INTRODUCERE

Enzimologia este o parte importantă a biochimiei, deoarece studiază

structura chimică a enzimelor, cinetica enzimatică, localizarea în sistemele
vii și utilizarea în practică a acestora Enzimele pot fi folosite fie libere în
soluții, fie imobilizate pe diferite substraturi sub formă de biosenzori.
Imobilizarea enzimelor se poate face prin metode diferite: adsorbția fizică
sau chimică pe un suport inert; încorporarea în ochiurile de rețea ale unui
gel sau polimer; micro-încapsularea; reticularea sau legarea covalenta. În
alegerea tehnicii de fixare a enzimelor trebuie să se țină cont de mai mulți
factori: activitatea enzimatică remanentă; posibilitățile tehnice de realizare;
necesitățile de utilizare.

Enzimele sunt substanțe complexe (molecule proteice) ce participă la foarte

multe reacții ce au loc în organismul nostru. Acestea sunt catalizatori
specifici ce impreună cu coenzimele reglează procesele biochimice din
organism. Fără ele fructele nu s-ar coace, semințele nu ar germina, nu am
putea gândi, nu am putea digera alimentele și absorbi substanțele nutritive
prezente în acestea. Enzimele sunt implicate în mii de procese biochimice ce
se desfașoară în organismul nostru. În corpul nostru se găsesc aproximativ
2.700 enzime diferite care împreună cu coenzimele formează aproximativ
100.000 de compuși ce ne ajută să vedem, să simțim, să auzim, să digerăm
hrana și să gândim. Enzimele ajută în lupta împotriva îmbătrânirii,
obezității, colesterolului, ajută sistemul imunitar, curăță colonul, descompun
grăsimile, cresc inteligența, detoxifiază organismul, elimină bioxidul de

3
carbon din plămâni. Enzimele nu pot distruge o celulă vie, dar pot
descompune o celulă moartă. Acest lucru se întâmplă datorită faptului că o
enzimă nu poate traversa membrana celulară a unei celule vii, dar atunci
când celula moare poate face acest lucru și astfel compușii prezenți în celula
moartă pot fi reutilizați.

Enzimele au fost denumite prima dată cu termenul de “fermenți”, in 1897,

când Buchner, prin distrugerea pereților celulelor de drojdie obține un
mojarat care catalizează fermentația alcoolică și a demonstrat pentru prima
oară că enzimele pot funcționa independent de celule. În prezent se cunosc
aproximativ 3.200 de enzime diferite care s-au obținut în stare pură, sau sub
formă de preparate cu diferite grade de puritate aproximativ 1.000-1.500.

CUM ACȚIONEAZĂ ENZIMELE

Când consumăm alimente, enzimele prezente în acestea sunt activate de

căldura și umezeala din cavitatea bucală și împreună cu enzimele produse de
organism digeră o parte din alimente înainte ca acestea să ajungă în stomac.

4
Alte enzime digeră hrana pe tot traseul ei pentru ca apoi enzimele
metabolice să folosească nutrienții respectivi pentru a regenera țesuturile
existente și pentru a produce țesuturi noi.2

Fiecare celulă din organism depinde de un anumit grup de enzime. Fiecare

enzimă are o anumită funcție. De exemplu o enzimă care digeră proteine nu
digeră și grăsimi.

Enzimele sunt prezente în toate organismele vii și se găsesc în toate tipurile

de celule animale, în fluidele corporale (sânge, limfă, lichid cefalorahidian,
lichid intestinal), în unele secreții specifice pentru diferite organe (stomac,
pancreas, rinichi), la plante și în toate virusurile și microorganismele care
populează diferite zone ale Pământului. La plantele și la animalele
superioare, enzimele se găsesc în toate celulele vii ale acestora, însă
distribuția lor variază după natura țesutului din care fac parte celulele.

Există mai multe tipuri de enzime cum ar fi: enzime de fermentație, enzime
amilolitice, enzime celulozolitice, enzime proteolitice, enzime pectinolitice
și enzime lipolitice.

2
http://cesamancam.ro/despre_enzime_rol_beneficii.html

5
 CAPITOLUL 1

1.1 CARACTERISTICI GENERALE

Tirozinaza (EC 1.14.18.1) este o enzimă care se întâlnește în bacterii, fungi,

plante și animale. Aceasta este fenol-oxidază și necesită pentru oxidare,
oxigen molecular. Aplicabilitatea acestei enzime, în vederea obținerii de
biosenzori și bioreactoare enzimatice, este de mare importanță în domeniul
cercetării medicale și în special în biotehnologii, datorită combinării unor
materiale la dimensiuni micrometrice sau nanometrice cu unele
biomolecule. Tirozinaza posedă două situsuri catalitice: unul pentru
hidroxilarea fenolilor (activitate cresolazică) și cel de-al doilea pentru
oxidarea difenolilor până la chinone (activitate catecolazică), ambele
situsuri fiind active în prezența oxigenului molecular (Fig.1).

6
Tirosinaza este o metaloenzimă, care posedă la nivelul situsului activ
enzimatic, doi ioni de cupru, care sunt coordinați fiecare prin intermediul
unui număr de trei resturi histidinice din lanțul polipeptidic enzimatic.
Acțiunea oxidoreductazică a tirosinei este asigurată de transferul reversibil
al electronilor prin intermediul ionilor de cupru (Cu+; Cu 2+).

În oxidarea tirosinei, în prezența tirosinazei, se obțin doi intermediari

metabolici (L-DOPA și L-DOPA-chinonă). În sistemele vii, L-DOPA-
chinona se transformă necatalitic în melanină, în urma unor reacții de
condensare intramoleculară, oxidare și polimerizare (Fig. 2).

Tirozinaza face parte din subclasa polifenol oxidazelor și prezintă

specificitate față de substraturi derivate din fenol: catecoli, crezoli,
dopamina, epinefrina. Datorită acestor caracteristici, tirozinaza poate fi
utilizată pentru evidențierea analitică a fenolilor în alimente, mediu,

7
laboratorul clinic. Studiile de specialitate au demonstrat importanța utilizării
biosenzorilor pentru detectarea nivelului dopaminei din creier, și astfel
diagnosticarea și prevenirea evoluției bolii Parkinson.

Când o persoană are o genă mutantă de tirozinaza, aceea pesoană suferă de

albinism. Albinismul este o boală ereditară, pe care o persoană la 17.000,
din Statele Unite o are.

Albinismul se întâlnește și la oameni dar și la animale, în special la vite.

Efectele acestei boli sunt acelea ca pigmentația din păr, piele se pierde, iar
ochii animalelor devin roz, deranjându-i, astfel ajung să nu se mai
folosească de ei.

1.2 STRUCTURA TIROZINAZEI

Fig.1.2.1 Structura tirozinazei

8
Tirozinaza a fost izolată și studiată dintr-o varietate largă de plante, animale
și specii de fungi. S-a sugerat că nu există o structură asemănătoare a
tirozinazei la toate speciile.

Enzimele găsite în țesuturile plantelor, animalelor și fungilor, diferă frecvent

de structura primară, ca mărime, tiparul de glicozidaze și caracteristicile de
activare. Toate tirozinazele au în comun un centru de Cu binuclear, între
poziția activă. 2 atomi de cupru sunt coordinați cu 3 reziduuri de histidină.

Tirozinaza e o enzimă “cheie” în sinteza melaninei în celulele pigmentate

ale vertebratelor. Reglarea, reglementarea acesteia în produsele agricole și
în cele cosmetice este foarte importantă. Așadar, inhibarea reacțeii
enzimatice va fi un proces valoros de investigat.

1.3 TIROZINA CA MODEL AL ROLULUI CALRETICULINEI

După tratamentul celulelor de melanom, deși corect transportată în

melanosom, tirozinaza este inactiva.

Tirozinaza nu se pliază gresit în prezența N-glicanilor gluconați, atât cât să

fie reținută în reticulul endoplasmatic și degradată. Mai mult, ea e corect
transportată în melanosomi. În ciuda localizării corecte ea nu are activitate
catalitică în celulele tractate și celulele nu realizează melanogeneza, fiind
deficitare în pigment.

S-a dovedit că absența N-glicanilor de tip complex nu este responsabilă

pentru menținerea tirozinazei în forma activa. În absența inhibării procesării

9
N-glicanilor, tirozinaza are nevoie de aproximativ trei ore pentru a se plia
corect.

Tirozinaza este o enzimă care conține cupru, găsită în plante, animale și

fungi. Aceasta este responsabilă pentru biosinteza melaninei, care determină
culoarea pielii, a părului și blană. Fiind o enzimă care produce pigment,
aceasta catalizează două reacții distincte: adăugarea unei grupări hidroxil (-
OH) la aminoacidul tirozină, care devine apoi 3,4-dihidroxifenilalanină (L-
DOPA). Tirozinaza convertește apoi L-dopa în o-dopachinonă printr-o
reacție de oxidare. În urma acestor două etape principale, melanina este apoi
generată după alte etape enzimatice.

Fig.1.3.1

Deoarece această enzimă catalizează reacția de producere de pigmenți,

problemele apar atunci când avem exces de melanina. Astfel de probleme
sunt probleme dermatologice și rumenirea rapidă a fructelor și legumelor.
Compuși numiți inhibitori sunt sintetizați pentru a împiedica sau opri funcția
enzimei. Cu toate acestea, din cauza resurselor care se epuizează, derivați
sintetici pe bază de compuși naturali au deschis aceasta cercetare la o gamă
largă de posibili inhibitori tirozinazei.

10
Fig.1.3.2

11
 CAPITOLUL 2

2.1 DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ENZIMATICE ¹

CONDIȚII: T = 25°C, pH = 6.5, A280nm, SPECTRUL DE LUMINĂ = 1

cm

ACTIVITATEA ENZIMATICĂ A TIROZINAZEI SE DETERMINĂ

SPECTOFOTOMETRIC

2.2 REACTIVI

1) 50 Mm solutie tampón de fosfat de potasiu, pH 6,5 la 25 ° C

(Se prepară 50 ml în apă deionizată folosind foasfat de potasiu, monobazic,

anhidru. Se ajustează la pH 6,5 la 25 ° C cu 1 M KOH.)

2) 1 mM Soluție L-tirozina

(Se prepară 100 ml de apă deionizată, folosind L-tirozină)

3) Extract proteic total

(Imediat înainte de fo3losire, se prepară o soluție care conține

500 - 1.000 de unitati / ml de tirozinaza în Reactiv rece A.)

2.3 MOD DE LUCRU

3
- https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-
aldrich/docs/Sigma/General_Information/2/tyrosinase.pdf

12
Se prepară un cocktail de reacție prin pipetarea (în mililitri)

următorilor reactivi într-un recipient adecvat:

- Apă deionizată 9.00

- Reactiv A (tampon) 10,00
- Reactiv B (tirozina) 10,00

Se amestecă și se ajustează la pH 6,5 la 25 ° C cu 1 M HCI sau NaOH 1M,

daca este necesar. Imediat înainte de utilizare, se barboteaza 99,9% pur O2
prin cocktail reacție timp de 3 până la 5 minute.

Se echilibrează la 25 ° C. Monitorizarea A280 nm se face constant, utilizând

un spectrofotometru termostatizat corespunzător. Apoi se adauga solutia
tampon si EPT-ul.

Se amestecă imediat prin răsturnare și înregistrează creșterea A280 nm timp

de aproximativ 10 minute. Se citeste densitatea optică la maximul de
absorbție la 280 nm.

2.4 CALCUL

13
 CAPITOLUL 3

3.1 UTILIZĂRI ȘI IMPORTANȚĂ

Tirozinaza este o enzimă care se întâlnește în bacterii, fungi, plante și

animale. Albinismul este cauzat de absența tirozinazei, o enzimă esențială
pentru producerea pigmenților celulari. Tirozinaza este o enzimă care
conține un cofactor metalic, cuprul, implicată în primele două reacții
determinante de viteza (oxidarea tirozinei la DOPA, respectiv
dehidrogenarea DOPA la dopachinonă) din cadrul căii metabolice de
producere a melaninei. Gena umană a tirozinazei, care codează o proteină de
529 aminoacizi, constă din 5 exoni care acoperă circa 50 Kbaze de ADN din
cromozom. În cazul unei mutații homozigote, absența activității
melanogenice, pacienții nu vor biosintetiza melanina în piele, păr sau ochi în
decursul vieții. O posibilă alternativă în combaterea acestor deficiențe
enzimatice este aceea prin care se înlocuiește enzima lipsă. Trebuie ținut
cont de faptul că administrarea unor enzime din alte surse poate conduce la
reacții imunologice adverse. Una din strategiile frecvent utilizate este aceea
de protejare a enzimei intr-o microcapsulă, gel sau fibră în scopul protejării
acesteia față de răspunsul imunologic nedorit.

Albinismul este o hipomelanoză generalizată congenitală, permanentă,

determinată genetic și exprimată morfologic prin depigmentarea părului,
pielii sau penelor și prin apariția unui iris de culoare roz-rosiatic. Cauzele
albinismului sunt de natură genetică și sunt reprezentate de mutații genetice
ce afectează producția pigmentului numit melanină. Melanocitul este celula
responsabilă de producerea melaninei și astfel de pigmentarea pielii, părului

14
și ochilor. În albinism, melanocitele sunt prezente, dar mutațiile genetice
împiedică producerea pigmentului sau posibilitatea de distribuție a acestuia
în cheratinocite (tipul principal de celule ce alcătuiesc epidermul). În
prezent sunt cunoscute cinci tipuri de albinism, cele mai întâlnite fiind:
albinismul oculocutanat de tip 1 si de tip 2. Cel de tip 1 este cauzat de
mutații la nivelul genei TYR (tirozinază) care este responsabilă de
producerea enzimei tirozinază, folosită de celule în transformarea
aminoacidului tirozină în molecule de pigment; cel de tip 2 rezultă în urma
mutației unei gene ce codifică proteina P, al cărei rol nu este cunoscut.

Tirozinaza (EC 1.14.18.1), oxidază ce conţine cupru, este prezentă în

ţesuturile plantelor şi animalelor în care catalizează producerea melaninei şi
a altor pigmenţi prin oxidarea tirozinei. Tirozinaza izolată dintr-o cultură de
mucegai Trichoderma reesei este mai eficientă decât tirozinaza obţinută din
ciuperca Agaricus bisporus atât la reticularea proteinelor, cât şi la
încorporarea dihidroxifenilalaninei într-un substrat proteic. Tirozinaza
obţinută din A.bisporus este înclinată spre oxidarea substraturilor cu masă
moleculară mică şi care conţin tirozină.

Tirozinaza este marker extrem de util pentru evidențierea celulelor tumorale

joncționale în periferia tumorii cât și a celulelor tumorale din straturile
superficiale epidermice. Interesant de semnalat este faptul că melanoamele
maligne hipomelanotice au fost intens difuz pozitive pentru tirozinază, deși
tirozinaza este în mod obișnuit legată de sinteza melaninei, și deci de țesutul
pigmentat. Identificarea tirozinazei în tumori maligne lipsite de pigment este
cu atât mai importantă cu cât identificarea melanomului este mult mai

15
dificilă în cazul acestui tip de tumori în care în absența pigmentului,
diagnosticul se bazează pe alți biomarkeri specifici melanomului.

Tirozinaza folosită pentru obținerea senzorilor electrochimici pentru detecția

substraturilor sale specifice, pe baza metodelor de imobilizare clasice, dar și
folosind nanotehnologiile. În zilele noastre, biosenzorii electrochimici cu
tirozinaza constituie o tehnologie promițătoare pentru monitorizarea în situ a
compușilor fenolici, din cauza avantajelor lor, cum ar fi o selectivitate
ridicată, costuri de producție reduse, viteză de răspuns mare, potențial de
miniaturizare și instrumentație simplă. În genere, senzorii electrochimici
sunt obținuți folosind electrozi din materiale inerte din punct de vedere
chimic, cum sunt platina sau aurul, dar și a unor materiale carbonice, mult
mau ieftine. Imobilizarea ei folosind filme polimerice, fiind des utilizată.
Astfel, au fost utilizați polimeri neconductori dar și polimeri conductori.
Straturi biocompuse din poli (3,4-etilendioxitiofen) (PEDOT) și tirozinază
au fost electrodepuse pe electrozi de aur convenționali dar și pe
microelectrozi. Biosenzorii amperometrici au fost testați pentru dopamină și
catecol, în soluții apoase tamponate și au afișat un răspuns liniar în
intervalul de concentrații cuprins între 10 și 300 µM, cu o limită de detecție
de 4,18 µM.4

4
- APLICAȚII ALE TIROZINAZEI ȘI LACAZEI: BIOSENZORI ENZIMATICI

ELECTROCHIMICI Șef lucr.dr. Monica Florescu, drd. Andreea Vâlceanu, prof.univ.dr.

Gh.Coman Facultatea de Medicină, Universitatea „Transilvania” din Brașov

16
 CONCLUZII

- Tirozinaza este extrem de importantă deoarece această enzimă

catalizează reacția de producere de pigmenți, problemele apar atunci
când avem exces de melanină
- Tirozinaza este o metaloenzimă prezentă în bacterii, fungi, plante și
animale. Aceasta este o fenol-oxidază având ca substrat fenolii.
Aplicabilitatea acestei enzime, în vederea obținerii de biosenzori și
bioreactoare enzimatice, este de mare importanță în domeniul
cercetării medicale și în special în biotehnologii, datorită combinării
unor materiale la dimensiuni micrometrice sau nanometrice cu unele
biomolecule.
- De asemenea tirozinaza are o mare importanță în medicină întrucât
cu ajutorul acesteia se pot evidenția celulele tumorale joncționale în
periferia tumorii cât și a celulelor tumorale din straturile superficiale
epidermice.

3
 BIBLIOGRAFIE

- http://webbut.unitbv.ro/jmb/JMB%202013%20nr%202/01_04_refer
at%20florescu.pdf
- http://cesamancam.ro/despre_enzime_rol_beneficii.html
- https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-
aldrich/docs/Sigma/General_Information/2/tyrosinase.pdf
- http://www.fabricadecarne.ro/enzime-utilizate-la-fabricarea-
5
produselor-din-carne
- https://robi74ro.files.wordpress.com/2010/03/en14.pdf
- http://www.scrigroup.com/sanatate/Tirozinaza-Patologia-si-
Struct31198.php
- APLICAȚII ALE TIROZINAZEI ȘI LACAZEI: BIOSENZORI
ENZIMATICI ELECTROCHIMICI Șef lucr.dr. Monica Florescu,
drd. Andreea Vâlceanu, prof.univ.dr. Gh.Coman Facultatea de
Medicină, Universitatea „Transilvania” din Brașov