Lucrarea practicd l.

cOMPozrTr1^ CI{IMICA A PLzTNTELOR

1.1, Determinarea apei, substanfei uscate qi a cenuqii

Determinarea substar-r{e i uscate totale se rcalizeaz.it prin cintdrirea malerialului vegetal

proaspf,t, uscarea timp de 24 ore la 105'C, rdcirea in exicator gi recAr-rtdrirea materialului vegetal
uscat. Rezultatele oblinute vor fi exprimate proceutual (%).
Determinarea cenugei s-a realizat prir-r cAntdrirea materialului uscat, calcinarea 5 ore la
570'C, ricirea in exicator gi recAntdrirea materialului vegetal calcinat. Rezultatele ob{inute vor fi
exprimate procentual ('%).

I'ara + 'fara +
Tara + Subst. Substanfi
Denumire Nr. Tara subst. subst. Apr CenuqI
cenugi proaspiti uscatl
probi creuzet yqgpl!r uscatii
(,

Frunze

Mere

F-runze

Mere

Model culcul:

$tiind ca in ,4 g subst. proaspitd . ...8 g subst. uscatd. ...C g cenuqi

100 g x %o surbst. uscatd .Y oZ cenugi

x 7r, subst. uscatl -'f ' 100 y %o subst. uscati: C' l!0
A
oh apd: 100 - x "/" subst. uscati

Temd. Contparali rezultatele ob1inttte.

1.2. Eviden(ierea elementelor minerale prezentc in cenuqi

1.2.1. Evidenfierea fierului (Iie)
Fierul se gdseSte tn cenuEu plantelor cle spanac, Jructelor de tomute, etc. sub.formd de
Fe2Oj, care prin trotare cu IICI trece in lreCls.
Extrac{ie.
intr*un balon lrrlenmeyer se pun aproximativ 3 g de cenr,rg[ peste care se adaugd 10.96 rnl
de acid clorhidric conc. (d---1,190) apoi se adaugd fi9"04 ml apd distilatf,, astfel inc0t volumul final
al extractului sd fie de i00 ml. Se incilzeqte timp de 10 rnin. la flacdr'a micd, apoi se filtreazd
printr-un filtru cutat. Acest extract se poate folosi pentru evidenlierea fierului, aluminiului.
calciului. magneziului, carbor, a{ilor 9i sulfalilor-
 Evidentiere.
a) C u .fbrocianuti de-pPto.YuL
intr-o eprubetf, se iau 1-2 m[ de extract ob{inut prin procedeurl de mai sus peste care se adaugd 2-3
picdturi de ferocianurd de potasiu de concentra{ic 10%0. Se obline un precipitat de culoare albastr6
caracteristic6 de f'erocianur6 ferici (albasn'u de Berlin).

4FeClr I 3K,r[Fe(CN)r,] ' Fc4[f;e(CN)olr+ r l2KCl

t-erocianura I'crocianura
dc potasiu l'eric5
(albu:;tru cle Rerlin)

Dacd in extract este foarte pu{in fier nu se lormeazd precipitatul albastru ci apare o culoare
albastrE-verzuie sau cl, iar verde. Concerrtra{ia lirrita pentru oblinerca culorii este de I : 1.000.000.

b) *lu-QJllJ q eiquwg--d-c t?(?lt! J i!!-.

intr-o eprubetd se iar-r l-2 ml clc extract oh{inut prir-r procedeul de mai suts peste care se adaugd 2-3
picdturi de sulfocianurd de potasiut (KSCN). Cor-r{ir-rutul eprubetei se vo colora in roSu intens
datorita form[rii sulfocianurii de fier.

Irecl.r I SKSCN Ire(SCN)3 i 3 KCI

sul{bcianr:ra sr-rlfocianura
de potasiu fericd

Dac[ in extract este fbarte pu{in fier apare o colora(ie ro;u pal.

1.3. Eviden{ierea elementelor minerale in fesuturile vegetale

1.3.1. Eviden{ierca azotului amoniacal (Nltr')
intr-un pahar firlenmaver de 100-200 ml se pun fragtnente de bulb de ceapd tdiate mdrunt qi se
acoperi cu NaOII 1O-20%. Se asturpd paharul cu un dop de caucittc strdbltut de un ttrb de sticld
indoit in unghi asculit gi at cdrui capdt Iiber esle inlrodus intr-o eprurbetd cu apd in care s-au pus
2-3 picdtr-rri de fenolfialeind (un indicator care ir-r mediu neutru este incolor, iar in mediu bazic
devine rogu). Se incdlzeqte con{inr-rtul balonr,rlui, linAnd f-lacira la o oarecare distan{a de acesta
astfel incdt sd se evite spargerea sa.
Pe mdsura degajirii amoniacului dir, sf,rurile dc amoniu existente in {esutul vegetal,
fenolftaleir-ra se colorcazf, in rogu mai mult sau mai pu{ir-r intens. in func{ie de cantitatea degajata.
1.3.2. Identilicarea histologici a calciului
Se realizeazd secliuni transversale prin pe{iolr-tl fiunzelor de Begonio sempervirer.r sau Begonia
rex care se trec pe o lamd de rnicroscop intr-o picaturd de ap[ distilata, se acoperd cu lamela 9i se
observi la microscop. in cetulele paranchirnatice se observd cristale de oxalat de calciu.

1.4. Metocle morlerne de determinare a elementelor minerale in organele plantelor

Aceste metode necesit[ cchiparnente speciale numite spectrotnetre, care pot fi cu absorblie
atomica (prescurtat AAS) sau de emisie atomicd in plasmf, cuplatd inductiv (lCP-AES).
a) Spectro/tttornetrul cu abs'ctrbtrie atomicii,l,4$ cuprinde o sursd de excitalie a probei
(sursa de radialii larnpd de der:terir: sau cu vapori de mercur). un atomizor care are rolul de a
transforma proba tichidi in picdturi foar1e fine (flacarh sau cuptor de grafit), un selector de
lungirni de undi (un filtrr-r specific fiecdrui element analizal), un detector, amplificator qi procesor
de semnal (componente care transformd radia{ia absorbitd de elementul de interes in date
analitice).

Principiul spectronietriei de al)sorblie atomica

,i :r*r:1*
ja,r, 6s
Lentile de
c!ncentlale
r&
eN k ,*aI Selector de

ryt.Nt
ru
ffi{
lungimi de unda

&i
fl -:"*,''
Procesol
' da semnal

,$p+ctrometru cu ahs*rhtie at$micfr

in timpul excitdrii probei cu o
sursd de radia{ii, atomii absorb radia!ia luminoasd
caracteristici lleo[rui element. Gradul de absorblie este proporlional cu concentra{ia elementului
in flaciri. Difererr{a mdsuratf,, dintre intensitatea lurminii dinainte qi dupd absorblia radia}iei
specifice elel-rentulr,ri de interes. defineqte absorb{ia specifica 9i poate fi folositd pentru
determinarea elementului din solulie.
Este o pretocl[ dc analizd ser-rsibild (p6rr[ la concentralii de 0,1-5 ppm). insS necesit5
consum mare de tirnp gi probd daci se urmSre;te determinarea concentra{iei mai multor elemente,
datoritd analtz.ei succesive a f iecirr-ria.
 b) Spectrontetrtl cle emi,sie cttomicti in plusntu cuplata inductiv, IC'P-AES,
Principiul de func{ionare al spectrometrului lCI']-AE,S este spectrometria de emisie opticS.
Substanla de interes al'latd in slare lichidi este pulverizati (nebulizatd) gi pr"rrtatd de un flux de
gazinerr. (de regula argon) in plasrn[. in urnra proceselor de excitare-dezexcitare care au loc in
plasm[ (un gaz a cirui temperaturA internd a.junge la 10.000 K), atomii gi ionii probei emit
radia{ii electromagnetice (radia{ii optice). Aceste radia{ii emise. sLrnt trecLrte in sistemul optic al
spectromerrului. unde in urma dispersiei dupa lungirnea de uncld. intensitatea radia{iilor de interes
este mdsuratd prin intermcdiul deteclorului. Inteusilatea radia{iei care este proportional6 cu
concentralia elementului din proba. este recalcr-rlatd intern dintr-r,tn set de curbe de calibrare

. i -r"!l
s*i $
$, t l:rlt,, i

it
$
A}

Aceastd tehrics pemite analiza simurItand a pAnd la zl0 de elemente. fiind o tehnici
multielement, rapidf,, sensibild gi precise
Pentru analiza cantitativi a elementelor prezcnte in probcle vegetale de interes. cenu$a
ob{inuth dupd calcir-rarea unei cantititri de probi cLrr-roscute se dizolv[ in I ml de acid azotic conc..
apoi se trece intr-un balon cotat de 50 rnl gi se adr-rcc la semn cu apd bidistilat6. Astfel elementele
minerale prezente ir-r probd au fbst dizolvate;i se pot analiza la spectrometrul de emisie atomicd
in plasmd cr"rplatS inductiv.
Lucrarea practicd 2.

CLUCIDE
1.1. Reacfii de identilicare a glucidelor reducltoare in materialul vegetal
Principiul metodei
Se utilizeazi reuclin Fehling sau reaclia'l-rommer care au acelaqi mecanisnt al reacliei. reactivul Fehling
continend in plus fa{6 dc reactivul J'romnrer sarea Seigr.rctte (tartrat dr"rblu de sodiu gr potasiu). Sdrurile de cupru de
culoare albastrd in n-rediu alcalin sunt reduse de cdtre elucidele rcducltoare (rnonoglucide sau oligoglucide) la oxid
cupros de culoare rogie-clrdmizie. care se depune sub lorma unr-ri precipitat.
Mecanisnul reacliei estc unnhtorr-rl: sullatul de cupru reaclioneazi cu hidroxidul de sodiu, formdnd
hidroxidul cLrpric Ei sulfatul de sodir,r:
CuSOa I 2NaOH Na.SO1 t Cu(Ol I):r

Hidroxidul cupric, de culoare albastrd. in prezen{a glucozei sau a altor uronoglLrcide sau oligoglucide cu
gruparea aldehidicd liberd. la cald este reclr-rs la oxid cupros. Lrn precipitat de culoarc rogie-ciirdmizie:
o'\---- !l Os..r -ClH
i

H--l-- oH l.l-.i cjll

I

-t- H
I

l-1O ts J,. rr1111, -.---+- l-{O-i lt ,+ Cu:O+ H:O

H- -l-- ,.-lu H--|-=-ot"l
HiOH
l
i c'xicl cllpros
:
H-1-OH
cl-t;,otl {.:Fl .ari.l

Glir0oza .Ai:i,:i rJluConic

in tirnpul reacliei cle reducere a hidroxidulLri cupric la oxid cupros. gruparea aldelridic[ a glr-rcidului este
oxidatA, monozaharidul (oligozaharidul) este translbrrral in acid monocarboxilic - in acest caz glucoza este
transf,ormatd in acid gluconic.

1.1.1. Identificarea glucidelor reducltoare in extracte vegetale

Reactivii neces0ri
Reactiv Fehling oblinurt prin arnestecLrl in p6rli egale (l:l), in momentul reactriei, a
reactivului Fehling I (a0 g (lurSO,r'5H:O dizolvat in I I apd distilata) cu reactivul Fehling II (346
g sare Seignette tartrat dublu de sodir"r qi potasiLr $i 140 g de NaOFI dizolvate la cald intr-un
litru de apa distilatd). Reactivul Ti'ommer este identic cu reactivLrl Fehling, insd nu contine sarea
Seignette.
Soltttii standard de concentralie 2o/o de monoglucide (glucoz5,, fructozd) ;i oligoglucide
(zaharozd, maltozA).
Exlractul glucidic. Materialul vegetal consland in fructe (mere, struguri, etc.), frunze ale
plantelor din farnilia Liliacee (ccapi verde sau ('hlorophytum). bulb de ceapi, riddcini tuberizate
de morcov sau sfeclA de z.ahdr. semintre aflate in curs de germinare se miruntre$te $i se {lerbe
cateva minute in apd distilat[ (aproximativ 20 g material vegetal la 100 ml ap[ distilata).
Extractul obtrinut se filtreazA sau se decanteaz.d qi se folose$te in reactriile de identificare,
comparativ cLr solutriile standard de glucide.
Mod de lucru
in -5 eprr-rbete numcrotate se pun cAte l-2 ml de solulii de glucozd. ftuctozd, zaharozd Si
extract glucidic. apoi se adaugd un volum egal de reactiv Irehling $i se agit6. Con{inr-rtul celor 5
eprubete se incdlzegte la fierbere. apoi sc lasA sd se r[ceasc6 intr-un stativ. Se constat6 aparitia
unui precipitat rogr-r-cdrimizir-r de oxid cLrpros ir-r r-rnele eprLrbete.
Temii. C'ontpcrru{i reznhatele reacliei cle culoore oblinute cu cele 5 solttlii de analizat Si
explicali prezen{a sou absenla precipilalului de CutO.
1.1.2. Identificarea histochimici a glucidelor reducitoare
Mod de lucru
Se trec pe lama de microscop odteva liagn,ente din epidenna inferioard a bulbului de
ceapd gi se adaugd 2-3 picratL-rri de reactiv Fehling. Prin incilzire la flacdrd,, apare o coloralie
ror;ie cdrdmizie cle oxid cupros, ceea ce inclicd prezen{a glucidelor reducdtoare.
Pentru stabilirea localizdrii la nivel celular a respectivelor glucide. seclir-rnile se trec apoi
pe o alta lamd de sticlS, intr-o picdturi de ap6, se acoperd cu lamela gi se examineazd la
microscop. Se remarci prezenta in vacuola celr"rle lor a numeroase granulc de oxid cupros, ceea ce
indicd prezen\a in special a glucozei depozitatd in acest orgar-rit.
Temd. Realizali de"^enul corespunzdtor campului nricroscctpic'in core se observd
granulele de oxid cupro,t in yacuole.

1.2. Reac(ii de identilicare a poliglucidelor tn materialul vegetal

1.2.1. Identificarea amidonului din f[in5
Principiul metodei
Metoda sebazeazd pe reaclia de culoare specifica anridonului cu iod in iodura de potasiu, datoratd re{inerii
L de cdtre rnacrornoleculele de arr-ridon.
Reuctivii necesori
Reaclit; iod in iodurd de polcts'iu (12/KI) ob{inut prin dizolvarea a 4 g ioclur6 de potasiu in
10 ml ap6 distilati; in solLrlia ob{inuta se dizolva I g de iod metalic. apoi se adauga 290 ml ap[
distilat[.
Amidon oblinurt prin amestecul a 1 g de fdina (sau pulbere de amidon) cr-r 100 rnl apd qi
fierbere 1 min.

Mod de lucru
intr-o eprrlbetd se pun 1-2 rnl cle amidon. apoi se adaugd 1-2 picdtLrri de reactiv iod in iodurd de
potasiu gi se agit[. Se constatd crparilia unei colora{ii albastru inlens care latemperaturi mai mari
de 60 oC dispare. apoi reapare la sciderea lernperatLrrii.

1.2.2. Identificarea histochimicl a amidonului

Mod de lucru
Se efectueazd secliur-ri prin semin{e cle fasole. cariopse de grAur gi porun-rb }inute in prealabil in
apd, cAt gi prin tubercr-rlurl de cartof. Secliunile se trec pe lama microscopicd. intr-o picdtura de iod
in iodr-rr[ de potasiu. se acoperd cu larnela q;i sc analizeaz.ia la microscop. Vor fi oh,s'entali in
fiecare caz in parle, grdunciori de amidon colorali in albaslru at,and mdrimi Si /brme
ca racl e r is t i t'e s pa t i t' i.
 Astf'el, la poruntb. grdunciorii cle arnidon sunt poliedrici gi au
po1'ullrlr gt'iirr
circa 25 pm; la grau sunt de fbrrr-ri circulari privili din fa{[ pi
ffis
ffii'
"ireil10
a@
lenticulard. privili din profit, iar dimensiunile sunr de circa 40
pLrn: [a .fasole. grdunciorii au dimensiuni mari (50-70 um), iar
lorma este ovald. cu un hil rarnifrcat gi orientat in direclia axului
l.rsolc CaIl{l.f
longitudinal.
@oJ
-drJso @@ L,a cartctf. grdr-rnciorii de amidon sunt mari (100 prm). au formh

W ovald. iar hilLrl cste pozi{ionat excentric. in jurul sau observAndu-

se striali ur-ri concentrice.

1.2.3. Identificarea histochimicii a inulinei

lnulina este un poliglucid ncreducdtor. un fructan. fbrmat din i5-100 de molecule de frr,rctozd lesate terminal de o
molecul6 de glucoza, solubil in apA gi insolubil in alcool etilic concentrat.

Mod de lucru
Se trec pe lama de microscop sec{iurni cAt mai fine prin
r6dicina tuberizald de Dohlia (pdstrati in alcool etilic absolut,
schimbat repetat, pentru deshidratare), intr-o picdturd de glicerind
pur6. se acoperd cu lamela gi se examineazra [a microscop. Inulina
apare sub l'orm[ de sf'erocristale incolore, situate in .iurul pere{ilor
ceh-rlari
Dacci .s'e ltloseazd in api| inulino se dizolvd Si nu se mui
observd nimic.

1.3. Metode moderne de determinare a glucidelor in extractele vegetale

Se referd la metodele cromatografice care pot evidenlia prezen{a glucidelor (mono- qi
oligoglucide) in extractele vegetale (cromatografia pe hArtie) sau pot fvrniza date analitice cu
privire la concentralia glLrcidelor in probe (cromatografia de lichide, de inaltd presiune - HPLC).
Principiul cromatogra/iei de lichicle - LC.
Este o metodd de separare a oomponer"rlilor unui amestec (dc ex. suo de fructe) pe baz.a
gradului diferit de solubilitate a acestora intr-un amestec de solven{i organici (faza tichidd) gi a
gradului diferit de relinere pe un suport (hArtie cromatografica. cliferite umpluturi ale coloanelor
crortatografice). in urma separdrii. fiecare glr-rcid component va apdrea in cromatogrami la un
anumit timp caracteristic. numit timp de reten(ie.pe baz-a cdruia va fi identificat.
Identificarea fiecdrui tip de glucid se poate f'acc fie peba'za reac{iilor de culoare cu un reactiv
de revelare (in cromatografia pe hArtie) sau pe baza indicelui de refrac{ie sau a masei moleculare
a sa. In cazul in care pentru transportul fazei Iichide in sistemul cromatografic se folosesc pompe
care aplici presiuni ridicate asupra amestecului de solven{i metoda se numegte cromatografie de
inaltd presiune ;i folosegte echipamente speciale - cromatografe HPLC cr-rplate cu diverq;i
detectori (RID-indice de rcfraclie. MS-speclrometru de rnas6).
 --:-.)
\N Cr0mat0qraf in fnza
]N\\\\: .r') lict:ida (HPI-C) cu s\.

.'!N\\: detect0ri: *x
'.'i - spectrotnetru tle rtrasa
f,,l; (tvls) &
rl\\N - intiice de refractiB I

i\$N\\ (Rrn)
..- ... r* - dioda arrny (tlAD)
.Y$ : N.
e\. xh.
I
l
J
,j 1
I I
tj l$**"*+
I
ffi

w
W

N,'s
Aceastd tel"u-rici pen,ite analiza simr:ltand a gluciclelor in probe. fiind o tehnici
rnultielement. rapidS, sensibilS 5i precisS.
HiDl 3. {$fr;d Ni lr,Je{ S:llflit tJrit.tr.HUl+s,Jr,tr:} i}l.l:rl
i::{tu,
l

1i;*{7 1
rr{ N
;

l F
:rn ,-

t'-.1

F;Bl) i
t:
l'l
l
a
il,i
l
iii tl
:
ii
.lt:$D ',

rl

I
Lucrarea praclica 3.

LIPIDE
1.1. Reac{ii de identificare a lipidelor
1"1.1. Lipidele lash pe hArtia alba de scris o patf, transparentd. Semin{e de dovleac, de alun
sau de nuc presate pe o hdrtie albd de scris dau naqtere la o pata persistenti
transparentd care denoti prezenla grisin-rilor
1.1.2. Cu reactiv Sudan III
a) Se aplica o picaturd de solulie alcoolic[ 0,5% de Sudan III pe o sec]iune fEcutd din
sdmAnla de dovleac se obline o coloralie roqie-portocalie.
b) Se amestecd intr-o eprubeti 1-2ml de ulei vegetal cu cAteva pic[turi de Sudan IIi
qi se agitd puternic. Uleiul se coloreazd intens in portocaliu.

1.2. Metode de determinare a confinutului de lipide

Semin{e de dovleac, alun. nuc Llscate la eturrd la 100-105 "C;i
mdrr"rnfite se introduc intr-un cartuq Soxhlet (l) sau intr-un cartuq
confeclionat din hArtie de filtru, care se monteazd la tubul extractor
(b). Se ataqeazd. tubul extractor la balonul (a) cAnthrit in prealabil ;i
refrigerentul (c), avAnd grijd ca acesta sa fie conectat la releaua de
ap6. Se toarni solventul (eter de petrol) prin partea superioard p6nd
cdnd acesta sifoneazd (d) li ajunge in balon. apoi se mai adaugd
aproximativ 50-60 ml pentru a evita ca balonul sa rarnina fEra
solvenl inainte de o noud sifonare.
La incdlzirea balonului pe cuibul de incdlzire. vaporii
solventului ajung prin tubul lateral (e) in tubul extractor gi in
refrigerent, in care condenseaz[ qi cad in cartuqul de extrac{ie. unde
dizolva lipidele gi se adund in partea inferioard a tubului extractor.
Cdnd nivelul solventului cu lipide clizolvate ajunge in clreptul
sifonului lateral (d) are loc o prima sifonare in balor-rul de fierbere
(a). In acest fel au loc 10-20 extraclii repetate cu aceeagi cantitate
de solvent, ceea ce asigura extraclia intregii cantitAti de lipide din
Aparatul Soxhlet
rrr.n! 4;
tr . u-.rL)--'. LtrrL:n
materialul vegetal.
-i.rni
r' r.nrleiDnr I rif.nr F I lrll nr. i
., rat!5!l li enri.t.r Dupd terminarea extracliei se opreqte incilzirea balonului qi
! -.rlh iE ir..:tri
se lasi si se rdceascS, apoi se distil5 eterul de pctrol pdna cAnd tot
eterul s-a eliminat. iar balonr-rl se tusucf, in etuvd la 80 "C pdna la greutate constantd, se rf,ceqte
intr-un exicator ;i se cdntdreqte.
Diferen{a dintre masa balonului cu lipide gi tara (masa) acestuia reprezintd cantitatea
total[ de lipide extras6, care se raporteaz.d la 100 g material vegetal.

1.3. Separarea acizilor graqi prin gaz cromatografie cuplati cu spectroscopia de masl
(GC-MS)
GC-MS a$a cum aratd qi numele" reprezintd doua tehnici combinate intr-o singurd
metodd de anali'zd. a unui ameslec de substanle chimice, prin care se poate evalua atAt calitativ,
c6t qi cantitativ o soh,rfie care conline un amestec cle substanle cl-rimice nepolare.
Gaz cromatografia separd componenlii ameslecului cu ajutorul unui gaz purlStor
(hidrogen, heliu. azot). flecare peak al cromatogramei fiind un semnal creat in momentul in
care compusul este eluat din coloana gaz cromatografului qi intra in detector.
Axa Ox. reprezintd timpul de retenlie (RT), iar axa Oy. intensitatea semnaluiui (abundenla).
Ab(r.xla-re

TtC L-AP]-E O5-12-2(XX) REP1. L)

3ao(m :16'tEi 41 31 45.41
360()q)
34CmO

32()(m
3m
2AOq)O

26()(rc
u{m
xtx)
20(:}:m
1am
38 15
16()000

14lmc)
12()(rc
3(),44
100(rc 4:3 (]A
a@o 19€*j 2416 45.7t
2€ 01
m 12.n 16,16
19..16 .4o ,*r., saaff]'6 a5.2747.d)
4crr)
1c).@ 15.(D rc.CD 25"() :JO.(X) 35.(x) 4o.(\) 4-5.G) 5a) Cr)
-l-irre+
Spre exemplu, peak-ul de la 41,31 minute este pentru acidul erucic. iar cele de la 26 sunt
pentru acizii graqi Cls (oleic, linolenic, linoleic).

f s
f ffi
w
ffi
iffit' #

'/,!li,i Nt t!.tti

GC-MS
Computerul GC-MS are o libr[rie de spectre, care pot fi utilizate pentru identificarea
unei substanle necunoscute din amestecul probd. Libraria compard spectrul de masa al
componentelor proba, cu spectrele de masd din librarie gi emite o lista cr-r probabilitatea
statisticd de asemdnare.
Lucrarea praclicd 1.

AMINOA CIZI $I PROT E,INE,

1.1. Reac{ii de identilicare a aminoacizilor gi proteinelor - reactia cu ninhidrinl
Principiul metodei
Se utilizeazd reaclia cu ninhidrind, fiind dat6 de grupdrile arnino 9i carboxil din molecula aminoacidului, gi
are loc la cald in solu{ie neutri sau slab alcalin6, rezultAnd un complex colorat in albastru-violet.
Mecanismul reac{iei'. Ninhidrina reac}ioneazd cu aminoacizii dupd urudtoarele reactii:
a) intr-o primi etapd are loc oxidarea aminoacidului la iminoacid. care pierde la cald o moleculd de dioxid
de carbon gi un de arnoniac, formdnd aldehida corespunzdtoare.

COOH O _o
II-C-NHz
I il c'(
,/\,/c\ c ro}l l-H '*- co: +
(cr{r).,
(cHr)"
I

+ lll NH3 -J-

I
\,/\c,r'\orr I

R
R
oil
Aminoar:icl ninhi.lrine alclehicla
()
tl

///,\ \,',Ct \/ lH
+-lll c(1)
\,/\c/,'\oH
il
o
ninhidrina reclusa
o O
il II
,CC)H
//'-,tc\ ,H t/\/ \,/
lll c + I ll c -{- 2NII3 *+
\r'\Cr" \OH \,,,\C// \ OH
il ll
o O

o(NH3) O
tll
/\,'C1\ c-N:c ,'C\r'..r
I ll ll I + 3H2o (2)
\.,'\<:," \C,/\//
ti II
o o
coDlpUs col(

b) in ultirna fazh o molecul6 de ninhidrin6 redusd reaclioneaza cu o moleculi de ninhidrind qi una de amoniac
formdnd un complex colorat in albastru-violet.

Reactivii necesdri
Reactiv ninhidrind ob{inut prin dizolvarea a 0,1 g ninhidrina in I 00 ml apa distilat6..
ya
Solulii standard de concentra\ie ZYo de aminoacizi sau soluJie de proteind 0,5
hidrolizat[ cu l0 rnl HCl 20o la 115oh timp de 20-25 ore.
Solulie neutrd de proteine de concentralie 1o/o.
Mod de lucru
in doud eprubete nltmerotate se pun 2 rnl de solulie neutra de proteine 9i, respectiv 2 ml
solulie standard de aminoacizi, apoi se adaugA in fiecare cateva picdturi de reactiv ninhidrina.
Eprubetele se incf,lzesc pe baia de apa pAna la aparilia colora{iei albastru-violet caracteristice.
Temd. Comparcrli rezLtltatele reacliei de culoare ob{inute cu (:ele 2 solulii de analizal Si
explicali inlensitatea culori i oblinute.
1.2. Determinarea concentra(iei de proteine in materiale vegetale - lleac{ia biuretului
Principiul reacliei
proteinele. polipeticlele. peptidele ca qi biuretul, reac{ioneazd cu ionii de Cur* in solulie alcalini ddnd un cornplex
proteic ruu p"pii,li" cupro-alcalin de culoare violeti. colorirnetrabil la 540 nm. Se aplicain cazul unor carrtitdli relativ
mari de proteine (l -20 rrg/ml).
Aceasti reac{ie dath de compr-rgii cr-r legdturi peptidice R-CO-Ntl-CO-NH-R poar16 numele de reac(ia biuretului
intrucAt cel mai simplr-r compus care di aceasti reac{ie este biuretul, un colltpus care ia naqtere la incdlzirea ureii.
,oH
2 HrN (,:ll--co NH CII*(lO NH-CH-CO " ''NH CII -C(o *
n Rr R, R"*.'.
Molecuia Proteica

OH OH O}I
ill --(l 'rr:;r::: , N .-cu .c{
,OH
2 II"N--CH- C:N-.CII-C:N-CH
't1l L \tO
n R, Ilr Rn* "

Forma lautornerl a moleculei proteicr:

o l1r,

O
R3
I

CH COONa
llr
NaOC- CII 0
itl lti
Utr:tr4. -_)]Cu:--I
- -------'-----N i

l'laOFI ' ('[l

.,-r.r, \ -- '=-
ll llI--uH
NaO--C Rr
Rr C-ONa
I
I

Rr R:,

Proteinat cle cupru, cot-ttplcx de culoare vioi"t

Reuctivii necesari
Reactiv biuret obtinut prin dizolvareaa4,5 g tartrat de sodiu gi potasiu in 40 ml hidroxid de sodiu
0,2N, peste care se aclar-rgd 1,5 g sr-rlfat de cupru li 3 g iodr-rrd de potasiu, apoi se aduce la semn
intr-un balon de 500 ml cur hidroxid de sodiu 0.2N. Se pdsLreaz.d, in sticle brune.
Solulii standard de concentralie 5 mg/rnl de proteind.
Extrlactul proteic. Materialul vegetal constand in lructe (rnere, struguri, etc.). frunze ale
plantelor din familia Lilicrcee (ceapa verde saLl Chtorophytunt).bulb de ceap6. rdddcini tuberizate
de morcov sau slecla de zahdr, semintre afla1e in oLtrs de germinare - se mojareaziain prezenp de
nisip de cuartr $i se spalA cantitativ cu apA distilatd (aproximativ 1 g material vegetal la l0 ml apd
distilata). Se {ir-re t h la 4"C (la frigider), apoi se fillrazia sau se centrifirgheazd 10 min' la 6000
rpm. piltratui sau supernatantul ob{inut se foloser;te penlru dozarea proteinelor solubile,
comparativ cu solulia star,dard de proteind din care se face curba de etalonare.
Mod de lucru
l. Dozorea. in 8 eprLrbete numerotate se pLln in ordine urmdtorii reactivi, conform tabelului
de rnai jos.

ml solu(ie Concentra{ia de
ml apl ml extract proteinI I)O
Denumire standard slo n,n
distilati proteic
proteinl (mg/ml)
I _q
o,E
j 005 0 ?s
0.15 0 75 I ?5
 "i-
t=a. *alon"i-
:_* \
I

.-.-i
ll!

1
!

,.__----_._,_-J

in fiecare eprubet[ cAte 1.5 rnl de reactiv

Se adaugd bir"rret qi se agitd. Conlinutul celor 8
eprubete se {ine pe baie de api la3l'C timp de l0 min. apoi se ricesc la jet de apf, (sau 20 min la
temperatura camerei). Se constatd aparilia unei colora{ii violacee. de inter-rsitd1i diferite in func{ie
de concentralia proteinelor so lubite din eprubcta. Se cietennind dcrTsitatea opticd a solu{iilor
colorate la 540 nm (DOsao nn,) cu aiutorul unui spectrofotometru, etalonAnd aparatul fafa de apd
distilat5, considerat[ blanc.ltezultatele se trec in tabel.
2. Calctl . Se traseazia curba de etalonare tre cird pe axa OX valorile concentraliei de
proteiui corespur-rzAtoare eprubetelor l-6, iar pe axa OY valorile corespunzitoare DOs+o
,,,,., citite la spectrcllotometru.
Se citegte pe curba de elalonare concentrafia corespunz.dtoare DOseo,,,,, citite pentru proba
necLlnoscuti sau sc calculeazdpebaza formulei stabilite in MS E,xcel[, A mg proteinS/ml
extract deproteinizal.
Concentrulia de proteine solubile totale I mg/S s.p.J : Ax l0
Unde: l0 : factor de dilulie cle la extraclie (lg/10 ml)

Temd. Comparali rezuhaleLe reacliei cle dozare a concenlrtttriei de proteine solubile totale
oblinute penlru probelele analizate ;i explica{i rezttltatele obyinute.

1.2.1. Identificarea histochimicl a proteinelor cu ajutorul reactivului biuret

Mod
de lucru
Se trec pe lama de microscop cateva sectriuni de seminle de fasole imbibate timp de 24h
peste care se adaugd 2-3 picSturi de reactiv biuret. Se observi aparilia unei coloralii albastrd sau
ttiolacee, ceea ce indicd prezen{a proteinelor.Dacd. sec{iunile sunt suficient de subliri se pot trece
pe o lamd de microscop intr-o piciturd de api distilatd pentru a observa graur-rciorii de aleurond
dispersali in toatd masa serninlei de lasole. in cazr-rl cotiledoanelor reac{ia este foafte pronunlat[.
Temci. l?ealizali desenul corespunzdtor oh.servasiilor macroscopice, evenlual
micro s copice, re aliz a t e.

1.3. Metotle moderne de determinare a aminoacizilor qi proteinelor in extractele vegetale

1.3.1. Metorle moderne de determinare a aminoacizilor in extractele vegetale
Se referd la ruetodele croruatopg'afice care pot evidenlia prezen{a aminoacizilor in extractele
vegetale (cromatografia pe hdrtie) sau pot furniza date ar-ralitice cu privire la concentralia
aminoacizilor in probe (cromatografia de lichide, de inaltd presiune - HPI-C).
I'rincipiul cro motograJiei de I ic hide.

Este o metutcld cle .separore a componenlilor unui amestec (de ex. sLlc de fructe) pe baza
gradului cliferit de solubilitate a acestora intr-un amestec de solven{i organici (faza lichidd) 9i a
gradului diferit cle re{inere pe Lrn suport (hArtie cromatografic5, dif-erite umpluturi ale coloanelor
cromatografice). in Llrma separdrii. fiecare glucid componenl va apdrea in cromatograrnd la un
anumit timp caracteristic. numil timp de reten{ie. pebzv,a cdruia va fr identifrcat.
 Iclenti/icaren fiecdrui tip de glucid se poate lace fie pebaza reacliilor de culoare cu un reactiv
de revelare. in cazul in care pentru transportul fazei tichide in sistemul cromatograflc se folosesc
pompe care aplic[ presiuni ridicatc asupra amesteculr:i dc solvcn{i metoda se nume$te
crctmatografie cle inaltd presiune;;i fblosegte echipamente speciale - cromatografe IlPl,C cuplate
cu divergi cletectori (DAD-diode atralt-ss 9ir de diode pentru deteclie in UV-VIS. FL-
fluorescen{a. MS-spectrometrLt de masa).
Cromatograma HPLC a standardului de aminoacizi
DAD1 A. Sig=338,10 Ref=390,20, rT
(PEFll\rvAF!AA000405 0)

!
::
'NAU
1s .iI
I
1

,0
]
i
5il
il
taa
I \t'
ol-
l

10 15
0

1,3.2. Metode moderne de separare a proteinelor in extractele vegetale

Se relerd la metotlele electrof'oretice care pot evidenlia prezen{a proteinelor in extractele
vegetale pe buza masei lor moleculare gi a sarcinii globale. datorit[ proprietdJii acestora de
amfiioni.
Princ ip i ul e Ie ctr o/b r ez.ei.

Este o rnetodd cle sepu"are a componen{ilor unui amestec (de ex. sllc de fructe) pe baza
masei lor moleculare gi a sarcinii gtobale utilizAnd diferite geh-rri de amidon sau poliacrilamidd,
migrarea realizAndr.r-se intr*un cdmp electric generat de o sursd de curent continuu. In urma
separdrii. fiecare proteind va apdrea in electrofbregramd alunci cAnd sarcitla sa a atins punctul
izielectric pI caracteristic (cAr"rd suma sarcinilor pozitive este egal6 cu suma sarcinilor negative),
pebaza c[ruia va fi identificat.

is
ws
il

Sistente de electl'oforeza
verticala, otizontala si
imagistica
t\

l.:

r.;,6:-1*lt
u..,
41n;, t ta+:
1:i
.;""
Nxxr-\\R((r,',r;,'l.,sqw;i,;=',i

Ident iJicarea proteinelor se f-ace pe baza reac{iilor de culoare cut lun rcactiv de revelare qi
comparativ cu un amestec de proteine cu mase moleculare curtoscute.