Imunitatea celulară specifică

Imunitatea celulară specifică - limfocitele

 Se împart în două mari categorii:
 Limfocite T
răspunzatoare de imunitatea celulară
 circulă în sânge, limfă, dar cea mai importantă fracţie se
găseşte cantonată în organele limfoide
 se găsesc în circulaţie, în drum spre organele limfoide
primare sau în interiorul acestora, aflate în diferite stadii de
maturare
 Limfocite B
 răspunzatoare de imunitatea umorală
 au originea, iniţial în ficatul fetal şi ulterior în măduva
hematogenă
 în sângele periferic aproximativ 10-20 % din limfocite
aparţin liniei B.
 trec prin mai multe stadii până să devină efectori
competenţi ai imunităţii umorale
Maturaţia limfocitelor T
Limfocitele T - funcţii
 Limfocitele T se împart în mai multe populaţii celulare cu
funcţii specifice. Ele nu se deosebesc din punct de vedere
morfologic:
 limfocitele CD8+ sau citotoxice
 limfocitele CD4+ sau ajutatoare (helper)
 Th1:
 secretă IL-2, IL-12, IFN gamma, TNF beta;
 activează macrofagele, amplificându-le capacitatea de secreţie a
citokinelor şi potenţialul de prezentare a antigenelor;
 activează sinteza anticorpilor IgG, dar nu a IgE;
 sunt implicate în reacţiile de hipersensibilitate întarziată;
 sunt activate de semnalele date de virusuri şi bacterii intracelulare;
 Th2:
 secretă IL-4, IL-5, IL-6, IL-10;
 activează sinteza de IgE;
 stimulează proliferarea şi activarea eozinofilelor;
 sunt stimulate de alergene sau componente parazitare;
Diferenţierea Ly T – CD4

 Diferenţierea limfocitului CD4+ naiv, activat, în limfocit

efector de tip Th1 sau Th2 este influenţată de o serie de
factori, dintre care cei mai importanţi par să fie
citokinele prezente în fazele precoce de activare şi de
expansiune clonală:

 în prezenta IL-12 şi a IFN-gamma CD4+ naive se vor

diferenţia în limfocite Th1
 limfocitul Th2 se diferenţiază în prezenţa IL-4
Modificări ale Ly T – CD4
 Scăderea CD4 apare în:

 Infecţii intercurente
 Leucopenii de diferite etiologii
 Terapie cu steroizi sau cu imunosupresoare
 Efort fizic excesiv
 Intervenţii chirurgicale
 Graviditate
 Stres psihic
 Variaţie diurnă – CD4 scad spre amiază şi cresc seara
Modificări ale Ly T – CD8

 Creşterea CD8 se întâlneşte în:

 Boli autoimune
 Infecţii virale
 Reactii imune patologice de tipul „Graft versus host
disease”, rejet de transplant
 Deficienţe imune congenitale sau dobândite (SIDA)

 Scăderea CD8 se întâlneşte în:

 LES sau după tratament cu corticosteroizi

 Raportul CD4/CD8 normal este dovada unui sistem

imun sănătos şi are valoarea între 1 şi 4. În infecţia HIV
scade numărul Ly CD4 iar raportul devine subunitar.
Alte tipuri limfocitare T
 Celulele T γδ (celule T gamma delta)
 reprezintă un mic subset al celulelor T, care posedă un
alt receptor T la suprafaţă (TCR).
 majoritatea celulelor T au TCR alcătuit din 2 lanţuri gp
α- şi β-. Spre deosebire de acestea celulele T γδ au TCR
alcătuit dintr-un lanţ gamma şi unul delta.
 sunt abundente în mucoasa intestinală

 Celulele T natural killer (NKT)

 sunt un grup heterogen de celule T, care au proprietăţile
atât ale celulelor NK, cât şi ale celulelor T
 reprezintă doar 0.2% din totalul limfocitelor T circulante
în sânge
Clasele limfocitare
Clasa de
Functia limfocitelor % Markeri fenotipici
limfocite

Liza celulelor infectate viral si

NK 7% (2-13%) CD16, CD56 dar nu CD3
a celulelor tumorale

Elibereaza cytokine şi factori

T helper de crestere ce regleaza alte 46% (28-59%) TCR αβ, CD3 şi CD4
celule imune
Liza celulelor infectate viral si
T
a celulelor tumorale si 19% (13-32%) TCR αβ, CD3 şi CD8
citotoxic
alogrefelor

γT Imunoreglare si citotoxicitate TCR γδ şi CD3

Limfocit CMH clasa II, CD19,

Secretie de anticorpi 23% (18-47%)
B CD20
Modificările seriei limfoide
 Limfocitoza:
 Fără modificări morfologice:
 După efort fizic
 Stress
 Boli endocrine
 Post splenectomie
 Tuse convulsivă
 Cu modificări morfologice:
 Modificări reactive: mononucleoză, toxoplasmoză,
bruceloză, TBC, lues, HIV, hepatite virale, CMV, LED,
sarcoidoză
 Creşterea numărului de limfocite mari granulare apare
uneori în infecţia HIV, HVB, EBV;
 Vacuolizări apar la pacienţi cu boli metabolice (ex.
glicogenoze)
 Limfoproliferări maligne: LLC, limfoame
Limfocite reactive
Citometria în flux
 Citometria în flux este o
tehnică folosită pentru
numărarea, examinarea şi
sortarea particulelor
microscopice suspendate în
fluid.
 Permite de asemenea
analiza multiparametrică a
caracteristicilor fizice şi/sau
chimice a unei singure
celule ce trece printr-un
aparat de detecţie optic
şi/sau elecronic.
 Fluorocromii care pot fi
utilizaţi sunt aleşi în funcţie
de laserul folosit pentru
excitare şi de detectorii
disponibili.
Citometria în flux
 Forward scatter (“FS”,
“FSC”)
 Lumină transmisă prin Detector lum ină
împrăştiere la 180° îm prăştiată la 90°
 Proporţională cu
suprafaţa (dimensiunea)
celulei Sursa
 Side scatter (“SS”, de
Detector lum ină
180°
“SSC”) lum ină
 Lumină refractată şi
împrăştiată la 90°
 Proporţională cu
complexitatea
structurală internă a
celulei (granularitate)
Citometria în flux
 Datele generate pot fi
reprezentate sub formă de
ploturi într-o singură
dimensiune, sub formă de Pozitiv CDX2
Dublu pozitiv CDX1 şi
histograme sau în două sau CDX2

chiar trei dimensiuni.

 Regiunile din aceste ploturi
pot fi separate pe baza
intensităţii fluorescenţei cu
ajutorul porţilor. Negativ Pozitiv CDX1
 Citometrele moderne
analizează câteva mii de
particule pe secundă, în
timp real şi pot separa şi Interpretarea expresiei, respectiv a
izola particule cu anumite co-expresiei unui antigen
proprietăţi.
Citometria în flux

 Citometria în flux utilizează principiile împrăştierii, excitării şi

emisiei de către moleculele de fluorocromi, pentru a genera
date multiparametrice despre particule şi celule cu diametre
între 0,5 şi 40µm.
 Celulele sunt hidro-dinamic focusate în flux de PBS, înainte să
întâlnească o sursă de lumină optim focusată. Ca sursa de
lumină se foloseşte cel mai frecvent laserul.
 Un citometru are 5 componente principale:
 Fluxul care antrează celulele prin dreptul razei laser
 Sistemul optic
 Componenta electronică
 Detectori – care transformă semnalele SSC, FSC, fluorescente în
impulsuri electrice
 Sistem de amplificare liniar (SSC, FSC) sau logaritmic (FL)
 Computer pentru analiza semnalelor
Sistemul fluidic
Sistemul optic
Sistemul electronic
Aplicaţii ale citometriei în flux
 Hematologie – volum, complexitate internă, CD.
Citometria în flux a devenit metoda preferată pentru
stabilirea liniei, stadiului de maturaţie, stabilirea
clonalităţii, markerilor aberanţi (Imunofenotiparea).
 ADN – ciclu celular, proliferare şi cinetică celulară
 ARN
 Expresia şi localizarea unor proteine
 Antigene intracelulare – diferite citokine, mediatori
secunzi
 Activitate enzimatică
 Apoptoză, viabilitate celulară
 Caracterizarea multirezistenţei la droguri în celulele
canceroase
 Combinaţii
 Aplicaţii practice

 Analiza cantitativă a
seturilor limfocitare din
sângele periferic.
 Se folosesc markerii CD45,
CD3, CD4, CD8, CD16+56,
CD19.
 CD45 este antigen comun
leucocitar – folosit pentru
investigarea celulelor
hematopoetice.

Limfocitele exprimă înalt CD45

Aplicaţii practice

 Separarea Ly T CD 4 şi
CD8
Aplicaţii practice

 Separarea populaţiilor limfocitare T, B, NK

Aplicaţii practice
Aplicaţii practice

 Leucemia limfatică cronică (LLC) - patternul LLC

Aplicaţii practice

Caz tipic de LLC: demonstrarea clonalităţii (lanţuri uşoare kappa), co-expresia

CD19 cu CD5 şi CD23 pozitiv
Aplicaţii practice – Leucemie acută
mieloidă

 Strategia de gating a blaştilor CD45/SSC în cazul unui pacient cu LAM. Se

observă populaţia blastică bine delimitată, cu expresie joasă în funcţie de CD45
şi SSC.