LP 6

Dr. Mara Mihai-LP5

 Cuvinte cheie
• Populație
• Clonă
• Tulpină
• Însămânțare
• Inoculare
• Mediu selectiv
• Mediu electiv
• Mediu diferențial
• Mediu de îmbogățire
• Insamantare in pentagon deschis

Dr. Mara Mihai-LP5

• Metodele de cultivare a bacteriilor sau
fungilor urmăresc trei obiective:
– Cantitate suficientă
– Prevenirea contaminării
– Produs plurimicrobian-izolarea fiecărei tulpini
în culturi monomicrobiene/“culturi pure”.
• Nu există un mediu unic, valabil pentru
cultivarea oricărui microorganism.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Istoric

Louis Pasteur 1822-1895

Dr. Mara Mihai-LP5

Robert Koch:
• Metoda de izolare utilizată:
– Dilutii succesive in mediu de cultura
lichid
– Dezavantaje: specia cea mai
numeroasa / agent etiologic;
– Medii cu gelatină-> rezultate
nesatisfăcătoare
• Cartofii fierți lăsați în aer liber: se dezvoltă
mici picaturi circulare
Robert Koch 1843-
– 1 microb/picătură 1910
• microorganisme din aer ->culturi
pure
– A dezvoltat tehnici de lucru in mediu
steril-> Bacillus anthracis-antrax
– Totuși multe microorganisme nu se
dezvoltau pe mediul său
Dr. Mara Mihai-LP5
Walter Hesse s-a alăturat lui Robert Koch –
studii despre calitatea aerului
Soția Angelina Fannie Hesse
• pe lângă treburile casnice, îl ajuta și în
laborator
• medii ce conțineau gelatină:
– T C /degradarea directă bacteriana
– topirea mediilor
– experimente eșuate
• Lina: jeleurile și budincile rămâneau solide –
agar-agar
• Topire: 100 grade; puțini microbi pot degrada
agarul, rezistă perioade lungi de timp

Dr. Mara Mihai-LP5

 Definiții
• Populaţia = o multitudine de indivizi ai unei specii care
habitează într-un anumit biotop.
• Clona=populaţia care rezultă dintr-o singură celulă
prin înmulţire vegetativă
• Tulpina = populaţia microbiană alcatuită din
descendenţii unei singure izolări în cultură pură.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Definiții
Mediul de cultură= mediu solid sau lichid care asigură
nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii
şi multiplicării bacteriene

Tipuri de medii de cultură

1. Medii celulare (care includ celule vii): animale de
laborator/ ouă de găină embrionate/ culturi de celule-
inoculare
2. Medii necelulare (artificiale, medii de cultură)-
însămânțare

Dr. Mara Mihai-LP5

I. Medii
celulare

Dr. Mara Mihai-LP5

 Medii celulare
1. Animale de experiență

Ex: şoarecele alb, cobaiul,

şobolanul, hamsterul ,iepurele
-producerea de seruri imune:caii
• vârste diferite (embrioni, nou-născuţi,
animale tinere, adulţi)-cu cât este
mai tânăr/sensibilitate e mai mare
• căi de inoculare (per cutanat,
subcutanat, instilare la nivelul
anumitor mucoase, per os, IM, IV)
Dr. Mara Mihai-LP5
Dr. Mara Mihai-LP5
 Medii celulare
2. Oul de găină embrionat
• Avantaje: preţ mai scăzut, steril , fără factori
antimicrobieni
• Examinare la ovoscop
• Inoculare:
– la 6-14 zile de incubaţie
– strictă asepsie
– intraembrionar/ membrana chorioalantoidiană/
sacul alantoidian/ sacul amniotic.
• Incubație: temperatură + umiditate, pentru 1/
mai multe zile.
• U: izolarea şi identificarea tulpinilor
rickettsiene

Dr. Mara Mihai-LP5

Dr. Mara Mihai-LP5
 Medii celulare
3. Culturi de celule
• culturi de organ
• culturi de celule dispersate
– culturi primare: dispersia enzimatică (de ex. cu
tripsină-EDTA) a celulelor unui organ proaspăt
recoltat; 3-5 pasaje
– tulpini celulare: un singur tip de celule; 50-60 pasaje

Dr. Mara Mihai-LP5

 Medii celulare
3. Culturi de celule

– linii celulare continue (stabile)

populaţii celulare care derivă din
ţesut normal sau malign; pasaje
nelimitate
• derivate din rinichi de maimuţă
(Vero, BSC-1, BGMK etc),
şoarece (McCoy), ovar de
hamster (CHO)
• derivate din carcinom de col
uterin (HeLa), laringe (HEp-2)
• limfoblastoide (MT-4, H9 etc)
etc.
Dr. Mara Mihai-LP5
Dr. Mara Mihai-LP5
II. Medii de cultură celulare

Dr. Mara Mihai-LP5

Avantaje : Sunt mai ieftine, se pot prepara mai usor.

Condiţii impuse

• sterile

• nutritive (să conţină factorii de creştere necesari),

• pH (7.2-7.6)

• presiune osmotică

• umiditatea favorabilă multiplicării germenilor

Dr. Mara Mihai-LP5

 Ingrediente

• Peptona (amestec de peptide)

• Extracte/infuzii de proteine animale

• Zaharuri

• Agenti de solidificare: agar

• Indicatori de pH: turnesol, rosu fenol

• Agenți selectivi

Dr. Mara Mihai-LP5

Clasificarea mediilor necelulare

Dr. Mara Mihai-LP5

 După starea de agregare
Lichide Semisolide Solide
fără agar 0,5% 2% agar
•apă peptonată alcalină, •Cary-Blair •agar / geloză,
•bulion nutritiv, •MIU •agar-sânge,
•bulion-sânge, •Stuart •AABTL,
•bulion selenit, •ADCL,
•bulion tioglicolat, •Bordet-Gengou,
•bulion Mueller-Hinton, •Chapman,
•Middlebrook 7H9, •Löffler,
•Löwenstein,
•Mueller-Hinton,
•Sabouraud,
•TSI
MIU=motility indol urea
AABTL= agar albastru de brom timol lactozat
ADCL=deoxycolate citrate agar
Dr. Mara Mihai-LP5
TSI= triple sugar iron
 După scopul urmărit
de transport de conservare
• apă peptonată alcalină, •agar nutritiv în coloană
• Cary-Blair,
• Stuart

de izolare de identificare
•agar-sânge, •TSI,
•Bordet-Gengou,
• MIU,
•Löffler,
•Löwenstein, • truse API
•Sabouraud

Dr. Mara Mihai-LP5

 După complexitatea
ingredientelor
simple complexe
•agar • agar-sânge,
•bulion simplu • geloză-chocolat,
·
• agar cu factori X şi V,
• Bordet-Gengou,
• Mueller-Hinton

Dr. Mara Mihai-LP5

 Medii speciale
• Mediul electiv/imbogatit : ingrediente-> dezvoltarea unei anumite bacterii
• Mediul selectiv: substanţe antimicrobiene care inhibă dezvoltarea altor
bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte
• Mediul de îmbogăţire: mediu selectiv +mediu electiv înmulţirea anumitor
bacterii patogene, inhibă dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs
patologic.
• Mediul diferenţial: un indicator de pH + substrat (de exemplu un zahar) care
poate fi sau nu metabolizat ->modificare pH/culoare indicator/ aspect
cultură.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Medii speciale
selective
elective
•Tinsdale cu telurit de potasiu-B. difteric
• Löffler (ser coagulat de •Chapman,-stafilococ
bou)- B. •Mac Conkey,
difteric (Coryne.dif.) •medii cu antibiotice

diferenţiale
•AABTL(agarul cu albastru de brom-timol de îmbogăţire
lactozat) •apă peptonată alcalină,
•lactozo-pozitive (E. coli) •bulion selenit,
•lactozo negative •O.C.S.T.
(Shigella, Salmonella ).
•ADCL,
•Mac Conkey,
•MIU,
•TSI,

Dr. Mara Mihai-LP5

 Medii simple-solide

• Geloza simpla(nutrient agar)

• Geloza simpla in coloana inclinata
• U: bacterii nepretențioase

Dr. Mara Mihai-LP5

 Medii simple- lichide
• Apa peptonată alcalină:
• peptonă 1%
• NaCl 0.5%
• apă distilată
• Bulion simplu
• Bulion selenit

U: germeni nepretențioși

Dr. Mara Mihai-LP5

Medii compuse

Dr. Mara Mihai-LP5

Geloză sânge-Mediu diferențial

Conține: Sânge de
berbec defibrinat
U: Reacția de
hemoliză
– Alpha: incompletă-
culoare verde (H2O2)
– Alpha’: completa,
limitata (hemolizina
a)
– Beta: completă
– Gamma: fără

Dr. Mara Mihai-LP5

Geloza chocolat- Mediu special
U: Cultivarea microorganismelor
pretențioase
Sângele de berbec defibrinat
este încălzit la 80 grade-liza
eritrocitară- NAD, hemină
+ABT

-Neisseria gonorrhoeae
-Haemophilus spp.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Levine (EMB agar)-
Mediu selectiv-diferențial
• EMB- eosine methylene
blue
• U: Izolarea, cultivarea și
diferențierea coliformilor și
a patogenilor enterali.
• Enterobacteriaceae
• Enterobacteriile patogene
nu fermentează lactoza,
producând colonii
transparente. E. coli
produce colonii cu luciu
metalic

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Mac Conkey- mediu
selectiv-diferential
• Saruri biliare si violet cristal:
inhibă cocii Gram +
• Indicator pH: roșu neutru
• Lactoză: + roz/- palid
• Izolarea, cultivarea și
diferențierea:bacili enterali
Gram-. Enterobacteriile
patogene nu fermentează
lactoza, producând colonii
transparente.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Chapman (manitol-salt-
agar)
• Izolarea selectivă și cultivarea stafilococilor.
• Microorganismele care utilizează manitolul transformă mediul în
galben

Dr. Mara Mihai-LP5

 Geloză lactozată (CLED agar)
Mediu diferențial
• CLED= cystine lactose
electrolyte deficient
• Abs. electoliților: inhibă Proteus
spp.
• Lactoză: +
• Indicator: bromtimol albastru
• Izolarea, enumerarea și
identificarea prezumptivă a
bacteriilor urinare (susp
infecție urinară). Cultivarea și
izolarea neselectivă a
enterobacteriilor.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Sabouraud
Mediu selectiv

• Izolarea și cultivarea fungilor

• pH acid care inhibă maj
speciilor bacteriene
• ABT:cloramfenicol

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Mueller Hinton
Mediu special
U: Antibiograma -testarea susceptibilității față de
antibiotice;Izolarea și menținerea speciilor
patogene de Neisseria.

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Loffler
U: Cultivarea Corynebacterium diphtheriae;
Demonstrarea proteolizei

Dr. Mara Mihai-LP5

 Mediu Lowenstein-Jensen

• Cultivarea și diferențierea speciilor de

Mycobacterium, Gordona, Nocardia,
Rhodococcus, Tsukamurella

Dr. Mara Mihai-LP5

Tehnici de cultivare
 Obţinerea coloniilor izolate
Însămânţarea
• “în pentagon deschis”
• cu ansa calibrată
• cu tamponul sau cu bagheta de sticlă în “L”
• prin înţepare a mediului turnat în tuburi sau eprubete
• cu seringa
• cu pipeta (Pasteur sau pipeta gradată, după caz)
• cu pipeta, prin “inundare” –antibiograma difuzimetrica sensibilitatea la
bacteriofag
Tehnica diluţiilor succesive în lichidul de condens al mediilor solide
Tehnica epuizării ansei pe medii solide
Tehnica diluţiilor succesive în medii lichide
Tehnici de izolare speciale
1. Metode fizice
2. Metode chimice
3. Metode biologice
·
Însămânţarea “în pentagon
deschis”
Însămânţarea cu ansa calibrată
Însămânţarea cu tamponul sau cu
bagheta de sticlă în “L”

Pseudomonas aeruginosa
 Însămânţarea prin înţepare a mediului
turnat în tuburi/ eprubete
• U:medii multitest
Tehnica epuizării ansei pe medii solide
U: mai multe eprubete- epuizarea continutului
ansei
Tehnica epuizării ansei pe medii solide
U: mai multe eprubete- epuizarea continutului
ansei
Însămânţarea cu pipeta ( “inundare”)-antibiograma difuzimetrica
Tehnica diluţiilor succesive în medii
lichide
Examinarea caracterelor de cultura