Diagnosticul infecției determinate de Clostridium difficile.

Diagnosticul infecției
determinate de Helicobacter pylori.

1. Însuşirea etapelor diagnosticului bacteriologic în infecția determinată de C. difficile.

2. Însuşirea etapelor diagnosticului bacteriologic în infecția determinată de H. pylori.

1. Diagnosticul infecției determinate de Clostridium difficile (ICD)

C. difficile
– prezent în microbiota intestinală (1-4% adult, 30-40% copii < 1 an)
- produce – toxina A (enterotoxină) – alterează permeabilitatea epiteliului interstinal
- toxina B (citotoxină) – lezează mucoasa colică
- prezintă rezistență naturală la numeroase antibiotice.
C. difficile (tulpini toxigene) determină colita pseudomembranoasă post antibiotico-terapie
(clindamicină, aminopeniciline, cefalosporine).
Indicații de testare
 toți pacienții la care diareea apare după 48 de ore de la internare
 diaree sau alte tablouri clinice sugestive la pacienți care au avut spitalizări recente sau
tratament la domiciliu cu antibiotice (clindamicină, aminopeniciline, cefalosporine),
antisecretorii gastrice, imunosupresoare.
a. Prelevare - 1-2 ml de scaun diareic
- dacă detecția toxinelor nu se poate efectua în primele 2 ore după recoltare,
proba se poate păstra timp de cel mult 2 zile la 4C (la temperatura camerei
toxina se degradează după 2 ore); păstrarea probei pe o durată mai mare de
timp este posibilă doar la -20.
b. Teste screening – la paienții cu manifestări clinice evocatorii de ICD
1. Cultivare - metodă cu sensibilitate crescută
- bacterie nepretențioasă nutritiv - proba prelucrată se însămânțează pe medii
de cultură adecvate (selective și neselective)
- strict anaerob
- incubare 48-72 ore, 37°C
- identificarea coloniilor suspecte – ex. microscopic (bacili gram pozitivi,
sporulați, spor oval, deformant, central/subterminal) și test de aglutinare
2. Detectarea enzimei GDH (glutamat dehidrogenaza) - metoda are sensibilitate ridicată,
însă specificitate redusă (nu face diferența între tulpinile toxigene și netoxigene). În plus,
poate fi produsă și de alte bacterii.

1
 https://www.google.ro/search?q=clostridium+difficile&tbm=isch&tbs=rimg
Fig. 1. Frotiu cultură colorat Gram
Clostridium spp.
Legenda: bacili gram pozitivi, sporulați, spor oval, deformant, central/subterminal

c. Teste de confirmare - detectare a toxinogenezei:

3. Detectarea toxinelor A și B prin metode imunoenzimatice :
4. direct din materii fecale sau din supernatantul culturilor în bulion.
5. Metodele tip ELISA, ELFA și imunocromatografice au performanțe similare, mai reduse
decât ale testelor de citotoxicitate, variind între 25-89%.
6. Se recomandă folosirea testelor care urmăresc concomitent prezența toxinelor A și B.
7. Detectarea genelor care codifică toxinele C. difficile prin metode moleculare
8. este în prezent tehnica optimă (”gold standard”) pentru stabilirea diagnosticului etiologic.
9. se recomandă folosirea truselor comerciale de real-time PCR pentru detectarea genelor ce
codifică toxinele de C. difficile (A, B sau toxină binară).
10. sensibilitatea și specificitatea metodelor moleculare este ridicată și oferă un diagnostic
rapid.
11. Limite: necesită infrastructura adecvată.
12. Teste de citotoxicitate pe culturi celulare
13. au sensibilitatea cea mai ridicată și sunt considerate ”gold standard”.
14. Limite: durata detectării din proba de scaun este de aproximativ 2 zile, necesită
echipament de laborator adecvat pentru culturi celulare și personal instruit în acest
domeniu.
Algoritm de diagnostic etiologic
Se recomandă un diagnostic în 1-3 etape, aplicabil doar în laboratoarele care au posibilitatea
efectuării atât a testelor de detecție rapidă cât și a cultivării :
a. Efectuarea unui test de detecție a prezenței toxinelor/genelor care le codifică
 în caz de pozitivitate, diagnosticul de ICD este confirmat;
 în cazul de negativitate se trece la a doua etapă.
b. Cultivarea probei de scaun pentru izolarea de anaerobi:
 absența culturilor face improbabil diagnosticul de ICD;
 în cazul izolării de colonii identificate drept C. difficile se trece la a treia etapă.
c. Efectuarea unui test de detecție a toxinelor/genelor care le codifică din cultura
bacteriană :

2
  dacă este pozitiv se confirmă ICD
 dacă este negativ este foarte probabilă colonizarea cu C. difficile iar boala actuală are o
altă etiologie
Justificarea algoritmului:
 testele imunoenzimatice/PCR au specificitate foarte bună și identifică tulpinile toxigene –
diagnostic confirmat
 în special testele imunoenzimatice, dar și PCR pot furniza rezultate fals negative, de aceea se
trece la cultivare pentru a crește șansa identificării unei tulpini toxigene de C. difficile
Pentru pacienții cu teste negative sau la care s-au izolat tulpini netoxigene decizia de tratament
adecvat a ICD este la latitudinea medicului curant.

2. Diagnosticul infecției determinate de Helicobacter pylori.

A) Diagnostic direct
Prelevare I) fragment biopsie gastrică
II) materii fecale

I) fragment biopsie gastrică

a) Ex. microscopic - bacili gram negativi spiralați sau încurbați, nesporulați
b) Izolare – pretențios nutritiv – medii îmbogățite (suplimentate cu sânge, hemină și cărbune)
și selective (antibiotice)
- microaerofil
- cultivă lent (3-6 zile), la 30°- 37°C
- catalază pozitiv, oxidază pozitiv, urează pozitiv

https://www.google.ro/search?q=helicobacter+pylori+catalase+test&source
Fig. 2. Identificare biochimică
Legenda: testul catalazei, testul oxidazei, producerea de ureaza

c) Testul ureazei – fragment de biopsie + soluție uree și indicator de pH => reacție pozitivă =
culoare roșie

3
 https://www.google.ro/search?q=helicobacter+pylori+catalase+test&source
Fig. 3. Testul ureazei
Legenda: pozitiv – roșu; negativ - galben

d) Teste de biologie moleculară

Infecția poate evolua atât la pacienții cu cancer gastric cât și la cei fără această neoplazie =>
este indicată biopsia gastrică deoarece evidențiază și transformarea malignă a celulelor.

II) materii fecale – detecție antigenică în materii fecale

https://www.google.ro/search?q=helicobacter+pylori+catalase+test&source
Fig. 4. Detecție antigen H. pylori în materii fecale

B) Testul respirator cu uree – metodă neinvazivă care depistează dioxidul de carbon marcat
radioactiv eliminat în aerul expirat după ce se administrează uree marcată cu izotop 13C
sau 14C

4
 Fig. 5. Testul respirator cu uree marcată
https: https://www.google.ro/search?biw=1280&bih=614&tbm=isch&sa=1&ei=â

C) Diagnostic indirect – diagnostic serologic (ELISA, WB)

- anticorpii persistă mulți ani
- titrul anticorpilor nu se corelează cu gravitatea infecției sau cu răspunsul la terapie
- util în studii epidemiologice și în evaluarea inițială a unui pacient simptomatic

În sală se găsesc: frotiuri din cultură C. difficile colorate Gram; testul ureazei.