Cercetarea experimentală

Curs MCS 4

Dr. Șerban Radian

Disciplina Endocrinologie
UMF Carol Davila, București
 Utilitatea cercetării (experimentale)

• Progres științific și medical

• Formare profesională (licență, master,
doctorat, postdoctorat)
• Acces la job-uri academice / industrie
• Satisfacție – curiozitatea / plăcerea de a
descoperi – motivație esențială
• Motivație personală (afectivă) –rezolvarea
unor probleme care ne privesc direct
Variabilitatea genomului uman

• SNP = single-
nucleotide
polymorphism

http://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMoa0908094
The Human Genome Project 1990-2003
 Tipuri de cercetare experimentală

• Wetlab (wet = umed – pipetarea soluțiilor)

• Drylab (in silico – bioinformatică)
• Cele două sunt complementare
• Statistică
Genome Browsers

http://genome-euro.ucsc.edu
Whole genome sequencing (WGS)
 Cercetarea translațională

• From (patient) bed to (lab) bench and back to

patient
 Cercetarea translațională

• Exemple: diagnosticul genetic, modele

experimentale țintite (mutații
”private” – diferențierea iPSCs,
genome editing, animale transgenice)
• Diagnosticul prenatal și
preimplantator
• Personal genetics / genomics
 Medicina personalizată

• Profil de risc individual

• Ghidarea strategiilor de prevenție
• Diagnostic precoce
• Tratament individualizat (farmacogenetică /
farmacogenomică)
 Mituri

• Cercetarea nu este necesară ca să fii un doctor

bun
• Cercetarea poate fi făcută doar de biologi,
este inaccesibilă pentru clinicieni
• Cercetarea nu se poate face decât în țările
avansate economic / tehnologic
• Cercetarea necesită bugete mari, la care nu
avem acces
 Cercetarea experimentală

• Ipoteză – Plan experimental – Experiment

• Intervenție (farmacologică, mecanică, genetică,
etc.)
• Rezultate: Observație / Detectare cantitativă /
calitativă
• Analiză date
• Interpretare rezultate: semnificație (statistică),
mecanism (cauză-efect), consecințe, ipoteze noi
• Publicații
• Continuarea finanțării
 Research Tools

• Documentarea robustă / planificare proiect

• Lucrul în echipă
• Colaborarea / networking
• Infrastructura de cercetare
• Abilități tehnice / protocoale de cercetare
• Servicii conexe – secretariat, achiziții,
administrație, organizare seminarii / conferințe
• Finanțare
 Probleme frecvente
Problema Soluții
Lipsă de experiență Antrenament, interacțiune
(Research Gate)
Lipsă precizie / rigoare Documentare (caiet experimente – labbook),
supervizare, quality control)

Monotehnică Colaborare / Project management

(”diviziunea muncii”
Lipsa reproductibilității Replicare / Controlul condițiilor
experimentale

Lipsa timp Management cercetare

Ne-finalizare Folosirea rezultatelor preliminare

Continuitatea în cercetare
Rezultate negative Publicații de tip nou
 Participarea studentului la cercetarea
experimentală

• Voluntariat
• Lucrare de licență
• Lab visits
• Proiecte scurte (stagii de vară)
• BSc. (UK)
• DEA (Franța)
 Dogma centrală a biologiei

ADN – ARN – Proteină – Funcție

Genetică

Genomică Expresie genică /

Transcriptomică

Epigenetică

Analize proteinelor

Proteomică
 Nivele de studiu experimental

Fiziologie in vivo / in vitro

Fenotip:
- Homeostazie
Biologie moleculară și - Comportament
celulară - Antropometrie
- Longevitate
- Etc.
 ADN – genetică și genomică

• Extragerea ADN
• Amplificarea prin PCR
• DNA sequencing – Sanger și Next Generation
Sequencing – NGS
• Aplicații – detecție de mutații
• Citogenetică
CARE ESTE DIAGNOSTICUL?

Pacienta DL, 15 ½ ani, sex feminin

Clinic: amenoree primară
întârzierea dezvoltării pubertare
deficit statural relativ

Dezvoltare pubertară: Tanner B1 P4

Stigmate somatice minime:

torace în platoşă
discret cubitus valgus
hipertelorism mamelonar
metacarpienele 4 şi 5
moderat scurtate
 DAR CARIOTIPUL?

Examen direct a 57 metafaze, din care 4 au fost

cariotipate.
Dintre acestea 52 au avut cariotip 45,X şi 5 au avut
cariotip 47,XXX

Cariotip 45,X Cariotip 47,XXX

Cariotip spectral (SKY – Spectral Karyotyping)

Cromozomii sunt identificati prin hibridizare de sonde marcate

fluorescent (Fluorescent in situ hybridization)
Carcinomul medular tiroidian familial - AD

Normal control DNA

TGC634TAC
(Cys634Tyr)
 NGS (Next Generation Sequencing)
Principiu – emiterea unui semnal luminos cand o baza
este incorporata enzimatic (ADN-polimeraza / ligaza)
Flux de lucru (durata – zile)

Costuri – Target sub 1000 $ / genom complet

Costurile de analiza sunt
suplimentare – atat bani cat si timp

Parhon – Illumina MiSeq

 Screening mutatii AIP – experienta noastra

157 pacienti cu AH recrutati în perioada 2009-2013 (56 M / 91 F,

155 sporadici, 2 FIPA)
Diametrul AH 4.9-59mm: 125 Macro / 20 micro / 12 mezo
Secvențializare cu terminatori
Tipuri adenoame marcaţi fluorescent a celor 6 exoni ai
hipofizare (AH) - AIP genei AIP
 p.R314W, c.940C>T

IT, sex M, 18 ani la debutul modif,

ACM, diagn la 30 ani – ACM

SCHO (cecitate OD, AV OS=0.1), R314W

DZ sec, Cardiomiopatie
AIP exon 6L AIP exon 6R

3 ani postop
 NGS (Next Generation Sequencing)
Aplicatii in diagnostic
WES (Whole Exome Sequencing) – descoperirea a noi
gene cauzale
WGS (Whole Genome Sequencing) – putin folosit –
costisitor, dificil de analizat
Targeted Capture – varianta restransa a WES: avantaje de
cost si rapiditate (ex. feocromocitomul)
Teste de diagnostic – NGS – Exeter Lab (UK)
 Reglarea expresiei genice

• Promoterii genelor
• Enhancer
• Factorii de transcripție
• ChIP
• EMSA
• 3C, 4C
 ADN – epigenetică și epigenomică

• Reglarea expresiei genice

• Modificări ADN – metilarea
• Modificări ale histonelor – metilare, acetilare
 ADN recombinant

• Plasmide
• Bacterii competente
• ADN plasmidic
 Instrumente esențiale

• Pipeta digitală / pipetare robotică

• Mașina PCR (thermocycler)
• DNA sequencer – Sanger și NGS (core facility)
Garage / Kitchen Lab
 ARN

• Extragerea și purificarea ARN total / mesager

• Revers-transcripția
• Northern blot
• In situ hybridization (ISH)
• Quantitative realtime reverse-transcribed PCR
(qRT-PCR)
• Digital droplet PCR
• Expression arrays
• RNAseq
 MicroRNAs (miRNAs)

• Reglarea expresiei genice

• La nivelul 3’-UTR (untranslated region)
 Microarrays

• Tehnologie – principiu
• Aplicații:
– expression arrays (ARN – transcriptomics)
– Genotyping (single-nucleotide polymorphisms -
SNPs)
 Proteine

• Extracție
• Cuantificare proteine totale
• Separare și analiză cantitativă – Western Blot
• Imunodozare (în ser / plasmă, mediu de
cultură, etc.)
• Mass spectrometry (MS), LC-MS, Tandem MS,
etc.
• Proteomică – electroforeză 2D
 Anticorpii monoclonali

• Obținuți în linii celulare (Hybridoma)

• Avantaje: specificitate crescută, disponibilitate
”nelimitată”
• Aplicații:
– Western blot
– Purificare proteine / Co-IP
– Imunohistochimie
– Imunofluorescență / Citometrie de flux
– ChIP (Chromatin immunoprecipitation)
 Anticorpii policlonali (antiseruri)
• Obținuți prin inocularea animalelor (iepure,
capră, măgar, etc.) cu fragmente moleculare
antigenice
• Avantaj: semnal crescut, datorită clonelor
diferite de anticorpi / epitopi multipli
• Probleme:
– legarea nespecifică de alte antigene (pot fi
purificați prin afinitate)
– Cantitate mare, dar limitată (de cantitatea de ser
ce se poate recolta de la un animal)
• Încă larg folosiți în cercetare
wt KO
 GH - green, TSH red

control 21 days 28 days

 Modele biologice

• Culturi de celule
– culturi primare
– linii celulare
– S. Cerevisiae
• Animale de laborator
– Șoareci, șobolani
– Iepure, pisică, câine, primate
– Drosophila, Caenorhabditis Elegans, Danio Rerio,
 Tehnici – culturi celulare

• Tratamente farmacologice
• Expresie de transgene – transfecție (chimică,
electroporare)/ transducție (virală)
• Gene silencing (siRNA)
• Genome editing
• Output – proliferare celulară, formare de
colonii, apoptoză, migrare și invazie,
xenograft-uri la șoarecii nuzi (atimici)
Henrietta Lacks
1920-1951
Locusul de integrare al HPV-18 in genomul HeLa
 Tehnici – animale de laborator

• Tratamente farmacologice
• Gene KO
• Animale transgenice (germline sau injectare
țintită
• Animale KO /transgenice specifice de țesut (Cre-
Lox)
• Genome editing
• Output – fenotip: mortalitate, malformații,
creștere, metabolism, comportament, biochimie,
hormoni și reproducere, schelet, etc.
 Nude mouse

• Șoarecele nud (Foxn1−/−) și cel heterozigot -

normal fenotipic (Foxn1+/−).
• Lipsa de dezvoltare a timusului – deficit de
limfocite T
• Deficite imunologice (CD4+ / CD8+
dependente)
• Lipsa rejetului grefelor: Allotransplant-uri /
Xenotransplanturi-uri
 Celule stem

• ESCs (embryonic stem cells)

• iPSCs (induced pluripotent stem cells) –
Yamanaka factors
• Au markeri imunohistochimici
• Au proprietăți specifice în culturile celulare
• Pot fi diferențiate cu protocoale specifice în
țesuturi specializate, pentru a le studia
 iPSCs
Induced pluripotent stem cells
Genome editing
HEK 293 AIP / AHR double immunofluorescence

AIP – red / AHR – green / DNA – blue

Leica widefield microscope
 Etica

• Utilizarea rațională / economică a animalelor

în cercetare
• Tratamentul uman al animalelor de experiență
• Reproductibilitatea
• Frauda (scientific misconduct) – exemple și
consecințe
• Data manipulation
• Data fabrication