Filimon Ana Mihaela

Master BMBA, an I

Microscopia de fluorescență

Microscopia de fluorescență este o ramura a microscopiei care studiază fluorescența

compușilor organici și anorganici concomitent cu absorbția și reflexia.
Fluorescența este proprietatea optică a unor molecule de a emite radiație
electromagnetică (lumina) ca urmare a tranziției de dezexcitare de pe un nivel electronic
superior pe unul inferior, în urma absorbției de radiație electromagnetică situată în domeniul
UV sau vizibil.
Anumite substanțe posedă proprietatea de a emite radiație vizibilă în urma expunerii la
UV, proprietatea purtând numele de fluorescență. Aceste substanțe sunt caracterizate de o
lungime de undă de excitație (in UV) și de o lungime de undă de emisie, (in vizibil), ceea ce
face ca tehnica de punere în evidență a fenomenului de fluorescență să permită și identificarea
substanțelor studiate, nu doar semnalarea prezenței acestora. Cu acest scop se utilizează filtre
optice și UV pentru selecția radiaţiei de excitaţie şi de emisie a substanţei care urmează a fi
observată.
Printre substanțele care posedă aceste proprietăți se numară și cele de interes medical,
precum acizii nucleici, proteinele, etc.
Pentru a observa o serie de substanţe care nu prezintă fluorescenţă în mod direct, se
utilizează ”markeri de fluorescenţă”. Markerii sunt substanţe care au următoarele proprietăţi:
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează.
Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor.
Evidentierea si studiul proprietăţii de fluorescenta are loc în prezenţa unei molecule
numite fluorofor : proteina verde fluorescenta, fluoresceină (proteine fluorescente). Proba se
supune unei lumini de o anumită lungime de undă, radiaţia luminoasă fiind absorbită de către
fluorofor. In urma absorbtiei, acesta emite o radiaţie luminoasă de lungime de undă diferita de
cea absorbita. In componenta unui astfel de microscop intra pe langa sursa de lumina, oglinda
dicroica si filtre (in diferite combinatii, de excitatie - banda dubla de excitatie, banda tripla de
excitatie, si de emisie).
Fluorescența are multe aplicații practice, cum ar fi mineralogia, gemologia, medicina,
senzorii chimici (spectroscopia fluorescentă), etichetarea fluorescentă, coloranții, detectoarele
biologice, detecția razelor cosmice și, cel mai adesea, lămpile fluorescente. Fluorescența apare
frecvent în natură în unele minerale și în diferite stări biologice din multe ramuri ale regnului
animal.
Principii fizice
Fotochimie
Fluorescența apare atunci când un electron orbital al unei molecule, atom sau nanostructură se
relaxează la starea de bază prin emiterea unui foton dintr-o stare de excitare singlet:
 Excitație: S0 + hνex → S1
 Fluorescență (emisie): S1 → S0 + hνem + căldura
Aici hv este un termen generic pentru energia fotonică cu h = constantă Planck și ν =
frecvența luminii. Frecvențele specifice ale luminii incitante și emise depind de sistemul
particular.
 Filimon Ana Mihaela
Master BMBA, an I

S0 se numește starea de bază a fluoroforului (moleculă fluorescentă), iar S1 este prima stare de
excitare singlet excitată (electronică).
O moleculă în S1 se poate relaxa prin diverse căi concurente. Aceasta poate suferi o
relaxare non-radiativă în care energia de excitație este disipată sub formă de căldură (vibrații)
a solventului. Moleculele organice excitate se pot relaxa, de asemenea, prin conversie într-o
stare triplă, care se poate relaxa ulterior prin fosforescență sau printr-o etapă de relaxare
secundară non-radiativă.
Relaxarea din S1 poate apărea și prin interacțiunea cu o a doua moleculă prin stingerea
fluorescenței. Oxigenul molecular (O2) stopează extrem de eficient fluorescența doar datorită
stării sale triplete neobișnuite.
În majoritatea cazurilor, lumina emisă are o lungime de undă mai lungă și, prin
urmare, o energie mai mică decât radiația absorbită; acest fenomen este cunoscut sub numele
de deplasarea Stokes.
Randament cuantic
Randamentul cuantic de fluorescență asigură eficiența procesului de fluorescență.
Acesta este definit ca raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul de fotoni absorbiți.
Φ = Numărul de fotoni emiși / Numărul de fotoni absorbiți
Randamentul maxim al fluorescenței cuantice este 1,0 (100%); fiecare foton absorbit are ca
rezultat un foton emis. Compușii cu randament cuantic de 0,10 sunt încă considerați destul de
fluorescenți. Un alt mod de a defini randamentul cuantic al fluorescenței este prin rata
dezintegrării stărilor excitate:
Φ = kf/Σi ki
unde kf este constanta ratei emisiei spontane de radiație și Σi ki este suma tuturor ratelor de
dezintegrare a stărilor excitate.
Durata de viață
Durata de viață a fluorescenței se referă la timpul mediu în care molecula rămâne în
starea excitată înainte de a emite un foton. Fluorescența urmează în mod obișnuit cinetica de
ordinul întâi:
[S1] = [S1]0e-Γt
unde [S1] este concentrația moleculelor de stare excitate la momentul t, [S1]0 este concentrația
inițială, și Γ este rata de dezintegrare sau inversul duratei de viață a fluorescenței. Acesta este
un exemplu de dezintegrare exponențială. Diferitele procese radiative și non-radiative pot
depopula starea excitată. În acest caz, rata totală de dezintegrare este suma tuturor ratelor:
Γtot = Γrad + Γnrad
unde Γtot este rata totală de dezintegrare, Γrad este rata de dezintegrare radiativă și Γnrad rata de
decădere non-radiativă. Este similară unei reacții chimice de ordinul întâi în care constanta
ratei de ordinul întâi este suma tuturor ratelor (un model cinetic paralel). Dacă rata emisiei
spontane sau oricare alte rate sunt rapide, durata de viață este scurtă. Pentru compușii
fluorescenți utilizați în mod obișnuit, timpii de dezintegrare tipici ai stărilor excitate pentru
emisiile de fotoni cu energii de la UV până la infraroșu apropiat sunt în domeniul de la 0,5 la
20 nanosecunde. Durata de viață a fluorescenței este un parametru important pentru aplicațiile
practice ale fluorescentei, cum ar fi transferul de energie prin rezonanță fluorescentă și
microscopia de imagistică prin fluorescență.
 Filimon Ana Mihaela
Master BMBA, an I

Bibliografie
1. http://www2.phys.uaic.ro/labs/comb/facilitati%20-
Microscop%20de%20fluorescenta.html
2. https://www.setthings.com/ro/fluorescenta/
3. http://www.phys.ubbcluj.ro/~dana.maniu/OS/Lab_fluorescenta.pdf