ASPECTE CLINICE

IDENTIFICAREA TULPINILOR STAFILOCOCICE DIN

HEMOCULTURI CU PRECIZAREA FENOTIPURILOR DE
REZISTENŢĂ LA Β-LACTAMI UTILIZÂND SISTEMUL
AUTOMAT VITEK® 2 COMPACT

M. COLCIERU 1, E. JAKAB2, O. POPESCU3

1
Spitalul General C.F. din Sibiu, 2,3Universitatea “Babeş-Bolyai”din Cluj-Napoca

Cuvinte cheie: Rezumat: Hemocultura constituie una din cele mai importante investigaţii în laboratorul de bacteriologie
hemocultură, medicală. Identificarea rapidă a patogenilor cu precizarea speciei şi determinarea profilului de
stafilococ, fenotip sensibilitate la antibiotice este importantă, bolnavii putând fi trataţi eficient cu agentul antimicrobian
corespunzător. Prognosticul pacienţilor poate fi îmbunătăţit, câştigarea rezistenţei de către patogen poate
fi redusă, iar costul îngrijirii va fi mai redus. Infecţiile sistemice cu stafilococi reprezintă o cauză majoră a
mortalităţii atât datorită tulpinilor dobândite în comunitate cât şi celor intraspitaliceşti.(1) În ultimii
douăzeci de ani creşterea numărului de proceduri invazive, folosirea antibioticelor cu spectru larg, a
permis emergenţa stafilococilor coagulazo-negativi şi în special Staphylococcus epidermidis.(2) La ora
actuală există sisteme automate ce permit detecţia rapidă a creşterii bacteriene în hemoculturi. Sistemul
BACTEC® (Becton Dickinson Instruments Systems, Sparks, SUA) permite detecţia directă a producerii CO2
prin prelevare seriată de eşantioane de gaz din flaconul de cultură.(3) Studiul de faţă îşi propune să
prezinte identificarea tulpinilor stafilococice din hemoculturi şi totodată precizarea fenotipurilor de
rezistenţă la β-lactami utilizând sistemul automat VITEK® 2 COMPACT (bioMerieux Inc., Hazelwood,
SUA) pe o perioadă de aproximativ 2 ani, date obţinute în laboratorul de bacteriologie al Spitalului Clinic
Judeţean de Urgenţă Sibiu.

Keywords: blood Abstract: Blood cultures are one of the most important investigation methods in medical bacteriology.
cultures, Rapid identification of pathogens and determination of the relevant antibiotic sensitivity profiles are an
Staphylococcus, important step for effective treatment with appropriate antimicrobial agent. Using blood cultures the
phenotype prognosis of patients can be improved, reducing the acquisition of the antibiotic resistance determinants by
bacteria and lowering the total cost of healthcare. Systemic staphylococcal infections caused by
community-acquired and the hospital-acquired strains are one of the major causes of mortality worldwide
(1). In the last twenty years the increased number of invasive procedures, the widespread use of broad-
spectrum antimicrobial agents leads to the emergence of coagulase-negative staphylococci, Staphylococcus
epidermidis in particular (2). In our days automated bacteriological systems allows rapid detection of
microbial growth in blood cultures. The BACTEC® system (Becton Dickinson Instruments Systems, Sparks,
USA) detects directly the CO2 production taking serial samples from the produced gas in the culture bottle
(3). The aims of this study are the identification of staphylococcal isolates from blood cultures and the
detection of its β-lactam resistance phenotypes with VITEK® 2 COMPACT automated system (bioMerieux,
Inc., Hazelwood, USA.) using samples collected during a nearly two-year period in the bacteriology
laboratory of the Emergency County Hospital, Sibiu, Romania.

INTRODUCERE MATERIAL ŞI METODĂ

Hemocultura constituie una din cele mai importante
investigaţii în laboratorul de bacteriologie medicală.
Identificarea rapidă a patogenilor cu precizarea speciei şi
determinarea profilului de sensibilitate la antibiotice este
importantă, bolnavii putând fi trataţi eficient cu agentul
antimicrobian corespunzător. Prognosticul pacienţilor poate fi
îmbunătăţit, câştigarea rezistenţei de către patogen poate fi
redusă, iar costul îngrijirii va fi mai redus.
SCOPUL STUDIULUI
Studiul de faţă îşi propune să prezinte identificarea
tulpinilor stafilococice din hemoculturi şi totodată precizarea
fenotipurilor de rezistenţă la β-lactami utilizând sistemul
automat VITEK® 2 COMPACT (bioMerieux Inc., Hazelwood,
SUA).
1
Autor Corespondent: M. Colcieru, Spitalul General C.F. Sibiu, str. C-tin Noica nr. 20, Sibiu, România, e-mail: mcolcieru@yahoo.com @yahoo.com,
tel +40-0723 809490
Articol intrat în redacţie în 23.04.2010 şi acceptat spre publicare în 27.04.2010
ACTA MEDICA TRANSILVANICA Iunie2010; 2(2)87-89
Probele biologice
Probele biologice utilizate sunt reprezentate de sânge
prelevat de la pacienţi în condiţii de sterilitate şi însămânţate în
flacoane speciale cu mediu nutritiv pentru hemoculturi.
Tulpinile bacteriene
Izolatele reprezintă un panel de tulpini colectate în
laboratorul de bacteriologie al Spitalului Clinic Judeţean de
Urgenţă Sibiu, provenind de la pacienţii internaţi în diferitele
secţii ale spitalului. Perioada studiului se întinde din noiembrie
2007 până în august 2009. Culturile pozitive detectate cu
ajutorul echipamentului BACTEC® 9050 au fost procesate în
sistemul automat VITEK® 2 COMPACT. Rezultatele obţinute
legate de tulpinile genului Staphylococcus au fost prelucrate în
continuare.

AMT, vol II, nr. 2, 2010, pag. 87

 ASPECTE CLINICE
Dispozitive medicale folosite
Echipamentul BACTEC® 9050 este conceput pentru
detectarea rapidă a bacteriilor şi fungilor în culturi clinice de
sânge. Când microorganismele sunt prezente, ele metabolizează
nutrienţii din mediul de cultură, eliberând CO2. Un marker din
senzor reacţionează cu CO2, acesta modulează cantitatea de
lumină care este absorbită de un material fluorescent din senzor.
Detectorii fotosensibili ai aparatului măsoară nivelul
fluorescenţei, care corespunde cantităţii de CO2 eliberat de către
organism. Citirea este realizată de către detectorii fotosensibili ai
aparatului. Se realizează un ciclu de test la fiecare zece minute.
Culturile pozitive sunt imediat semnalizate printr-un indicator
luminos, o alarmă şi sunt afişate pe ecran.
Sistemul automat VITEK® 2 COMPACT permite
identificarea germenilor şi testarea sensibilităţii la antibiotice în
câteva ore folosind metoda colorimetrică de citire a cardurilor
pentru identificarea speciei bacteriene şi turbidimetric pentru
testarea sensibilităţii la antibiotice. Pentru testarea sensibilităţii
la antibiotice sistemul evaluează modelul de creştere al fiecărui
microorganism în prezenţa agentului microbian, comparativ cu
godeul martor de creştere. Sunt utilizaţi mai mulţi parametri
bazaţi pe caracteristicile de creştere observate în vederea
asigurării datelor adecvate pentru calcularea CMI (concentraţie
minimă inhibitorie). Rezultatul CMI trebuie să fie asociat cu
identificarea unui microorganism pentru a fi stabilită
interpretarea categoriei. (4)
În fazele iniţiale ale studiului au fost folosite cardurile
de testare a rezistenţei la antibiotice AST-P535 care permiteau
determinarea CMI pentru oxacilină şi interpretarea categoriei
pentru oxacilină, domeniul valorilor fiind cuprins între 0,50
µg/ml şi 8,00 µg/ml. Împreună cu testul CMI, screening-ul
pentru oxacilină previzionează un rezultat fie sensibil, fie
rezistent, rezultatele testului corelându-se cu cele obţinute prin
metoda de screening pe agar. Ulterior au fost folosite cardurile
AST-P554 care conţin testul de screening pentru cefoxitină
utilizat pentru a previziona rezistenţa la oxacilină mediată mecA;
metoda se bazează pe testul de screening cu disc de cefoxitină.
Screening-ul pentru cefoxitină şi testul pentru oxacilină sunt
utilizate în paralel pentru a stabili interpretarea finală raportată
pentru oxacilină. În tabelul nr.1 sunt prezentate CMI ale
oxacilinei pentru interpretarea cardurilor VITEK® 2 COMPACT
în cazul stafilococilor. (5)
Tabelul nr. 1. CMI pentru interpretarea cardurilor VITEK®
2 COMPACT în cazul stafilococilor.
CMI oxacilină
Microorganism Interpretare
(µg/ml)
≤2 S de legare a penicilinei (PBP 2a) este codificată de gena
S. aureus
≥4 R cromozomală mecA care face parte dintr-un fragment
Stafilococ coagulazo- ≤ 0,25 S suplimentar de ADN integrat în ADN-ul bacteriei. (6)
negativ ≥ 0,5 R Au fost descrise alte trei mecanisme de rezistenţă la
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Pe durata studiului au fost izolate un număr de 62 de
tulpini aparţinând genului Staphylococcus. Dintre acestea un
număr de 24 de tulpini (38,70%) au fost izolate de la pacienţi de
sex masculin, iar restul, respectiv 38 de tulpini (61,29%) provin
de la femei.
Media de vârstă calculată a fost de 55,77 ani. Putem
afirma astfel că persoanele cu vârstă relativ înaintată sunt mai
susceptibile la infecţiile stafilococice. Unul din motive poate fi
considerat scăderea treptată a imunităţii odată cu înaintarea în
vârstă.
Diagnosticele iniţiale întâlnite la pacienţii identificaţi
cu infecţii stafilococice sunt următoarele: sindrom febril în 22 de
cazuri, 11 pneumopatii, 10 peritonite, 4 cazuri de endocardite şi
AMT, vol II, nr. 2, 2010, pag. 88
3 infecţii ale tractului urinar. Restul de 12 tulpini izolate provin
de la pacienţi ce sufereau de diverse alte afecţiuni printre care
tromboflebite, diverse abcese, tumori, ulcere varicoase, psoriazis
etc. (Figura 1).
Figura nr. 1. Ponderea tulpinilor stafilococice izolate în
funcţie de afecţiunile întâlnite
Cele 62 de tulpini izolate au fost identificate cu
ajutorul sistemului automat VITEK® 2 COMPACT (Tabelul nr.
2).
Tabelul nr. 2. Speciile stafilococice identificate şi ponderea
acestora raportată la numărul total de tulpini izolate
Nr. Specia Nr. Ponderea
crt. tulpini %
1 S. epidermidis 24 38,71
2 S. aureus 17 27,42
3 S. haemolyticus 8 12,90
4 S. hominis 7 11,29
5 S. warneri 2 3,23
6 S. saprophyticus 1 1,61
7 S. capitis 1 1,61
8 S. auricularis 1 1,61
9 S. cohnii 1 1,61
Pornind de la valorile CMI prezentate în tabelul nr. 1
au fost identificate în lotul studiat un număr de 7 tulpini MRSA
(S. aureus rezistent la meticilină) şi 36 de tulpini de stafilococi
coagulazo-negativi rezistenţi la oxacilină. Astfel ponderea
tulpinilor rezistente la oxacilină raportată la numărul total de
tulpini identificate a fost de 69,35%.
Fenotipurile de rezistenţă ale stafilococilor la β-
lactami sunt datorate unor mecanisme multiple. Cel mai
important mecanism este reprezentat de modificarea ţintei.
Rezistenţa este datorată prezenţei unei proteine suplimentare de
legare a penicilinei, PBP 2a sau PBP 2', care are o afinitate
foarte slabă pentru ansamblul β-lactamilor. Proteina modificată
oxacilină nelegate de gena mecA. Unele tulpini sunt
hiperproducătoare de β-lactamază şi anume tulpinile BORSA (S.
aureus borderline), care nu au rezistenţă intrinsecă (nu produc
PBP 2a). În absenţa genei mecA câteva tulpini produc probabil o
meticilinază capabilă să hidrolizeze meticilina, a cărei genă nu a
fost descrisă.
Modificarea altor proteine de legare a penicilinei
diferite de PBP 2a, duce la apariţia tulpinilor MODSA (S.
aureus modificat). Aceste tulpini prezintă rezistenţă scăzută la
oxacilină şi nu produc β-lactamază. (7)
În tabelul nr. 3 sunt prezentate fenotipurile de
rezistenţă dobândită ale stafilococilor la β-lactami.
Advanced Expert System (AES) reprezintă un sistem
destinat gestionării şi validării rezultatelor generate de analizor.
Acesta permite cunoaşterea tiparelor de rezistenţă la antibiotice
 ASPECTE CLINICE

cu indicarea fenotipurilor specifice. tulpinile MRSA. (7)

Fenotipul predominant este cel de modificare a PBP,
Tabelul nr. 3. Fenotipuri de rezistenţă dobândită ale urmat de achiziţia de penicilinază şi doar un număr redus de
stafilococilor la β-lactami tulpini prezintă fenotipul sălbatic.
Mulţumiri

carboxipeniciline,
ureidopeniciline
Dorim să mulţumim d-nei Dr. Elefterescu Mărioara

Cefalosporine,
inhibitor de β-

carbapeneme
Penicilină G,

Penicilină M
penicilină A,

Antibiotic +
Mecanism

pentru tot sprijinul acordat în realizarea acestui material.

lactamază
BIBLIOGRAFIE
1. Diekema DJ, Pfaller MA, Schimtz FJ, Smayevsky J, Bell J,
Jones RN, Beach M. Survey of infections due to
Staphylococcus species: frequency of occurrence and
Sălbatic S S S S antimicrobial susceptibility of isolates collected in the
Penicilinază R S S S United States, Canada, Latin America, Europe and Western
Modificarea PBP, Pacific region for the Sentry Antimicrobial Surveillance
R R R R program, 1997–1999. Clin. Infect. Dis. 2001; 32:S114–
gena mecA
BORSA (rar) R S/R R S S132.
MODSA (rar) S S R S 2. Kloos WE, Bannerman TL. Update on clinical significance
Legenda: R - rezistent, S - sensibil. of coagulase-negative staphylococci. Clin. Microbiol. Rev.
În tabelul nr. 4 sunt prezentate fenotipurile de 1994; 7:117–140.
rezistenţă la β-lactami pentru cele 62 de tulpini identificate. 3. Diederen BM, Zieltjens M, Wetten H, Buiting AG.
Fenotipul de tip sălbatic este definit ca fenotip al speciilor Identification and susceptibility testing of Staphylococcus
respective anterior oricărei mutaţii la nivelul genelor aureus by direct inoculation from positive BACTEC blood
cromozomale sau achiziţiei de ADN, care ar putea să afecteze culture bottles. Clin Microbiol Infect. 2006; 12:84-86.
sensibilitatea la antibiotice. În acest fel, se poate observa că 4. Ligozzi M, Bernini C, Bonora MG, De Fatima M, Zuliani
dintre cele 24 de tulpini de S. epidermidis, 21 prezintă J, Fontana R. Evaluation of the VITEK 2 system for
modificări ale PBP şi două dintre ele au dobândit penicilinază. identification and antimicrobial susceptibility testing of
Doar una dintre tulpini prezintă fenotipul sălbatic. Cele 17 medically relevant gram-positive cocci. J. Clin. Microbiol.
tulpini de S. aureus sunt distribuite astfel: 7 prezintă modificări 2002; 40:1681–1686.
ale PBP, 9 dintre ele au dobândit penicilinază şi una dintre 5. Informaţii referitoare la produsul VITEK® 2 Sistems.
tulpini prezintă fenotipul sălbatic. Au fost identificate 7 tulpini bioMérieux. 2009.
cu PBP modificate în cazul speciei S. haemolyticus şi doar un 6. Buiuc D, Neguţ M. Tratat de microbiologie clinică. Editura
fenotip sălbatic. În cazul speciei S. hominis au fost identificate 6 Medicală. Bucureşti. 2008. pp. 472-474.
tulpini cu PBP modificate şi doar un fenotip sălbatic. 7. Jehl F, Chomarat M, Weber M, Gerard A. De
l'antibiogramme à la prescription. Édition bioMérieux.
Tabelul nr. 4. Fenotipurile de rezistenţă la β-lactami pentru 2003. pp. 80-81.
cele 62 de tulpini identificate.
Specii (nr. Fenotip de rezistenţă la β–lactami (nr.
tulpini) tulpini)
S. epidermidis Modificarea PBP (21), Penicilinază
(24) dobândită (2), Sălbatic (1)
S. aureus (17) Modificarea PBP (7), Penicilinază
dobândită (9), Sălbatic (1)
S. haemolyticus Modificarea PBP (7), Sălbatic (1)
(8)
S. hominis (7) Modificarea PBP (6), Penicilinază
dobândită (1)
S. warneri (2) Penicilinază dobândită (2)
S. saprophyticus Penicilinază dobândită (1)
(1)
S. capitis (1) Penicilinază dobândită (1)
S. auricularis (1) Modificarea PBP (1)
S. cohnii (1) Modificarea PBP (1)

CONCLUZII
Persoanele de vârstă relativ înaintată sunt mai expuse
infecţiilor stafilococice, unul din motive fiind scăderea treptată a
imunităţii odată cu înaintarea în vârstă. Aceste tipuri de infecţii
sunt asociate frecvent cu sindromul febril.
Specia cel mai frecvent izolată a fost S. epidermidis,
urmată de S. aureus.
Ponderea tulpinilor rezistente la oxacilină a fost de
69,35% în timp ce tulpinile sensibile au fost reprezentate de
30,65% dintre izolate. Neaşteptat a fost raportul între tulpinile
de stafilococi coagulazo-negativi rezistenţi la oxacilină (36) şi
AMT, vol II, nr. 2, 2010, pag. 89