MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII ŞI TINERETULUI

UNIVERSITATEA “OVIDIUS” CONSTANŢA

FACULTATEA DE MOAŞE
CATEDRA DE FIZIOLOGIE NORMALĂ ŞI PATOLOGICĂ
DISCIPLINA MICROBIOLOGIE

LUCRARE DE LICENŢĂ

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
PROF.UNIV.DR. BRAGA VICTORIA

ÎNDRUMĂTOR:
ASIST.UNIV.DR. VOINEAGU LAVINIA

ABSOLVENT:
DANCIU MARIANA

CONSTANŢA
2011
 MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII ŞI TINERETULUI
UNIVERSITATEA “OVIDIUS” CONSTANŢA
FACULTATEA DE MEDICINĂ – COLEGIUL LABORATOR CLINIC
CATEDRA DE FIZIOLOGIE NORMALĂ ŞI PATOLOGICĂ
DISCIPLINA MICROBIOLOGIE

PARTICULARITATI ALE SENSIBILITATII

SI REZISTENTEI LA ANTIBIOTICE A
TULPINILOR DE STAFILOCOC IZOLATE
DIN SECRETIILE DE PLAGA

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
PROF.UNIV.DR. BRAGA VICTORIA

ÎNDRUMĂTOR:
ASIST.UNIV.DR. VOINEAGU LAVINIA

ABSOLVENT:
DANCIU MARIANA

CONSTANŢA
 2011

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL I
Genul Staphylococcus - prezentare generală............................................3
1.1. Particularităţi microscopice........................................................ 3
I.2. Caractere de cultură..................................................................... 6
I.3. Habitat şi implicaţii în patologia infecţioasă...............................12

CAPITOLUL II
Modalităţi de identificare ale germenilor genului Staphylococcus folosite în
laborator................................................................................................... 16

CAPITOLUL III
Modalităţi şi mecanisme de rezistenţă la antibiotice la germenii genului
Staphylococcus...........................................................................................24

PARTEA PERSONALĂ

CAPITOLUL I
Obiectiv.........................................................................................................30
CAPITOLUL II
Material şi metodă..........................................................................................31
CAPITOLUL III
Rezultate obţinute...........................................................................................39
Concluzii.........................................................................................................52
Bibliografie......................................................................................................53
 CAPITOLUL I

GENUL STAPHYLOCOCCUS - PREZENTARE GENERALĂ

I.1. Particularităţi microscopice

Genul Staphylococcus a fost separat din fosta familie Micrococacceae, grupare
prea heterogenă filogenetic pentru a-şi justifica existenţa. Argumentele au fost: conţinutul
total diferit al bazelor ADN (un conţinut G + c al ADN de 30-39 mol % la Staphylococcus
faţă de 63-73 mol % la Micrococcus), compoziţia peretelui celular, diferenţe imunologice ale
catalazelor, tipul menaquinonelor, spectrul diferit de sensibilitate la antibiotice. [2, 6, 10, 11].

Stafilococ – microscopie electronică

(Avril J.I. Bacteriologie Clinica)

Până în anul 1997 în genul Staphylococcus au fost individualizate 33 de specii, dintre

care 16 au putut fi izolate la om: S. aureus şi 15 specii de stafilococi coagulază negativ, aşa
cum se vede în tabelul de mai jos:
TABEL 1
GRUP SPECII
Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis sensu stricto
Staphylococcus auricularis
Staphylococcus capitis
 Staphylococcus caprae subsp. 1

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus

Staphylococcus hominis
Staphylococcus lugdunensis

Staphylococcus pasteuri

Staphylococcus saccharolyticus

Staphylococcus warneri
Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus

Staphylococcus xylosus
Staphylococcus cohnii

Staphylococcus simulans Staphylococcus simulans

Staphylococcus intermedius Staphylococcus scheleiferi

Din punct de vedere morfo-tinctorial, stafilococii sunt coci sferici cu diametru de circa
1 µm, Gram pozitivi, dispuşi în grămezi neregulate asemănătoare ciorchinilor de strugure,
aspect morfologic tipic pentru frotiuri efectuate din culturi pe mediu solid sau dispuşi în
perechi, tetraede sau lanţuri scurte de 3-4 celule, aspect tipic pe frotiurile efectuate din
prelevate sau culturi pe mediu lichid.
Aspect microscopic frotiu coloraţie Gram din cultură cu stafilococ
(Dilip K. Banerjee – Pocket Picture Guide)

Stafilococii sunt Gram pozitivi, dar în condiţii de stres metabolic (temperatură, pH,
presiune osmotică, factori antimicrobieni) pot deveni Gram variabili. Astfel: în aceeaşi
grămadă, alături de coci Gram pozitivi apar mai mult sau mai puţin coci Gram negativi; o
dată cu anomalia tinctorială, apar de regulă şi anomalii morfologice, cum ar fi forme uşor
alungite şi contururi imperfecte. [2, 6, 10,11].
 I.2. Caractere de cultură
Stafilococii se dezvoltă cu uşurinţă în 18-24 de ore pe medii nutritive simple în
aerobioză; vitamina B1 şi acidul nicotinic sunt factori indispensabili pentru creştere.
Staphylococcus auricularis creşte într-un timp mai îndelungat după 24-36 de ore în
aerobioză şi pe aceleaşi medii nutritive; Staphylococcus saccharolyticus şi Staphylococcus
aureus anaerobius se dezvoltă mai repede şi mai abundent în anaerobioză. Unele variante
rare de S. aureus se dezvoltă numai în prezenţa CO 2 sau a altor metaboliţi, cum ar fi hemina
sau menadiona. [2, 10, 26, 29, 35].
Formele cu deficienţe ale peretelui celular necesită mediu hiperton pentru a putea
supravieţui şi a se multiplica.
Temperatura optimă de creştere pentru stafilococi este de 37°C, iar pH-ul optim este
de 7,5 dar sunt tolerate şi variaţii mari.
Obişnuit, coloniile de 24 de ore pe mediu solid au aspect S, sunt cremoase, rotunde cu
diametru cuprins între 2-3 mm, margini perfecte, suprafaţă netedă bombată şi lucioasă, aşa
cum se vede în imaginile de mai jos:
Stafilococ auriu – cultură pe geloză-sânge
(Dilip K. Banerjee – Pocket Picture Guide)

Staphylococcus aureus: cultură pe agar-sânge după 24 ore de

incubare la 37°C (alfa-hemolizină pozitiv, beta-hemolizină pozitiv,
pigment pozitiv)
Staphylococcus aureus: manită pozitiv (stânga) şi Staphylococcus epidermidis manită
negativ (dreapta) pe mediu hiperclorurat solid cu manitol şi roşu fenol după 24 ore de
incubare la 37°C

Staphylococcus aureus: cultură pe agar-sânge după 24 ore de

incubare la 37°C (hemoliză negativ, pigment pozitiv)
 Staphylococcus epidermidis: cultură pe agar-sânge după 24 ore de
incubare la 37°C (colonii mai mici, hemoliză şi pigment negative)

Mediile lichide sunt tulburate omogen, cu depozit moderat la fundul tubului

însămânţat.
Tulpinile de stafilocod cu deficienţe ale peretelui celular, provenind din probe care
conţin substanţe antimicrobiene sau supuse unor tratamente termice pot da naştere pe
mediile solide unor colonii de G pitice sau G-R cu margini imperfecte granulate fără
hemoliza. Aceste tipuri de microorganisme nu tulbură mediul lichid în care sunt
însămânţate şi apar ca un depozit granular în partea inferioară a tubului de cultură. Rareori
întâlnim în culturi provenite direct din prelevate colonii de tip M mucoase caracteristice
tulpinilor capsulate. [2, 10, 26, 29, 35].
Pe agar cu 5-8% sânge defibrinat de berbec sau de bou S. aureus şi S. haemolyticus
produc o zonă circulară de hemoliza în jurul coloniei. Hemolizina alfa a S. aureus determină
hemoliza totală cu clarificarea completă a mediului. Beta-hemolizina tulpinilor animale de
S. aureus întâlnită ocazional şi la tulpini umane determină o hemoliza de tip cald - rece
însemnând zone de hemoliza incompletă la 37°C care, după expunerea culturii câteva ore
la 4°C devine completă, similară celei produsă de hemolizina alfa:
Prezenţa pigmentului carotenoid, portocaliu sau galben-citrin este o caracteristică
relativ constantă a tulpinilor de S. aureus dar şi a unor stafilococi coagulază-negativi cum ar
fi: S. hominis, S. haemolyticus, S. saprophyticus. Nu toate tulpinile de S. aureus sunt
producătoare de hemolizina şi/sau pigment.
Lipsa de specificitate a caracterelor hemolitice şi pigmentogene constituie un
argument pentru dezaprobarea unor formulări de tipul "stafilococ auriu hemolitic".
 Pigmentarea coloniilor pe medii nutritive simple sau cu adaos de sânge defibrinat
poate întârzia timp de 24-48 de ore în cazul tulpinilor de S. aureus supuse unui tratament
nefavorabil dezvoltării (antibiotic, antiseptic) şi este absentă în anaerobioză. Mediile cu
suplimente organice (ser, ou, digestie triptică de soia, peptone) favorizează
pigmentogeneză.

Staphylococcus aureus - mediu geloză-sânge (pigmentogeneză şi

beta-hemoliză)

Aspectul coloniilor de stafilococi coagulază-negativi diferă foarte mult în funcţie de

vârsta culturii, unele caracteristici cum ar fi pigmentul, hemoliza, fiind clar definite numai
după 72-120 de ore de creştere.
În tabelul următor este prezentat aspectul coloniilor pentru speciile cel mai frecvent
întâlnite în prelevate de provenienţă umane pe mediu nutritiv simplu cu adaos de sânge
defibrinat de berbec 5-8% şi pe mediu hiperclorurat agarizat tip Chapman după 3 zile de
incubare la 37°C.
Staphylococcus aureus – agar Chapman
 TABEL 2

Specia Aspectul pe agar- Diametrul Pigment Aspectul

sânge coloniei coloniilor pe
mediul solid
hiperclorurat
S. aureus Neted, cremos 5-10 mm Auriu/citrin/fără Colonii galbene,
Var. pitice, pigment manitol pozitive,
transparente îngălbenesc
Var. mucoase mediul

S. epidermidis Opac 2,5-6 mm Fără pigment/rar Colonii

gri- nepigmentate,
gălbui mediul rămâne
roz
S. hominis Neted, cremos 3-5 mm Fără pigment Colonii
nepigmentate,
mediul rămâne
roz
S. Neted, cremos, 5-9 mm Pot fi Variabil (64%
haemolyticus opac pigmentate manitol- pozitive)

S. warneri Neted, lucios, 3-5 mm Fără pigment Variabil (70%

centrul acuminat manitol-
pozitive)
S. lugdunensis Neted, lucios, uşor 4-7 mm Gălbui Colonii
convex portocaliu/fără nepigmentate,
pigment mediul rămâne
roz

S. Lucios, cremos, 5-9 mm Pot fi Colonii

saprophyticus foarte convexe pigmentate galbene,
manitol-
pozitive

S. simulans Neted, cremos 3-5 mm Pot fi Colonii

pigmentate galbene,
manitol-
pozitive
S. schleiferi Neted, lucios, uşor 3-5 mm Fără pigment Colonii
convex nepigmentate.
mediul rămâne
roz
 I.3. Habitat şi implicaţii în patologia infecţioasă
Germenii genului Staphylococcus au o afinitate particulară pentru tegument.
Tegumentul este un înveliş conjunctivo-epitelial care îmbracă suprafaţa externă a
corpului şi se continuă prin joncţiuni cutaneo- mucoase la nivelul orificiilor naturale ale
organismului. [6, 12, 19, 24, 34].
Microbiota indigenă cutanată este dominată de stafilococi coagulază-negativi care
colonizează ariile mai superficiale ale unităţilor pilosebacee, orificiul glandelor sudoripare,
crevasele stratului cornos, scuamele şi fanerele sub formă de gregate sau microcolonii care
grupează de la câţiva până la sute şi mii de coci.
Stafilococii coagulază-negativi metabolizează debriurile epidermei şi substanţele
excretate prin piele, creând un pH acid care împreună cu o varietate de polipeptide şi
substanţe cu acţiune antibiotică (stafilococcine, lizostafine, enzime bacteriolitice) limitează
creşterea altor bacterii rezidente sau flotante.
Observaţii in vivo demonstrează că stafilococii, alături de alte bacterii Gram
pozitive rezidente ale tegumentului, previn colonizarea axilei cu bacterii Gram negative.
S. aureus colonizează nările şi colonul de unde contaminează frecvent tegumentul.
Proporţia purtătorilor sănătoşi de S. aureus variază între 10-40% în colectivitatea generală şi
ajunge la 40-70% în mediul de spital. [6, 12, 19, 24, 34].
Exceptând S. epidermidis prezent în biotopurile tegumentare, celelalte specii au
tropisme pentru anumite biotopuri: scalp, faţă, conduct auditiv extern, aşa cum se vede în
schema de mai jos:
CARTAREA SPECIILOR DE STAFILOCOCI COAGULAZĂ – NEGATIVI PE
TEGUMENTUL UMAN
 Staphylococcus aureus constituie specia asociată cel mai frecvent cu infecţii ale pielii,
cele mai comune localizări ale infecţiilor stafilococice la om fiind: foliculite, furuncule,
carbuncule, celulita, impetigo, infecţii ale plăgilor.
Aceste infecţii superficiale se pot extinde prin continuitate pe cale limfatică,
bacteriemic sau septicemie cauzând endocardite, meningite, pneumonii, pioartrite,
osteomielite etc.
Multe dintre infecţiile cu S. aureus au caracterul unor izbucniri nosocomiale.
Infecţiile cu S. aureus meticilino-rezistent presupune rezistenţă multiplă la antibiotice,
incluzând toate antibiotice cu structură beta-lactam şi foarte adesea macrolidele,
aminoglicozidele şi cotrimoxazol.
Sunt de amintit, de asemenea, manifestările de tip toxiinfecţios în care este implicat
S. aureus: toxiinfecţiile alimentare, sindromul stafilococi al pielii opărite, sindromul de şoc
toxic stafilococic. [6, 12, 19, 24, 34].
Unii stafilococi coagulază-negativi şi-au dovedit capacitatea patogenă condiţionată
- patogeni oportunişti. Acest nou aspect al ecologiei stafilococilor s-a conturat în special în
ultimele trei decenii în relaţie directă cu utilizarea pe scară largă a procedurilor medicale
invazive: sonde, catetere din materiale plastice, precum şi inserţiile protetice de tip valve
cardiace, şunturi, proteze vasculare şi articulare.
Dintre stafilococii coagulază-negativi, S. epidermidis deţine cel mai înalt potenţial
patogen; este agentul cauzal major al infecţiilor nosocomiale în secţiile de nou-născuţi şi
oncologie, fiind prima cauză a bacteriemiilor în acest tip de unităţi. Poate cauza infecţii în
secţiile de chirurgie cardiovasculară, cum sunt mediastinitele, infecţii de pace - maker,
infecţii de grefă vasculară, endocardită asociată cu valve protetice etc. poate fi patogen
primar în infecţiile asociate cu şunturile lichidului cefalorahidian, protezele articulare,
dispozitivele ortopedice. Poate provoca infecţii articulare în absenţa factorilor predispozanţi
şi, mai rar, osteomielită. A fost semnalat ca agent primar al peritonitei asociată cu dializa
peritoneală ambulatorie continuă şi este frecvent izolat din infecţii ale tractusului urinar
cum sunt cistita, uretrita şi pielonefrita. [6, 12, 19,24, 34].
Staphylococcus haemolyticus a fost izolat în endocardită, chiar în absenţa valvelor
protetice, septicemie, peritonită, infecţii ale tractului urinar, plăgi chirurgicale.
Staphylococcus lugdunensis şi Staphylocccus scheleiferi par a fi patogeni oportunişti
semnificativi; pot coloniza cateterele, drenurile şi alte dispozitive introduse în organism,
putând cauza endocardite pe valve protetice sau native, septicemii, abcese cerebrale,
infecţii profunde, osteite, osteoartrite cronice, infecţii ale protezelor vasculare, infecţii
cutanate şi ale plăgilor, infecţii ale lichidului peritoneal, precum şi infecţii de cateter.
Staphylococcus saprophyticus constituie un agent etiologic frecvent implicat în
infecţiile tractusului urinar la femeile tinere în perioada fertilă, putând cauza unele uretrite
negonococice şi prostatite, precum şi infecţii de plagă şi septicemii.
Alte specii de stafilococi ca S. hominis, S. simulans, S. cohnii, S. sacharolyticus, S.
capitis, S. warneri apar mai rar în patologia infecţioasă umană iar izolarea lor din prelevate
trebuie să fie susţinută printr-o serie de criterii clinice şi de laborator particulare.
 CAPITOLUL II

MODALITĂŢI DE IDENTIFICARE ALE GERMENILOR

GENULUI STAPHYLOCOCCUS FOLOSITE ÎN LABORATOR

Necesităţi minimale de identificare a speciilor de stafilococi coagulază-negativi

a) Identificarea preliminară
Identificarea preliminară în cadrul laboratorului de analize medicale urmăreşte
evidenţierea speciilor mai frecvent implicate în patologia infecţioasă.
Identificarea speciei de stafilococ coagulază-negativ la nivelul laboratoarelor clinice
poate fi necesară în cazul unor infecţii cronice cu tulpini rezistente la antibiotice.
Diagnosticul de rutină trebuie să vizeze diferenţierea:
 Staphylococcus saprophyticus în urină;
 Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi de pe
suprafaţa şunturilor, cateterelor şi din hemoculturi;
 Staphylococcus epidemidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis izolate din infecţii ale
ţesuturilor moi.

Semnificaţia clinică a unui stafilococ coagulază-negativ este susţinută de izolarea

acestui microorganism în proporţie predominantă sau în cultură pură şi de izolările repetate
ale aceloraşi tulpini de sânge, urină sau alte prelevate. Infecţii urinare, meningitele şi
peritonitele sunt însoţite de celularitatea semnificativă pentru o infecţie bacteriană.
În infecţiile nosocomiale sistemice apărute în secţii cu risc (ATI, nou-născuţi,
oncologie, chirurgie cardiovasculară), interpretarea implicării unor stafilococi coagulază-
negativi în sindromul infecţios poate fi orientată de corelaţia dintre numărul de bacterii
izolate de pe cateter şi prezenţa aceloraşi bacterii de pe hemoculturi.
Capacitatea de a produce slime a unor tulpini de stafilococi coagulază-negativi
constituie un argument pentru susţinerea rolului lor etiologic într-o septicemie.
Corelarea bacteriuriei cantitative cu piuria stabileşte semnificaţia clinică a
stafilococilor izolaţi în uroculturi.
 Scheme de identificare minimală
Aspectul microscopic, ca şi o serie de caractere fenotipice cum sunt aspectul
coloniilor pe medii neselective, alături de un set restrâns de teste enzimatice permit
identificarea preliminară a speciilor mai frecvent izolate.
În anul 1975, Schleifer şi Kloos au propus o schemă taxonomică a stafilococilor şi au
avansat un sistem simplificat de identificare pentru uzul curent al laboratoarelor; acest
sistem utilizează 13 teste şi permite identificarea a 10 specii. Cele 13 teste include:
coagulaza, hemolizinele, reducerea nitraţilor şi acidifierea a 10 zaharuri; aceste teste cheie
sunt interpretate în corelaţie cu creşterea anaerobă, sensibilitatea la lizostafin şi sensibilitatea
la novobiocină.
Schema recomandată de Subcomitetul pentru Taxonomia Stafilococilor şi
Micrococilor în 1976 este destinată identificării numai a 3 specii considerate a fi deosebit de
importante în patologia umană: S. aureus, S. epidermidis şi S. saprophyticus aşa cum se vede
în tabelul de mai jos:

Schemă minimală de diferenţiere a principalelor specii de stafilococi recomandată de

Subcomitetul pentru Taxonomia Stafilococilor şi Micrococilor
Caractere S. S. S.
AUREUS EPIDERMIDIS SAPROPHYTICUS
Coagulaza liberă + - -

Fosfataza + + -

Novobiocină, - - +
rezistenta la
Acidifierea + + +
zaharozei (aerob)
Acidifierea + - +
trehalozei (aerob)
Acidifierea + d
manitolului(aerob)

Pornind de la criteriile taxonomice avansate de Schleifer şi Kloos, în cadrul Centrului

Naţional de Referinţă pentru Stafilococ a fost elaborată o schemă de diferenţiere a speciilor
de stafilococi aşa cum se vede în tabelul de mai jos:

Schemă pentru identificarea minimală a speciilor de stafilococ frecvent izolate din

 procese infectioase la om (centrul Naţional de Referinţă pentru Stafilococ)
Scopul testului Test Rezultat Semnificaţie

Familie Catalază + Micrococacceae

- Streptococacceae

Gen Furazolidon ≥15 Staphylococcus

(100 µg/disc)
≤10 Micrococcus

Glucoză anaerob + Staphylococcus

- Micrococcus

Specie Coagulază legată + S. aureus, S.

şi /sau proteină A lugdunensis, S.
scheleiferi

- Celelalte specii

Diferenţierea speciilor cu coagulază legată sau proteina A pozitive

Testul S. aureus S. lugdunensis S. scheleiferi

Coagulază liberă + - -

Acidifierea manitolului + - -
anaerob
Termonuclează + - +

Diferenţierea speciilor cu coagulază legată şi/sau proteina A negative

Testul S. aureus S. epidermidis S. haemolyticus
s.s
Novobiocină (5 ^g/disc) - -

Acidifierea manitolului + - -
anaerob

Termonuclează + - +

Etapele cheie ale identificării, conform acestei scheme sunt:

 Diferenţierea familiei Micrococacceae de familia Streptococacceae prin testul
 catalazei pozitiv cum se vede în imaginea de mai jos;

 Diferenţierea genului Staphylococcus de genul Micrococcus prin testul de

fermentare a glucozei şi/sau testul sensibilităţii la furazolidon;
 Diferenţierea S. aureus de celelalte specii de stafilococi pe baza: caracterelor de
cultură, testele coagulazei libere şi legate, termonucleazei, fermentarea manitei în
anaerobioză aşa cum sunt prezentate în imaginile de mai jos:

Testul coagulazei în tub (pozitiv tub 1; negativ tub 2)

(Dilip K. Banerjee – Pocket Picture Guide)

Testul pe lamă pentru proteina A - coagulază legată şi polizaharid capsular (jos pozitiv -
S. aureus; sus negativ - S. epidermidis)
 Testul termonucleazei: pozitiv - godeurile de la ora 4 şi 6; negativ
restul godeurilor

 Diferenţierea celorlalte specii de stafilococi implicate mai frecvent în infecţii la

om prin: testele sensibilităţii la novobiocină, fosfatază, fermentarea trehalozei şi
manitolului în aerobioză, precum şi caractere de cultură.
b) Identificare definitivă
Datorită complexităţii actualei scheme taxonomice, identificarea definitivă nu poate
fi realizată în unele cazuri decât prin metode moleculare şi analiza unor proprietăţi
moleculare fenotipice cum ar fi: acizii graşi, enzimele multilocus, polipeptidele totale,
proteinele eczocelulare sau unele proprietăţi genetice dintre care amintim fragmentele de
restricţie ale materialului genetic utilizând hibridarea lanţurilor nucleotidice. [15, 25, 32].
În tabelul de mai jos sunt prezentate caracterele diferenţiale ale speciilor şi
subspeciilor cu importanţă medicală din genul Staphylococcus - schemă actualizată în
1998.
 Caractere diferenţiale ale speciilor şi subspeciilor cu importanţă medicală din genul
Staphylococcus

Identificarea rapidă a speciei S. aureus poate fi făcută cu ajutorul reactivilor comerciali

de aglutinare rapidă (reactivi care conţin fibrinogen şi imunoglobuline G, cuplează coagulaza
legată, respectiv proteina A din perete ceea ce are ca expresie macroscopică aglutinarea
amestecului dintre reactiv şi cultura de S. aureus.), aşa cum se vede în imaginea de mai jos:
 Reacţie latex-aglutinare: sus negativ (lipsa coaglutinării);
jos pozitiv (prezenţa coaglutinării)

Mai multe firme produc truse de identificare şi/sau instrumente automatizate care
identifică speciile de stafilococi cu acurateţe între 70 şi 90%. Dintre acestea amintim sistemul
de identificare API pe truse API STAF IDENT, sistem de identificare de care beneficiază şi
Laboratorul Spitalului Clinic Judeţean Constanţa.

Test latex-aglutinare (negativ 1; pozitiv 3

(Dilip K. Banerjee – Pocket Picture Guide)

Galerii de identificare test API
(Avril J.I. Bacteriologie Clinica)
CAPITOLUL III
 MODALITĂŢI Şl MECANISME DE REZISTENŢĂ LA
ANTIBIOTICE LA GERMENII GENULUI
STAPHYLOCOCCUS

Marea majoritate a autorilor au demonstrat că introducerea în uz a unui nou antibiotic

a dus în scurt timp la apariţia tulpinilor rezistente atât la pacienţi cât şi la purtătorii sănătoşi
din rândul personalului sanitar încă din primele luni de utilizare. De asemenea, sistarea
administrării antibioticului respectiv a dus la diminuarea rapidă a proporţiei tulpinilor
rezistente. [1, 5, 7, 9].
Explicaţia logică a acestui fenomen este existenţa diferenţelor de sensibilitate la
antibiotice la bacteriile aceleiaşi specii circulante în spitale în perioade diferite de timp.
Acest fenomen a fost raportat în urma studiilor extinse în timp atât de medici englezi
cât şi de medici francezi; astfel, curbele evoluţiei frecvenţei tulpinilor rezistente au pentru
toate antibioticele un aspect bifazic cu o porţiune iniţială ascendentă urmată la câţiva ani de
o stabilizare în platou, la nivelul căruia curba nu mai descrie decât oscilaţii moderate.
Alura curbei îmbracă forme diferite pentru fiecare antibiotic, precum şi după
mediul de provenienţă al tulpinilor - spital sau ambulator.
Posibilitatea de urmărire a rezistenţei la antibiotice a influenţat pozitiv menţinerea
unui nivel acceptabil de sensibilitate la o serie de antibiotice prin utilizarea alternativă şi
eliminarea din schema terapeutică a antibioticelor cu nivel înalt de rezistenţă, precum şi prin
menţinerea în rezervă a unor grupe de antibiotice. [1, 5, 7, 9].

Testarea sensibilităţii stafilococilor; principalele fenotipuri de rezistenţă

Testarea stafilococilor faţă de penicilinele rezistente la penicilinază. Între
stafilococi au fost identificate trei fenotipuri de rezistenţă la penicilinele rezistente faţă
de penicilinază, fiecare cu semnificaţii deosebite pentru testarea sensibilităţii şi
antibioterapia infecţiilor stafilococice: fenotipul clasic, fenotipul inactivator prin beta-
lactamază şi fenotipul MOD-SA. [8, 22, 23, 27, 30].
Fenotipul clasic produce o proteină de legare a penicilinelor (PBP) suplimentară,
PBP2a, codificată de gena cromozomală mec. Această rezistenţă poate fi omogenă,
prezentă la întreaga populaţie testată sau eterogenă şi manifestată numai la 10-4 până la 10-8
din organismele populaţiei testate.
Fenotipul inactivator produce beta-lactamază în exces.
Fenotipul MOD-SA îşi asigură rezistenţa prin PBP modificate (PBP-urile1, 2 şi 4).
Tulpinile cu rezistenţă clasică au CMI ale oxacilinei > 8 µg/ml şi numai rar între 2 şi 8
µg/ml (rezistenţă intermediară). Uzual, rezistenţa clasică se extinde la întregul grup al
antibioticelor beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme, inhibitori de beta-
lactamaze), la eritromicină, clindamicină, cloramfenicol, tetraciclină, asociaţia
trimetoprim-sulfametoxazol, chinolone, aminoglicozide, deşi testul difuzimetric poate
indica o falsă sensibilitate la aceste antibiotice. [3, 4, 20, 21, 28, 31].
Fenotipurile inactivator prin exces de beta-lactamază şi MOD-SA au rezistenţă
intermediară la oxacilină, obişnuit nu exprimă rezistenţă multiplă şi sunt identificate încă
rar, doar la S. aureus. Această rezistenţă intermediară, conform observaţiilor experimentale
şi clinice, pare a avea impact nesemnificativ asupra terapiei cu oxacilină. [13, 17, 18].
Aşadar, interesul depistării corecte a fenotipurilor de rezistenţă încrucişată ale
stafilococilor faţă de penicilinele rezistente la penicilinază este evidente, dar rezultatele sunt
profund influenţate de condiţiile testării.
a) La 37°C stafilococii cu fenotipul clasic de rezistenţă cresc mai lent decât
stafilococii sensibili, dar diferenţa devine nesemnificativă în culturile incubate la temperaturi
mai joase (e.g., 35° sau 30°C).
b) Testele uzuale depistează corect tulpinile de stafilococ cu expresie omogenă a
rezistenţei clasice, dar total nesatisfăcătoare pe cele heterorezistente.
c) Pot exista diferenţe între capacitatea loturilor de mediu Mueller- Hinton de a depista
heterorezistenţa stafilococilor.
d) Antibioticul de testare pentru depistarea rezistenţei încrucişate a stafilococilor faţă
de penicilinele rezistente la penicilinază trebuie corect ales:
 oxacilină este preferată pentru stabilitatea ei şi reproductibilitatea rezultatelor;
 nafcilina poate fi utilizată, dar nu pe medii care conţin sânge;
 meticilina este mai puţin stabilă, dar depistează mai bine decât oxacilina rezistenţa S.
epidermidis;
 izoxazolilpenicilinele sunt contraindicate pentru testare.

e) Mediile agarizate adiţionale cu 4% NaCl ameliorează detectarea heterorezistenţei

stafilococilor la oxacilină/meticilină. [3, 4, 20, 21, 28, 31].
 1. Testarea difuzimetrică a heterorezistenţei stafilococilor la oxacilină/meticilină
Indicaţii: Testări ocazionale în laboratoare mici.
Necesar. Discuri cu 1µg oxacilina, 1 µg nafcilina sau 5 µg meticilina; mediu
Mueller-Hinton cu 4% NaCl.
Procedează ca pentru testarea difuzimetrică dar incubează plăcile 24 ore la 35°C.
Citirea şi interpretarea:
Heterorezistenţa stafilococilor la oxacilină/meticilină se manifestă, comparativ cu
testarea uzuală, prin:
 reducerea diametrului zonei de inhibiţie;
 film de creştere sau colonii cu dimensiuni progresiv reduse în zona de inhibiţie. [7,
9, 19, 20, 21].
2. Testarea heterorezistenţei stafilococilor prin metoda plăcii de triaj
Indicaţii: Metodă de referinţă; permite testarea mai multor tulpini pe o singură placă.
Necesar: plăci cu agar Mueller-Hinton adiţionat cu 4% NaCl şi 6µg oxacilină/ml sau
10µg meticilină/ml.

Procedura:
Se pregăteşte şi se etalonează inoculul ca pentru testarea difuzimetrică.
Se imersează un tampon de vată în inoculul etalonat, se scurge excesul de fluid prin
rularea tamponului pe peretele tubului.
Se însămânţează placa cu tamponul în spot sau în striuri pe o arie limitată. Alternativ
se pot însămânţa spoturi de 0,01 ml din suspensia etalonată şi diluată 1:10.
Se incubează placa 24 ore la 35°C.
Citirea şi interpretarea: Chiar o singură colonie de stafilococ per spot indică tulpină cu
fenotipul clasic de rezistenţă (tulpină med pozitivă). Tulpinile cu rezistenţă
intermediară, indiferent de fenotip, nu cresc pe placa de triaj.
Controlul de calitate al testărilor pentru heterorezistenţă: Foloseşte tulpina de S.
aureus ATCC 29213, sensibilă şi ATCC 38951 heterorezistenţă la oxacilină.
3. Identificarea şi semnificaţia clinică a altor fenotip uri de rezistenţă ale
stafilococilor ia oxacilină/meticilină.
Dacă tulpina testată nu creşte pe placa de triaj, dar alte metode de testare o indică
sensibilă la oxacilină/meticilină, trebuie considerată cu rezistenţă la limită şi aparţine altui
fenotip de rezistenţă. Testează tulpina faţă de oxacilină asociată cu un inhibitor de beta-
lactamază: dacă apare sensibilă aparţine fenotipului inactivator prin exces de beta-lactamază,
dacă rămâne rezistentă aparţine fenotipului MOD-SA. În infecţii grave care ameninţă viaţa
bolnavului, această diferenţiere trebuie făcută şi comunicată.

Testarea stafilococilor faţă de aminoglicozide

Este suficientă testarea faţă de kanamicină, tobramicină şi gentamicină. Rezistenţa
faţă de aminoglicozide este enzimatică şi se extinde la amikacină şi netilmicină, cărora le
alterează mai mult activitatea bactericidă decât cea bacteriostatică, de unde decurge şi
pierderea sinergismului cu beta-lactaminele. Activitatea bacteriostatică restantă se poate
traduce prin falsa sensibilitate la amikacină şi netilmicină. Rezistenţa la kanamicină
(fenotipul K), la kanamicină şi tobramicină (fenotipul KT) sunt predictive pentru
rezistenţă şi la amikacină; netilmicină rămâne activă. Rezistenţa la kanamicină,
tobramicină şi gentamicină (fenotipul KTG) este predictivă pentru rezistenţă la amikacină
şi netilmicină. [7, 9, 19, 20, 21].

Rezistenţa inductibilă la eritromicină

Testează asociaţia eritromicină cu lincomicină (antibiotic inductor). Apariţia unei
configuraţii de antagonism la discul cu eritromicina indică rezistenţă inductibilă la
macrolidele cu 14 atomi (eritromicina, oleandomicină, claritromicină) şi azitromicină, în
timp ce macrolidele cu 16 atomi (spiramidna, josamicina) şi clindamicina rămân active.
Simpla testare a stafilococilor numai la eritromicina riscă prin urmare un eşec terapeutic cu
acest antibiotic.
Folosirea extensivă a cefalosporinelor din ultimele generaţii precum şi modificările
bioecologice determinate de progresele remarcabile înregistrate de tehnologia medicală în
domeniul chirurgiei, anesteziei şi terapiei intensive etc, au condus la selectarea unor
populaţii microbiene preponderent Gram pozitive şi multiplu rezistente la antibiotice în
serviciile de specialitate ale multor spitale din Europa, Australia, America, Japonia, etc.
În ultimele două decade preocupările privind comportamentul stafilococilor faţă de
agenţii antimicrobieni s-au concentrat asupra fenomenului de rezistenţă la penicilinele
penicilinazo-rezistente.
Rezistenţa la meticilină (oxacilină, nafcilină) implică nu numai lipsa răspunsului
clinic la toate antibioticele beta-lactam, dar, de asemenea, capacitatea potenţială de
câştigare a rezistenţei la majoritatea antibioticelor non beta-lactam, ceea ce reduce
drastic arsenalul terapeutic antiinfecţios în cazul unor infecţii cu astfel de germeni.
 Până de curând, glicoproteinele au fost singurele substanţe antibacteriene faţă de
care se consideră că stafilococii meticilino - rezistenţi sunt în totalitate sensibili. [3, 4, 20,
21, 28, 31].
În 1996 însă, H. Hiramatsu raportează în Japonia primele tulpini de S. aureus cu
sensibilitate intermediară la vancomicină, semnalare urmată de altele similare referitoare la
izolate din Michigan, New Jersey şi Florida.
Tulpinile respective au fost izolate de la pacienţi cu imunitate deficitară, trataţi timp
de mai multe săptămâni cu vancomicină pentru infecţii sistemice.
Experimente de laborator au dovedit capacitatea acestor tulpini GISA de a deveni
rezistente la vancomicină în timp relativ scurt, atunci când au fost cultivate în medii cu
concentraţii înalte de antibiotic (50µg/ml).
Perspectiva neliniştitoare a popularii serviciilor medicale cu tulpini total rezistente la
substanţe antibacteriene a catalizat preocupările comunităţii medicale internaţionale în
direcţia căutării unor soluţii practice. Acestea vizează aspecte cum sunt: uzul raţional
al antibioticelor, metodologia de depistare a GISS şi GISA, elucidarea mecanismelor de
rezistenţă la glicopeptide a stafilococilor, asociaţii de antibiotice şi noi substanţe
antibacteriene, metode terapeutice alterne (vaccinuri profilactice, fracţionate şi/sau
recombinante) etc.
După datele publicate de Centrul Naţional de Referinţă pentru Stafilococ în anul
1998, aproximativ 19% din stafilococii circulanţi în 16 spitale mari din principalele zone
geodemografice ale României erau meticilino-rezistenţi, în servicii de risc procentul
ridicându-se la 40-80%.
Vancomicina este disponibilă în România şi frecvent utilizată în infecţii grave cu
stafilococi meticilino-rezistenţi.
PARTEA PERSONALĂ
 CAPITOLUL IV

OBIECTIV

În prezent, infecţiile cu care se confruntă medicina modernă pornesc din surse

diversificate şi sunt determinate de agenţi microbieni care şi-au modificat mecanismele de
acţiune, căpătând rezistenţă la mijloacele chimice terapeutice folosite.
Streptococii şi pneumococii care în trecut reprezentau principalii agenţi ai infecţiilor
mortale sunt astăzi bine controlaţi prin antibioterapie, în timp ce stafilococii continuă să
reprezinte cauză majoră a infecţiilor intraspitaliceşti alături de bacilii Gram negativi.
Infecţiile nosocomiale apar ca urmare a transmiterii bacteriilor la un bolnav neinfectat
de la o sursă existentă în mediul spitalicesc; astfel, microbii pot proveni de la bolnavul însuşi
(autoinfecţie), precum şi de la focare active sau latente cunoscute sau necunoscute.
Infecţiile intraspitaliceşti au o cauză iatrogenă provenind în cursul sau în urma unor
acte terapeutice efectuate. Cele mai frecvente exemple de infecţii provin în urma unor
tratamente de durată: cateterism venos, traheostomie, intubaţie prelungită, sondaj vezical
urinar, manevre ce pot duce la infecţii îndelungate, ce compromit starea bolnavului,
îngreunează tratamentul şi creşte costul spitalizării.
Studiul realizat îşi propune:
 urmărirea fenotipurilor de rezistenţă la antibiotice a tulpinilor de stafilococ izolate din
plăgi, infecţiile de cateter, posibilitatea de diseminare septicemică cu punct de plecare
plaga şi infecţia de cateter;
 urmărirea modului în care aceste fenotipuri de rezistenţă au suferit modificări în timp.
 CAPITOLUL V
MATERIAL Şl METODĂ

a) Recoltarea produselor patologice

Principalele produse patologice examinate au fost secreţia de plagă şi în unele
situaţii sânge pentru hemoculturi, catetere.
Recoltarea secreţiei de plagă a fost efectuată folosind ecuvioane sterile care au fost
aduse imediat în laborator pentru a se evita uscarea secreţiilor pe tampoane.
Sângele a fost recoltat pentru hemoculturi de la pacienţi la care în paralel cu infecţia de
plagă a evoluat şi septicemia.

b) Metode de identificare a agenţilor etiologici izolaţi în plăgile infectate

 examen microscopic;
 însămânţarea pe medii de cultură şi identificarea.

Examenul microscopic s-a efectuat pe frotiu colorat simplu şi Gram; etapele şi

timpii parcurşi pentru obţinerea frotiului colorat Gram sunt prezentate în schema următoare:
 Însămânţarea pe medii de cultură şi identificarea

HEMOCULTURA

1. RECOLTARE
2. FROTIU COLORAT
■ albastru de metilen
■ Gram
3. ÎNSĂMÂNŢARE ÎN FLACOANE PENTRU SISTEM BACT/ALERT
Probă pozitivă:
■ Examen microscopic pe frotiu colorat Gram
■ Însâmânţare pe:
a) Gelozâ-sânge (pentru coci Gram pozitivi) → Catalază →pozitivă →Stafilococ →
→ ID 32 Staph. ↓
negativă
(Streptococ, Enterococ) →
→ ABE→pozitivă (Enterococ)
↓
negativă - Streptococ → β hemoliză (+)
↓
β hemoliză (-)→ ID 32 Strep.
b) Geloză chocolat → API-NH (Neisseria sau Haemophylus) → Frotiu → Antibiogramă
a) AABTL (pentru bacili Gram-) → Identificare ID 32 E → Antibiogramă
b) Sabouraud → 30°C 5 - 7 zile → ID 32 C → Antibiogramă
c) Mediu VF cu acid tioglicolic (10ml/tub) → 37°C 5 zile → Geloză Columbia cu
pirogalol.
Hemoculturi neconfirmate → Culturi pe bulion cu thioglicolat 48 h → Geloză Columbia →
→Se dă rezultat fals pozitiv după 48 h.
 Alături de metodele clasice de însămânţare şi identificare, pentru o parte din produse
am folosit metoda modernă de cultivare BacT/Alert (pentru hemoculturi) şi identificare în
sistem automat API.
*Sistemul BacT/Alert este un sistem automat capabil să incubeze şi să monitorizeze
probe aerobe şi anaerobe; flacoanele cu medii de cultură sunt incubate la 37°C având
posibilitatea de a indica multiplicarea bacteriilor prezente în produs prin refractometrii de
fază solidă prezenţi la baza flacoanelor. Probele pozitive sunt apoi însămânţate pe medii
de cultură aerobe şi anaerobe urmând ca în final germenii dezvoltaţi să fie identificaţi în
sistem automat API.

*Sistemul automat API este un sistem modern de identificare a speciilor de coci şi

bacili aerobi şi anaerobi.
Identificarea se bazează pe însămânţarea unei suspensii din germenii de identificat
pe stripuri cu medii miniaturizate şi deshidratate; în funcţie de virajele de culoare produse pe
aceste medii, aparatul face o citire automată în urma căreia identifică genul şi specia
bacteriană.
Identificarea se poate face rapid după 4 ore (API rapid) şi clasic după 24 de ore.
În schema următoare sunt prezentate etapele de identificare şi exemplificare a unui
strip pe care s-a identificat Staphylococcus aureus comparativ cu un strip negativ.
 Exemplificarea unui strip pe care s-a identificat S. aureus

Infecţia de cateter (inflamaţie, bacteriemie) este un risc al cateterizărilor

intravenoase prelungite (perfuzii, dializă extrarenala etc).
Inserţia transcutanată şi intravenoasă a cateterelor este colonizată cu microorganisme
din microbiota epidermei fără invadarea curentului sanguin.
Riscul inflamaţiei şi bacteriemiei apare când numărul organismelor de colonizare
depăşeşte 103UFC/inserţie intravenoasă.
Pentru controlul acestui risc şi diagnosticul rapid al bacteriemiei consecutive am
folosit 2 tipuri de metode:

♦ Metoda cantitativă;
♦ Metoda semicantitativă de examinare a cateterelor.
 Metoda cantitativă
Inserţia intravenoasă a cateterului a fost retezată cu foarfece steril; în extremitatea
proximală a inserţiei intravenoase a cateterului a fost fixat un ac steril şi apoi într-un volum
cunoscut de bulion a fost realizată agitarea produsului.
*s-au efectuat diluţii decimale în acelaşi mediu de cultură;
*0,1 ml din fiecare diluţie a fost însămânţat pe o placă cu geloză sânge;
*plăcile au fost incubate 24 de ore la 37°C;
*numărul de colonii dezvoltate x inversul diluţiei determină numărul de unităţi
formatoare de colonii pe inserţie.

Interpretare
-prezenţa a peste 103UFC/inserţie atenţionează asupra iminenţei inflamaţiei şi
bacteriemiei;
-prezenţa a peste 104UFC/inserţie dă certitudinea existenţei inflamaţiei şi/sau
bacteriemiei.

c) Antibiograma
Testarea sensibilităţii la antibiotice am realizat-o în parte prin metoda clasică -
antibiograma difuzimetrică prin metoda Kirby-Bauer şi pe sistem automat API.
 Metoda difuzimetrică pe aparat API
Principiu: testul se bazează pe rata de dezvoltare a microorganismelor în
prezenţa antibioticelor.
Stripul este realizat dintr-un plastic transparent, rigid şi conţine 16 - 32 godeuri cu
antibiotic deshidratat cu o concentraţie cunoscută.
Stripurile sunt însămânţate cu suspensie bacteriană preparată într-un mediu special.
Stripurile pot fi citite după 24 de ore automat sau vizual.
Cititorul recunoaşte codul stripului, realizează măsurătorile şi le transferă
computerului care stabileşte profilul corespunzător: rezistent, sensibil, intermediar.
Măsurarea turbidităţii poate fi citită pe aparatul API în 2 moduri:
 Turbinefelometrică - se face turbidimetric (măsoară intensitatea luminii transmise
care este invers proporţională cu conţinutul de cultură bacteriană şi nefelometric –
măsoară intensitatea luminii împrăştiate la 30°C care este direct proporţională cu
cantitatea de cultură bacteriană;
  Colorimetric - măsoară transmisia luminii pentru fiecare godeu în 4 regiuni ale
spectrului vizibil.
În figura următoare este prezentată imaginea unui strip ATB STREPTO.

Metoda clasică Kirby-Bauer se bazează pe fenomenul de difuziune al antibioticului în

mediu de cultură însămânţat cu o suspensie bacteriană din tulpina de testat.
În funcţie de diametrul ariei de inhibiţie a dezvoltării germenilor în jurul
comprimatului de antibiotic se face aprecierea rezistent, sensibil, intermediar.
 CAPITOLUL VI

REZULTATE OBŢINUTE

VI.1. Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de stafilococ izolate.

Fenotipuri de rezistenţă.
 Din catetere
În cadrul acestei lucrări au fost luate în studiu 112 catetere provenite de la pacienţi
internaţi în diferite secţii ale Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Constanţa, din care 28 au
fost pozitive.
Tabel 4
Total probe Probe pozitive Probe negative
112 28 84
% 25% 75%
 Agenţi etiologici bacterieni izolaţi pe cateterele examinate
Aşa cum se vede în tabelul următor, stafilococul coagulază negativ se detaşează net
prin procentul de 42.8% de toţi ceilalţi agenţi etiologici implicaţi în infecţia de cateter.
Tabel 5
Microorganisme Număr tulpini %
Stafilococ coagulază negativ 12 42.8
Staphylococcus aureus 6 2.1
Enterobacter 2 0.7
Klebsiella pneumoniae 2 0.7
Klebsiella oxytoca 1 0.3
Alte specii 5 1.7

Rezultate comparative ale examenului microscopic si al culturii semicantitative

pentru microorganismele prezente pe cateterele examinate.
În tabelul următor este prezentat scorul microscopic pentru cele 28 de catetere care s-
au dovedit a fi infectate.
 Tabel 6
Microorganisme Număr de Scor microscopic
tulpini
Stafilococ coagulază negativ 12 0 1 2 3
Staphylococcus aureus 6 8 2 1 1
Enterobacter 2 2 2 1 1
Klebsiella pneumoniae 2 1 1 - -
Klebsiella oxytoca 1 - - - -
Alte specii 5 1 1 - -

Repartiţia pe secţii a cazurilor de infecţii de cateter examinate este prezentată în

tabelul şi graficul de mai jos:

Secţia Număr cazuri cateter %

Medicală I şi II 8 28.5
Chirurgie 4 14.3
STI 8 28.5
Pediatrie 3 10.8
Oncologie 5 17.9
Total 28 100%
 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Staphylococcus aureus izolate din catetere
este sistematizată în tabelul de mai jos:
Tabel 8
Determinarea sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de S. aureus
izolate din catetere

Antibiotice Sensibil Intermediar Rezistent

% % %
Penicilină 3.63 5.45 90.90
Oxacilină 30.9 29.09 40
Kanamicină 21.81 20 58.18
Eritromicină 21.81 16.36 61.81
Clindamicină 65.45 14.54 20
Lincomicină 32 24 42
Amoxicilină 16.36 32.72 50.9
Amoxicilină + Ac. clavulanic 27.27 56.36 16.36
Vancomicină 72 20 8
Cefoxitim 18 64 18
Ceftizoxime 30 30 40
Rifampicină 74.54 - 25.45
Streptomicină 38.18 21.81 40
Ampicilină 7.27 65.45 27.27
Biseptol 29.09 7.27 63.63
Gentamicină 20 52.72 27.27
Tetraciclină 7.27 36.36 56.36
Cloramfenicol 16.36 20 63.63
Netilmicină 70 10 20
Timentin 67 13 20
Ciprofloxacin 60 20 20

Principalele fenotipuri de rezistenţă a acestor tulpini de S. aureus este sistematizată în

tabelul următor.
 Tabel 9
Proporţia relativă a principalelor fenotipuri de rezistenţă la S. aureus
izolate din catetere

Fenotipul Tulpini rezistente

%
P, Te, Ox, E, S, K, CN 69.14
P, Te, Ox, E, S, K, CN, CIP 7.44
P, Te, S, K, GN 3.19
P, Te, S, K 3.19
P, Te, Ox, E, S, K, CN 2.12
P, Te, Ox, E, S, K, CN 2.12
P, E, S, K, CN 2.12
P, S, K, CN 2.12
Alte 8 fenotipuri (câte o tulpină) 8.48 (1.06%)

 din plăgi chirurgicale

Ponderea infecţiilor de plagă în secţiile chirurgicale ale spitalului este prezentată în
tabelul de mai jos:
Tabel 10

Secţia %
Chirurgie 18
Urologie 9
STI 15
Obstetrică – ginecologie 3
Ortopedie 13
Chirurgie plastică şi reparatorie 4
 Ponderea speciilor bacteriene izolate din plăgi este prezentată în tabelul şi graficul
următor:
Tabel 11
Microorganisme %
Staphylococcus aureus 42
Stafilococ coagulază negativ 19
Escherichia coli 32
Klebsiella 3
Proteus 2
Piocianic 2
 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Staphylococcus aureus izolate din plăgi este
prezentată în tabelul următor:

Tabel 12
Determinarea sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de S. aureus
izolate din plăgi

Antibiotice Sensibil Intermediar Rezistent

% % %
Penicilină 6 4 90
Oxacilină 30.9 29.09 40
Kanamicină 30 20 50
Eritromicină 21.81 16.36 61.81
Clindamicină 65.45 14.54 20
Lincomicină 32 24 42
Amoxicilină 16.36 32.72 50.9
Amoxicilină + Ac. clavulanic 40 30 30
Vancomicină 80 10 10
Cefoxitim 18 64 18
Ceftizoxime 30 30 40
Rifampicină 85 5 10
Streptomicină 38.18 21.81 40
Ampicilină 7.27 65.45 27.27
Biseptol 29.09 7.27 63.63
Gentamicină 50 20 30
Tetraciclină 7.27 36.36 56.36
Cloramfenicol 16.36 20 63.63
Netilmicină 70 10 20
Timentin 67 13 20
Ciprofloxacin 60 20 20

Tabel 13
 Proporţia relativă a principalelor fenotipuri de rezistenţă la S. aureus
izolate din plăgi
Fenotipul Tulpini rezistente
%
P, Te 12.61
P 10.67
P, Te, S, K, CN 9.70
P, S, K, CN 6.79
P, Te, S, K 5.82
P, Te, Ox, S, K, CN 4.85
P, Te, E, S, K, CN 4.85
P, Te, E, S, K, 3.88
P, S, K 2.91
P, Te, Ox, E, S, K, CN 2.91
P, Te, Ox, S, K, CN 2.91
P, Te, Ox, E, S, K 1.96
P, Te, Ox, E, S, K 1.96
S, K, CN 1.96
P, Te, Ox, E 1.96
P, S, K, CIP 1.96
Alte 21 fenotipuri (câte 2 tulpini) 20.38 (0.97%)

În graficul de mai jos prezentăm fenotipurile de rezistenţă la beta-lactamine.

În graficul de mai jos prezentăm fenotipurile de rezistenţă la aminoglicozide.

 VI.2. Comportamentul S. aureus faţă de antibiotice noi intrate în uz
Azitromicina
Azitromicina este un macrolid din subclasa Azalide cu spectru bacterian asemănător cu
al eritromicinei, dar extins şi asupra speciilor Gram negative.
Azitromicina se elimină lent din organism, astfel încât după administrarea unei singure
doze, prezenţa anitibioticului este detectată în urină după 14 zile. Acest antibiotic realizează
un timp de înjumătăţire de 2 – 4 zile şi concentraţii tisulare care persistă mai multe zile astfel
încât este posibilă adminstrarea la interval de 24 de ore.
În studiul nostru am testat sensibilitatea la Azitromicină după aceeaşi modalitate –
Kirby – Bauer – respectând normele NCCLS 1998.
Testarea sensibilităţii tulpinilor de stafilococi coagulază pozitivi şi coagulază negativi
se prezintă pentru Azitromicină, Eritromicină şi Claritromicină aşa cum se vede în tabelul şi
graficul următor:

Tabel 14
Tulpini Antibiotic Sensibil Rezistent
Stafilococi coagulază Azitromicină 92 8
pozitivi Eritromicină 76 24
Claritromicină 83 17
Stafilococi coagulază Azitromicină 98 2
negativi Eritromicină 82 18
Claritromicină 90 10

Sensibilitatea tulpinilor de stafilococ coagulază pozitivi

Sensibilitatea tulpinilor de stafilococ coagulază negativi

Cefalosporine de generaţia a – IV-a – Cefepima (Maxipime)

 Cefepima este o cefalosporină de generaţia a – IV-a cu spectru ultralarg care are un
timp de înjumătăţire de 2 ore, astfel încât după 8 ore păstrează concentraţii serice active pe o
gamă largă de germeni (coci Gram pozitivi şi Gram negativi, bacili Gram negativi aerobi şi
anaerobi); se elimină 85% prin urină.
Are o puternică acţiune bactericidă, acţionând în faza de multiplicare logaritmică a
bacteriilor, inhibând sinteza peretelui celular. Studiul sensibilităţii tulpinilor de
Staphylococcus aureus la cefepime a fost făcut tot prin metoda Kirby – Bauer respectând
normele NCCLS.
În tabelul următor prezentăm sensibilitatea la cefepime comparativ cu alte
cefalosporine de generaţia III (cefoperazonă şi ceftazidim).

Tabel 15
Tulpini sensibile (%) Tulpini rezitente (%)
Cefepimă 96.4 3.6
Cefoperazonă 90.9 9.1
Ceftazidim 90.4 9.6

III.3. Modificări ale sensibilităţii tulpinilor de S.aureus pe perioada luată în

studiu
 Studiul nostru relevă faptul că tulpinile de S. aureus izolate din cateter şi infecţii de
plagă manifestă sensibilitate de diferite grade la o gamă variată de antibiotice.
Dobândirea rezistenţei la unele antibiotice (meticilino – rezistenţă 69% pe fenotip
penicilină – meticilină), respectiv scăderea nivelului de sensibilitate la unele antibiotice se
face prin mecanism enzimatic şi prin modificarea sediului ţintă de acţiune a natibioticelor.
Studiul nostru relevă faptul că fenomenul de apariţie a rezistenţei la unele antibiotice.
Precum şi scăderea nivelului de sensibilitate la alte antibiotice se datorează folosirii pe
perioade lungi de timp a acestor antibiotice.
Folosirea abuzivă şi îndelungată a acestor antibiotice se reflectă în modificarea
nivelului de sensibilitate a tulpinilor de S. aureus pe perioada luată în studiu, modificări în
sensul scăderii sensibilităţii la antibiotice pentru: lincomicină, amoxicilină, cefalosporine şi
rifamicină, modificări prezentate şi în tabelele de mai jos.

Tabel 16
Determinarea sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de S. aureus
izolate din catetere

Antibiotice Sensibil Intermediar Rezistent

% % %
Penicilină 3.63 5.45 90.90
Oxacilină 30.9 29.09 40
Kanamicină 21.81 20 58.18
Eritromicină 21.81 16.36 61.81
Clindamicină 65.45 14.54 20
Lincomicină 30 20 50
Amoxicilină 14 30 56
Amoxicilină + Ac. clavulanic 27.27 56.36 16.36
Vancomicină 72 20 8
Cefoxitim 15 50 35
Ceftizoxime 25 25 50
Rifampicină 70 10 20
Streptomicină 38.18 21.81 40
Ampicilină 7.27 65.45 27.27
Biseptol 29.09 7.27 63.63
Gentamicină 20 52.72 27.27
Tetraciclină 7.27 36.36 56.36
Cloramfenicol 16.36 20 63.63
Netilmicină 70 10 20
Timentin 67 13 20
Ciprofloxacin 60 20 20

Tabel 17
Determinarea sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de S. aureus
izolate din plăgi

Antibiotice Sensibil Intermediar Rezistent

% % %
Penicilină 6 4 90
Oxacilină 30.9 29.09 40
Kanamicină 30 20 50
Eritromicină 21.81 16.36 61.81
Clindamicină 65.45 14.54 20
Lincomicină 30 20 50
Amoxicilină 15 30 55
Amoxicilină + Ac. clavulanic 40 30 30
Vancomicină 80 10 10
Cefoxitim 15 60 25
Ceftizoxime 25 25 50
Rifampicină 80 5 15
Streptomicină 38.18 21.81 40
Ampicilină 7.27 65.45 27.27
Biseptol 29.09 7.27 63.63
Gentamicină 50 20 30
Tetraciclină 7.27 36.36 56.36
Cloramfenicol 16.36 20 63.63
Netilmicină 70 10 20
Timentin 67 13 20
Ciprofloxacin 60 20 20

CONCLUZII
 1. Din studiul nostru rezultă că există diferenţe privind nivelele de sensibilitate la
antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate, diferenţe legate de secţia în care au fost izolate
aceste tulpini; există nivele de rezistenţă mai mare la antibiotice a tulpinilor izolate de pe
catetere de la pacienţii internaţi în secţii cu risc crescut (arşi, STI).
2. Pe perioada luată în studiu s-au constatat modificări ale sensibilităţii în sensul
scăderii acesteia pentru unele antibiotice, fenomen explicat de exercitarea unei presiuni
selective a antibioticelor folosite asupra tulpinilor de staflococ izolate.
3. Aceste considerente obligă o apreciere globală continuă a evoluţiei sensibilităţii la
antibiotice astfel încât să fie posibilă prevenirea transformării tulpinilor rezistente în populaţii
rezistente şi apariţia supergermenilor de spital, lucru realizabil printr-o colaborare strânsă între
medicul epidemiolog, clinician şi microbiolog.
4. Cunoaşterea fenotipurilor de rezistenţă ne informează asupra mecanismelor de
instalare a rezistenţei, modalităţi de răspândire a acestora creând premisele de apreciere a
evoluţiei posibilei rezistenţe în viitor.

BIBLIOGRAFIE
1. Bismuth R. - Cocci a Gram positif et aminosides, L'antibiogramme, MPC Vigot,
1995.
2. Bismuth R., Caillon J. - Staphylocoques, Bactericidie. Aspects thepretiques et
therapeutiques, Maloine, 1990.
3. Bismuth R., Zilhao R. şi coiab. - Gene heterogenicity for tetracyclin resistance in
Staphylococcus spp. Antimicrob. Agents Chemoter, 1990.
4. Bismuth R., Jarlier V., şi colab. - Etat actuel des phenotypes de resistance aux
antibiotiques de S. aureus, Les infections a staphylocoques meticilino-resistants, Arnette,
1984.
5. Bismuth R., Vermee F., şi colab. - Activite bacteriostatique et bactericide des
streptogramines sur des souches de S. aureus en fonction des principaux phenotypes de
resistance aux MLS, Macrolides et synergistines, Arnette, 1990.
6. Bîlbîie V., Pozsgi N. - Bacteriologie medicală, voi. II, Editura Medicală, Bucureşti,
1985.
7. Buu-Hoi A. - Cocci a Gram positif et macrolides-lincosamides- streptogramines,
L'antibiogramme. MPC Vigot, 1995.
8. Bryan L.E. - General mechanisms of resistance to antibiotics, JAC, suppl. A, 1994.
9. Budnik L.D., Schlaefler S. - Ciprofloxacin - resistant Methicilin resistant Staphylococcus
aureus in New York Health care facilities, Am. J. Publ. Health, 1990
10. Buiuc D. - Microbiologie clinică, vol. I, Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti 1998.
11. Codiţă I. - Genul Staphylococcus, Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol., 1993
12. Debeleac L, Popescu Dranda M.C. - Microbiologie – Editura Medicală Amaltea,
Bucureşti, 1994.
13. E Test Technical guide, 3rd edn. Solna, Sweden: AB Biodisk, 1993.
14. Gayral J.P., Albertini M.T. et. al. - Sensibilite â 27 antibiotiques de 858 souches de
Staphylococcus, Path. Biol., 1996.
15. Garrod P.L., Lambert P.H. şi colab. - Laboratory control, Antibiotic and
Chemotherapie, Fifth Ed. 1981, Churchill Livingstone.
16. Gerbaud G., Goldstein F. - Trimetophrime et Sulfamides. L'antibiogramme, MPC
Vigot, 1995.
17. Gutmann L, Goldstain F. - Staphylocoques et beta-lactamines, L'antibiogramme, MPC
Vigot, 1998.
18. Jarlov JO, Rosdahl VT - Quantitative determination of (β- lactamase production in
Staphylococcus aureus strains production in Staphylococcus aureus strains compared to
qualitative testing by a microbiologica! clover leaf test, a chromogenic cephalosporin test
and a iodometric test. Acta path Microbiol Immunol Scand Sect B 1996; 94:415-21.
19. Haley R.W., Cushion N.B. şi colab. - Eradication of endemic Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus infections from a neonatal intensive care unit, J.I.D., 1995.
20. Ingram G.I.C. - Formation of clear zones with "sensitive" and "resistant" Staphylococcus
aureus in penicillin plate assays, J Gen Microbiol, 1995.
21. Komatzukava H., Suzuki J., şi colab. - Effect of combination oxacillin and non beta-
lactam antibiotics on methicillin resistant Staphylococcus aureus, J. Antimicrob. Chemother,
1994
22. Leclerq R., Duval J., şi colab. - Mecanisme et evolution des resistance aux macrolides,
lincosamides et streptogramines, Macrolides et synergistines, Arnette, 1998.
23. Leclerq R., Courvalin P. - Bacterial resistance to macrolide, lincosamide and
streptogramin, antibiotics by target modification, Antimicrob. Agents Chemother., 1991.
24. Le Minor L., Vernon M. - Bacteriologie Medicale. 2eme edition, 1990, Flammarion
Medicine-Sciences, Paris.
25. MacFaddin J.F. - Biochemical tests for the identification of medical bacteria, second
edition, 1980 Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD.
26. Mandell G.L., Douglas R.G., şi colab. - Staphylococcus aureus. Principles and Practice of
Infectious Disease, Third Ed., 1990, John Wiley & sons, NY.
27. Mateos M., Knapp CC. et. Al. - Characterization of resistance Phenotype and
Cephalospohn activity in Oxaciilin resistant Staphylococcus aureus, Antimicrob. Ag.
Chemother, 1989.
28. Menkes R.E., Corner B.M. et. al. - Adaptation of methicilin resistant Staphylococcus
aureus during antibiotic therapy, J. Antimicrob. Chem., 1989.
29. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C. - Manual of Clinical Microbiology
Seventh Edition, 1999, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
30. Nicolau D.P., Freeman CD. et. al. - Minocycline versus Vancomycin for treatment of
experimental endocarditis caused by Oxacillin resistant Staphylococcus aureus, Antimicrob.
Ag. Chemother, 1994.
31.Østravik I, Ødegaard K. - A simple test for penicillinase production in Staphylococcus
aureus, Acta Path Microbioi Scand Sect B 1995; 79: 855-6.
32. Pierre J., Gutmann L. - Bases biochimiques et genetiques de la resistance aux beta-
lactamines chez Ies staphylocoque, Lettre Infect, 1998.
33. *** - Manual of Clinical Microbiology, fifth edition, Washington, 1991.
34. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Hoit J. G. - Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology Ninth Edition, Voi. 2, 1986, Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD.
35. The Staphylococci - Zentralblatt fur Bakteriologie, Mikrobiologie and Hygiene,
Supplement 14, Proceeding of the Vth International Symposionum on Staphylococci
and Staphylococcal Infections - Warszawa, June 1994