluri
ale membranei: schimbul de substan (transportul membranar) i schimbul de
informaie (semnalizarea celular). Endozomii care se formeaz dup desprinderea
de membran a structurilor de endocitoz asigur sortri ale componentelor
endocitate i chiar sunt implicai în continuarea proceselor de semnalizare [66].
3.2.3.2. Exocitoza
Procesul prin care celula elimin substane produse în diverse procese celulare
(inclusiv biosinteze de compui destinai secreiei) i acumulate temporar în structuri
delimitate de endomembrane numite vezicule sau vacuole de secreie poart numele
de exocitoz. Exocitoza este ultimul pas al unui proces celular complex, care implic
în cascad mai multe organite (ribozomi, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, sistem
endozomal), proces numit secreie celular. (Despre procesul de secreie celular
vom vorbi în volumul al II-lea, la capitolul ”Biogeneza i traficul intracelular al
membranelor”). Din punctul de vedere al mecanismelor prin care este controlat,
exocitoza poate fi constitutiv sau semnalizat. Aceasta înseamn c, pe de o parte,
unele produse destinate secreiei sunt eliminate din celul pe msur ce se formeaz
veziculele secretorii i acestea ajung la membrana celular unde are loc fuzionarea
membranelor i secreia, prin procese constitutive, care se desfoar de la sine. Pe
de alt parte, anumite componente produse în celul sunt acumulate i stocate în
zone juxtamembranare, pân când celula primete un semnal care comand secreia
lor. Aceast exocitoz semnalizat este dependent de creterea concentraiei de Ca2+
din citoplasm în zona de stocare a veziculelor de secreie [67]. Mecanismul
exocitozei (Fig. 3.14) presupune urmtoarele etape [68, 69]:
1. Transportul veziculelor (în englez „vesicle trafficking”) de secreie din
locul de formare în locul de stocare din apropierea membranei la nivelul creia
se face secreia. Acest transport este efectuat de aa-numitele motoare
moleculare (izoforme de miozin pentru transportul pe calea filamentelor de
actin, sau dynein ori kinezin pentru transportul pe calea microtubulilor);
2. Ancorarea veziculelor (în englez „vesicle tethering”) prin factori de
ancorare de natur proteic la o distan de ~25nm de membrana celular;
3. Acostarea veziculelor (în englez „vesicle docking”) la membrana celular,
adic aducerea acestora la o distan de 5 – 10nm (cât grosimea unei
membrane) între cele dou membrane (celular, respectiv vezicular);
4. Capacitarea veziculelor (în englez „vesicle priming”) care presupune o
serie de evenimente legate de rearanjrile dependente de ATP i de Ca2+ ale
proteinelor i lipidelor membranei veziculare, rearanjri necesare efecturii
ultimei etape. (În exocitoza constitutiv aceast etap se pare c nu exist.);
5. Fuzionarea veziculelor cu membrana celular i expulzarea produilor de
secreie [70]. Fuzionarea este realizat de nite proteine numite abreviat
SNARE (de la “Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein
REceptor”) care sunt v-SNARE (în membrana veziculelor) i t-SNARE (în
membrana int, cu t de la englezescul target). Trebuie menionat faptul c
interaciunile bazate pe complementaritatea v-SNARE/t-SNARE sunt
importante i pentru fenomenele care se petrec în etapele anterioare.
Ce se întâmpl cu membranele veziculelor de secreie pare a depinde de tipul
de exocitoz. La exocitoza constitutiv este acceptat c membranele poart, de

96
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

regul, componente noi pentru membrana celular, astfel încât acestea migreaz în
planul membranei int [71]. La exocitoza semnalizat (mai în detaliu investigat),
veziculele reintr în citosol fiind reciclate.

Fig. 3.14. Desfurarea procesului de exocitoz. A. În prima faz, dup ce vezicula de secreie a
fost direcionat ctre membrana pe unde se face exocitoza, are loc ancorarea la microdomeniul
specific. Acest fenomen este facilitat de nite proteine numite factori de ancorare, care sunt controlate
de proteine G mici (sunt definite la seciunea despre semnalizarea celular). B. Etapa urmtoare
implic interaciunile dintre partenerii veziculari i cei ai membranei int (v-SNARE i t-SNARE),
realizându-se acostarea. C. Interaciunile dintre v-SNARE i t-SNARE induc capacitarea membranei
veziculare în vederea deschiderii la nivelul porozomului, proces complex ce implic ioni de calciu
dehidratai. D. Deschiderea veziculei este însoit de expulzarea parial a materialului de exocitat,
dup care vezicula se reînchide revenind în citosol, proces care nu este prezentat în imagine.
Structurile albastre din interiorul veziculei de secreie reprezint componenta care contribuie la o bun
compactare a materialului de secreie. În anumite celule, aceast funcie de compactare revine unor
proteoglicani intraveziculari. Sgeile roii indic avansarea procesului. © Mircea Leabu, 2014.

97
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3. 15. Porozomi


în celulele pancrea-
sului exocrin (A, C,
D) i în neuroni (E,
F). A. Imagine de
microscopie de for
atomic (AFM) de la
polul apical al unei
celule acinare pan-
creatice vii, care evi-
deniaz prezena
adânciturii (sgeata
galben) cu poro-
zomi la nivelul ei
(sgeata bleu-gri). B.
Desen schematic re-
prezentând adâncituri
i cupe ale porozo-
milor, la care granule
de zimogen (ZG),
vezicule secretorii din
celulele pancreasului
exocrin, acosteaz i
fuzioneaz tranzitoriu
pentru a elibera en-
zime digestive din ce-
lul. C. Micrografie
AFM cu patru porozomi (unul indicat prin cap de sgeat, bleu-gri). Porozomii din membranele
celulelor pancreasului exocrin variaz în dimensiuni (între 100 i 180nm diametru). D. Aspectul în
microscopie electronic de transmisie al unui porozom din membrana apical (PM) a unei celule
acinare pancreatice. Este indicat membrana cu porozom (POM, cap de sgeat, în galben) asociat
membranei unei vezicule secretorii (ZGM). În insert, structura inelar (capete de sgeat, albastru)
care formeaz gâtul complexului porozomal. E. Imagine de microscopie electronic a unui porozom
neuronal (capetele de sgeat, în rou), asociate unei vezicule sinaptice (SV) din membrana
presinaptic (Pre-SM) dintr-o terminaie nervoas; abreviaia Post-SM din imagine indic membrana
postsinaptic. Este de observat o plomb central în complexul porozomal. F. O imagine
tridimensional AFM a unui porozom neuronal din membrana presinaptic într-o celul viabil.
Plomba central este evident (cap de sgeat, în rou). Porozomul neuronal este cu un ordin de
mrime mai mic (10-12nm diametru) fa de cel prezent în membrana celulelor pancreasului exocrin
(100-180nm diametru). (Imaginile au fost puse la dispoziie, cu generozitate, de Dr. Bahnu Jena,
George E. Palade University Professor, Department of Physiology, Wayne State University School of
Medicine and Director, NanoBioScience Institute, Detroit, Michigan, USA. Figura reprezint imagini
compozite publicate anterior în: Proc Natl Acad Sci USA. 94: 316-321 (1997); Biophys J. 85: 2035-
2043 (2003); Cell Biol Int. 28: 699-708 (2004); J Microscopy. 232: 106-111 (2008). ©Bhanu Jena)

98
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

În prezent exist un mare interes pentru înelegerea momentului final al


exocitozei, procesul de fuzionare a veziculelor secretorii cu membrana. Se pare c
fuzionarea (cel puin în unele tipuri de celule) se face la nivelul unor structuri
preexistente în membrana int, structuri care favorizeaz deschiderea veziculelor i
care au fost denumite porozomi [72-76], de unii autori, în timp ce alii opteaz
pentru sintagma pori de fuziune [77], care se formeaz în momentul interaciunii
intime a celor dou membrane, cea a veziculei, cu cea int. Indiferent de cum ar fi
denumite structurile care favorizeaz i faciliteaz fuzionarea veziculelor cu
membrana celular i expulzarea materialului de secretat, fenomenul de exocitoz se
petrece principial la fel, aa cum a fost prezentat mai sus (Fig. 3. 14).
Porozomii (Fig. 3.14 i Fig. 3.15) sunt complexe supramoleculare, lipido-
proteice, de la nivelul membranei, având fom de cup. La aceste complexe veziculele
de secreie acosteaz tranzitoriu pentru a fuziona cu membrana i a expulza o parte
din coninut, proces ce poate fi asemnat cu o erupie vulcanic. Vezicula se
reînchide i revine, parial golit, în citosol. Determinarea organizrii moleculare i a
dinamicii porozomilor la rezoluie nanometric i în timp real (adic pe celule vii),
izolarea lor, stabilirea compoziiei (atât proteine, cât i lipide), ca i reconstituirea
funcional a lor în bistraturi lipidice artificiale sunt etape experimentale care au fost
realizate i acestea recomand porozomii ca pori universale de secreie în celulele
specializate în acest fenomen.
Bhanu Jena, descoperitorul porozomului i cel care a propus denumirea, trece
dincolo de disputa porozom sau por de fuziune (disput pe care pare a o considera
caduc) i propune un posibil mecanism de aciune a acestei nanostructuri prezente
în membrana celulelor specializate în secreie. Prin acest mecanism, la baza
porozomului, în momentul eliberrii materialului secretat, se formeaz porul de
fuziune între membrana veziculei acostate i membrana celulei (vezi i legenda Fig.
3.15, d). Aadar, porozomii, care preexist în membrana int acioneaz prin
deschiderea unui por de fuziune. Mecanismul propus, nu numai c explic
fenomenele membranare care se petrec în procesul de exocitoz, dar este i o
pledoarie care ne arat c biologicul folosete la un nivel superior legile chimiei i
fizicii, exploatându-le în interesul fenomenelor ce constituie viul. Ceea ce se întâmpl
la nivelul porozomului, de exemplu crearea acelei tensiuni mecanice care contribuie
la formarea porului de fuziune, vine s demonstreze odat în plus c membrana
integreaz participarea componentelor biochimice în fenomenele complexe pe care
trebuie s le asigure celulei, folosind toate posibilitile chimice i fizice cu scopul
gsirii celor mai bune soluii pentru a face bine ceea ce are de fcut i pentru a
supravieui ea i angrenajul din care face parte. Aceast capacitate integrativ este
valabil pentru celul în ansamblul ei. Se vorbete deja în biologia celular despre
”ambiana social” a celulelor sau de integrare în contextul social al celulelor, iar
pentru toate acestea celulele au la suprafaa lor biocomponente care le ajut s fie
”buni membri ai societii”, prin organizare de elemente specializate în asemenea
funcii (de exemplu jonciuni celulare, pe care le vom aborda în volumul al II-lea al
crii, domenii sau microdomenii specializate ale membranelor).
Dup ce am prezentat fenomenele de transport cu membran prin care
celulele preiau, pentru propriile nevoi, substane din exterior (endocitoz) sau
elimin în exterior substane pentru a se ”comporta corect” fa de structura
biologic în care sunt angrenate sau chiar fa de întreg organismul (exocitoz), este
timpul s abordm i un comportament ”altruist” al celulelor, care implic transport
cu membran, adic procesul de transcitoz, prin care celulele mut dintr-o parte în
alta substane (între spaii pe care trebuie s le separe), pentru a le favoriza
ajungerea la locurile unde este nevoie de ele.

99
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.15. Vezicule de secreie acostate la complexele porozomului în membrana presinaptic a


unei terminaii nervoase. a. Imagine AFM a unei vezicule sinaptice (SV), obinut în suspensie,
acostat la complexul în form de cup al porozomului (P), pe faa citosolic a membranei
presinaptice. De observat diametrul de 35nm al SV acostate la complexul porozomului de 15nm. b.
Imagine de microscopie electronic (EM) evideniind asemntor o SV de 35nm acostat la
porozomul de 15nm din membrana presinaptic. De notat plomba central a porozomului, ce se
poate evidenia i prin EM. c. Confirmarea celor observate prin AFM i EM referitor la organizarea
porozomului, prin tehnica împrtierii la unghi mic a razelor X, în soluie (SAXS), care a permis
reconstrucia tridimensional a unei vezicule sinaptice (în violet) acostat la complexul porozomului
cu form de cup (în roz) din membrana presinaptic a unor sinaptozomi izolai. De remarcat c toate
tehnicile (AFM, EM i SAXS) duc la rezultate similare referitor la acostarea i interaciunea veziculei
sinaptice cu complexul porozomului, în neuroni. d. Desen care sistematizeaz un posibil mecanism al
implicrii porozomului (P) în acostarea veziculelor sinaptice la membrana presinaptic (PSM) i
eliberarea neurotransmitorului. Mecanismul implic cinci etape: 1. Vezicul acostat la complexul
porozomului. De notat braul (A) al plombei centrale (CP) care permite micarea vertical a acesteia,
pe direcia indicat de sgeata roie cu dou capete. Când baza plombei centrale (B) este împins
ctre interiorul veziculei, ca urmare a stimulrii, se formeaz o mic ridictur cu dimensiuni apropiate
de diametrul bazei plombei (aproximativ 3-4nm diametru). În consecin, membrana de la baza
porozomului, care formeaz ridictura de 3-4nm, este supus unei mari tensiuni conducând la o
strâns apropiere i contact cu foia citosolic a membranei veziculare, ceea ce favorizeaz
interaciunile v-SNARE/t-SNARE dup geometria unui inel sau rozete ducând la fuzionarea
membranelor, cu formarea unui por de fuziune i eliberarea neurotransmitorului (prezentat în etapa
notat cu 3 în figur). 4. Ulterior, prin retragerea plombei porozomale în poziia de repaus, tensiunea
dispare i are loc reînchiderea porului format tranzitoriu. 5. Vezicula implicat în proces se desprinde
de porozom i este recirculat, fiind reîncrcat prin intermediul transportorilor de neurotransmitor

100
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

3.2.3.3. Transcitoza
Dei privit simplist ar prea o însumare a endocitozei i exocitozei, lucrurile
nu sunt aa. Transcitoza este un proces al crui mecanism, chiar dac neelucidat în
momentul de fa, este departe de a însemna o endocitoz urmat de o exocitoz.
Termenul a fost introdus de Nicolae Simionescu în 1979 [78] privitor la trecerea prin
celulele endoteliale de macromolecule dinspre plasm ctre esut i invers, prin
structuri delimitate de membrane, numite la început, pentru celulele endoteliale
vezicule plasmalemale, ulterior fiind numite caveole în cazul tuturor tipurilor
celulare.

Fig. 3.16. Modificrile în procesul fisiunii membranare atrag creterea ultrastructurilor


neconvenionale de endocitoz/transcitoz, în celulele endoteliale din plmânul de oarece
care exprim un domeniu (SH3A) al intersectinei-1s. a1. Ultrastructura endoteliului este afectat
de modelarea experimental a exprimrii domeniului intersectinei-1s, astfel încât alturi de caveole,
componentele normale, apar unele elemente neconvenionale de transport cu membran: invaginri
cu structuri cu înveli de clatrin (asterisc în caseta delimitat de linia punctat alb), sau structuri
tubulare (casetele punctate în negru), coninând componenta de transportat (albumin seric marcat
cu aur coloidal). Elementele tubulare sunt mai bine evideniate în inserturile a1.1 i a1.2. a2. Alte
forme de structuri neconvenionale datorate aceleiai modulri a proteinei exprimate de celulele
endoteliale. Este vorba de ciorchini de caveole mari, nefireti (sgeata neagr i caseta delimitat de
linie punctat alb, respectiv insertul a2.1), coninând acelai compus transportat marcat cu aur
coloidal. Bare dimensionale: 200 nm (a1.1); 100 nm (a1 i a2); 50 nm (a1.2). Imagini de microscopie
electronic de transmisie puse cu amabilitate la dispoziie de Dr. Sanda Predescu, Department of
Pharmacology/Pulmonary and Critical Care Medicine, Rush University Medical Center, Chicago,
Illinois. © 2012. Dan N. Predescu et al. [81], articol cu acces liber, sub licena Creative Commons
Attribution.

___________________________________________________________________________________________________________________________________________

(Continuare legend Fig. 3.15)


(NTT) din membrana SV, pentru a fi gata în efectuarea unui nou ciclu de exocitoz (acostare,
fuzionare, expulzare de neurotransmitor). (Imaginile au fost realizate i puse la dispoziie, cu
generozitate, de Dr. Bahnu Jena, George E. Palade University Professor, Department of Physiology,
Wayne State University School of Medicine and Director, NanoBioScience Institute, Detroit, Michigan,
USA. Figura reprezint imagini compozite publicate anterior în: Cell Biol Int. 28:699-708 (2004) i
Micron. 56:37-43 (2014). ©Bhanu Jena)
____________________________________________________________________________________________________________________________

101
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Transcitoza este un proces specific celulelor ce formeaz epitelii simple


(monostratificate). Celulele endoteliale de la nivelul capilarelor sunt exemplul clasic
de celule care efectueaz transcitoz [79-81]. Studiul mecanismelor transcitozei la
nivelul endoteliului reprezint un domeniu de mare interes atât pentru cunoaterea
fenomenului normal, cât i în vederea modulrii sale, inclusiv pentru scopuri
terapeutice. Exist modaliti de afectare a procesului de transcitoz prin exprimarea
selectiv de proteine celulare care pot interfera cu fenomenele membranare care
însoesc transcitoza i contribuie la formarea unor structuri de transport nefireti
(Fig. 3.16).
Procesul transcitozei se petrece i la nivelul altor epitelii cum ar fi epiteliul
absorbant intestinal. Hepatocitele efectueaz i ele transcitoz pentru
dimeri/polimeri de IgA de la polul sanguin la polul biliar, unde sunt eliberai cu o
component secretorie, ectodomeniul receptorului implicat în transcitoz [82].
Imunoglobulina A astfel eliminat ajunge în bil i mai departe în tubul digestiv
unde au loc prime activiti de aprare imun legate de alimentaie. Exemplul
transportului trans-hepatocit al dimerilor de IgA reprezint dup toate dovezile o
transcitoz mediat de receptori [83]. De altfel, transportul prin transcitoz al
unor polimeri imunoglobulinici pare a fi o proprietate a tuturor epiteliilor simple ce
cptuesc organe cavitare, cu rol în iniierea aprrii imune înc din aceste spaii,
echivalente topologic cu exteriorul organismului. Spre exemplu, acest tip de
transcitoz a fost dovedit i pentru epiteliul uterin [84].
Celor interesai de noutile referitoare la transcitoz sub aspectul diversitii
epiteliilor la nivelul crora se petrece i asupra mecanismelor prin care se produce, le
recomandm un relativ recent articol de sintez scris de Pamela Tuma i Ann L.
Hubbard, de la Johns Hopkins University, Baltimore [85]. În acest articol se va vedea
c, dei transcitoza a fost definit ca proces specific celulelor epiteliale simple, ea se
petrece i în sisteme neepiteliale. De interes este i articolul de sintez redactat de
Aleksandr Treyer i Anne Müsch, de la Albert Einstein College of Medicine,
Department of Developmental and Molecular Biology, Bronx, New York, prezentând
detalii legate de anumite procese de transcitoz (unele surprinztoare) în hepatocite
[86], cu referire la unele implicaii patologice.

3.2.4. Consideraii finale asupra transportului membranar


Celula nu poate supravieui dac nu schimb substane cu mediul: preluarea
de produi utili metabolismului su i eliminarea de compui inutili, care ar putea
deveni toxici, sau de compui destinai cooperrii cu alte celule din organism
(compui destinai secreiei). Cum substanele care trebuie s ajung în celul, ca i
cele care trebuie s o prseasc, sunt de o mare diversitate (unele lipofile, altele
hidrofile, iar între acestea din urm putem vorbi de substane purttoare de sarcin
sau nu, ca i de molecule mici sau macromolecule), este firesc s înelegem c la
nivelul membranei se petrec mecanisme specifice, pentru a facilita celulei preluarea
sau eliminarea acestei mari diversiti de compui.
Aadar, o diversitate de tipuri de compui de transportat (iar dac ar fi s ne
gândim la diversitatea de entiti chimice de transportat, aceasta este i mai mare,
adic avem mai multe specii ionice, mai multe specii de molecule polare, mai multe
proteine etc.) atrage, fr doar i poate, o diversitate de fenomene responsabile de
transportul membranar. Cum avem de-a face cu o mare diversitate de fenomene de
apropiat, de îneles i, eventual, de însuit, cea mai comod modalitate de a acoperi
realizarea elului este clasificarea lor pe diverse criterii. Acest lucru l-am i fcut în
acest subcapitol legat de transportul membranar. Astfel, exist fenomene de
transport prin membran, în care substanele transportate strbat planul membranei
i exist fenomene de transport cu membran, prin care substanele transportate
sunt introduse în sau expulzate din celul prin structuri delimitate de membrane.
102
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fiecare dintre aceste dou mari tipuri de fenomene de transport membranar include,
la rândul su, multiple variante în funcie de caracteristicile fizico-chimice ale
substanelor transportate.
Între substanele care pot realiza transport prin membran, unele difuzeaz
relativ nestingherite prin bistrat (substanele liposolubile, dar i substane polare cu
mase moleculare sub 100Da), difuzând dinspre spaiul cu concentraie mare (fie el
citosol, fie exteriorul celular) ctre spaiul cu concentraie mic, ceea ce se numete
transport prin difuziune simpl.
Ionii i moleculele polare mai mari (pân în 800Da) au nevoie la trecerea prin
planul membranei de proteine ce organizeaz ci transmembranare de strbatere, iar
aceste elemente de transport sunt numite canale pentru ioni i transportori pentru
celelelate tipuri de molecule polare mici (adic glucide, aminoacizi, nucleotide etc).
Ca i la difuziunea simpl, i în acest caz, motorul transportului îl reprezint
diferenele de concentraie în care aceti compui se afl de o parte, respectiv de
cealalt a membranei. Deoarece transportul necesit proteine organizate
transmembranar, aceste modaliti de transport prin membran poart denumirea
de difuziune facilitat. Termenul difuziune, ca i în fizic, are semnificaia de micare
de la concentraie mare la concentraie mic, iar asta se face fr consum de energie.
În aceste situaii vorbim de transport pasiv, form de transport corespunztoare unei
clasificri fcute în funcie de energetica procesului. Când fenomenul de transport
necesit consum de energie, avem de-a face cu ceea ce numim transport activ. Nevoia
de consum de energie apare atunci când prin membran trebuie s fie transportate
componente împotriva gradientului de concentraie. Dac energia necesar trecerii
substanei prin membran se consum concomitent cu realizarea transportului,
atunci acesta este denumit transport activ primar, iar dac energia a fost consumat
anterior transportrii compusului de interes pentru celul, vorbim de transport activ
secundar.
Fenomenele de transport prin membran se pot clasifica i în funcie de
numrul de tipuri de substane transportate într-un ciclu al fenomenului. Dac se
transport un singur compus odat, atunci transportul este singular sau uniport.
Dac simultan sunt transportate cel puin dou tipuri de substane atunci vorbim de
transport cuplat sau co-transport. În sfârit, fenomenele de co-transport se clasific
la rândul lor în funcie de sensul în care se mic substanele ce trec simultan prin
membran, prin aceeai formaiune proteic transmembranar. Dac toate
substanele transportate în cadrul unui ciclu de activitate trec prin membran în
acelai sens, transportul este simport. Dac cel puin un compus transportat se mic
în sens opus celuilalt/celorlali, atunci vorbim de transport antiport.
Toate fenomenele de transport prin membran, identificate pân în prezent,
se pot asocia diferitelor categorii definite prin diversele tipuri de clasificri, menite s
uureze cunoaterea i înelegerea.
Prin diversitatea de tipuri de transport cu membran, celulele, pe de o parte,
îi completeaz nevoile de substane i/sau cur organismul i îl apr de ”intrui”
(cum se întâmpl prin procesele imune) sau de materiale rezultate din procese
fiziologice (apoptoz) sau patologice (resturi de celule necrozate), dar contribuie, pe
de alt parte i la buna organizare i/sau funcionare ale esuturilor, respectiv
organismului în ansamblul su. Pentru aceste scopuri, celulele i-au dezvoltat o
multitudine de tipuri de fenomene endocitotice prin care îi asigur capacitatea de a
prelua diverse componente macromoleculare (pinocitoza, potocitoz, endocitoz
mediat de receptori) sau materiale insolubile, cum ar fi bacterii, debriuri celulare
(fagocitoz). Mai mult, dincolo de grija pentru sine i responsabilitatea pentru
meninerea curat a organismului, implicarea unora dintre celule (cele care
organizeaz epitelii monostratificate ce cptuesc organe cavitare) în meninerea
bunei funcionri a esuturilor i a organismului în ansamblul su a necesitat

103
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

instituirea unor procese de transport de substan dintr-o parte în alta a spaiilor pe


care le separ, transcelular. Aceste procese care pot fi dependente sau nu de unii
receptori poart denumirea de transcitoz, care poate fi uneori transcitoz mediat
de receptori.
În sfârit, desfurarea normal a tuturor acestor procese de transport
membranar (prin membran, respectiv cu membran) contribuie la starea de
sntate a organismului. Multe patologii pot fi însoite sau determinate de dereglri
în desfurarea fenomenelor de transport membranar i, de aici, rezult interesul i
justificarea acestuia pentru cunoaterea în detaliu a proceselor i pentru gsirea de
soluii în vederea utilizrii terapeutice a lor. De mult vreme sunt cunoscute
modaliti terapeutice care exploateaz modularea funciei canalelor ionice sau a
pompelor (de exemplu în cardiologie). Dar nici fenomenele de transport cu
membran nu sunt de ignorat. Exist modelri experimentale din care rezult c
pinocitoza i transcitoza pot fi exploatate în interes terapeutic [87].

Bibliografie selectiv
1. Montel-Hagen A, Sitbon M, Taylor N. (2009) Erythroid glucose transporters. Curr Opin Hematol.
16: 165-172.
2. Uldry M, Thorens B. (2004) The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters. Pflugers
Arch. 447: 480-489.
3. Hou JC, Pessin JE. (2007) Ins (endocytosis) and outs (exocytosis) of GLUT4 trafficking. Curr Opin
Cell Biol. 19: 466-473.
4. Cheeseman C. (2008) GLUT7: a new intestinal facilitated hexose transporter. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 295: E238-E241.
5. Mavros Y, Simar D, Singh MA. (2009) Glucose Transporter-4 expression in monocytes: a systematic
review. Diabetes Res Clin Pract. 84: 123-131.
6. Wright EM, Turk E. (2004) The sodium/glucose cotransport family SLC5. Pflugers Arch. 447: 510-
518.
7. Wright EM, Hirayama BA, Loo DF. (2007) Active sugar transport in health and disease. J Intern
Med. 261: 32-43.
8. Williamson RC, Toye AM. (2008) Glycophorin A: Band 3 aid. Blood Cells Mol Dis. 41: 35-43.
9. Satchwell TJ, Shoemark DK, Sessions RB, Toye AM. (2009) Protein 4.2: a complex linker. Blood
Cells Mol Dis. 42: 201-210.
10. Alper SL. (1991) The band 3-related anion exchanger (AE) gene family. Annu Rev Physiol. 53: 549-
564.
11. Jay DG. (1996) Role of band 3 in homeostasis and cell shape. Cell. 86: 853-854.
12. Barzilai A, Rahamimoff H. (1987) Stoichiometry of the sodium-calcium exchanger in nerve
terminals. Biochemistry. 26: 6113-6118.
13. DiPolo R, Beaugé L. (2006) Sodium/calcium exchanger: influence of metabolic regulation on ion
carrier interactions. Physiol Rev. 86: 155-203.
14. Yang YC, Fann MJ, Chang WH, Tai LH, Jiang JH, Kao LS. (2010) Regulation of sodium-calcium
exchanger activity by creatine kinase under energy-compromised conditions. J Biol Chem. 285(36):
28275-28285. doi: 10.1074/jbc.M110.141424.
15. Ren X, Nicoll DA, Philipson KD. (2006) Helix packing of the cardiac Na+-Ca2+ exchanger:
proximity of transmembrane segments 1, 2, and 6. J Biol Chem. 281: 22808-22814.
16. Bers DM. (2000) Calcium fluxes involved in control of cardiac myocyte contraction. Circ Res. 87: 275-
281.
17. Engbers JD, Anderson D, Zamponi GW, Turner RW. (2013) Signal processing by T-type calcium
channel interactions in the cerebellum. Front Cell Neurosci. 7: 230. DOI: 10.3389/fncel.2013.00230.
18. Van Petegem F, Lobo PA, Ahern CA. (2012) Seeing the forest through the trees: towards a unified
view on physiological calcium regulation of voltage-gated sodium channels. Biophys J. 103(11): 2243-
2251. DOI: 10.1016/j.bpj.2012.10.020.
19. Catterall WA. (2012) Voltage-gated sodium channels at 60: structure, function and pathophysiology. J
Physiol. 590(Pt 11): 2577-2589. DOI: 10.1113/jphysiol.2011.224204.
20. Li WG, Xu TL. (2012) Emerging approaches to probing ion channel structure and function. Neurosci
Bull. 28(4): 351-374. DOI: 10.1007/s12264-012-1248-0.

104
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

21. Findlay I. (2004) Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels: one switch. J
Physiol. 554(Pt 2): 275-283.
22. Arnadóttir J, Chalfie M. (2010) Eukaryotic mechanosensitive channels. Annu Rev Biophys. 39: 111-
137.
23. Zeidel ML. (2012) Water homeostasis: evolutionary medicine. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123: 93-
105.
24. Verkman AS. (2011) Aquaporins at a glance. J Cell Sci. 124: 2107-2112.
25. Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, Agre P. (1992) Appearance of water channels in Xenopus
oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science. 256(5055): 385-387.
26. Verkman AS, Mitra AK. (2000) Structure and function of aquaporin water channels. Am J Physiol
Renal Physiol. 278(1): F13-28.
27. Perez Di Giorgio J, Soto G, Alleva K, Jozefkowicz C, Amodeo G, Muschietti JP, Ayub ND.
(2014) Prediction of Aquaporin Function by Integrating Evolutionary and Functional Analyses. J Membr
Biol. 247(2): 107-25. DOI: 10.1007/s00232-013-9618-8.
28. Day RE, Kitchen P, Owen DS, Bland C, Marshall L, Conner AC, Bill RM, Conner MT.
Human aquaporins: Regulators of transcellular water flow. Biochim Biophys Acta. 2013 Sep 30. pii:
S0304-4165(13)00435-2. doi: 10.1016/j.bbagen.2013.09.033. [Epub ahead of print] Accesibil la:
http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.09.033 (vizualizat în 21 decembrie 2013).
29. Blanco G, Mercer RW. (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in
function. Am J Physiol. 275(5 Pt 2): F633-F650.
30. Blanco G. (2005) Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion
regulation. Semin Nephrol. 25: 292-303.
31. Axelsen KB, Palmgren MG. (1998) Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase
superfamily. J Mol Evol. 46: 84-101.
32. Beggah AT, Jaunin P, Geering K. (1997) Role of glycosylation and disulfide bond formation in the b
subunit in the folding and functional expression of Na,K-ATPase. J Biol Chem. 272: 10318–10326.
33. Geering K. (2008) Functional roles of Na,K-ATPase subunits. Curr Opin Nephrol Hypertens. 17: 526-
532.
34. Füzesi M, Gottschalk KE, Lindzen M, Shainskaya A, Küster B, Garty H, Karlish SJ. (2005)
Covalent cross-links between the gamma subunit (FXYD2) and alpha and beta subunits of Na,K-ATPase:
modeling the alpha-gamma interaction. J Biol Chem. 280: 18291-18301.
35. Lindzen M, Gottschalk KE, Füzesi M, Garty H, Karlish SJ. (2006) Structural interactions
between FXYD proteins and Na+,K+-ATPase: alpha/beta/FXYD subunit stoichiometry and cross-
linking. J Biol Chem. 281: 5947-5955.
36. Berl T. (2009) How do kidney cells adapt to survive in hypertonic inner medulla? Trans Am Clin
Climatol Assoc. 120: 389-401.
37. Faller LD. (2008) Mechanistic studies of sodium pump. Arch Biochem Biophys. 476: 12-21.
38. Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H. (2000) The cellular biology of
proton-motive force generation by V-ATPases. J Exp Biol. 203(Pt 1): 89-95.
39. Nakanishi-Matsui M, Sekiya M, Nakamoto RK, Futai M. (2010) The mechanism of rotating
proton pumping ATPases. Biochim Biophys Acta. 1797: 1343-1352.
40. Biemans-Oldehinkel E, Doeven MK, Poolman B. (2006) ABC transporter architecture and
regulatory roles of accessory domains. FEBS Lett. 580: 1023-1035.
41. Oldham ML, Davidson AL, Chen J. (2008) Structural insights into ABC transporter mechanism.
Curr Opin Struct Biol. 18: 726-733.
42. Huang Y, Sadée W. (2006) Membrane transporters and channels in chemoresistance and -sensitivity
of tumor cells. Cancer Lett. 239: 168-182.
43. Oostendorp RL, Beijnen JH, Schellens JH. (2009) The biological and clinical role of drug
transporters at the intestinal barrier. Cancer Treat Rev. 35: 137-147.
44. Nagao K, Kimura Y, Mastuo M, Ueda K. (2010) Lipid outward translocation by ABC proteins.
FEBS Lett. 584: 2717-2723.
45. Tissières P, Pugin J. (2009) The role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative bacteria.
Curr Opin Infect Dis. 22: 286-291.
46. Yin J, Kuebler WM. (2010) Mechanotransduction by TRP channels: general concepts and specific
role in the vasculature. Cell Biochem Biophys. 56(1): 1-18. doi: 10.1007/s12013-009-9067-2.
47. Koyasu S. (2010) Vanilloid flavor for a good appetite? Nat Immunol. 11(3): 187-189. doi:
10.1038/ni0310-187.
48. Link TM, Park U, Vonakis BM, Raben DM, Soloski MJ, Caterina MJ. (2010) TRPV2 has a
pivotal role in macrophage particle binding and phagocytosis. Nat Immunol. 11(3): 232-239. doi:
10.1038/ni.1842.

105
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

49. de Almeida CJ, Linden R. (2005) Phagocytosis of apoptotic cells: a matter of balance. Cell Mol Life
Sci. 62: 1532-1546.
50. Elliott MR, Ravichandran KS. (2010) Clearance of apoptotic cells: implications in health and
disease. J Cell Biol. 189: 1059-1070.
51. Han CZ, Ravichandran KS. (2011) Metabolic connections during apoptotic cell engulfment. Cell.
147(7): 1442-1445. doi: 10.1016/j.cell.2011.12.006.
52. Goldstein JL, Basu SK, Brunschede GY, Brown MS. (1976) Release of low density lipoprotein
from its cell surface receptor by sulfated glycosaminoglycans. Cell. 7: 85-95.
53. Goldstein JL, Brown MS. (1976) The LDL pathway in human fibroblasts: a receptor-mediated
mechanism for the regulation of cholesterol metabolism. Curr Top Cell Regul. 11: 147-181.
54. Brown MS, Ho YK, Goldstein JL. (1976) The low-density lipoprotein pathway in human fibroblasts:
relation between cell surface receptor binding and endocytosis of low-density lipoprotein. Ann N Y Acad
Sci. 275: 244-257.
55. Pearse BM. (1976) Clathrin: a unique protein associated with intracellular transfer of membrane by
coated vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 73: 1255-1259.
56. Ungewickell E. (1983) Biochemical and immunological studies on clathrin light chains and their
binding sites on clathrin triskelions. EMBO J. 2: 1401-1408.
57. Popova NV, Deyev IE, Petrenko AG. (2013) Clathrin-mediated endocytosis and adaptor proteins.
Acta Naturae. 5(3): 62-73.
58. Anderson RG, Kamen BA, Rothberg KG, Lacey SW. (1992) Potocytosis: sequestration and
transport of small molecules by caveolae. Science. 255: 410-411.
59. Matsue H, Rothberg KG, Takashima A, Kamen BA, Anderson RG, Lacey SW. (1992) Folate
receptor allows cells to grow in low concentrations of 5-methyltetrahydrofolate. Proc Natl Acad Sci U S
A. 89: 6006-6009.
60. Anderson RGW. (1998) The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem. 67: 199-225.
61. Mineo C, Anderson RG. (2001) Potocytosis. Robert Feulgen Lecture. Histochem Cell Biol. 116: 109-
118.
62. Doherty GJ, McMahon HT. (2009) Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78: 857-902.
63. Hansen CG, Nichols BJ. (2009) Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell
Sci. 122(Pt 11): 1713-1721.
64. Grant BD, Donaldson JG. (2009) Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nat Rev Mol
Cell Biol. 10: 597-608.
65. Masilamani M, Peruzzi G, Borrego F, Coligan JE. (2009) Endocytosis and intracellular
trafficking of human natural killer cell receptors. Traffic. 10: 1735-1744.
66. Murphy JE, Padilla BE, Hasdemir B, Cottrell GS, Bunnett NW. (2009) Endosomes: a
legitimate platform for the signaling train. Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 17615-1722.
67. Barclay JW, Morgan A, Burgoyne RD. (2005) Calcium-dependent regulation of exocytosis. Cell
Calcium. 38: 343-353.
68. Mayer A. (2002) Membrane fusion in eukaryotic cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 18: 289-314.
69. Verhage M, Sørensen JB. (2008) Vesicle docking in regulated exocytosis. Traffic. 9: 1414-1424.
70. Leabu M. (2006) Membrane fusion in cells: molecular machinery and mechanisms. J Cell Mol Med.
10; 423-427.
71. Morgan A. (1995) Exocytosis. Essays Biochem. 30: 77-95.
72. Jena BP. (2012) Porosome: the secretory portal. Exp Biol Med (Maywood). 237(7): 748-57. DOI:
10.1258/ebm.2012.012110.
73. Jena BP. (2009) Functional organization of the porosome complex and associated structures
facilitating cellular secretion. Physiology (Bethesda). 24: 367-376. doi: 10.1152/physiol.00021.2009.
74. Jena BP. (2008) Porosome: the universal molecular machinery for cell secretion. Mol Cells. 26: 517-
529.
75. Jena BP. (2004) Discovery of the Porosome: revealing the molecular mechanism of secretion and
membrane fusion in cells. J Cell Mol Med. 8: 1-21.
76. Jena BP. (2003) Fusion pore or porosome: structure and dynamics. J Endocrinol. 176(2):169-174.
77. Vardjan N, Jorgacevski J, Zorec R. (2013) Fusion pores, SNAREs, and exocytosis. Neuroscientist.
19(2): 160-174. DOI: 10.1177/1073858412461691.
78. Simionescu N. (1979) The microvascular endothelium. Segmental differentiation, transcytosis:
selective distribution of anionic sites. În „Advances in Inflammation Research”. Editat de Gerald
Weissmann, Bengt Samuelsson i Rodolfo Paoletti. Raven Press, New York, 1979, vol. I, pp. 61-70.
79. Predescu SA, Predescu DN, Malik AB. (2007) Molecular determinants of endothelial transcytosis
and their role in endothelial permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293(4): L823-L842.

106
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

80. Predescu SA, Predescu DN, Palade GE. (1997) Plasmalemmal vesicles function as transcytotic
carriers for small proteins in the continuous endothelium. Am J Physiol. 272(2 Pt 2): H937-H949.
81. Predescu DN, Neamu R, Bardita C, Wang M, Predescu SA. (2012) Impaired caveolae function
and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-
1s expression in mouse lung endothelium. Biochem Res Int. 2012:672705. DOI: 10.1155/2012/672705.
82. Solari R, Schaerer E, Tallichet C, Braiterman LT, Hubbard AL, Kraehenbuhl JP. (1989)
Cellular location of the cleavage event of the polymeric immunoglobulin receptor and fate of its
anchoring domain in the rat hepatocyte. Biochem J. 257(3): 759-768.
83. Geuze HJ, Slot JW, Strous GJ, Peppard J, von Figura K, Hasilik A, Schwartz AL. (1984)
Intracellular receptor sorting during endocytosis: comparative immunoelectron microscopy of multiple
receptors in rat liver. Cell. 37: 195-204.
84. Richardson JM, Kaushic C, Wira CR. (1995) Polymeric immunoglobin (Ig) receptor production
and IgA transcytosis in polarized primary cultures of mature rat uterine epithelial cells. Biol Reprod. 53:
488-498.
85. Tuma PL, Hubbard AL. (2003) Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol Rev. 83: 871-932.
86. Treyer A, Müsch A. (2013) Hepatocyte polarity. Compr Physiol. 3(1): 243-287. DOI:
10.1002/cphy.c120009.
87. In J, Lukyanenko V, Foulke-Abel J, Hubbard AL, Delannoy M, Hansen AM, Kaper JB,
Boisen N, Nataro JP, Zhu C, Boedeker EC, Girón JA, Kovbasnjuk O. (2013) Serine protease
EspP from enterohemorrhagic Escherichia Coli is sufficient to induce shiga toxin macropinocytosis in
intestinal epithelium. PLoS One. 8(7): e69196. DOI: 10.1371/journal.pone.0069196.

107
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

3.3. Semnalizarea celular


Probabil c nimic din ceea ce se întâmpl la nivelul membranelor nu prezint
o complexitate mai mare decât fenomenele de semnalizare. Când ptrunzi în aceast
tem a biologiei celulare, te simi ca intrat într-o jungl: nu tii de unde poate veni
sprijinul în a gsi calea de rzbatere în drumul ales, nu tii de unde poate veni
pericolul. (Rugm cititorii ca, dincolo de pregtirea pentru dificultatea temei, s
îneleag din aceast metafor c fenomenele de semnalizare sunt, pe de o parte,
eseniale pentru buna funcionare a celulelor, dar, pe de alt parte, atunci când ies
din limitele normalului însoesc procese patologice dintre cele mai diverse.) Au fost
scrise cri întregi care încearc s sistematizeze cunotinele noastre despre
semnalizarea celular. Problema este c, dei suntem ca într-o jungl, cunoscând o
groaz de aspecte, care mai de care mai provocatoare, cunoatem prea puine pentru
a gsi drumul ctre esene. Acumularea de cunotine în domeniul semnalizrii
celulare este un proces continuu, susinut de interesul major pentru acest subiect din
cercetarea biomedical contemporan, cu efecte atât în cunoaterea celulei normale,
cât i în ceea ce înseamn patologiile dependente de aceste fenomene membranare,
respectiv celulare. Din 1957, când Earl Wilbur Sutherland, Jr. a identificat adenozin-
monofosfatul ciclic (AMPc) ca molecul produs intracelular (rezultate publicate un
an mai târziu [1, 2]) i pe care în 1965 a supranumit-o mesager secund, fiind
implicat în rspunsul celular la semnalul primit de la epinefrin (adrenalin) [3],
interesul pentru ce se întâmpl în celul, când aceasta interacioneaz cu molecule
semnal (numite i mesageri primari) a crescut permanent, iar informaiile s-au
acumulat în ritm din ce în ce mai alert, ajungând în acest moment la o explozie de
cunotine în permanent cretere, exponenial. Munca de pionierat a lui
Sutherland 1 i a grupului su a permis elaborarea unui model de aciune a
hormonilor potrivit cruia molecula semnal (mesagerul primar) nu trebuie s intre în
celul pentru a transmite un mesaj. Conform acestui model, hormonul se leag de un
receptor expus pe suprafaa celular stimulând formarea, în mediul intracelular, a
mesagerului secund, care la rândul su poate s moduleze (s activeze sau s inhibe)
diverse procese metabolice. Rolul pe care mesagerii secunzi îl au în semnalizarea
celular a fost îneles, din ce în ce mai bine, pe parcursul urmtorilor 50 de ani de la
descoperirea AMPc, iar eforturile depuse pentru descifrarea rolului nucleotidelor
ciclice (atât al AMPc, cât i al unui alt compus înrudit, guanozin-monofosfatul ciclic –
GMPc) au fost rspltite prin decernarea a nu mai puin de cinci Premii Nobel [4].
Descoperirea rolului de mesager secund pentru AMPc a fost începutul unei evoluii
spectaculoase a cunotinelor despre ceea ce numim acum semnalizare celular, iar
implicarea mesagerilor secunzi s-a dovedit a fi o regul fr aplicabilitate general,
întrucât exist multiple ci de semnalizare care nu necesit participarea acestor
intermediari, dup cum se va vedea în acest subcapitol.
Demersul prezentrii temei într-o carte general despre biomembrane, care
are i rolul unui manual, este unul dificil, deoarece necesit o sistematizare atent
care s nu creeze confuzie i s lase mintea cititorului deschis. Ne asumm
dificultatea i riscurile unei reuite de un nivel aflat sub exigenele celor iniiai.

3.3.1. Câteva aspecte generale despre semnalizarea celular


Semnalizarea celular, care mai general ar putea fi denumit semnalizare
intercelular (deoarece exist de regul o celul care transmite un semnal i o alt
celul care îl recepteaz, dei unele celule pot recepta i semnale fizice), reprezint

1Earl Wilbur Sutherland Jr. a fost distins în 1971 cu Premiul Nobel pentru fiziologie sau medicin, cu
urmtoarea motivaie a juriului: „for his discoveries concerning the mechanisms of the action of
hormones”.

109
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

modalitatea esenial prin care celulele pot comunica între ele prin schimb de
informaii, indiferent de distana la care se afl. O alt denumire a ceea ce generic
numim semnalizare celular mai poate fi aceea de semnalizare transmembranar,
deoarece oricare ar fi calea prin care celula primete din afara sa sau transmite în
afar informaiile, mesajul trebuie s strbat membrana, s treac prin planul
acesteia. Aadar, semnalizarea celular presupune, de regul, cooperarea între dou
celule; una care trimite semnalul, cealalt care îl recepteaz i fenomene care se
petrec la nivelul membranelor (pentru trecerea semnalului din interior în exterior, la
celula semnalizatoare i pentru trecerea mesajului prin membrana celulei receptoare,
de la exterior la interior, pentru a fi folosit mesajul).
3.3.1.1. Clasificarea cilor de semnalizare
În funcie de distana la care se afl celulele care semnalizeaz între ele (celula
care transmite semnalul, respectiv celula care îl recepteaz), cile de semnalizare se
împart în (Fig. 3.17):
- endocrine (Fig. 3.17, A), atunci când celulele se afl la distan, iar molecula
semnal trebuie s fie transportat de umorile organismului (de regul de sânge
i de lichidul interstiial);
- paracrine (Fig. 3.17, B), atunci când celulele care comunic se afl în imediata
vecintate;
- autocrine (Fig. 3.17, C), atunci când semnalul este transmis i receptat de
aceeai celul;
- juxtacrine (Fig. 3.17, D), ci prin care sunt receptate semnale, atunci când
celulele sunt joncionate, adic legate una de alta (tocmai datorit strii lor de
ataare).
Aceast clasificare este necesar s fie nuanat, deoarece exist o modalitate
de semnalizare deosebit, între dou celule dintre care cel puin cea care transmite
semnalul este neuron i care se afl în imediata apropiere (deci corespunde definiiei
semnalizrii paracrine), dar este denumit specific i anume semnalizare prin
sinapse sau semnalizare sinaptic (vezi ce se întâmpl la nivelul sinapselor aa cum a
fost prezentat în Fig. 3. 5). Alt situaie, care ar prea a nu respecta, în mod rigid,
clasificarea i definiiile date pentru diversele tipuri de ci de semnalizare, este cea
legat de faptul c unele celule care comunic paracrin se pot afla la mare distan
unele de altele, deoarece celulele care semnalizeaz trimit prelungiri citoplasmatice
foarte lungi. Aa se întâmpl în cazul telocitelor care trimit lungi telopode, de ordinul
sutelor de Pm [5]. Pentru aceste tipuri de celule i capacitatea lor de a semnaliza au
fost descrise i ultrastructuri ce se numesc sinapse stromale, realizate cu celule
tisulare rezidente sau migrate din sânge [6]. În sfârit, între aceste cazuri deosebite
de procese de semnalizare, care nuaneaz clasificarea, trebuie menionat i
semnalizarea prin intermediul jonciunilor comunicante (Fig. 3.17, E), care de fapt
reprezint o cale prin care celule stimulate prin interaciunea unor receptori proprii
cu molecule semnal, trimit informaia stimulului celulelor din jur, cu care au stabilit
jonciunile. Aceast transmitere de informaii se face prin difuziunea direct a unor
mesageri secunzi pe calea conexonilor, complexe proteice transmembranare (vezi în
volumul al II-lea).
Revenind la clasificare, pentru primele trei ci menionate, semnalizarea se
face prin molecule secretate de celula semnalizatoare. Acestea trebuie s se deplaseze
prin spaiile intercelulare pentru a ajunge la int, adic la alte celule (în primele
dou cazuri), sau la aceeai celul pentru semnalizarea autocrin. Semnalizarea
juxtacrin presupune interaciunea unor molecule din structura membranelor celor
dou celule (celula semnalizatoare, respectiv celula int). De remarcat c, în aceast

110
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

situaie, ambele celule transmit semnal i ambele recepteaz informaii prin


semnalul transmis de partenerul de interaciune.

Fig. 3.17. Tipuri de ci de semnalizare. Sgeile roii, unde exist, indic direcia de micare a
moleculelor semnal. A. Calea endocrin reprezint semnalizarea în care celula care trimite semnalul
se afl într-un esut din alt zon a organismului. Celula secret molecula semnal (ligandul) prin
exocitoz, iar aceasta ajunge în circulaia sanguin prin care este dus la celula int. Intrarea
moleculelor semnal în capilare se face prin transcitoz (dinspre esut ctre lumenul vasului de sânge)
sau prin fenestre (deschideri diafragmate în corpul celulelor endoteliale), iar la nivelul esutu-rilor ce
conin celulele int are loc procesul de transcitoz în sens invers (dinspre lumenul capilarului ctre
spaiul subendotelial). Odat ajunse în zona celulelor int, moleculele semnal se leag de receptorul
specific, declanând procesul de semnalizare celular. B. Semnalizarea paracrin implic dou celule
aflate în proximitate. Moleculele semnal exocitate de celula semnalizatoare gsesc pe suprafaa
celulelor vecine receptorul cu care interacioneaz, activându-l i iniiind mecanismul de semnalizare.
C. În semnalizarea autocrin, celula care elibereaz molecula semnal o i recunoate prin receptorul
aflat în propria membran, auto-stimulându-se. D. Semnalizarea juxtacrin implic interaciunea a
dou celule prin componente, de regul, transmembranare. În aceast situaie ambele celule transmit
semnale i ambele recepteaz starea de legtur în care se afl. E. Semnalizare prin eludarea unui
receptor din celula int. Acest tip de semnalizare opereaz în celulele esuturilor în care este nevoie
de comportament sincron. Aceste celule stabilesc jonciuni comunicante (vezi în volumul al II-lea al
crii, la seciunea despre jonciuni celulare) prin intermediul unor complexe transmembranare
denumite conexoni. Avantajul unor asemenea nanostructuri joncionale, destinate comunicrii
intercelulare, este dat de faptul c nu este nevoie ca fiecare celul s fie stimulat de molecula
semnal în mod direct, prin propriii receptori, ci o singur celul stimulat transmite informaia tuturor
celorlalte celule dimprejur. © Mircea Leabu, 2014.

111
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3. 18. Componentele eseniale pentru declanarea semnalizrii i efectele semnalelor. A.


Pentru declanarea unui proces de semnalizare sunt necesari doi factori: molecula semnal, numit i
ligand, în spaiul extracelular i receptor accesibil, cel mai adesea în membran. B. Procesul de
semnalizare celular se iniiaz, îns, numai prin interacionarea ligandului cu receptorul pe care îl
activeaz prin modificarea conformaiei. C. Orice celul recepteaz o mare diversitate de semnale.
Cea mai mare parte a semnalelor (indicate în figur prin numere de la 1 la 4) sunt destinate
supravieuirii i funcionrii normale a celulelor. Celulele stem i cele progenitoare au nevoie de
stimuli specifici (5 i 6) pentru a se diferenia corespunztor. Diviziunea celular i toate procesele ce
pregtesc aceast etap a ciclului celular necesit o combinaie adecvat de stimuli, inclusiv unii
specifici (7 i 8) care induc proliferarea. În situaia în care celulele nu mai primesc stimulri de nici un
fel, respectiv combinaii neadecvate de semnale, sau anumite semnale (9), acestea pot duce la
declanarea morii celulare programate (de regul apoptoz) sau la situaii patologice (ceea ce nu
este prezentat în figur). Sgeile dinspre cifrele care indic stimulii au semnificaia acionrii
acestora, iar liniile barate însemn c semnalele respective sunt blocate. © Mircea Leabu, 2014.

112
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Un caz aparte de semnalizare juxtacrin este reprezentat de ataarea celulelor


la componente ale matricei extracelulare; în aceast situaie, celula care
interacioneaz cu componenta extracelular „contientizeaz” starea ei: se afl
angrenat într-o interaciune cu matricea extracelular sau se afl detaat de
aceasta, comportându-se diferit, adic rspunzând nuanat în funcie de starea în
care se afl.
3.3.1.2. Aspecte generale legate de mecanismul semnalizrii celulare
Oricare ar fi tipul de cale de semnalizare, la iniierea fenomenului particip
dou componente (Fig. 3.18, A, B): (i) molecula semnal, numit i ligand
(secretat sau expus la suprafaa membranei de celula semnalizatoare; ligandul
poate fi i o macromolecul din matricea extracelular) i (ii) receptorul de la
nivelul celulei int.
Ca urmare a interaciunii receptorului cu ligandul, deci ca urmare a receptrii
unui semnal, celula int declaneaz unele procese ce se constituie ca reacie la
primirea informaiei purtate de molecula semnal i se finalizeaz cu ceea ce se
numete rspuns la semnalul receptat. Legarea moleculei semnal atrage modificri
conformaionale la nivelul receptorului ce induc iniierea mecanismului prin care
celula primete i prelucreaz semnalul. Rspunsurile celulare sunt de o mare
diversitate. Aceast mare diversitate de rspunsuri are la baz, în primul rând, marea
varietate de molecule semnal. Exist sute de molecule semnal care pot afecta celulele.
Cum simultan pot s se exercite diverse semnale (diferite molecule semnal receptate
simultan de aceeai celul), rezult c celulele pot rspunde, teoretic, la milioane de
combinaii posibile. Cum capacitatea unei celule de a recepta un semnal este
dependent de prezena receptorului corespunztor, rezult c diversitatea
rspunsurilor celulare este dependent i de setul de receptori disponibili. Dar tipul
de rspuns pe care celula îl creeaz este dependent i de setul de proteine efectoare,
adic acele proteine care preiau semnalul de la receptor i contribuie la desfurarea
proceselor intracelulare care constituie rspunsul. Acesta este motivul pentru care
acelai stimul (aceeai molecul semnal) poate duce la rspunsuri diferite, în tipuri
diferite de celule. De exemplu, acetilcolina determin contracia la nivelul celulelor
musculare striate scheletale (vezi în Fig. 3.5 cum se determin aceast contracie),
dar conduce la relaxarea muchiului cardiac, pe când în celulele secretoare ale
mucoasei gastrice sau din medulosuprarenal duce la secreie, inducând exocitoz.
Oricare ar fi combinaia de semnale care acioneaz asupra unei celule la un
moment dat, rspunsul celular va determina un comportament îndreptat spre unul
dintre urmtoarele patru efecte posibile (Fig. 3.18, C):
(i) diferenierea, însoit de autoregenerare, pentru celule stem sau
progenitoare în perioada dezvoltrii embrionare i formrii esuturilor,
inclusiv în organismele tinere, dar i în organismele adulte, în situaii de
regenerare tisular sau în procesele legate de hematopoiez;
(ii) supravieuirea, care reprezint efectul cel mai des întâlnit ca rspuns i
care se bazeaz pe cea mai mare diversitate de combinaii, fiecare celul
necesitând stimuli specifici pentru a rspunde prin supravieuire i
funcionare normal;
(iii) proliferarea, este declanat la anumite combinaii de semnale ce apar
atunci cînd este nevoie de sporirea populaiei celulare într-o anume zon a
unui esut (ine de capacitatea organismului de a-i menine homeostazia
celular i capacitatea de a reface esuturile);
(iv) moartea celular programat (de regul sub form de apoptoz),
apare în lipsa oricrui semnal care s determine supravieuirea sau în
prezena unor semnale specifice.

113
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Indiferent de rspunsul celular pe care îl determin, putem defini patru etape


ale procesului de semnalizare celular, etape care sunt general valabile (dar nu în
exclusivitate). Celula i-a creat alternative la aceste principii ale procesului de
semnalizare pentru a eficientiza satisfacerea nevoilor sale, deoarece uneori nu este
cazul s recurg la procese deosebit de elaborate. Etapele de principiu ale
mecanismelor de semnalizare celular sunt:
1. Iniierea semnalizrii prin legarea ligandului (moleculei semnal) de
receptor (Fig. 3.18, B i Fig. 3.19, momentul 1). Legarea ligandului de
receptor presupune o interaciune de afinitate, de mare specificitate,
caracteristic sistemelor biologice, care se bazeaz pe o multitudine de fore
fizico-chimice, dintre cele mai diverse, exercitate simultan (puni de hidrogen,
interaciuni electrostatice, interaciuni hidrofobe), toate contribuind la punerea
în comun a unor suprafee organizate de structurile teriare i/sau cuaternare
ale celor dou molecule.
Fig. 3.19. Mecanismul de
semnalizare celular în
cascad. 1. Iniierea sem-
nalizrii are loc la nivelul
membranei prin realizarea
interaciunii ligand-recep-
tor. Legarea moleculei
semnal de receptor induce
modificri conformaionale
ale lanului polipeptidic al
receptorului care se pro-
pag prin domeniul trans-
membranar pân la endo-
domeniu, mesajul fiind
transdus. Informaia purtat
de molecula semnal traver-
seaz astfel planul mem-
branei ajungând în citosol
i are loc activarea recep-
torului. 2. Receptorul acti-
vat leag molecula primului
efector, activându-l. Cât
persist starea stimulat a
receptorului, acesta poate
activa un numr mai mare
de molecule ale primului
efector. Are loc prima
treapt a amplificrii sem-
nalului. 3. Primul efector
activat interacioneaz, la
rândul su, cu efectorul al
doilea din cascad stimu-
lându-l în numr multiplu,
ceea ce sporete ampli-
ficarea. Procesul continu
în aceeai manier, de n
ori, iar la sfârit, ultimul tip
de efector din cascada de
semnalizare, activat pentru
un numr de molecule
corespunztor amplificrii (n*x), contribuie la finalizarea rspunsului celular. Factorul de amplificare
3, folosit în primele trepte, este aleatoriu, dup cum aleatorie este situaia în care, în toate treptele
cascadei de semnalizare, amplificarea ar respecta un factor constant. În figur nu este reprezentat
pasul 4 al semnalizrii, atenuarea semnalului, care implic fenomene complexe i diverse. ©
Mircea Leabu, 2014.

114
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

2. Transducia semnalului i activarea receptorului: Transducia


semnalului 2 are la baz modificri conformaionale la nivelul moleculei
receptorului, datorate interaciunii cu ligandul. Pentru receptorii aflai la
nivelul membranei celulare, cei mai numeroi din cunotinele noastre de pân
acum, modificrile se propag, prin intermediul domeniului transmembranar al
receptorului, la endodomeniu, atrgând activarea receptorului.
3. Activarea efectorului i amplificarea semnalului (Fig. 3.19, momentele
de la 2 la n): Receptorul stimulat prin legarea ligandului activeaz, la rândul
su, proteina efectoare din pasul imediat urmtor al semnalizrii. O prim
amplificare a semnalului este efectuat chiar la acest nivel deoarece un receptor
stimulat poate, cât se afl în aceast stare, s activeze un numr mai mare de
molecule ale efectorului. inând cont de faptul c un proces de semnalizare
presupune un numr mai mare de tipuri de efectori acionând secvenial,
fiecare preluând semnalul de la tipul anterior (din amonte) i transmiându-l
tipului urmtor (în aval), amplificarea semnalului crete în fiecare etap a cii
de semnalizare, pân la finalizarea rspunsului celular.
4. Atenuarea semnalului i desensibilizarea celulei: Aceast etap
presupune inactivarea efectorilor i controlul complexului ligand-receptor (fie
desfacerea ligandului i degradarea intracelular a acestuia, fie degradarea
simultan a celor doi protagoniti ai iniierii procesului de semnalizare, ceea ce
presupune implicarea fenomenului de endocitoz). Inactivarea efectorilor poate
însemna cel mai adesea lizarea moleculelor activatoare (de exemplu scindarea
GTP la GDP), metabolizarea mesagerilor secunzi (vezi mai jos definirea
acestora), dac acetia sunt implicai în calea de semnalizare în cauz, sau
scoaterea funciunilor activatoare de pe molecula efectorului (de exemplu
defosforilarea, dac fosforilarea a presupus activarea), sau alte modaliti de
modificare post-traducere 3 (de exemplu fosforilarea dac forma activ
presupune defosforilarea). Desfacerea complexului ligand-receptor se face, de
regul, dup internalizarea acestuia în sistemul endozomal, care poate fi
urmat de sortri i direcionri ale ligandului sau chiar i ale receptorului ctre
lizozomi, pentru degradare. Alteori receptorul, care elibereaz ligandul în
endozom, este reciclat la suprafaa celulei, pentru a reintra în rol în interesul
celulei.

3.3.2. Tipuri de receptori i modaliti de aciune


Marea diversitate a receptorilor cunoscui se poate clasifica în funcie de mai
multe criterii. Un prim criteriu îl reprezint proprietile fizico-chimice ale moleculei
semnal. În funcie de acest criteriu, împrim receptorii celulari în dou categorii:
1. Receptori pentru molecule semnal liposolubile/lipofile (hidrofobe);
2. Receptori pentru molecule semnal hidrosolubile/hidrofile.
3.3.2.1. Receptorii pentru liganzi lipofili sunt proteine localizate în citosol sau
în nucleu care preiau ligandul dup difuzia acestuia prin membran. Este firesc ca
aceti liganzi, având proprieti lipofile (adic fiind solubili în lipide), s poat
strbate membrana prin difuziune simpl, adic s treac printre lipidele bistratului.

2 Dei nu exist neaprat o controvers, sintagma de transducie a semnalului a fost iniial îneleas ca
introducerea semnalului purtat de ligand din exteriorul celulei, în interior i transmiterea mesajului mai departe
ctre elementele implicate în realizarea rspunsului celular. În prezent, unii consider c prin transducia
semnalului trebuie s înelegem atât trecerea mesajului prin planul membranei i activarea receptorului, cât i
procesele de transmitere în cascad a informaiei primite de celul, cu amplificarea efectului, pentru realizarea
rspunsului celular. În carte, noi folosim prima accepiune.
3 Prin modificri post-traducere înelegem schimbri ale diferitelor funciuni ale aminoacizilor din lanul

polipeptidic al unei proteine, dup ce biosinteza acesteia a fost finalizat. Aceste modificri post-traducere sunt
efectuate de enzime specializate.

115
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.20. Modul de aciune a receptorilor pentru liganzi lipofili. A. Ligandul este purtat ctre
membrana celulei int de un transportor extracelular, care îl izoleaz de hidrofilicitatea mediului. B.
La nivelul membranei int transportorul se adsoarbe la suprafaa celulei, creând premisele eliberrii
ligandului ctre bistratul lipidic. C. Dup eliberare, ligandul traverseaz bistratul lipidic membranar. D.
Dup traversarea bistratului lipidic, ligandul este preluat de receptor în citosolul cortical; receptorul
trece în stare activat, gata s cltoreasc spre i s ptrund prin porii nucleari în nucleu, pentru a
aciona asupra genei int. © Mircea Leabu, 2014.

116
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Ca s ajung la membrana celulei int, îns, liganzii trebuie s fie purtai prin
spaiul extracelular de ctre transportori miscibili cu apa, adic proteine care îi leag
în complexe specifice, mascându-i de hidrofilicitatea mediului. Ajuni prin aceast
intermediere la celulele int, sunt eliberai la nivelul plasmalemei, permiându-li-se
strbaterea bistratului datorit proprietilor lor fizico-chimice. Mai departe
fenomenele se pot rezuma astfel: (i) pentru receptorii localizai în citosol (Fig. 3.20),
dup formarea complexului ligand-receptor acesta este transportat în nucleu, unde
îi îndeplinete funcia, aceea de a modula exprimarea genelor i (ii) pentru
receptorii localizai direct în nucleu, liganzii sunt condui acolo de alte proteine
transportoare, aflate în citosol, care îi izoleaz de hidrofilicitatea mediului
intracelular, îi translocheaz prin porii nucleari i, odat ajuni în spaiul în care sunt
localizai receptorii, îi transfer acestora activându-i i declanând transcrierea
genelor int.
Sunt cunoscute 6 tipuri de receptori pentru liganzi lipofili: receptor pentru
cortizol, receptor pentru estrogeni, receptor pentru progesteron,
receptor pentru vitamin D, receptor pentru hormoni tiroidieni i
receptor pentru acid retinoic.
Pe lâng receptorii ai cror liganzi lipofili sunt cunoscui, exist i receptori
care au fost identificai i inclui în clasa receptorilor nucleari doar pe baza descifrrii
secvenei de ADN, fr ca ligandul lor s fie cunoscut. Acetia au primit denumirea
de receptori nucleari orfani i sunt intens dezbtui i studiai, reprezentând
pentru comunitatea tiinific o int de dezvoltare a cunoaterii, inclusiv o posibil
int terapeutic [7, 8].

Fig. 3.21. Organizarea molecular i modul de aciune caracteristice receptorilor pentru liganzi
lipofili. A. Receptorul în complexul inhibitor i domeniile funcionale ale sale. B. Receptor activat
ataat la elementul de legare a receptorului din structura ADN (în rou) i cu domeniul de activare a
transcrierii la nivelul genei int. © Mircea Leabu, 2014.

117
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Oricare ar fi tipul de receptor din aceast categorie, ei prezint unele


caracteristici structurale i funcionale comune. Acestea sunt: un sit de legare a
ligandului, un sit de legare la secvene specifice din ADN i un domeniu de activare a
transcrierii (Fig. 3.21, A). Similar este i mecanismul de activare. În stare inactiv,
înainte de a interaciona cu ligandul, receptorul este cuplat la un complex proteic
inhibitor (Fig. 3.21, A). În aceast stare complexat, inactiv, receptorul are mascate
situl de legare la ADN i domeniul de activare a transcrierii. Dup legarea ligandului,
receptorul se desprinde de complexul de inactivare i, dac se afl iniial în citosol,
este gata de transportat (translocat) în nucleu. Ajuns acolo, declaneaz fenomenele
pe care le faciliteaz i receptorii localizai permanent în nucleu, adic datorit
expunerii locului de legare la ADN, se ataeaz în zone favorabile activrii genei
specifice i prin domeniul de activare a transcrierii, devenit accesibil, procesul este
declanat (Fig. 3.21, B). Transcrierea genei i exprimarea acesteia în celul, prin
proteina codificat, determin producerea rspunsului specific perechii respective
receptor-ligand.
3.3.2.2. Receptorii pentru liganzi hidrofili sunt cei mai numeroi i sunt
localizai la nivelul membranei celulare, expunând situl de legare a moleculei semnal
la suprafaa celulei. Aceti receptori se pot împri, în funcie de tipul de mecanism
de semnalizare pe care îl declaneaz, în 3 clase principale:
1. Receptori cu funcie de canal ionic (deja amintitele canale comandate
chimic, de la transportul prin membran);
2. Receptori cuplai cu proteine G heterotrimerice;
3. Receptori cu funcie enzimatic sau cuplai cu enzime.
Chiar din denumirile lor se poate deduce faptul c mecanismele prin care
receptorii la liganzi hidrofili sunt activai se caracterizeaz prin mare diversitate.
Pentru a nuana i mai mult ideea de diversitate, în cazul receptorilor pentru liganzi
hidrofili, menionm c cei cu funcie enzimatic sau cuplai cu enzime se clasific, la
rândul lor, în 6 tipuri:
i. Receptori cu activitate tirozin-kinazic – acioneaz direct ca enzime
atunci când sunt activai i fosforileaz tirozine specifice din propriile structuri
(mai exact, ale partenerului de dimerizare, un alt monomer al receptorului) sau
din structura unui mic set de proteine de semnalizare, intracelulare;
ii. Receptori cuplai cu tirozin-kinaze citosolice – nu au activitate
enzimatic intrinsec, dar transmit semnalul prin asocierea direct cu proteine
intracelulare cu funcie tirozin-kinazic ;
iii.Receptori cu activitate serin/treonin-kinazic – au funcie enzimatic
i fosforileaz serine i/sau treonine din propriile structuri i/sau din structura
unor proteine reglatoare cu care se asociaz i care, dup activare, moduleaz
transcrierea unor gene specifice;
iv. Receptori dependeni de o activitate histidin-kinazic – activeaz o
cale de semnalizare cu dou componente: mai întâi se produce autofosforilarea
kinazei la histidin, dup care are loc transferul gruprii fosfat unei proteine de
semnalizare secundar, efector al acestor ci;
v. Receptori cu activitate guanilat-ciclazic – au funcie enzimatic i
catalizeaz, prin activarea endodomeniului, formarea direct de GMP ciclic
(GMPc) în spaiul citosolic submembranar;
vi. Receptori cu activitate fosfatazic – acioneaz ca enzime, hidrolizând
grupri fosfat grefate pe tirozine din structura unor proteine de semnalizare
intracelulare, specifice; se numesc i tirozin-fosfataze asemntoare
receptorilor deoarece liganzii prezumtivi nu au fost înc identificai, iar
funcia lor de receptori nu a fost evideniat direct.

118
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.22. Receptor cu funcie de canal, exemplificat prin receptorul pentru acetilcolin. A. În
stare inactiv, lipsa interaciunii cu ligandul, contribuie la meninerea domeniilor transmembranare
TM2, ale complexului pentameric, în poziii prin care obtureaz calea de trecere a ionului (sunt
prezentate în imagine numai cele dou subuniti D, ale complexului proteic ce organizeaz canalul).
B. Dup ocuparea sitului de legare a acetilcolinei, modificrile conformaionale din ectodomeniul
complexului transmembranar induc o deplasare a TM2, printr-o micare de rsucire (direciile de rotire
sunt indicate de sgei) ce se finalizeaz cu deschiderea cii de trecere a ionului specific. © Mircea
Leabu, 2014.

Este momentul s detaliem puin informaiile despre canalele comandate prin


liganzi, despre care am mai vorbit la subcapitolul anterior, transportul membranar.
Ne amintim c sunt complexe proteice transmembranare, multipas cu rol în
transportul ionilor i ele funcioneaz i ca receptori cu funcie de canal. Un exemplu
de receptor cu funcie de canal ionic a fost deja amintit la transportul prin
membran. Este vorba de receptorul pentru acetilcolin (Fig. 3.22) de la nivelul
sarcolemei (membrana celulei musculare striate scheletale), localizat în membrana
de la nivelul sinapsei neuro-musculare. Acest receptor este un complex
transmembranar format din cinci subuniti (2D, E, J i G), fiecare cu câte patru
treceri în D-helix prin bistratul lipidic (TM1-TM4). Trei dintre aceste segmente
transmembranare sunt orientate ctre lipidele bistratului (TM1, TM3 i TM4), iar
unul (TM2) ctre axul pentamerului, unde se formeaz calea de trecere a ionului [5].
Ectodomeniile celor 5 subuniti sunt mari i formeaz 2 situri de legare a
acetilcolinei cu participarea în principal a celor dou subuniti D. Când receptorul
interacioneaz cu ligandul, modificrile conformaionale de la nivelul
ectodomeniului complexului atrag deplasarea TM2 la nivelul zonei transmembranare
i se deschide calea de trecere a ionului [9-11]. Organizarea descris mai sus i
mecanismul de aciune (Fig. 3.22) sunt valabile i pentru alte categorii de receptori
cu funcie de canal aflai în membrana celular i comandai de liganzi extracelulari.
Un alt exemplu de canal implicat în procese de semnalizare îl reprezint
receptorul pentru IP3, numit i canal de calciu controlat de IP3, din
membrana reticulului endoplasmic (reticul sarcoplasmic în celulele musculare), al
crui ligand este citosolic. Receptorul se gsete într-un numr mare de tipuri
celulare i apare în toate formele de organisme de la nematode la om. Rolul su este
acela de a elibera Ca2+ din rezervele intracelulare, cel mai adesea din reticulul

119
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

endoplasmic. Controleaz o mare diversitate de fenomene dependente de Ca2+, cum


ar fi contracia muscular, secreia celular, proliferarea celular, apoptoza,
fertilizarea, motilitatea celular i altele. Receptorul este protein transmembranar
cu ~2700 aminoacizi în molecul i o mas de ~300kDa. Domeniul transmembranar
implic poriunea carboxi-terminal a lanului polipeptidic, are 6 treceri în D-helix
prin bistratul lipidic prin care organizeaz canalul de calciu, trecerile 5 i 6 fiind
critice în formarea cii ionice. Canalul pentru ion se formeaz la nivelul unei
structuri tetramerice (patru monomeri de receptor pentru IP3 se asociaz în
membran pentru a forma complexul unui canal funcional). Captul amino-
terminal al proteinei monomerice, orientat ctre citosol structureaz situl de legare a
IP3 (pân spre aminoacidul 650) i conine trei aminoacizi bazici prezeni în toate
cele trei izoforme ale receptorului: Arg-265, Lys-508 i Arg-511. Între regiunea
responsabil de legarea ligandului i poriunea proteinei care formeaz domeniul
transmembranar, se afl o zon ampl de control i modulare a funciei receptorului
la nivelul creia se afl situri de legare a diveri modulatori cum ar fi ATP,
calmodulin sau situri de fosforilare sub aciunea unor kinaze [12-14].
Receptorii cuplai cu proteine G heterotrimerice 4 (Fig. 3.23) sunt
proteine transmembranare multipas de tip I, cu 7 treceri prin planul membranei.

Fig. 3.23. Organizarea transmembranar a receptorilor cuplai cu proteine G heterotrimerice.


Ectodomeniul proteinei poate organiza situri de interaciune cu o diversitate de molecule semnal.
Aceste situri se pot afla la nivelul captului N-terminal al lanului polipeptidic, la nivelul buclelor
extracelulare, dar i în spaiul creat, pe faa extern a membranei, de domeniile transmembranare
TM3, TM5, TM6 i TM7, cu asistarea, la exterior, prin bucla dintre TM4 i TM5. La nivelul
endodomeniului, receptorul organizeaz interfaa de interaciune cu proteinele G heterotrimerice.
© Mircea Leabu, 2014.

4 În 2012, Robert J. Lefkowitz i Brian K. Kobilka au primit Premiul Nobel pentru chimie, pentru contribuia lor
la cunoaterea acestor receptori, iar motivaia succint a juriului a fost: "for studies of G-protein–coupled
receptors". Mai mult, anterior, în 1994, Alfred G. Gilman i Martin Rodbell au primit Premiul Nobel pentru
medicin sau fiziologie pentru studii destinate proteinelor G heterotrimerice cu urmtoarea motivaie a juriului:
"for their discovery of G-proteins and the role of these proteins in signal transduction in cells".

120
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Ectodomeniul receptorului este mare i structureaz situri pentru diveri


liganzi, iar endodomeniul conine situl de interaciune cu proteinele G
heterotrimerice, cât i locuri de fosforilare necesare desensibilizrii.
Organizarea transmembranar a receptorului [15] implic expunerea la
suprafaa celulei a captului amino-terminal, iar cele apte domenii
transmembranare (TM1 la TM7) organizeaz trei bucle externe între TM2 i TM3,
TM4 i TM5, respectiv TM6 i TM7 (aceste bucle împreun cu captul N-terminal
formând ectodomeniul), ca i trei bucle interne între TM1 i TM2, TM3 i TM4,
respectiv TM5 i TM6, bucle care, împreun cu captul carboxi-terminal expus pe
faa citosolic, formeaz endodomeniul receptorului, responsabil de transmiterea
mesajului ctre proteinele G heterotrimerice. În endodomeniu, bucla dintre TM5 i
TM6, ca i captul C-terminal prezint mare variabilitate structural de la o form la
alta de receptori din aceast clas. Pe ectodomeniu se pot afla multiple situri de
legare pentru diveri liganzi organizate fie la nivelul poriunii N-terminale a lanului
polipeptidic, fie de buclele extracelulare, fie de zone superficiale din TM3, TM5, TM6
i TM7, împreun cu bucla extracelular dintre TM4 i TM5 aflat deasupra.
Diversitatea de situri de legare a unor molecule semnal explic i potenialul deosebit
al acestor receptori pentru fiziologia celular. La aceasta se adaug diversificarea pe
care o pot asigura seturile de efectori intracelulari din diferitele tipuri de celule care
folosesc aceti receptori.
Au fost identificate circa 1000 de tipuri de receptori cuplai cu proteine G
heterotrimerice. Numrul lor mare poate fi corelat cu faptul c recunosc i mediaz
rspunsuri la stimularea celular printr-o gam foarte divers de molecule semnal
(peptide i hormoni peptidici, neurotransmitori sau mediatori lipidici) i prin
stimuli senzoriali.
Ca s argumentm mai concludent marea diversitate a receptorilor cuplai cu
proteine G heterotrimerice, putem da drept exemplu pe cei sensibili la substanele
odorante din mucoasa nazal. Exist un numr foarte mare de receptori olfactivi
diferii, circa 350 subtipuri în mucoasa nazal la om i aproximativ 1000 la oarece,
ceea ce explic simul olfactiv mai dezvoltat la cel din urm.
Numrul acestor receptori este amplificat i de faptul c pentru acelai ligand
pot exista mai muli receptori; de exemplu exist 9 receptori activai prin adrenalin,
5 pentru acetilcolin i cel puin 15 pentru serotonin.
Succint, mecanismul de aciune al acestor receptori implic urmtoarele patru
etape:
1. legarea ligandului i activarea receptorului;
2. interaciunea receptorului activat cu proteinele G heterotrimerice i activarea
acestora prin eliberarea GDP, urmat de legarea GTP i disocierea trimerului în
subunitatea D i heterodimerul EJ, ambele elemente rezultate în urma disocierii
efectuând pai independeni în semnalizare;
3. transmiterea semnalului la efectorul din aval care poate avea fie funcie
enzimatic (adenilat-ciclaza, fosfolipaza C-E, GMPc-fosfodiesteraza), fie rol de
canal ionic.
4. dezactivarea proteinei G heterotrimerice prin hidroliza GTP datorat funciei
GTP-azice a subunitii ; în acest fel, subunitatea  revine la conformaia
iniial, inactiv, cu GDP legat, form care are mare afinitate pentru dimerul

cu care se reasociaz, rezultând structura heterotrimeric ce poate începe un


nou ciclu.
Ca în toate celelalte procese de semnalizare, fixarea ligandului determin
reorganizarea conformaiei unor segmente transmembranare din structura
receptorului i expunerea unor motive cheie de aminoacizi la nivelul buclelor
citosolice dintre domeniile transmembranare i de la nivelul segmentului C-terminal

121
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

al lanului polipeptidic. Aceste motive permit modularea interaciunilor


endodomeniului receptorului cu proteina G heterotrimeric. Proteinele G
heterotrimerice funcioneaz ca un „releu” ce cupleaz funcional receptorul din
amonte de efectori din aval. Activarea lor de ctre receptor se concretizeaz prin
schimbarea GDP cu GTP pe subunitatea D i desfacerea trimerului în GD activat i
heterodimerul activat GEJ, fiecare dintre aceste elemente activate având propriile
roluri în cascade de semnalizare de sine stttoare (Fig. 3.24).
Receptorii cuplai cu proteinele G heterotrimerice au mecanisme diferite,
deoarece acionând asupra unor efectori diveri induc rspunsuri difereniate, în
funcie de tipul de protein G heterotrimeric implicat i setul de efectori ai celulei
stimulate. Au fost identificate mai multe tipuri de proteine G heterotrimerice,
cunoscându-se cam 20 subuniti D, cel puin 6 subuniti E i 12 subuniti J[16, 17]
pentru celulele mamiferelor. La om au fost evideniate 16, 5, respectiv 11 gene diferite
care codific subunitile D, E i J [18]. Punctm 7 dintre aceste subuniti D:

Fig. 3.24. Iniializarea semnalizrii prin receptorii cuplai cu proteine G heterotrimerice i


diversitatea de ci ce pot fi urmate. A. Complexul receptor-efector în stare inactiv. Ligandul nu
este legat pe situl specific, ceea ce menine receptorul i heterotrimerul proteinei G în stare inactiv.
Sgeata albastr indic disponibilitatea GTP de a dezlocui GDP de pe subunitatea D a
heterotrimerului. B. Ligandul legat de receptor activeaz endodomeniul care se comport ca factor de
schimbare a GDP cu GTP pe subunitatea D a proteinei G heterotrimerice. Aceast înlocuire
determin desfacerea complexului (sgeile roii, duble, în contrasens) în trei elemente: receptor,
subunitatea GD activat i dimerul EJ, de asemenea activat. Sunt menionate cile ulterioare de
transmitere a semnalului pentru elementele active ale proteinei G heterotrimerice, fiind evident
diversitatea de modaliti de folosire de ctre celule a acestei clase de receptori, ca i faptul c
rspunsurile pot fi rapide sau lente. © Mircea Leabu, 2014.

122
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

1. Ds din proteine G stimulatoare (Gs), care activeaz adenilat-ciclaza i canale de


Ca2+;
2. Di pentru proteine G inhibitoare (Gi), inhibând adenilat-ciclaza i activând
canale de K+;
3. Dq în organizarea proteinelor Gq, care activeaz fosfolipaza C-E;
4. Dolf în proteine G olfactorii (Golf), activând adenilat-ciclaza în neuronii olfactivi;
5. proteine Go, care conin Do inhibând canale de Ca2+ i activând canale de K+ i
fosfolipaza C-E;
6. Dt din proteine Gt (transducin), care activeaz GMPc-fosfodiesteraza în
celulele fotosensibile cu bastonae;
7. D12, sau D13 din organizarea proteinelor G12/13, care activeaz factori de
schimbare a guanozin-nucleotidelor (abreviat GEF, de la numele englezesc
Guanine nucleotide Exchange Factors) în GTP-azele mici (numite i
proteine G mici sau proteine G monomerice) din familia Rho GTP-azelor.
Din diversitatea de fenomene controlate de receptorii cuplai cu proteinele G
heterotrimerice alegem dou pentru exemplificare, ambele folosind ca efector
adenilat-ciclaza i ca mesager secund adenozin-monofosfatul ciclic (AMPc),
produs din ATP de enzima menionat. Prin aciunea adenilat-ciclazei, dintr-o
molecul de ATP rezult o molecul de AMPc cu eliberarea de pirofosfat. Cele dou
fenomene alese pentru detaliere vizeaz rspunsurile rapide (prima exemplificare),
respectiv rspunsurile lente (a doua exemplificare), ambele fiind dependente de
protein-kinaza A activat de AMPc (Fig. 3.25, A).
Rspunsul rapid ales pentru exemplificare (Fig. 3.25, B) se refer la
modularea metabolismului glicogenului în muchiul striat scheletal i controleaz
homeostazia glucozei în celulele acestui esut. Mecanismul este declanat de
protein-kinaza A, efector al cascadei pornite de receptorul cuplat cu proteine G
heterotrimerice din sarcolem (membrana celulei musculare). Protein-kinaza A este
activat de AMPc, produs de adenilat-ciclaz, care este efectorul din amonte stimulat
de subunitatea D a proteinelor G heterotrimerice, dup primirea semnalului de ctre
celul.
Activarea protein-kinazei A implic desprinderea subunitilor catalitice de
cele inhibitoare care le împiedic s acioneze în absena AMPc (aa cum se prezint
în Fig. 3.25, A). Aadar, când adenilat-ciclaza este activat de stimularea receptorilor
cuplai cu proteina G heterotrimeric are loc formarea de AMPc care interacioneaz
cu subunitile inhibitoare din complexul de repaus, inactiv al protein-kinazei A.
Interaciunea cu AMPc schimb conformaia subunitilor inhibitoare, iar
subunitile catalitice se elibereaz, cu situl kinazic activ. Odat activat, protein-
kinaza A intete enzimele implicate în metabolismul glucozei, inhibând formarea
glicogenului (glicogenogeneza) i favorizând eliberarea monozaharidului
(glicogenoliza).
Eliberarea glucozei se face sub form de glucozo-1-fosfat, ca urmare a unui
proces celular ce începe cu activarea fosforilaz-kinazei, prin fosforilarea indus de
protein-kinaza A. Fosforilaz-kinaza fosforilat (aadar în form activat), transmite
informaia, mai departe, la glicogen-fosforilaz. Glicogen-fosforilaza este activat,
prin fosforilare, de ctre fosforilaz-kinaz i acioneaz asupra depozitelor de
glicogen, eliberând glucozo-1-fosfatul. Glucozo-1-fosfatul astfel eliberat este convertit
în glucozo-6-fosfat i intr sub aceast form în procesul de glicoliz. Aadar,
procesul de eliberare a glucozei din glicogen face parte din fenomenele de rspuns
rapid induse de receptorii cuplai cu proteinele G heterotrimerice.

123
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Fig. 3.25. Ci de semnalizare induse de receptorii cuplai cu proteine G heterotrimerice, având
adenilat-ciclaza ca efector. A. Mesagerul secund produs de activarea adenilat-ciclazei, AMP ciclic,
se leag de elementele subunitii reglatorii, ducând la desprinderea acestora de subunitile
catalitice ale protein-kinazei A care devine activ. B. Exemplu de rspuns rapid, prin care se
controleaz depozitele de glucoz reprezentate de incluziunile de glicogen. Protein-kinaza A
activeaz fosforilaz-kinaza, care, la rândul su, stimuleaz glicogen-fosforilaza. Glicogen-fosforilaza
activat elibereaz glucoza din glicogen sub form fosforilat la hidroxilul glicozidic. Glucozo-1-
fosfatul, astfel mobilizat din depozitul de glicogen, intr în procesul de glicoliz, contribuind la
metabolismul energetic celular. C. Exemplu de rspuns lent, prin care se moduleaz exprimarea unor
gene. Protein-kinaza A activat în citosol este translocat în nucleu unde activeaz, prin fosforilare,
CREB, protein specific pentru elemente (secvene de ADN) de rspuns la AMPc. CREB astfel
activat se leag de secvena specific i recruteaz CBP declanând transcrierea genei int. N.B. În
figur nu este sugerat complexitatea transportului din citosol în nucleu a protein-kinazei A, prin porul
nuclear, fenomen care este el însui bine controlat i reglat de celul prin intermediul complexului
proteic al porului care este prezent în figur, în mod schematic. © Mircea Leabu, 2014.

Dar, aa cum am menionat, activarea receptorilor cuplai cu proteine G


heterotrimerice poate induce i rspunsuri celulare lente (Fig. 3.25, C). Astfel de
rspunsuri, mediate tot de protein-kinaza A (activat de creterea concentraiei de
AMPc), presupun transcrierea unor gene specifice i se deruleaz pe parcursul unor
intervale de timp de ordinul orelor, i nu de ordinul secundelor aa cum se întâmpl
în cazul rspunsurilor rapide. Numeroase gene, a cror transcriere este activat de
AMPc, prezint în regiunea reglatoare secvene scurte de ADN denumite elemente de
rspuns la AMPc sau CRE (abreviere de la termenul din limba englez Cyclic AMP
Response Element). Aceste secvene sunt recunoscute de factorul transcripional
124
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

CREB (de la CRE-Binding protein) ce este substrat al protein-kinazei A. Aadar,


protein-kinaza A, activat de AMPc, fosforileaz proteina nuclear CREB (la
hidroxilul unei serine), iar, ulterior, proteina CREB fosforilat recruteaz un
coactivator transcripional denumit CBP (de la CREB-Binding Protein), stimulând
transcrierea genelor int. Factorul transcripional CREB este implicat într-o mare
diversitate de procese celulare: proliferare, supravieuire, difereniere, rspunsuri
adaptative, homeostazia glucozei, spermatogenez, reglarea rspunsurilor imune,
plasticitatea sinaptic asociat cu memorizarea, reglarea ritmului circadian, dar este
implicat i în procese mai puin fiziologice, cum este dezvoltarea dependenei de
droguri [19-21].
Pentru o mai corect i complet înelegere a rolului protein-kinazei A în
semnalizare, câteva aspecte sintetice merit subliniate. În primul rând, faptul c
activarea protein-kinazei A de ctre AMPc presupune o modificare a structurii
cuaternare a acesteia. Astfel, în stare inactiv protein-kinaza A este alctuit din
dou subuniti catalitice i dou subuniti reglatoare (Fig. 3.25, A). AMPc se leag
de subunitile reglatoare, modificându-le conformaia i determinând eliberarea
subunitilor catalitice. Subunitile catalitice eliberate acioneaz mai departe,
fosforilând resturi de serin sau treonin atât la proteine int din citoplasm (de
exemplu fosforilaz-kinaza) cât i la proteine din nucleu (de exemplu proteina CREB).
Un alt aspect ce trebuie subliniat este faptul c protein-kinaza A nu mediaz absolut
toate efectele AMPc de la nivel celular. De exemplu, în neuronii olfactivi AMPc
activeaz direct anumite canale ionice din membrana celular, fr intervenia
protein-kinazei A [22-24].
În sfârit, tot pentru extinderea informaiilor, a cunoaterii i, de ce nu, a
înelegerii s punctm câteva aspecte legate de adenilat-ciclaz. Exist cel puin 8
izoforme de adenilat-ciclaze membranare, clasificate în patru grupe în funcie de
mecanismele reglatorii care le guverneaz activitatea [25], dar au fost identificate i
forme solubile ale acestei enzime [26]. Încercând o sintez a ceea ce se cunoate
despre formele membranare ale acestui efector intracelular, putem spune c
adenilat-ciclaza este o protein integral cu 12 treceri prin bistrat, notate cu TM1 la
TM12 [25, 27]. Ambele capete terminale (amino, respectiv carboxil) ale lanului
polipeptidic se afl pe faa citosolic a bistratului lipidic membranar. Dincolo de
aceste elemente grosiere de organizare, se cunoate faptul c cele 12 segmente
transmembranare sunt grupate în dou blocuri: primele 6 într-un prim bloc, urmat
de o bucl citosolic generoas de cel puin 400 de aminoacizi (component
important a endodomeniului), urmat de al doilea bloc transmembranar cu celelalte
6 segmente care strbat bistratul lipidic, iar captul carboxi-terminal, de asemenea
amplu, contribuie semnificativ la endodomeniu, în timp ce celelalte bucle citosolice
sunt mult mai mici. La organizarea endodomeniului particip substanial i
poriunea N-terminal a lanului polipeptidic, având o lungime semnificativ. Pe
bucla citosolic ce urmeaz primului bloc transmembranar exist o poriune de
aproximativ 230 de aminoacizi (notat C1a) care prezint omologie de aproape 40%
cu un fragment al poriunii citosolice C-terminale (notat C2a), aceste dou
segmente ale lanului polipeptidic (poriuni ale endodomeniului) fiind responsabile
de organizarea sitului catalitic [25]. Ectodomeniul este mai puin abundent, dar
conine situri N-glicozilate pe buclele dintre TM9 i TM10 (Asp805), respectiv TM11
i TM12 (Asp890). Interesant este de remarcat c aceste structuri glucidice
influeneaz activitatea catalitic a adenilat-ciclazei deoarece eliminarea lor afecteaz
funcia enzimei [27], ceea ce sugereaz posibiliti de modulare extracelular. Aceste
informaii reprezint argumente suplimentare asupra diversitii i complexitii
mecanismelor celulare poteniale în care este implicat adenilat-ciclaza.

125
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

S nu uitm c suntem la o discuie asupra diversitii de fenomene de


semnalizare declanate de receptorii cuplai cu proteine G heterotrimerice i la
exemplificri pentru tipuri de rspunsuri rapide, versus tipuri de rspunsuri lente.
Un alt rspuns rapid, declanat de receptorii cuplai cu proteine G
heterotrimerice, se datoreaz activrii fosfolipazei C-E prin subunitatea D a
efectorului din prima linie. Aceast cale de semnalizare duce la declanarea
cascadei fosfoinozitidelor (vezi Fig. 2.9) i se afl printre primele fenomene de
semnalizare descifrate. Fosfatidilinozitolii sunt mai întâi fosforilai succesiv la
hidroxilii din diversele poziii ale inozitolului (de exemplu la hidroxilii din poziiile 4
i 5). Apoi, fosfolipaza C-E, specific pentru fosfoinozitide, scindeaz
fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfaii la inozitol-1,4,5-trisfosfat (IP3) i diacilgliceroli. IP3
difuzeaz rapid de la nivelul membranei celulare în citosol, activând canale de calciu
comandate chimic aflate în membrana reticulului endoplasmic/sarcoplasmic,
determinând eliberarea de Ca2+ din lumenul organitului i creterea concentraiei
acestuia în citosol. Creterea concentraiei citosolice de Ca2+ determin efecte
diverse, în funcie de tipul celulei. În celulele musculare striate cardiace, IP3 deschide
canalul de calciu activat chimic din membrana reticulului sarcoplasmic, determinând
contracia muscular.
Moleculele mici de tipul AMPc sau IP3 cu rol în transmiterea semnalelor
dinspre receptori ctre efectori sunt denumite mesageri secunzi.5
Diacilglicerolul eliberat din fosfatidilinozitol-trisfosfai are, la rândul su,
dou poteniale roluri în semnalizare, acionând i el ca mesager secund i inducând
rspunsuri lente.
Pe de o parte, poate activa protein-kinaze C, efectori cu activitate
serin/treonin-kinazic dependent de Ca2+ (de unde i numele de protein-kinaze C).
Activarea protein-kinazelor C are loc dup recrutarea acestora din citosol la nivelul
feei citoplasmatice a membranei celulare. Aceast recrutare este dependent de
creterea concentraiei citosolice de Ca2+. Ajunse la nivelul feei citoplasmatice a
membranei, protein-kinazele C sunt activate prin efectul cumulat al Ca2+,
diacilglicerolului i fosfatidilserinelor (fosfolipide anionice prezente, în condiii
normale, numai în foia intern a bistratului). Activarea protein-kinazelor C este
urmat de fosforilarea unei diversiti de efectori, diferind de la un tip la altul de
celul i declanând o diversitate de rspunsuri.
Alt posibil rol al diacilglicerolului este acela de a elibera (sub aciunea
fosfolipazelor A2) un alt compus care, prin metabolizare, duce la formarea de
molecule implicate în fenomene de semnalizare. Fosfolipazele A2 elibereaz acidul
arahidonic din compoziia diacilglicerolului. Acest acid gras cu patru duble legturi
este apoi prelucrat de enzime specifice la patru categorii de molecule mesager cu rol
în semnalizri autocrine sau paracrine:
(i) prostaglandine (molecule mesager cu aciune autocrin sau paracrin);
(ii) prostaciclin (molecul mesager cu aciune paracrin produs de celulele
endoteliale);
(iii) tromboxani (mesageri cu aciune paracrin produi de plachete);

5 A se remarca faptul c atât efectorii celulari, cât i mesagerii secunzi fac acelai lucru: preiau semnalul din
amonte i îl transmit în aval. Folosirea a dou sintagme: efectori intracelulari, respectiv mesageri secunzi este
îns îndreptit i difereniaz între compui de natur polipeptidic (proteine, deci macromolecule) implicate în
procesele de semnalizare i compui de greutate molecular mic i de diverse naturi biochimice, inclusiv ioni, ce
particip în desfurarea proceselor de semnalizare. În plus, este de remarcat c sintagma corect, în contextul
semnalizrii celulare, este aceea de mesageri secunzi, nu secundari, pentru a evidenia faptul c sunt la fel de
importani în derularea eficient i corect a procesului de semnalizare ca toate celelalte elemente implicate. Este,
dac vrei similar cu terminologiile din marin: vorbim de cpitan secund i nu secundar, tocmai pentru
importana funciei, aceea de a suplini activitatea superiorului când acesta devine indisponibil. Singura deosebire
este c în semnalizarea celular mesagerii secunzi nu suplinesc ali factori implicai de drept.

126
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

(iv) leucotriene (molecule mesager evideniate a fi produse de leucocite – de


unde i denumirea: triene produse de leucocite – dar i de alte celule ale
sistemului imunitar, cu aciune tot în semnalizarea autocrin sau paracrin).
Primele trei categorii sunt formate pe calea ciclo-oxigenazelor, cea de-a patra
pe calea lipo-oxigenazei. Toi aceti metabolii ai acidului arahidonic fac parte din
clasa eicosanoizilor i acioneaz în reaciile inflamatorii i în producerea
senzaiilor de durere. Medicamentele antiinflamatorii (aspirina, antiinflamatoarele
nesteroidice sau cortizonul) acioneaz prin inhibarea producerii de eicosanoizi.
De remarcat c, în exemplele de mecanisme amintite mai sus, am introdus
noiunea de efector intracelular. Se deduce c numim efector intracelular orice
protein implicat în mecanismele de semnalizare celular care primete mesajul
din amonte, activându-se i îl transmite în aval stimulând urmtorul partener din
proces. În amonte de un anumit efector se poate afla receptorul însui, un mesager
secund sau un alt efector activat.
Mergem mai departe încercând s exemplificm i celelalte tipuri de receptori
pentru liganzi hidrofili.
Receptorii cu activitate guanilat-ciclazic sunt i ei de o mare
diversitate [24]. Trebuie menionat c pentru declanarea mecanismelor de
semnalizare aceti receptori dimerizeaz dup legarea ligandului [28].
Ca exemplu de receptor cu activitate guanilat-ciclazic menionm
receptorul pentru factorul natriuretic atrial. În plmânul bovin, de exemplu, acesta
este o glicoprotein transmembranar, unipas, tip I, cu masa molecular de ~135kDa
care, dup legarea ligandului pe ectodomeniu, activeaz domeniul guanilat-ciclazic
din endodomeniu [29]. De remarcat c endodomeniul receptorului conine i un
domeniu omolog kinazic a crui menire nu este cunoscut, dar sunt dovezi
experimentale care indic faptul c acesta este implicat în modularea/reglarea
activitii receptorului [28, 30]. Guanozin-monofosfatul ciclic (GMPc) format este
mesagerul secund care transmite semnalul unor protein-kinaze dependente de GMPc
(G-kinaze) care fosforileaz specific la Ser sau Thr proteine efectoare din aval
necesare crerii rspunsului celular. Efectele factorului natriuretic atrial (se numete
aa deoarece este secretat de cardiomiocitele atriale) sunt: stimularea eliminrii de
sodiu i ap la nivelul rinichilor i relaxarea celulelor musculare netede din peretele
vascular, ambele conducând la reducerea tensiunii arteriale.
Receptorii cu activitate tirozin-kinazic sunt cei mai numeroi, din
datele de care dispunem în acest moment, între receptorii suprafeei celulare din
clasa receptori cu funcie enzimatic sau cuplai cu enzime. Ei se
caracterizeaz printr-o mare diversitate structural acoperind semnalizarea celular
prin cea mai mare parte a factorilor de cretere cunoscui. Aceti receptori sunt
divizai în 20 de subfamilii, caracterizându-se prin acelai domeniu omolog cu
activitate tirozin-kinazic [31, 32]. Primul identificat a fost receptorul la factorul de
cretere epidermal (EGF). Ligandul acestui receptor este un peptid de ~6kDa, cu 53
aminoacizi în structur.
De regul, receptorii cu activitate tirozin-kinazic (Fig. 3.26) sunt proteine
transmembranare unipas, tip I, care exist ca monomeri în stare liber (face excepie
receptorul la insulin, aflat sub form de dimeri, legai prin punte disulfuric), iar
dup interaciunea cu ligandul dimerizeaz. Domeniul transmembranar este
structurat în D-helix i conine între 28 i 35 de aminoacizi. În ciuda diversitii lor,
exist câteva trsturi comune reprezentate prin anumite domenii structurale relativ
bine conservate. O trstur comun la nivelul poriunii citosolice este reprezentat
de o zon cu activitate tirozin-kinazic (domeniu tirozin-kinazic). Ectodomeniul
(domeniul extracelular) reprezint o poriune semnificativ a lanului polipeptidic cu
captul N-terminal al acestuia i este glicozilat. La nivelul ectodomeniului se pot gsi

127
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

domenii repetitive bogate în leucin, domenii bogate în cisteine, domenii repetitive


fibronectinice de tip III sau domenii de tip imunoglobulinic. Existena unor
asemenea domenii reprezint o posibilitate de clasificare a acestor receptori în familii
i subfamilii. În acest moment exist o clasificare pe baza tipului de ligand cu care
receptorii interacioneaz. Pe de alt parte, pe baza asemnrilor structurale
receptorii tirozin-kinazici se pot include în superfamilii de proteine. Receptorii cu
domenii de tip imunoglobulinic sunt inclui în superfamilia imunoglobulinelor.

Fig. 3.26. Organizarea domeniilor i modul de activare a receptorilor cu activitate tirozin-


kinazic. A. Receptorii în absena interaciunii cu ligandul sunt în stare inactiv i sub form
monomeric în membran. Au domeniul transmembranar format dintr-un singur D-helix.
Ectodomeniul poart situl de legare a ligandului i uniti repetitive fie de acelai tip (cum apare în
figur), fie în combinaii de diferite tipuri (vezi în text despre ce tipuri de uniti repetitive este vorba).
Endodomeniul prezint domeniul kinazic i o poriune care poate lega efectori dup activare. B.
Legarea ligandului determin dimerizarea i activarea receptorului prin trans-fosforilare. Trans-
fosforilarea (reprezentat prin simbolul P din cercurile cu fond de culoare magenta) se poate efectua
atât la nivelul domeniului kinazic (sporind activitatea catalitic), cât i la nivelul altor tirozine din
poriunea de legare a efectorilor. Dup aceste fosforilri, efectorii se leag prin domeniile SH2, fiind
activai i transmiând astfel semnalul în aval. C. Este sugerat diversitatea de ci de semnalizare
declanate de receptorii cu activitate tirozin-kinazic i efectele pe care acestea le pot induce. ©
Mircea Leabu, 2014.

128
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

CASETA 3.1. Proteina Src i domeniile modulare de legare, de tip SH


Proteina Src (prescurtarea este de la sarcoma și în lumea știinific se pronun „sarc”, adic în
conformitate cu pronunia englezeasc a abreviaiei, întrucât ”r” se pronun ”ar”) este o protein
cu activitate kinazic, ce este codificat de proto-oncogena c-src, similar oncogenei virale v-src
(identificat la virusul sarcomei Rous). Src joac un rol important în reglarea dezvoltrii
embrionare i a creterii celulare. În celulele mamiferelor au fost identificate 11 tipuri de proteine
cu secvene omoloage i particulariti comune cu cele ale proteinei Src [33]. Ele formeaz o
familie de proteine cunoscute sub numele de kinazele familiei Src. Reprezentanii acestei familii de
kinaze interacioneaz cu numeroase proteine citosolice, nucleare i membranare pe care le
modific prin fosforilare pe resturi de tirozin, specifice. Prin exercitarea funciei protein-tirozin-
kinazice, membrii familiei de proteine Src regleaz o mare diversitate de procese celulare: cretere
celular, diviziune, difereniere, supravieuire, moarte celular programat, rspunsuri imune,
adeziune celular, motilitate i endocitoz. Controlul strict al activitii lor este esenial pentru
funcionarea celular normal, dereglarea activitii lor fiind incriminat în etiologia unor forme
de cancer.
Protein kinazele aparinând familiei Src au o organizare structural multimodular: (i) o regiune
N-terminal care, prin miristilare și/sau palmitilare, asigur ancorarea mai ferm a endoproteinei
la bistratul lipidic i meninerea ei la nivelul feei citosolice a membranei celulare, (ii) un domeniu
SH3 prin intermediul cruia se fixeaz de motive structurale bogate în resturi de prolin din
structura partenerilor de interaciune, (iii) un domeniu SH2 care recunoate secvene scurte de
aminoacizi ce includ tirozina fosforilat, (iv) un domeniu cu funcie kinazic (abreviat SH1) i (v) o
regiune C-terminal important pentru reglarea activitii kinazice [34, 35].
Menionm c domeniile SH reprezint structuri modulare ce au fost identificate ulterior la
numeroase clase de proteine celulare implicate în lanuri de semnalizare.

Mecanismul de principiu prin care aceti receptori funcioneaz ar putea fi


sintetizat prin urmtoarele etape:
1. Legarea ligandului atrage atât activarea domeniului catalitic de la nivelul
poriunii citoplamatice, cât i dimerizarea receptorilor datorit modificrilor
conformaionale pe care le induce (în cazul receptorului la factorul de cretere
derivat din plachete, prescurtat PDGF – de la „Platelet-Derived Growth
Factor” – ligandul este dimer i dimerizarea receptorului este atras de aceast
caracteristic a factorului de cretere);
2. Activarea i dimerizarea realizeaz condiiile unor autofosforilri încruciate
(trans-autofosforilare) la multiple tirozine ale domeniilor citosolice ale
receptorului. Procesul de autofosforilare are loc la nivelul a dou tipuri de
tirozine: (i) tirozine localizate în domeniul kinazic, a cror fosforilare determin
o cretere marcant a activitii kinazice i (ii) tirozine aflate în afara
domeniului kinazic, care servesc ca situri de ancorare pentru un mare numr de
proteine implicate în procesul de semnalizare. Majoritatea siturilor de
autofosforilare tirozinic sunt localizate în regiunile necatalitice ale domeniului
citosolic;
3. Atragerea i interaciunea cu proteine de semnalizare intracelulare (efectori
enzimatici, proteine adaptoare sau proteine reglatoare) care conin domenii
omoloage Src de tip 2, abreviate prin domenii SH2, cu SH de la Src
Homology (pentru c au fost evideniate pentru prima oar la proteina Src).
Tirozinele modificate prin fosforilare reprezint zonele de interaciune cu
domeniile SH2 (vezi CASETA 3.1). Aadar, proteinele de semnalizare, care se
leag de tirozinele fosforilate din domeniul citoplasmatic al receptorilor
activai, pot fi: efectori enzimatici, proteine adaptoare, respectiv proteine
reglatoare. Toate acestea au structuri i funcii diferite, dar au drept
caracteristic structural, comun prezena domeniilor SH2;
4. Activarea efectorilor legai prin SH2, care înseamn transmiterea semnalului în
aval, prin diferite mecanisme dependente de natura proteinelor cu domenii
SH2 recrutate la nivelul tirozinelor fosforilate din domeniul citoplasmatic al
receptorilor. Astfel, mecanismele de transmitere a semnalului în aval constau în

129
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

activarea efectorilor enzimatici, respectiv în structurarea unor complexe de


semnalizare prin intermediul proteinelor adaptoare, toate evenimentele fiind
dependente de domenii SH2. Domeniile SH2 sunt implicate chiar i în
atenuarea semnalului, atunci când aceasta este fcut prin declanarea
endocitozei urmat de sortarea compuilor internalizai la nivelul endozomilor
timpurii, pentru corecta lor direcionare ctre lizozomi i degradare.
Din categoria efectorilor enzimatici, alii decât kinazele Src, care au fost deja
amintite, menionm fosfolipaza C-
, enzim care prezint dou domenii SH2. Dup
legarea la receptorul activat, fosfolipaza C-
declaneaz calea semnalizrii prin
fosfoinozitide, aa cum a fost prezentat mai sus în cazul fosfolipazei C- . Aadar,
cascada fosfoinozitidelor poate fi declanat atât prin activarea receptorilor cuplai
cu proteine G heterotrimerice, cu implicarea fosfolipazei C- , cât i prin activarea
receptorilor tirozin-kinazici cu implicarea fosfolipazei C-
.
Alt efector cu activitate enzimatic este fosfatidilinozitol 3’-kinaza
(abreviat PI3K, de la numele englezesc). Are tot dou domenii SH2, contribuie dup
activare la formarea unor derivai de fosfatidilinozitoli [fosfatidilinozitol 3-fosfat,
fosfatidilinozitol (3,4)-bisfosfat sau fosfatidilinozitol (3,4,5)-trisfosfat]. Dei PI3K
este acceptat c acioneaz în reglarea proliferrii celulare, ca i în dinamica
morfologiei celulare i motilitate, detaliile mecanismelor acestor procese sunt
departe de a fi pe deplin elucidate.
Proteinele adaptoare reprezint alt categorie de proteine cu domenii SH2
care interacioneaz cu receptorii tirozin-kinazici activai. Acestea nu au activitate
catalitic, dar au funcie de proteine platform i mediaz asocierea fizic dintre
receptorii fosforilai i ali efectori din aval. Proteinele adaptoare au în structura lor
cel puin dou domenii SH care mediaz interaciuni protein-protein. Se consider
c proteinele adaptoare pot juca în afara rolului structural de punte de legtur i un
rol în procesarea semnalului, prin optimizarea amplitudinii i duratei rspunsului la
stimuli.
Un exemplu de protein adaptoare este Grb2 (de la Growth factor receptor
bound protein 2). Grb2 face legtura, în sens fizic, între receptorii pentru factorii de
cretere i o cale de semnalizare cunoscut sub numele de calea Ras-MAPK (Ras de
la Rat sarcoma sau de la Retrovirus-associated DNA sequences, i MAPK de la
Mitogen-Activated Protein Kinase) prin intermediul domeniilor SH din structura
sa. Grb2 are un domeniu SH2 i dou domenii SH3. Aadar, Grb2 se fixeaz cu
domeniul SH2 de receptorul tirozin-kinazic activat i folosete domeniile SH3 pentru
a recruta alte proteine în complexul de semnalizare (proteine care au în structura lor
motive bogate în resturi de prolin). O astfel de protein recrutat de Grb2 este
proteina Sos (de la Son-of-sevenless). Sos are un domeniu C-terminal bogat în
prolin prin intermediul cruia interacioneaz cu domeniile SH3 al proteinei Grb2 i
un alt domeniu, denumit Ras-GEF (GEF de la Guanosine nucleotide Exchange
Factor), prin intermediul cruia interacioneaz cu proteina Ras. Aadar
proteinele cu domenii modulare SH particip la structurarea unor complexe de
semnalizare multiproteice, în cadrul crora proteina Ras, dup cum vom vedea în
continuare, joac un rol foarte important.
O alt categorie de efectori pe care o amintim este cea din superfamilia creia
îi aparine i Ras. Este vorba de GTP-azele mici [36]. GTP-azele mici sunt proteine
monomerice cu o mas molecular în jur de 25kDa care au proprietatea de a lega
GTP pe care îl hidrolizeaz, datorit funciei lor GTP-azice intrinseci (viteza reaciei
de hidroliz a GTP datorat funciei GTP-azice intrinseci este foarte mic), dar mai
ales cu concursul unor proteine care activeaz hidroliza GTP, notate simbolic cu
GAP, de la GTP-ase-Activating Protein. GTP-azele mici sunt activate cât timp
conin GTP i se inactiveaz dup hidroliza acestuia. Datorit capacitii lor de a

130
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

trece ciclic din stare activ în stare inactiv sunt cunoscute i sub numele de
„comutatori moleculari”. În ciclul de activare-inactivare mai particip i alte proteine
partenere i anume factorii de schimbare a guanin-nucleotidului, notate simbolic cu
GEF, de la Guanine nucleotide Exchange Factors. GEF stimuleaz schimbul GDP cu
GTP, aadar determin activarea GTP-azei mici. Când nu este nevoie de funcia lor,
GTP-azele mici sunt localizate în citosol, complexate cu o protein inhibitoare
numit inhibitor de disociere a guanozin-nucleotidului, prescurtat GDI, de
la Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor. Cel mai adesea activarea GTP-azelor
mici este însoit de recrutarea lor la nivelul membranelor (plasmalem sau
endomembrane), recrutare favorizat i de acilare (palmitilare i prenilare) [37]. Din
superfamilia GTP-azelor monomerice fac parte reprezentani ai familiilor de proteine
Ras, Rab, Rac, Ran, Rho. Dintre acestea numai familiile Ras i Rho au legtur cu
receptorii suprafeei celulare. Un alt rol al GTP-azelor este acela de a participa la
controlul corectitudinii traficului structurilor membranare în celul, cum ar fi traficul
dintre reticulul endoplasmic i aparatul Golgi sau traficul veziculelor de secreie ctre
i ancorarea acestora la membrana celular (vezi i Fig. 3.14, A).
Revenind la complexul de semnalizare structurat prin participarea proteinelor
cu domenii SH, rezumm secvena de evenimente:
(i) activarea receptorului tirozin-kinazic este indus de fixarea ligandului, fiind
însoit de dimerizare i fosforilarea unor tirozine din endodomeniul
partenerului de dimerizare;
(ii) tirozinele fosforilate servesc ca situri de recrutare a proteinelor cu domenii
SH2 (de exemplu Grb2), care la rândul lor recruteaz ali participani
(pentru Grb2 este vorba de poteina Sos, care este plasat în vecintatea Ras
astfel încât funcia de GEF, s poat media schimbul nucleotidic GDP cu
GTP);
(iii) forma activ Ras-GTP iniiaz calea de semnalizare Ras-MAP kinazic (un
sistem enzimatic de tip “releu” ce implic o cascad de reacii catalizate de
protein kinaze ce se activeaz secvenial).
Pe lâng efectorii enzimatici i proteinele adaptoare, de receptorii tirozin-
kinazici activai se pot lega (prin intermediul domeniilor SH2) i proteine reglatoare
care atenueaz procesul de semnalizare, printr-un mecanism de reacie negativ. Un
exemplu în acest sens este proteina c-Cbl (abreviaie de la Casitas B-cell
lymphoma). Aceast protein se poate ataa de receptori tirozin-kinazici activai (de
exemplu de receptorul pentru factorul de cretere epidermal, abreviat EGF) i
determin modificarea covalent a acestora prin ubiquitinare. Mai precis, c-Cbl
catalizeaz grefarea covalent a câte unei singure molecule de ubiquitin (proces
denumit mono-ubiquitinare) în unul sau mai multe situri din structura receptorului.
Mono-ubiquitinarea promoveaz endocitoza i degradarea receptorului în lizozomi,
aceast modificare mediat de proteina c-Cbl fiind aadar responsabil de atenuarea
semnalului [38]. Ubiquitina este o protein înalt conservat în decursul evoluiei
speciilor i are roluri multiple în celul (vezi CASETA 3.2).
Receptorii cuplai cu tirozin-kinaze citosolice includ o mare diversitate
de proteine transmembranare. Din aceast categorie fac parte receptorii pentru
hormonii de cretere, cei pentru citokine, receptorii specifici antigenelor
(receptorii pentru antigene) din limfocitele T i B devenite imunocompetente.
Mecanismul de aciune a acestor receptori implic dimerizarea/multimeri-
zarea receptorului, dup legarea ligandului, aceasta inducând activarea i
transmiterea semnalului prin tirozin-kinaze citosolice asociate. Mai bine cunoscute
sunt tirozin-kinazele citosolice din familia Src, în timp ce cele din familia Janus,
relativ de curând descrise, sunt mai puin cunoscute.

131
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

CASETA 3.2. Ubiquitina i ubiquitinarea cu multiplele ei roluri


Ubiquitina este o protein alctuit din 76 de aminoacizi (8,5 kDa), extrem de bine conservat
din punct de vedere filogenetic. Ubiquitina se poate fixa covalent de proteine int sub form de
mono-, multi- i poli-ubiquitin. Aceste modificri post-traducere determin localizarea,
funcionalitatea i stabilitatea proteinelor respective [39]. Una dintre cele mai studiate funcii ale
ubiquitinei se refer la reglarea proteolizei. Astfel, conjugarea mai multor molecule de ubiquitin
la o protein int prin poli-ubiquitinare (constând în grefarea unor catene liniare formate din 4-6
molecule succesive de ubiquitin) marcheaz proteina respectiv pentru degradare. Aceast
degradare are loc în proteazom, organit nedelimitat de endomembrane, sub aciunea complexului
proteolitic ATP-dependent, major al celulei. Ubiquitinarea poate s determine pe lâng degradarea
proteolitic i alte “destine” ale proteinelor int. De exemplu, modificrile prin mono-ubiquitinare
servesc ca semnal de recunoatere în traficul de membrane, endocitoz, repararea ADN i în
exportul nuclear [40]. Atragem atenia c trebuie fcut diferena între termenul de poli-
ubiquitinare (grefarea de ubiquitine legate succesiv, deci a unor lanuri de ubiquitine) i multi-
ubiquitinare (care const în mono-ubiquitinri multiple, deci în grefarea câte unei singure
molecule de ubiquitin în mai multe locuri de pe proteina int).

Fig. 3.27. Calea de semnalizare JAK/STAT aferent receptorilor cuplai cu protein-kinaze


citosolice. A. În absena interaciunii cu ligandul, receptorul inactiv poart pe endodomeniu JAK
inactiv. B. Legarea ligandului la receptor determin dimerizarea receptorului, ceea ce permite trans-
fosforilarea moleculelor JAK, care se activeaz astfel i determin fosforilarea siturilor de legare a
efectorului, pe endodomeniile receptorilor din dimer (simbolul P în cercurile pe fond magenta). C.
Fosforilarea receptorilor determin legarea efectorului STAT care este fosforilat de JAK activat. D.
Moleculele STAT fosforilate se desprind de complexul receptor stimulat-JAK activat sub forma unui
dimer de STAT activ. Sub aceast form, dimerul STAT fosforilat este translocat în nucleu unde
determin transcrierea unor gene specifice. © Mircea Leabu, 2014.

132
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Tirozin-kinazele citosolice fosforileaz o multitudine de efectori, transmiând


mesajul primit de celul în aval, pentru inducerea rspunsului celular adecvat. Calea
JAK-STAT (abreviaiile efectorilor vin de la Janus kinase6-Signal Transducer and
Activator of Transcription) este un exemplu pentru asemenea mecanisme de
semnalizare (Fig. 3. 27), care se finalizeaz prin transcrierea unor gene, cum se
întâmpl la semnalizarea indus de eritropoietin, hormonul de cretere sau
prolactin [41, 42]. Activarea cii de semnalizare JAK-STAT de ctre citokine /factori
de cretere/hormoni poate stimula proliferarea celular, diferenierea, migrarea
celular sau apoptoza. Aceste evenimente celulare sunt eseniale pentru
hematopoiez, rspunsurile imune, dezvoltarea glandei mamare, lactaie i diverse
alte procese celulare. Dereglarea transmiterii semnalului pe calea JAK-STAT, aa
cum se poate anticipa cu uurin, este însoit de o serie de manifestri patologice:
procese inflamatorii, eritrocitoz, gigantism i tumorigenez [43].
Calea de semnalizare JAK-SAT este relativ simpl din punctul de vedere al
mecanismului i implic participarea unui numr mic de componente cu rol de
„actori” principali: ligandul, receptorul, kinaza asociat (JAK) i efectorul STAT.
Activarea JAK este determinat de dimerizarea/multimerizarea receptorului indus
de interaciunea cu ligandul, astfel încât, ca urmare a modificrilor conformaionale
din endodomeniul receptorului, moleculele de JAK ajung în imediata vecintate,
expuse i se pot fosforila încruciat (trans-fosforilare) la nivelul domeniilor lor cu
activitate kinazic. Kinazele asociate receptorului (JAK) astfel activate fosforileaz,
ulterior, tirozine din endodomeniile receptorilor i din diverse alte substrate,
principala protein int fiind STAT. Proteinele STAT sunt factori transcripionali
lateni, cu localizare citosolic, pân în momentul activrii lor. La mamifere au fost
identificate apte tipuri de STAT, toate având drept caracteristici structurale comune
un rest de tirozin plasat în apropierea captului C-terminal, care reprezint situsul
de fosforilare pentru JAK, precum i un domeniu SH2 care îndeplinete dou funcii,
de ancorare la receptorul fosforilat de JAK i, respectiv, de dimerizare. Aadar, JAK
în form activ fosforileaz tirozine aparinând receptorului care, ulterior, servesc ca
situri de ancorare pentru STAT. Odat fixat de receptor, proteina STAT este
fosforilat de JAK, iar aceast modificare determin disocierea STAT de receptor.
Fosforilarea de ctre JAK a tirozinei din apropierea captului C-terminal al proteinei
STAT este responsabil i de homodimerizarea proteinelor STAT, întrucât
fosfotirozina este recunoscut i fixat prin intermediul domeniului SH2 din
structura partenerului de dimerizare. STAT în form de dimer este translocat în
nucleu i se fixeaz la ADN, pe secvene specifice cu rol reglator, care activeaz sau
represeaz transcrierea genelor int. Prin aceast secven de evenimente, calea de
semnalizare JAK-STAT asigur un mecanism direct de traducere a unui semnal
extracelular într-un rspuns transcripional. Cu toate acestea, chiar dac mecanismul
acestei ci de semnalizare pare s fie relativ simplu (cel puin teoretic), trebuie avut
în vedere c modularea semnalizrii JAK-STAT este extrem de complex, întrucât
alturi de componentele principale pot interveni o multitudine de proteine efectoare
[44]. Exemple, în acest sens, sunt proteinele STAM (Signal-Transducing Adapter
Molecules) i StIP (Stat-Interacting Protein). Proteinele STAM reprezint
substrate de fosforilare pentru JAK, având capacitatea de a interveni în activarea

6Abrevierea vine de la o viziune metaforic ce pleac de la faptul c pe aceste kinaze exist dou situri kinazice
(unul standard i unul mai neobinuit a crui funcie a fost într-o oarecare dezbatere, dei acum sunt dovedite
rolurile lui modulatoare), ceea ce a condus pe cei care au denumit enzima la ideea asemnrii cu Janus, zeul cu
dou fee din mitologia roman. Ali autori (mai puin sensibili la mitologie?) consider abrevierea ca provenind
de la Just Another Kinase (vezi aceast alternativ la originea abrevierii în Silvennoinen O, Witthuhn BA,
Quelle FW, Cleveland JL, Yi T, Ihle JN. (1993) Structure of the murine Jak2 protein-tyrosine kinase and its
role in interleukin 3 signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 90(18): 8429-33).

133
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

transcripional a unor gene int specifice (printr-un mecanism care nu a fost înc
elucidat). Proteinele StIP se pot asocia atât cu JAK, cât i cu STAT (în form
nefosforilat) i servesc, probabil, ca platform (proteine adaptoare) pentru a facilita
fosforilarea STAT de ctre JAK. În plus, au fost identificate i proteine reglatoare
care atenueaz semnalizarea JAK-STAT printr-un mecanism de reacie negativ [45].
Stingerea semnalului prin inactivarea proteinelor JAK i STAT presupune
defosforilri ale fosfotirozinelor (care fosforilate au rol activator) sub aciunea unor
fosfotirozin-fosfataze specifice.
Receptorii cu activitate Ser/Thr-kinazic sunt reprezentai de receptorii
pentru factorii de cretere transformani E. Factorii de cretere transformani E
reprezint o familie de peptide ce mediaz, prin intermediul receptorilor lor, o
multitudine de fenomene celulare în vertebrate. Efectele difer de la un tip de celul
la altul, putând inhiba proliferarea, putând stimula sinteza de proteine de matrice
extracelular inclusiv formarea de os, sau putând determina micarea celular
chemotactic.
Cât privete receptorii cu activitate fosfatazic, putem aminti ca exemplu
glicoproteina transmembranar, unipas CD45 din membrana limfocitelor T i B care
particip în mod esenial la activarea prin antigene. (Prescurtarea CD vine de la
Cluster of Differentiation, semnificând tipuri de proteine de pe suprafaa celular
prin care sunt desemnate limfocitele în diferite faze din cursul diferenierii.)
Pentru o imagine mai complet a diversitii fenomenelor pe care receptorii le
pot declana în celule, trebuie menionat c aceasta sporete prin faptul c activarea
lor se poate face difereniat în diferite momente. Celula este determinat s se
comporte astfel cum îi impune combinaia de semnale pe care le primete la un
moment dat. Comportamentul ei ine de echilibrul între rspunsurile sinergice la
stimuli.
Un ultim aspect pe care îl abordm în contextul semnalizrii celulare este
legat de rolul integrinelor i/sau moleculelor de adeziune celular, în asemenea
fenomene membranare. Menionm c prescurtarea internaional a sintagmei
molecule de adeziune celular este CAM i vine de la numele englezesc al ei: Cell
Adhesion Molecule. Aceste tipuri de semnalizare, prin integrine, respectiv CAM, pot
fi incluse în categoria semnalizrilor juxtacrine.
Integrinele sunt proteine transmembranare organizate ca heterodimeri DE.
Fiecare subunitate reprezint o protein transmembranar unipas, tip I. Dup datele
cunoscute i recunoscute în prezent de comunitatea tiinific a domeniului, exist 18
tipuri de subuniti D i 8 tipuri de subuniti E. Totui, numai 24 de integrine (adic
de heterodimeri DE) au fost identificate pân în prezent [46]. Integrinele sunt
receptori celulari pentru proteinele de matrice extracelular. Ele transmit semnale
celulei despre starea ei de ataare i despre caracteristici ale ambianei extracelulare.
Celula se comport diferit dac este ataat la matrice sau nu. Mai mult, integrinele
sunt implicate în motilitatea celular. Motilitatea celular este un fenomen
dependent i de semnale primite de celul de la alte tipuri de liganzi, prin receptorii
corespunztori. În aceast situaie, în care motilitatea este indus de rspunsul
celular la semnale primite de la molecule pentru care exist receptori pe suprafaa
celulei care se mic, este vorba de fenomenul numit chemotaxie. Atunci când
motilitatea este indus numai de interaciunile celulei cu matricea extracelular,
fenomenul poart numele de haptotaxie. Mecanismele haptotaxiei sunt mai puin
cunoscute în acest moment. Dincolo de rspunsul prin motilitate la stimuli, fenomen
în care sunt implicate integrinele, practic semnalele pe care celula le primete prin
receptorii pentru proteinele matricei extracelulare, analizate simultan cu celelalte
semnale, influeneaz i alte fenomene, cum ar fi: proliferarea celular, diferenierea

134
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

celular, apoptoza (tip de moarte celular programat). Apoptoza indus de


detaarea celulelor de substrat este denumit anoikis.
Integrinele sunt exemplul sugestiv de componente membranare implicate în
semnalizarea celular în ambele sensuri [46-48]: din exteriorul celulei ctre interior,
aa cum este cazul în toate cile de semnalizare sistematizate i prezentate succint în
cele de mai sus, dar i din interiorul celulei ctre exterior. Pentru realizarea rolului
lor, în diversitatea de procese celulare amintite mai sus, integrinele coopereaz cu
kinaze citosolice (kinazele adeziunii focale, prescurtat FAK, de la denumirea
englezeasc Focal Adhesion Kinase, kinazele asociate integrinelor, abreviate
prin ILK, de la Integrin-Linked Kinase, sau Src) [49-52], cu proteine adaptoare
(paxilin, Grb2, abreviaie de la Growth factor receptor-bound protein 2) [50] sau
cu comutatori moleculari din clasa GTP-azelor mici (RhoA, Rac1, Cdc42) [53, 54].
Dintre cele dou subuniti D, respectiv E ale heterodimerului, cele cu implicarea de
baz, în asemenea procese celulare, sunt subunitile E, iar mecanismele prin care
acestea iniiaz procese de semnalizare sunt mai bine cunoscute. Totui, exist dovezi
experimentale conform crora i subunitile D asist procesele de semnalizare prin
integrine [50, 55], modulându-le discret, dar semnificativ, dei mecanismele prin
care aceste componente ale heterodimerului acioneaz sunt mai puin descifrate.
C integrinele sunt o unealt pentru semnalizarea celular în dublu sens, se
poate argumenta simplu, prin descrierea organizrii heterodimerului în membran i
modificrile pe care conformaia diferitelor sale domenii (ectodomeniul, domeniul
transmembranar, respectiv endodomeniul) le sufer în timpul exercitrii funciei. În
stare de repaus, forma inactiv a dimerului DE are o structur pliat cu partea distal
a ectodomeniului îndoit ctre plasmalem, precum lama unui briceag în teac.
Diferitele zone ale ectodomeniului astfel pliat au primit, sugestiv, denumiri care ne
conduc la prie anatomice ale piciorului: gamb, pentru poriunea pliat (partea
distal a lanului polipeptidic care structureaz ectodomeniul), coaps, pentru
poriunea proximal plasmalemei din ectodomeniul heterodimerului i genunchi,
pentru poriunea cu rol de balama, la nivelul creia se petrece plierea [46, 56]. În
stare pliat, adic inactiv, ectodomeniul integrinelor se extinde pân la o distan de
10nm fa de aliniamentul bistratului lipidic. Asta înseamn c în stare inactiv
siturile de interaciune cu ligandul ale integrinelor sunt mascate în glicocolix, care
are o grosime minim de 20nm. Prin activare, ectodomeniul heterodimerului se
extinde, precum lama briceagului cu acionare prin buton, expunând siturile de
legare la suprafaa glicocalixului, unde pot interaciona cu partenerii, care sunt
proteine ale matricei extracelulare. Activarea este controlat i comandat din
interiorul celulei, adic rspunde la un semnal din interior în afar. Dup activare,
atâta timp cât integrina nu este legat de proteina de matrice specific,
endodomeniile celor dou subuniti rmân apropiate unul de altul, într-o
conformaie numit strâns [57], astfel încât efectorii intracelulari nu au acces la
siturile de legare. Dup interaciunea cu ligandul, adic, dup interaciunea cu
proteina de matrice, endodomeniile celor dou subuniti D, respectiv E se separ
lsând accesibile siturile de interaciune cu efectorii, iar procesele de semnalizare se
declaneaz. În sfârit, o ultim modificare conformaional propus pentru
ectodomeniul integrinelor active, dup legarea partenerului, este una angular,
flexat, stabil prin care strânge componentele legate, apropiind elementele de
matrice extracelular de membran i întrind fora legturii, ceea ce se întâmpl
odat cu aglomerarea complexelor integrin-protein de matrice la nivelul
microdomeniului de membran corespunztor poriunii joncionate [46].
Pentru a finaliza aceast succint referire la procesele de semnalizare pe care
integrinele le declaneaz, este demn de menionat c acestea sunt prin excelen un
mijloc de interferen (diafonie) cu semnalizrile prin intermediul receptorilor la

135
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

liganzii solubili, indiferent de tipul de receptori crora acetia le sunt destinai, având
loc astfel modulri dintre cele mai diverse în comportamentul celulelor ce recepteaz
o pluralitate de stimuli concomitent [58, 59]. Se produc astfel asamblri i
dezasamblri ale atarilor celulare la substrat, pentru a facilita funciile celulelor în
cadrul esuturilor în cazuri deosebite, când este nevoie de formarea sau refacerea
acestora [60].
CAM sunt proteine transmembranare, unipas implicate în adeziunea celulelor
între ele. Deoarece în stabilirea interaciunilor homofile dintre CAM la nivelul
jonciunilor este nevoie de ioni de calciu, aceste proteine transmembranare se mai
numesc caderine (aderine dependente de calciu). Caderinele, care formeaz o
familie de proteine, transmit semnale celulei dac sunt sau nu implicate în asemenea
interaciuni, la nivelul unor microdomenii de membran numite, de regul, jonciuni
celulare. Celula se comport diferit dac este aderat de alte celule sau este liber. În
momentul de fa sunt dovedite dou fenomene celulare pe care semnalizarea prin
caderine le poate induce: inhibiia de contact a locomoiei [61], respectiv inhibiia de
contact a proliferrii [62]. Ambele au putut fi evideniate în studii ale celulelor în
cultur, dar se caut semnificaia lor in vivo, existând raportri care dovedesc
implicarea acestor fenomene în procese de dezvoltare embrionar [63]. Ca i
integrinele, caderinele coopereaz în funciile lor cu proteinele G mici din familia
Rho-GTPazelor, care moduleaz citoscheletul de actin i interfer cu semnalizrile
altor receptori. De exemplu, la inhibiia de contact a proliferrii, contactul dintre
celule reduce sensibilitatea acestora la factorii de cretere prin inhibarea receptorilor
specifici [62].

3.3.3. Consideraii finale asupra semnalizrii celulare


Ce putem extrage ca semnificaie biologic, adic ce putem esenializa
referitor la fenomenele de semnalizare pentru înelegerea importanei lor în buna
funcionare a celulei i, de aici, pentru buna funcionare a biostructurilor (esuturi,
organe) la formarea crora celulele particip? Întrebarea nu este deloc retoric.
Din tot ce a fost prezentat în subcapitolul pe care îl încheiem aici, referitor la
acest subiect provocator de biologie celular a biomembranelor, este uor de
rememorat diversitatea de fenomene de semnalizare ce se declaneaz la nivelul
membranelor (în cazul moleculelor semnal hidrofile) sau pe care membrana le
faciliteaz, permiând difuzia moleculelor semnal prin planul ei (în cazul liganzilor
lipofili). Din datele acumulate pân în prezent, diversitatea de fenomene de
semnalizare prin receptorii membranari este mai mare decât pentru receptorii
intracelulari, chiar dac între acetia au fost identificai (pe baza studiului
genomului) unii denumii sugestiv receptori orfani, deoarece liganzii lor ne sunt înc
necunoscui. De remarcat c pe msur ce liganzii sunt identificai, aceti receptori se
renumesc receptori orfani adoptai. Aadar, diversitatea de fenomene de semnalizare
poate fi în primul rând argumentat prin diversitatea de tipuri de receptori. Acest
lucru se leag cu caracterul eterogen al organizrii moleculare a biomembranelor i
semnificaia biologic a acestei realiti. Dincolo de diversitatea datorat marii
variabiliti a tipurilor de receptori, varietatea de fenomene ce se petrec în celule,
dup receptarea de semnale, se explic i prin setul de efectori pe care o celul sau
alta îl au la dispoziie. De aceea, aceeai molecul semnal poate induce în diverse
celule rspunsuri diferite. În sfârit, diversitatea de comportamente celulare la
receptarea unuia sau a altuia dintre semnale este guvernat i de setul de semnale pe
care o celul le primete simultan, inclusiv de intensitatea fiecruia (adic rspunsul
celulei depinde de echilibrul dintre diferitele semnale primite). Aadar, totalitatea
semnalelor primite simultan de o celul creeaz interferene între cile de
semnalizare pe care fiecare dintre stimuli le declaneaz, rezultatul fiind unul reieit
din echilibrul care se stabilete în celul între diferitele fenomene menite s duc la
136
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

crearea rspunsului optim. Fr aceast capacitate de a gsi calea de echilibru, celula
nu s-ar putea adapta, supravieui i funciona în limite normale. De altfel, multe
patologii sunt legate de pierderea de ctre celul a acestei abiliti de echilibrare a
stimulilor.
În ciuda acestei diversiti de fenomene i elemente biochimice care concur
la producerea lor, exist câteva aspecte principiale, care pot crea câteva idei generale,
dar nu absolute, referitor la mecanismele semnalizrii:
(i) orice proces de semnalizare nu poate fi iniiat în absena a doi factori:
molecula semnal (numit generic i ligand), respectiv receptorul specific,
aceti doi factori biochimici trebuind s interacioneze pentru declanarea
fenomenelor;
(ii) interaciunea ligand-receptor duce la stimularea/activarea celui din urm i,
în aceast stare, receptorul activeaz, la rândul su, elemente intracelulare
care particip la procesul de semnalizare (efectori intracelulari, mesageri
secunzi);
(iii) elementele intracelulare implicate preiau semnalul din amonte (de la receptori
direct sau de la efectori, sau mesageri secunzi aflai înaintea lor în calea de
semnalizare) i îl transmit în aval altor efectori;
(iv) procesele menionate la punctele (ii) i (iii) reprezint i momente de
amplificare a semnalului, deoarece receptorii activai de liganzi sau efectorii
activai de participanii din amonte la fenomen, cât sunt în stare activ
transmit informaia la un numr mai mare de efectori din aval (activeaz mai
muli efectori de dup ei în calea de semnalizare sau produc mai multe
molecule de mesager secund); de aceea se vorbete de cascade de semnalizare:
informaia primit de celul este amlificat într-un torent (de menionat c nu
toate procesele de semnalizare implic, obligatoriu, amplificare);
(v) cile de semnalizare conin mai muli sau mai puini pai, pân când celula
ajunge în faza de a realiza rspunsul adecvat la semnalul primit; putem puncta
aici o regul de principiu, cu extindere în tot ce se întâmpl în celul: cu cât
procesul celular este mai complex, are mai muli pai, cu atât celula are mai
multe posibiliti de control asupra acestuia; în contextul subiectului nostru,
cu cât o cale de semnalizare este mai complex, cu atât celula o poate controla
mai bine, iar punctele de interferen pot fi mai numeroase, ceea ce, atâta
timp cât fenomenele sunt sub control adecvat, este spre binele celulei;
(vi) dup realizarea rspunsului la stimul, celula trebuie s se desensibilizeze
pentru a putea reveni la disponibilitatea de a primi acelai semnal în orice
moment în viitor;
(vii) o ultim meniune este cea referitoare la ce pot s însemne activrile diverilor
participani la mecanismul semnalizrii; în primul rând diferitele interaciuni
atrag modificri ale conformaiilor proteinelor implicate; nu întotdeauna
acestea sunt suficiente activrii propriu-zise, ci adesea sunt necesare
modificri post-traducere ale lanului polipeptidic, în varii poziii; cel mai
adesea este vorba de jocul fosforilare/defosforilare sau de schimbri de
molecule mici în diferite complexe, cum se întâmpl la proteinele G (fie ele
heterotrimerice sau monomerice); aadar activrile implic modificri
conformaionale, chimice sau chiar de ambele naturi care sunt reversibile,
aceast reversibilitate reprezentând practic posibilitatea de trecere a
proteinelor de semnalizare din stare inactiv în stare activ i invers.
Dincolo de aceast diversitate de fenomene de semnalizare, în celul lucrurile
se petrec coerent, unitar deoarece exist mecanisme de control i de interferare a
semnalelor în orice combinaie ar stimula ele celula int la un moment dat. Putem
aadar vorbi i în contextul semnalizrii celulare de unitate nscut din diversitate.

137
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

Bibliografie specific
1. Rall TW, Sutherland EW. (1958) Formation of a cyclic adenine ribonucleotide by tissue particles. J
Biol Chem. 232(2): 1065-1076.
2. Sutherland EW, Rall TW. (1958) Fractionation and characterization of a cyclic adenine
ribonucleotide formed by tissue particles. J Biol Chem. 232(2): 1077-1091.
3. Sutherland EW, Oye I, Butcher RW. (1965) The action of epinephrine and the role of the adenyl
cyclase system in hormone action. Recent Prog Horm Res. 21: 623-646.
4. Beavo JA, Brunton LL. (2002) Cyclic nucleotide research – still expanding after half a century. Nat
Rev Mol Cell Biol. 3: 710-718.
5. Popescu LM, Faussone-Pellegrini MS. (2010) TELOCYTES - a case of serendipity: the winding way
from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. J Cell Mol
Med. 14(4):729-740. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2010.01059.x.
6. Popescu LM, Gherghiceanu M, Cretoiu D, Radu E. (2005) The connective connection: interstitial
cells of Cajal (ICC) and ICC-like cells establish synapses with immunoreactive cells. Electron microscope
study in situ. J Cell Mol Med. 9(3): 714-730.
7. Mullican SE, Dispirito JR, Lazar MA. (2013) The orphan nuclear receptors at their 25-year
reunion. J Mol Endocrinol. 51(3): T115-T140. DOI: 10.1530/JME-13-0212.
8. Shi Y. (2007) Orphan nuclear receptors in drug discovery. Drug Discov Today. 12(11-12): 440-445.
9. Miyazawa A, Fujiyoshi Y, Unwin N. (2003) Structure and gating mechanism of the acetylcholine
receptor pore. Nature. 423(6943): 949-955.
10. Lester HA, Dibas MI, Dahan DS, Leite JF, Dougherty DA. (2004) Cys-loop receptors: new twists
and turns. Trends Neurosci. 27(6): 329-336.
11. Doyle DA. (2004) Structural changes during ion channel gating. Trends Neurosci. 27(6): 298-302.
12. Yoshida Y, Imai S. (1997) Structure and function of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Jpn J
Pharmacol. 74(2): 125-137.
13. Bosanac I, Yamazaki H, Matsu-Ura T, Michikawa T, Mikoshiba K, Ikura M. (2005) Crystal
structure of the ligand binding suppressor domain of type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Mol
Cell. 17(2): 193-203.
14. Foskett JK, White C, Cheung KH, Mak DO. (2007) Inositol trisphosphate receptor Ca2+ release
channels. Physiol Rev. 87(2): 593-658.
15. Haga T. (2013) Molecular properties of muscarinic acetylcholine receptors. Proc Jpn Acad Ser B Phys
Biol Sci. 89(6): 226-256.
16. Berman DM, Gilman AG. (1998) Mammalian RGS proteins: barbarians at the gate. J Biol Chem.
273: 1269-1272.
17. Patel TB. (2004) Single transmembrane spanning heterotrimeric G protein-coupled receptors and their
signaling cascades. Pharmacol Rev. 56: 371-385.
18. Hurowitz EH, Melnyk JM, Chen YJ, Kouros-Mehr H, Simon MI, Shizuya H. (2000) Genomic
characterization of the human heterotrimeric G protein D, E, and J subunit genes. DNA Res. 7: 111-120.
19. Sakamoto KM, Frank DA. (2009) CREB in the pathophysiology of cancer: implications for targeting
transcription factors for cancer therapy. Clin Cancer Res. 15: 2583-2587.
20. Wen AY, Sakamoto KM, Miller LS. (2010) The role of the transcription factor CREB in immune
function. J Immunol. 185: 6413-6419.
21. Larson EB, Graham DL, Arzaga RR, Buzin N, Webb J, Green TA, Bass CE, Neve RL,
Terwilliger EF, Nestler EJ, Self DW. (2011) Overexpression of CREB in the nucleus accumbens
shell increases cocaine reinforcement in self-administering rats. J Neurosci. 31: 16447-16457.
22. Müller F, Bönigk W, Sesti F, Frings S. (1998) Phosphorylation of mammalian olfactory cyclic
nucleotide-gated channels increases ligand sensitivity. J Neurosci 18: 164-173.
23. Boccaccio A, Lagostena L, Hagen V, Menini A. (2006) Fast adaptation in mouse olfactory sensory
neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J Gen Physiol 128: 171-184.
24. Pifferi S, Cenedese V, Menini A. (2012) Anoctamin2/TMEM16B: a calcium activated chloride
channel in olfactory transduction. Exp Physiol. 97: 193-199.
25. Sadana R, Dessauer CW. (2009) Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase
isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17(1): 5-22. DOI:
10.1159/000166277.
26. Tresguerres M, Levin LR, Buck J. (2011) Intracellular cAMP signaling by soluble adenylyl cyclase.
Kidney Int. 79(12): 1277-1288. DOI: 10.1038/ki.2011.95.

138
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

27. Willoughby D, Cooper DM. (2007) Organization and Ca2+ regulation of adenylyl cyclases in cAMP
microdomains. Physiol Rev. 87(3): 965-1010.
28. Lucas KA, Pitari GM, Kazerounian S, Ruiz-Stewart I, Park J, Schulz S, Chepenik KP,
Waldman SA. (2000) Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP. Pharmacol Rev. 52(3): 375-414.
29. Uchida K, Mizuno T, Shimonaka M, Sugiura N, Nara K, Ling N, Hagiwara H, Hirose S.
(1989) Purification and properties of active atrial-natriuretic-peptide receptor (type C) from bovine lung.
Biochem J. 263(3): 671-678.
30. Misono KS, Philo JS, Arakawa T, Ogata CM, Qiu Y, Ogawa H, Young HS. (2011) Structure,
signaling mechanism and regulation of the natriuretic peptide receptor guanylate cyclase. FEBS J.
278(11): 1818-1829. doi: 10.1111/j.1742-4658.2011.08083.x.
31. Zwick E, Bange J, Ullrich A. (2001) Receptor tyrosine kinase signalling as a target for cancer
intervention strategies. Endocr Relat Cancer. 8(3): 161-173.
32. van der Geer P, Hunter T, Lindberg RA. (1994) Receptor protein-tyrosine kinases and their signal
transduction pathways. Annu Rev Cell Biol. 10: 251-337.
33. Hunter T. (2009) Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Curr Opin Cell Biol. 21: 140-
146.
34. Okada M. (2012) Regulation of the Src family kinases by Csk. Int J Biol Sci. 8: 1385-1397.
35. Roskoski R Jr. (2004) Src protein-tyrosine kinase structure and regulation. Biochem Biophys Res
Commun. 324: 1155-1164.
36. Goldfinger LE. (2008) Choose your own path: specificity in Ras GTPase signaling. Mol BioSyst. 4:
293-299.
37. Ahearn IM, Haigis K, Bar-Sagi D, Philips MR. (2012) Regulating the regulator: post-translational
modification of Ras. Nat Rev Mol Cell Biol 13: 39-51.
38. Pennock S, Wang Z. (2008) A tale of two Cbls: interplay of c-Cbl and Cbl-b in epidermal growth
factor receptor downregulation. Mol Cell Biol. 28: 3020-3037.
39. Grabbe C, Husnjak K, Dikic I. (2011) The spatial and temporal organization of ubiquitin networks.
Nat Rev Mol Cell Biol. 12: 295-307.
40. Miranda M, Sorkin A. (2007) Regulation of receptors and transporters by ubiquitination: new
insights into surprisingly similar mechanisms. Mol Interv. 7: 157-167.
41. Watowich SS. (2011) The erythropoietin receptor: molecular structure and hematopoietic signaling
pathways. J Investig Med. 59(7): 1067–1072. DOI:10.231/JIM.0b013e31820fb28c.
42. Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N, Kelly PA. (1998) Prolactin (PRL) and its receptor:
actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocr
Rev. 19(3): 225-268.
43. Sansone P, Bromberg J. (2012) Targeting the interleukin-6/Jak/Stat pathway in human
malignancies. J Clin Oncol. 30: 1005-1014.
44. Rawlings JS, Rosler KM, Harrison DA. (2004) The JAK/STAT signaling pathway. J Cell Sci. 117:
1281-1283.
45. Kiu H, Nicholson SE. (2012) Biology and significance of the JAK/STAT signalling pathways. Growth
Factors. 30(2): 88-106. DOI: 10.3109/08977194.2012.660936.
46. Hynes RO. (2002) Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110: 673-687.
47. Coppolino MG, Dedhar S. (2000) Bi-directional signal transduction by integrin receptors. Int J
Biochem Cell Biol. 32: 171-188.
48. Kim M, Carman CV, Springer TA. (2003) Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic
domain separation in integrins. Science. 301(5640): 1720-1725.
49. Schwartz MA. (2001) Integrin signaling revisited. Trends Cell Biol. 11: 466-470.
50. Liu S, Calderwood DA, Ginsberg MH. (2000) Integrin cytoplasmic domain-binding proteins. J Cell
Sci. 113(Pt 20): 3563-3571.
51. Playford MP, Schaller MD. (2004) The interplay between Src and integrins in normal and tumor
biology. Oncogene. 23: 7928-7946.
52. Blattner SM, Kretzler M. (2005) Integrin-linked kinase in renal disease: connecting cell-matrix
interaction to the cytoskeleton. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14: 404-410.
53. Schwartz MA, Shattil SJ. (2000) Signaling networks linking integrins and rho family GTPases.
Trends Biochem Sci. 25(8): 388-391.
54. Wong KW, Isberg RR. (2005) Emerging views on integrin signaling via Rac1 during invasin-
promoted bacterial uptake. Curr Opin Microbiol. 8: 4-9.

139
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

55. Leabu M, Uniyal S, Xie J, Xu YQ, Vladau C, Morris VL, Chan BM. (2005) Integrin alpha2beta1
modulates EGF stimulation of Rho GTPase-dependent morphological changes in adherent human
rhabdomyosarcoma RD cells. J Cell Physiol. 202(3): 754-766.
56. Xiong JP, Stehle T, Goodman SL, Arnaout MA. (2003) New insights into the structural basis of
integrin activation. Blood. 102(4): 1155-1159.
57. Valdembri D, Serini G. (2012) Regulation of adhesion site dynamics by integrin traffic. Curr Opin
Cell Biol. 24(5): 582-591. DOI: 10.1016/j.ceb.2012.08.004.
58. Giancotti FG, Tarone G. (2003) Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein
kinase signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 19: 173-206.
59. Ffrench-Constant C, Colognato H. (2004) Integrins: versatile integrators of extracellular signals.
Trends Cell Biol. 14: 678-686.
60. Wehrle-Haller B. (2012) Assembly and disassembly of cell matrix adhesions. Curr Opin Cell Biol.
24(5): 569-581. DOI: 10.1016/j.ceb.2012.06.010.
61. Mayor R, Carmona-Fontaine C. (2010) Keeping in touch with contact inhibition of locomotion.
Trends Cell Biol. 20(6): 319-328. DOI: 10.1016/j.tcb.2010.03.005.
62. McClatchey AI, Yap AS. (2012) Contact inhibition (of proliferation) redux. Curr Opin Cell Biol.
24(5): 685-694. DOI: 10.1016/j.ceb.2012.06.009.
63. Carmona-Fontaine C, Matthews HK, Kuriyama S, Moreno M, Dunn GA, Parsons M, Stern
CD, Mayor R. (2008) Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional
migration. Nature. 456(7224): 957-961. DOI: 10.1038/nature07441.

140
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

3.4. Unitatea în diversitate, rezultat al modului


integrativ de funcionare a biomembranelor
Dup atâtea cunotine acumulate pân aici, am putea s ne întrebm, în
ideea cptrii înelepciunilor care pot fi extrase: de unde ideea unitii în diversitate
în contextul biomembranelor? În capitolul anterior, ndjduim c am reuit s
argumentm ideea de diversitate. Diversitatea se bazeaz pe ceea ce am prezentat
despre organizarea molecular a biomembranelor. Am vzut c este vorba de o
multitudine de biocomponente, ceea ce induce eterogenitatea molecular a
biomembranelor. Mai mult, componente biochimice care alctuiesc membranele se
afl într-o dispunere asimetric la nivelul ultrastructurii i într-o continu micare,
ceea ce induce fluiditate, o fluiditate care se manifest bidimensional. Am detaliat
acolo aspectele legate de aceste caracteristici i am i tras concluzii asupra
semnificaiei biologice a acestor proprieti. O component celular format dintr-o
multitudine de elemente asigur potenialul unei mari diversiti de fenomene ce se
pot petrece la nivelul ei. Este momentul s argumentm acum în ce const ideea de
unitate care se plaseaz deasupra acestei diversiti, folosind-o eficient. Este vorba de
unitatea (în sensul de coeren) pe care o confer modul de funcionare a
biomembranelor.
Membranele celulare acioneaz ca sisteme integrative la nivelul crora
componentele moleculare, dei sunt de o mare diversitate, coopereaz pentru
asigurarea schimbului de substan i de informaie dintre celul i mediu. Fr
aceste schimburi, celula nu poate supravieui i nici nu se poate adapta. Membrana
trebuie s fie o barier selectiv, cu selectivitate modulabil în funcie de condiii,
deoarece numai astfel poate asigura adaptarea celulei la ce se întâmpl în afara ei,
pentru a asigura supravieuirea, dar i funcionarea corespunztoare.
Fenomenele de schimb de substan între celul i mediu poart denumirea
de transport membranar. Fenomenele de transport membranar sunt de o mare
diversitate, ceea ce explic i, mai mult, impune prezena unei varieti de
componente biochimice în organizarea biomembranelor. O sistematizare eficient a
cunotinelor legate de transportul membranar poate fi fcut prin clasificarea
fenomenelor pe baza diferitelor considerente/criterii, ceea ce a i fost fcut în prima
parte a acestui capitol. S încercm s rezumm, în contextul imaginii integrative pe
care ne-am propus-o prin titlul seciunii.
Puine sunt substanele care pot trece liber prin biomembrane (altfel nu ar fi
posibil funcia de barier), fenomenele de transport pe care acestea le execut
purtând denumirea de difuziune simpl. Trecerea componentelor de acest tip prin
membran se face pe baza miscibilitii lor cu lipidele (ceea ce le ofer posibilitatea
trecerii) i a diferenei de concentraie în care ele se afl de o parte, respectiv de
cealalt a bistratului lipidic (aceasta reprezentând motorul transportului). Dincolo de
aceste situaii ale difuziunii simple, majoritatea schimburilor de substan se
realizeaz cu concursul principal al proteinelor membranare, fenomenele fcând
parte din ceea ce numim transport facilitat prin membran. Totui, proteinele nu
sunt independente, în funcia lor, de lipidele membranare. Caracteristicile fizico-
chimice ale lipidelor bistratului influeneaz funcia proteinelor prin efectele pe care
le induc în aranjamentele conformaionale ale poriunilor lanurilor polipeptidice
imersate în bistrat. Pentru transportul de ioni i molecule polare, pân la un anumit
gabarit (o anumit greutate molecular), exist structuri proteice numite canale,
pompe, respectiv transportori. Toate aceste tipuri de transport sunt reunite sub
categoria denumit transport prin membran. Din cele rezumate în acest paragraf,
transportul prin membran se poate face pasiv, fr consum concomitent de energie
(cazurile de difuziune simpl sau difuziune facilitat) sau activ, când trecerea

141
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

componentelor transportate se face împotriva gradientului de concentraie,


necesitând consum de energie din partea celulei.
Pentru macromolecule sau material insolubil (particule, debriuri celulare)
transportul se face cu implicarea unor ultrastructuri delimitate de membrane, unele
definite ca microdomenii de membran (caveole, vezicule cu înveli) sau vezicule de
secreie). Acest transport este numit transport cu membran. În funcie de sensul
transportului definim endocitoza (transport cu membran din exterior, adic din
mediul extracelular în interiorul celulei), exocitoza (transport cu membran din
celul în exterior) i un al treilea fenomen de transport cu membran, specific
celulelor epiteliale monostratificate, numit transcitoz. Transcitoza reprezint
transportul cu membran prin care celula preia substana de transportat de la un pol
(apical sau latero-bazal), o traverseaz prin corpul ei i o elimin la polul cellalt. În
aceast „excursie” substana poate sau nu s fie modificat de celul.
Pentru argumentarea ideii de integrativitate, rugm cititorii s identifice,
printr-un efort personal, dar facil pentru cine a citit cu motivaie, multiplele situaii
în care diferitele fenomene de transport membranar se condiioneaz reciproc.
Pentru ghidare, noi amintim doar cazul exocitozei semnalizate, proces de transport
cu membran, care depinde de semnale primite de celula secretoare, de funcionarea
canalelor de calciu, dar implic i pompe de calciu care restabilesc condiiile bazale
de concentraie a acestui ion bivalent în citosol.
În contextul acestei seciuni, care încearc s aeze ca un corolar al
cunotinelor câteva aspecte de principiu, trebuie menionate i fenomenele de
transport cu membran din interiorul celulei, pe care nu le-am abordat aici, dar le
vom prezenta în volumul al doilea al crii, fenomene cunoscute sub numele generic
de trafic intracelular al membranelor. Vom rememora acolo o serie de evenimente
moleculare de care ne-am ocupat aici, care însoesc procesele membranare ce asigur
traficul intracelular de materiale i care implic endomembranele.
Alturi de schimbul de substan amintim c ”datoria” membranelor este i
aceea de a culege din, sau de a transmite în mediul extracelular informaii.
Schimbul de informaie este realizat de celul prin fenomenele de semnalizare
celular. Componentele ce asigur acest schimb sunt tot proteine denumite, în
general, receptori membranari. Lor li se adaug molecule/macromolecule care pot
transmite semnale dinspre celula care trimite mesaj spre exterior (de regul aceste
molecule/macromolecule acionând ca liganzi pentru receptorii din membranele
celulelor int).
Receptorii sunt, în mare parte, proteine transmembranare unipas, dar asta nu
este o regul absolut. Dimpotriv, exist suficient de muli receptori care sunt
proteine transmembranare multipas. A fost evideniat o mare diversitate de tipuri
de receptori care presupun o multitudine de mecanisme de semnalizare. Totui, se
pot puncta unele aspecte general valabile ale fenomenelor de semnalizare. O mare
parte dintre semnale sunt amplificate în interiorul celulei i de aceea nu este nevoie
de concentraii ridicate de stimul (ligand) pentru ca celula s rspund i nici de
cantiti mari de receptori în membrane, pentru ca celula s simt stimulul.
Amplificarea se realizeaz prin mesageri secunzi i/sau efectori intracelulari. La
unele mecanisme de semnalizare particip i lipide membranare a cror complexitate
structural este exploatat fericit i eficient de celul. Lipidele sunt implicate în
mecanisme cu mesageri secunzi. Implicarea lipidelor membranare în procesele de
semnalizare este un alt argument al funcionrii integrative a biomembranelor. Tot
ce se afl în organizarea unei membrane se implic în menirea ultrastructurii într-un
fel sau altul.
În biologia celular, noiunea de receptor este îmbogit în coninut în
comparaie cu cea folosit în farmacologie. Astfel, proteine membranare care sunt
parteneri de interaciune ai altor proteine din matricea celular (cazul integrinelor)

142
Mircea Leabu i Marina T. Nechifor – Biomembranele, unitate în diversitate

sau din membrana altor celule (cazul moleculelor de adeziune celular, în principal
caderine) au i rol de transmitere de semnale celulelor crora le aparin, deci rol de
receptor.
Pentru argumentarea integrativitii membranelor în funcionare, trebuie
amintit faptul c diferitele ci de semnalizare, declanate de diveri stimuli prin
receptorii specifici, dac sunt iniiate concomitent, pot interfera modulându-se
reciproc, astfel încât celula s se comporte în cel mai adecvat mod, impus de situaia
concret în care se afl. Aceste realiti asigur coerena comportamentului celular,
deci aspectul unitar al fenomenelor biologice, fr ca diversitatea de procese s
afecteze supravieuirea i funcionarea, ambele utile sistemului din care celula face
parte. Atâta timp cât celula îi pstreaz capacitatea de a echilibra fenomenele, totul
decurge normal, îns, atunci când aceast capacitate se pierde, apar fenomenele
patologice.
În sfârit, ideea de integralitate în ceea ce au membranele de fcut, mai poate
fi argumentat i de dependena unor fenomene de transport de procese de
semnalizare i invers. Ca exemple putem, pe de o parte, face iari referire la
exocitoza semnalizat, în care un proces de transport membranar depinde de
semnalele pe care celula le primete, sau, pe de alt parte, de transmiterea
semnalelor de-a lungul axonilor, care depinde de fenomene de transport prin
membran, adic de funcia unor canale ionice comandate electric.
Dincolo de aceste exemple, lsm cititorilor bucuria de a identifica alte situaii
concrete de cooperare între fenomenele ce se petrec la nivelul membranelor i care
contribuie la comportamentul unitar al celulei, situaii care pot fi gsite chiar în
fenomenele biologice abordate în aceast carte.
Toat argumentarea din aceast seciune reprezint un fundament pentru
ideea unitii în diversitate, unitate în diversitate pe care biomembranele o asigur în
interesul bunei funcionri a celulelor, a esuturilor, a organelor, respectiv a
organismelor. Aceast caracteristic nu este specific biomembranelor, ci se extinde
la toate elementele de organizare i de funcionare a celulelor considerate individual
sau în cooperarea lor pentru asigurarea caracterului holistic al unitii elementare de
organizare morfo-funcional a lumii vii. Când se pierde caracterul unitar, celulele
deviaz de la comportamentul normal, ceea ce afecteaz pe de o parte funcionarea
individual a lor i, mai departe, influeneaz normalitatea întregului cruia acestea
le aparin; se dezvolt patologicul, care, în opoziie cu frumuseea armoniei
fiziologice, devine o hidoenie cu care medicina trebuie s se lupte i s o înving.
Suntem înc atât de neputincioi adesea...
Avem, totui, motive s ne pstrm optimismul pe termen lung.

143