ELECTROD AMPEROMETRIC PENTRU DETERMINAREA

CONCENTRATIEI DE ALANINA

A fost dezvoltat un electrod enzimatic amperometric pentru determinarea L-

alaninei. Sonda se bazeaza pe un electrod de platina care detecteaza peroxidul de
hidrogen produs de reactiile enzimatice catalizate de enzimele:
alaninaminotransferaza (ALT) si glutamat oxidaza. Ambele enzime au fost captate pe
suporturi de membrane pilomerice. Interferentele au fost distinse de membranele
protectoare aditionale. Au fost optimizate sisteme tampon, pH-ul, cosubstratul,
temperatura si procedurile de imobilizare. Raspunsul sondei a fost unul liniar in
intervalul de concentratie 10-5 - 10-3 mol/L cu o limita a detectiei de 2*10-6 mol/L.
Au fost executate studii ale interferentelor enzimatice. Glutamina a interferat
intr-un procent de aproximativ 50% la o concentratie de 5*10-4 mol/L.
Alte studii au avut loc pentru a elimina aceasta interferenta. Au fost efectuate
alte analize ale alaninei in mostre de sange. Rezultatele comparate cu procedura
HPLC au dat o buna corelare.

INTRODUCERE
Alanina este un aminoacid care joaca un rol important in metabolismul
gluozei, fiind unul din precursorii majori ai gluconeogenezei.
S-a semnalat o concentratie plasmatica mai scazuta a alaninei in cazul
pacientilor cu diabet insulino-dependent decat in cazul subiectilor normali datorita
unei cantitati crescute folosite in gluconeogeneza. In cazul acestor pacienti,
tratamentul cu insulina a dus la o revenire la normal in concentratia alaninei. A fost
raportata o concentratie crescuta de alanina in subiectii cu diabet non-
insulinodependent .
Au fost utilizate metode de determinare a alaninei folosind proceduri
cromatografice si fluorimetrice; asceste metode au o complexitate ridicata necesitand
timp si echipament costisitor.
Au fost dezvoltati electrozi enzimatici de determinare a alaninei folosind
alanin-dehidrogenaza si electrozi de grafit modificati sau lactat dehidrogenaza si un
senzor potentiometric de gaz pentru amoniac. Girotti et al. au folosit un senzor de
curgere bioluminescent pentru analiza alaninei in ser si urina. Aceste metode sunt
rapide si sensibile, dar necesita cofactori si, in cateva cazuri, mai mult de trei etape de
reactie.
Un receptor enzimatic nou pentru determinarea alaninei a fost folosit de
Ohashi et al. Aceasta metoda prezinta sensibilitate scazuta si timp crescut de raspuns.
Metoda prezentata in aceasta lucrare este bazata pe utilizarea a doua enzime:
alaninaminotranferaza (ALT) si glutamat oxidaza (GLOD) ambele imobilizate pe
suport de polimer amplasat pe varful unui senzor de peroxid de hidrogen. Analiza este
simpla si rapida, fiind nevoie doar de -ketoglutarat ca si cosubsrat.
pH-ul, temperatura, stabilitatea, reproductibilitatea si timpul de raspuns au fost
optimizate. A fost condus un studiu al interferentelor enzimatice majore si efectul
acestora a fost minimizat.
PARTEA EXPERIMENTALA

Aparatura
Electrodul de platina pentru peroxidul de hidrogen (0,3 mm2 suprafata
nominala) si Biosenzorul Detector Amperometric (ABD) apartin Universal Sensors
Inc., Metairie, LA. Curentul a fost masurat cu Linseis, Selb, Germany, L6512 x-t
recorder.
Temperatura a fost studiata utilizandu-se pahare de laborator cu pereti dublii,
sub control cu ajutorul unui termostat F3, Aake, Berlin, Germania.

Asamblarea electrodului
Electrodul pentru alanina a fost asamblat dupa cum urmeaza:
Membrana de acetat de celuloza a fost amplasata in contact direct cu varful de platina,
apoi enzimele au fost imobilizate pe o membrana de policarbonat. Pentru o singura
membrana cu suprafata de 1 cm2 s-au amplasat 0,5 mg de glutamat oxidaza si 1,5 mg
de ALT pe fata mata a membranei de policarbonat, fixata aneterior pe invelisul
inversat al electrodului. Apoi 20m de tampon fosfat de concentratie 0,05M, pH 7,0
au fost adaugati si cele doua enzime au fost amestecate cu o bagheta de sticla pana la
dizolvare completa. Au fost adugati 4m de aldehida glutarica 0,25% si s-a amestecat
energic. Solutia s-a lasat la uscat pentru 1 ora si 30 minute. Membrana a fost spalata
cu solutie de glicina 0,1 mol/L pentru a elimina excesul de glutarat aldehida, s-a
eliminat de pe invelisul electriodului, inversat si pus la loc pe invelis une a fost in
prealabil plasata membrana de acetat de celuloza. Invelisul a fost umplut cu o solutie
(solutia tampon Dulbecco). In final, electrodul a fost inserat in invelis si apasat pana
varful sau s-a aflat in contact sigur cu membrana de acetat de celuloza.

Procedura
Sonda de alanina a fost imersata in 5 ml de solutie agitata de tampon
Dulbecco, preparata anterior cu o concentratie aleasa de -cetoglutarat. Se adauga
apoi picaturi de alanina (sau ser) si se inregistreaza schimbari in curent.
Analiza alaninei prin metoda HPLC s-a desfasurat utilizand o faza inversata de
coloana C18 si un un amestec de solventi constand in metanol, acetat de sodiu 100
mmol/L, pH=7,2 la debit de 0,8 ml/min.

Rezultate si discutii
Analiza alaninei este bazata pe urmatoarele reactii:
alanina + -cetoglutarat piruvat + glutamat (1)
Glutamat + O2 + H2O  -cetoglutarat + NH3 + H2O2 (2)

Prima reactie este catalizata de alanil aminotransferaza si necesita ca si

cosubstrat -cetoglutarat. Glutamatul produs reactioneaza cu O2, reactie catalizata de
glutamat oxidaza si produce peroxid de hidrogen care este detectat de electrodul de
platina mentinut la un potential aplicat de +650mV versus un catod Ag/Ag/Cl.
Curentul masurat la iesire este corelat cu concentratia de alanina din proba.
Asa cum s-a aratat in rectiile 1 si 2, -cetoglutaratul este reactant in prima
reactie si produs de reactie in cea de a doua. Astfel, concentratia sa in solutia de testat
trebuie optimizata. Pentru a obtine un curent maximal, concentratia de -cetoglutarat
a fost selectata prin trasarea curbei de calibrare pentru alanina la diferite concentratii
de -cetoglutarat (fig 1.). Pana la o concentratie a -cetoglutaratului de 10-3 mol/L s-a
observat o scadere a raspunsului masurat in curent.
Aceast fapt se datoreaza efectelor diferite: concentratia aparenta pentru sistemul
enzimatic imobilizat, care este de 10-3 mol/L si limiteaza liniaritatea pana la
concentratii de 10-3 mol/L, si faptul ca, concentratii crecute de -cetoglutarat
incetinesc productia de H2O2, rezultand astfel o scadere a curentului de raspuns. In
plus, pentru o concentratie mai mare de 10-3 mol/L, -cetoglutarat este inhibitor al
ALT. Cea mai mare valoare a curentului de raspuns a fost inregistrata cu o
concentratie in -cetoglutarat de 10-3 mol/L si aceasta a fost utilizata in analize
urmatoare.

Studiul pH-ului
Fig.2 arata profilul pH-ului al electrodului de alanina obtinut la o concentratie
a alaninei de 10-4 mol/L. Rezultatele sunt compromise de activitatea celor doua
enzime imobilizate simultan. Dupa cum este demonstrat, la pH=6, solutia tampon de
citrat a dat rezultate mai bune comparativ cu cea de fosfat. Cel mai mare raspuns intre
valorile pH-ului a fost obtinut folosind solutie tampon de fosfat. Cel mai bun raspuns
a fost obtinut cu tampon de borax 0,05 M, pH=9. Acest rezultat se datoreaza unei
activitati crescute a ALT la aceasta valoare a pH-ului. S-a demonstrat acest lucru prin
masurarea curentului cu un electrod asamblat doar cu glutamat oxidaza. Curentul
rezultat in acest caz a fost de 62% din cea obtinuta in cazul solutiei tampon de fosfat
la pH=7,4. Din moment ce scopul este reprezentat de utilizarea acestui senzor pentru a
masura cantitativ alanina in sange, unde valoarea pH-ului este de 7,4, acesta a fost
selectat pentru experimentele urmatoare

Studiul temperaturii
Studii asupra temperaturii s-au desfasurat folosind recipiente termostatate cu
pereti dublii. Temperatura a luat valori de la 15 la 45°C. raspunsul sondei a aratat o
crestere continua in curent datorita cresterii activitatii enzimei si datorita
permeabilitatii membranelor in ceea ce priveste difuziunea prin substrat si produs
(date neprezentate). Dar la temperaturi mai mari de 25°C cresterea in curent a
transmis semnale mai sczute decat cele obtinute la 25°C, asa ca aceasta temperatura a
fost aleasa pentru experimentele urmatoare.

Raspunsul sondei
Fig.3. arata o curba de calibrare a alaninei obtinuta cu toti parametrii
optimizati. Limita de detectie a fost 2*10-6 mol/L si intervalul de liniaritate a pornit
de la 10-5 pana la 10-3 mol/L. Concentratia aparenta a substratului a fost de 10-3 mol/L.

Reproductibilitatea senzorului
Reproductibilitatea sondei de alanina a fost studiata prin efectuarea a 3 curbe
de calibrare in intervalul 10-5-10-3 mol/L. Coeficientul variatiei (C.V.) a fost
aproximativ 10 %. Timpul de raspuns a fost sub un minut prin masusrarea a 95% din
totalul curentului schimbat.

Stabilitatea senzorului
Fig 4 arata stabilitatea sondei ansamblate cand este depozitata la uscat in
frigider.
 Sensibilitatea senzorului a fost redusa la mai putin de 50% dupa 35 de zile.
Asta se datoreaza in principal inactivarii ALT; de fapt, cand sonda a fost calibrata
pentru glutamat, curentul obtinut a fost aprape identic cu cel obtinut in prima zi. In
timpul activitatii continue (pH, temperatura si optimizarea substratului) enzimele au
fost inactivate mai rapid (aproximativ 50% pierderi in raspuns dupa 15 zile). Fig.5
arata curbele de calibrare ale alaninei procesate timp de trei luni sub operatiuni
continue.

Studiul interferentelor
Selectivitatea sondei a fost evaluata prin masurarea respunsului a catorva
compusi enzimatici interferenti dizolvat in solutia de tampon Dulbecco la o
concentratie de 5*10-4 mol/L. Rezultatele sunt expuse in tabelul 1. Aspartatul si
asparagina au interferat 11% respectiv 12%. Cea mai importanta interferenta a fost
reprezentata de glutamina cate a dat o interferenta de 50%.
Fig.6 raporteaza curbe de calibrare ale alaninei si glutaminei. Asa cum se
arata in aceasta figura, la concentratii scazute de substrat (<2*10-4 mol/L) raspunsul
glutaminei este chiar mai mare decat in cazul alaninei. Cu toate acestea, raspunsul
glutaminei este liniar intr-un interval ingust si saturatia apare la 2*10-4 mol/L.
Glutamina si glutamatul sunt prezente in sange. Valorile normale ai acestor metaboliti
sunt 5*10-4 si 4*10-5 mol/L, in timp ce concentratia alaninei in sange este 4*10-4 -
cetoglutaratul este de asemenea prezent intr-o concentratie de 4*10-5 mol/L; asta nu
permite diferentierea intre analiza alaninei si interferentele cum sunt cele date de
glutamina si glutamat. Nu este posibila evitarea acestor interferente prin masurarea
continutului de glutamina si glutamat din ser inaintea adaugarii -cetoglutaratului in
solutia de testat., deoarece, cum se arata in articol, concentratia endogena a -
cetoglutaratului este suficienta pentru a porni reactia pentru alanina. Pentru a elimina
interferentele, s-a asamblat sonda cu o a treia membrana exterioara unde glutamat
oxidaza si catalaza au fost imobilizate impreuna. In aceste fel, glutamatul prezent in
proba reactioneaza cu glutamat-oxidaza imobilizata extern si H2O2 obtinut este
consumat de catalaza.
Glutamina reactioneaza deasemenea cu glutamat-oxidaza dar afinitatea sa
pentru enzima este mai mica decat a glutamatului asa ca acest substrat nu este complet
eliminat. Folosind aceasta abordare, sensibilitatea sondei scade (scade aportul de
oxigen si creste grosimea membranei) dar este totusi utila pentru a continua analiza
alaninei intr-un interval de valori de 20 de ori mai mici decat cele prezente in sange.

Glutamina nu poate fi complet eliminata asa ca s-a incercat tinerea acest metabolit sub
control in timpul analizei. Din fig. 8 este evident faptul ca o concentratie a glutaminei
mai mare de 2*10-4 mol/L nu va produce o variatie a curentului (efect de saturatie)
asa ca s-a adaugat solutiei tampon luate in lucru aceasta concentratie pentru a obtine
un curent de fond care include semnalul datorat glutaminei. Fig.9 arata curbe de
calibrare pentru alanina cu sau fara glutamina. In acest fel se poate duce la capat
analiza alaninei in medii bilogice.

Analiza serului
Analiza alaninei a avut loc in trei probe, proaspat recoltate, dintr-un laborator
local. Fiecare ser a fost diluat 1:10 cu solutia tampon luata in lucru si procesat de trei
ori. Rezultatele au corelat cu cele obtinute cu metoda HPLC si pot fi observate in
Tab.2, aratand astfel fezabilitatea utilizarii senzorului pentru a masura concentratia
alaninei in ser si posibiliatea monitorizarii continue a alaninei in pacientii cu diabet.
 REZUMAT

Prezentul articol descrie implementarea unei metode de determinare

cantitativa a alaninei din serul uman prin utilizarea unui electrod amperometric.
Aminoacidul studiat, alanina, joaca un rol important in organismul
uman, in special in metabolismul glucozei.
Alanina are o concentratie plasmatica mai scazuta in cazul pacientilor cu
diabet insulino-dependent decat in cazul subiectilor normali din cauza utilizarii
unei cantitati crescute in gluconeogeneza. In cazul acestor pacienti, tratamentul
cu insulina a dus la o revenire la normal in concentratia alaninei. Pe de alta
parte, in cazul subiectilor cu diabet non-insulinodependent s-a determinat o
concentratie crescuta de aminoacid.

In centrul cercetarii se afla o sonda bazata pe un electrod de platina ce

poate detecta H2O2 rezultat in urma reactiilor catalizate de enzimele ALT si
GTO (analinaminotransferaza si glutamat oxidaza).
Pentru desfasurarea analizei, este necesara imobilizarea enzimelor pe o
membrana suport de natura polimerica.
O problema in succesul acestei analize o reprezinta aparintia
interferentelor determinate de alte substante cu caracter sau formula
asemanatoare. Acestea au fost identificate si indepartate astfel din rezultatele
finale prin adaugarea de membrane protectoare aditionale. Principalii compusi
responsabili de aceste interferente au fost asparagina, aspartatul si glutamina.
Solutiile tampon, nivelul pH-ului, cosubstratul, temperatura si
procedurile de fixare au fost optimizate.
S-a urmarit variatia curentului inregistrat de sonda raportat la cantitatea
de alanina prezenta in solutia analizata.
Raspunsul sondei a fost liniar in intervalul de concentratie 10-5-10-3,
existand o limita de detectie de 2*10-6 mol/L. S-a observat interferenta
glutaminei in procent de aproximativ 50% la o concentratie de 5*10-4 mol/L,
dar s-a reusit eliminarea acesteia.
Analiza alaninei a avut loc pe mostre de sange. Rezultatele obtinute au
fost bine corelate cu cele obtinute prin procedura HPLC.