LUCRAREA 7

Testarea sensibilităţii/rezistenţei germenilor la actiunea substantelor

antimicrobiene

Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene este strict necesară datorită

apariţiei şi extinderii rezistenţei microorganismelor la aceste medicamente. Se aplică:
a. metode de testare a sensibilităţii in vitro;
b. metode de testare a sensibilităţii in vivo, care ţin cont de relaţia agent terapeutic-
infecţie.
•
Metode de testare a sensibilităţii in vitro
Antibiograma reprezintă metoda de laborator prin care se apreciază, sensibilitatea la
antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe
medii speciale (agar Mueller-Hinton). Pentru testare trebuie să folosim culturi pure.
Principiul metodei: O cantitate de substanţă antimicrobiană este depusă pe suprafaţă
unui mediu de cultura agarizat, preînsămânţat cu bacteria testată.
Concomitent se produc doua fenomene: difuzarea substanţei antimicrobiene şi creşterea
bacteriei. În zonele în care substanţa antimicrobiană realizează concentraţii mai mari
decât concentraţia minimă inhibitoare, bacteria nu creşte.
Antibiograma este utilă în:
- instituirea unui tratament ţintit de către medicul clinician;
- evidenţierea acelor tulpini ce posedă enzime capabile să inactiveze acţiunea
antibioticului in vivo;
- supravegherea epidemiologică a rezistenţei bacteriene;
- compararea fenotipurilor de rezistenţă a tulpinilor responsabile de infecţii
nosocomiale.
Se pot folosi:
• Tehnici calitative:
- antibiograma difuzimetrică comună;
- antibiograma difuzimetrică comparativă;
- antibiograma difuzimetrică standardizată;
• Tehnici cantitative:
- metoda diluţiilor în mediu lichid;
- metoda diluţiilor în agar, metoda microdiluţiilor în agar;
- metoda „punctelor de ruptură”
- testul „E”;
- metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare.

Antibiograma difuzimetrică comună:

- germenul de testat se însămânţează pe mediul solid (agar Mueller-Hinton) turnat
în plăci Petri prin „inundarea” plăcii, urmată de aspirarea (aseptic) excesului de inocul;
- se aplică după circa 20 minut microcomprimatele în care sunt încorporate
antibiotice cu ajutorul unei pensete sau a unui aplicator „automat” la distanţe de minim
30 mm între ele şi la 15 mm de marginea plăcii. Se aplică 5 antibiotice diferite pentru o
Page1

placă Petri cu diametrul de 9 cm. Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect

cu mediul, de aceea trebuie presate uşor;
 - după încă 20 minute, plăcile se incubează peste noapte în termostat, la 35-37°C
pentru majoritatea bacteriilor. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în
mediu şi realizează zone de inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (dacă
populaţia bacteriană este sensibilă). Cu cât diametrul zonei de inhibiţie este mai mare,
cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie
(indiferent de valoarea diametrului) se dezvoltă colonii („mutanţi rezistenţi”), germenul
va fi considerat rezistent.
Antibiograma difuzimetrică comună este o tehnică nestandardizată care permite de fapt
numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor
foarte active.

Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş):

- se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de
referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Pentru cocii gram pozitivi se
alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. care are o sensibilitate
cunoscută la antibioticele utilizate (CMI cunoscut; CMI reprezintă cea mai mică
concentraţie de agent antimicrobian, în mg/ml, cu acţiune bacteriostatică asupra
germenului testat);
- pe o placă de formă pătrată („împărţită” în 3 zone egale) se inoculează în treimea
medie microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme
diferite, pentru a fi testate. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la
apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente;
- se plasează microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre
culturi;
- se incubează peste noapte la 35-37°C.
Rezultatele se exprimă cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, în funcţie de
diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi
antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează comparativ). Poate fi apreciat şi CMI.

Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer):

- se procedează ca în cazul Antibiogramei difuzimetrică comună;
- metoda este standardizată şi recunoscută pe plan internaţional;
- rezultatele între laboratoare sunt reproductibile şi corelabile.
Elementele necesare standardizării sunt:
• mediul de cultură (agar Mueller-Hinton), cu elemente minerale „specifice”
testării unor anumite microorganisme (Mg2+ şi Ca2+, Pseudomonas aeruginosa, pentru
sensibilitatea la aminoglicozide); pH-ul mediului (frecvent între 7,2-7,4); cu suplimente
nutritive procurate comercial; grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm;
• inoculul trebuie să aibă o turbiditate corespunzătoare standardului 0,5
McFarland (circa 10 unităţi formatoare de colonii/ml) în multe dintre cazuri;
• timpul de incubare, atmosfera de incubare;
• concentraţia substanţelor din microcomprimate şi dimensiunea acestora (6 mm
diametru);
• alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
• utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
Page1

• interpretarea rezultatelor (rezultatul obţinut se compară cu rezultatele din tabele.

Nu permite aprecierea CMI sau CMB (concentraţia minimă bactericidă).

Metoda diluţiilor în mediu lichid:

- oferă informaţii cu privire la CMI pentru fiecare antibiotic studiat;
- pentru fiecare antibiotic testat se utilizează mai multe tuburi cu bulion Mueller-
Hinton în concentraţii descrescătoare (diluţii binare) de la 64 μg/ml până la 0,125 μg/ml,
în total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor;
- în final, se adaugă în fiecare tub câte 1 ml de antibiotic;
- se prepară inoculul standardizat turbidimetric;
- se inoculează toate cele 11 tuburi, cu câte 1 ml de inocul;
- se agită pentru omogenizare;
- se incubează cele 9 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-
37°C, al doilea tub martor se păstrează la frigider;
- pentru controlul de calitate se utiliză şi un şir de tuburi care sunt inoculate cu o
tulpină de referinţă corespunzătoare;
- rezultatul se citeşte în ziua următoare şi se interpretează. Concentraţia finală de
antibiotic se va înjumătăţi (în tubul în care diluţia iniţială a fost de 64pg/ml, diluţia
finală va fi 32 pg/ml). În tubul martor menţinut la +4°C nu trebuie să existe creştere, în
timp ce în tubul martor la 35-37°C creşterea trebuie să fie evidentă. În tuburile
inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatele corespunzătoare datelor
oferite de producător. În tuburile test, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului este CMI. Se consideră (cu diferenţe între specii diferite) că
microorganismele în cazul cărora CMI este < 2 pg/ml pot fi eficient inhibate de către
antibioticul respectiv şi in vivo.

Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă):

- se cunoaşte rezultatul CMI;
- se foloseşte ca sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost
inhibată;
- se împarte o placă Petri (agar Mueller-Hinton) în sectoare (4 sectoare dacă
inhibiţia a avut loc în ultimele 4 tuburi);
- se însămânţează (aseptic) din fiecare tub fără creştere microbiană, în sectorul de
placă corespunzător;
- se incubează 16-18 ore la 35-37°C;
- CMB corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus
microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii);
- se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot
atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB;
Determinarea CMI şi CMB se face:
- pentru aprecierea eficacităţii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini
bacteriene;
- în tratamentul infecţiilor severe (endocardite, meningite, septicemii);
- pentru imunodeprimaţi, la care efectuarea acestei metode este indispensabilă.
Page1

Determinarea CMI prin testul E (Etest)

 Testul E reprezintă o metodă cantitativă de testare in vitro care permite
determinarea valorii CMI.
Principiu:
Tehnica de lucru: - se scot plăcile cu mediu de cultură şi benzile Etest din
congelator;
- se menţin la temperatura camerei pentru echilibrare
termică, timp de 20 minute;
- se scot benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi se pun
în plăci Petri sterile;
- benzile nefolosite se conservă în tuburi, împreună cu o
substanţă desicantă;
- tuburile se păstrează la -20°C;
- după obţinerea inoculului standard şi după ce se verifică
dacă mediul de cultură nu mai prezintă condens, se
transferă inoculul pe mediu (cu un tampon) având grijă să
fie acoperită complet suprafaţa mediului;
- se lăsă placa timp de circa 10 minute, înainte de a aplica
benzile Etest;
- se ia cu grijă o bandă şi se aplică pe suprafaţa mediului
de cultură, cu capătul ce conţine concentraţia cea mai mare
aproape de marginea plăcii (pot fi aplicate 2 benzi Etest
într-o placă de 90 mm şi maxim 6 benzi dacă se lucrează cu
plăci cu diametrul de 150 mm);
- banda trebuie să fie în contact perfect cu suprafaţa
mediului. Dacă banda a fost aplicată greşit, aceasta nu
trebuie deplasată în altă poziţie, deoarece eliberarea
medicamentului are loc imediat, la fel ca şi în cazul
microcomprimatelor de la antibiogramă;
- se incubează la 35-37°C, timp de 16-18 ore.
Interpretarea - rezultatul se citeşte atunci când cultura este confluentă
rezultatelor: sau aproape confluentă;
- valoarea CMI corespunde liniuţei în care creşterea
bacteriană intersectează banda Etest;
- pe geloză - sânge se citeşte zona de inhibiţie a creşterii
bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei;
- dacă nu apare nici o zonă de inhibiţie se raportează
valoarea CMI ca fiind mai mare decât cea mai mare
concentraţie notată pe bandă;
- dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda, valoarea
CMI este mai mică decât concentraţia cea mai scăzută
menţionată pe bandă;
- se raportează rezultatul obţinut pentru tulpina studiată
după ce se verifică rezultatul obţinut pentru tulpina de
referinţă (control de calitate).
Page1
Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi aprecierea eficientei terapeutice
- determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori;
- determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori
(capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul
conţinând germenul infectant);
- determinarea nivelul de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori.

Page1