5/22/2019

Explorarea metabolismului hemoglobinei

Determinarea Hb şi a statusului Fe

Catalina Pisoschi
Biochimie clinica – Master LCAM

• Hemoglobina - hemoproteină globulară formată din:

► Parte prostetică HEM

protoporfirina IX
Fe2+

► Parte proteică GLOBINA

tetramer 2 lanțuri α (141 aa)
2 lanțuri β (146 aa) în HbA

1
 5/22/2019

Hemoglobine fiziologice

Tip Hb Structură % la adulţi

A α2 β2 92
A2 α2 δ2 2.5

F α2 γ 2 <1
Gower-1 ζ2 ε 2 0*
Gower-2 α2 ε 2 0*
Portland ζ2 γ 2 0*

* Hb embrionare

• HbA:
- Hemoglobina adultă majoritară
- Sistem tampon, transportă gazele respiratorii
- Crescută la fumători, efort fizic, hiperestrogenism
- Scade în diferite tipuri de anemii
• HbA2:
– Scade în deficit de fier, α-talasemii
– Creşte în anemie megaloblastică, hipertiroidism, β-talasemii
• HbF:
– Crescută în cazul persistenţei ereditare a lanţului γ
– Crescută în leucemia mielocitară cronică juvenilă (~70%)
– Creşte în siclemie, β-talasemii majore
– Normală sau uşor crescută în anemie hemolitică congenitală
– Creşte în unele forme de cancer

2
 5/22/2019

Anomaliile hemoglobinei

• Hb modificate chimic – carboxihemoglobina - CO

- methemoglobina – Fe3+
- carbhemoglobina – CO2
- Hb glicată – glucoză la capătul N-terminal
- Hb F acetilată
• Trei categorii de anomalii ereditare:
– Structurale sau calitative - hemoglobinopatii
– Cantitative: producerea unuia/mai multor lanţuri ale Hb redusă -
talasemii
– Persistenţa ereditară a HbF – lanţul γ nu se transformă complet
în lanţ β

• Motive de a suspecta o anomalie a Hb:

– Istoricul pacientului
– Rezultatele unor teste de laborator: hematii hipocrome de
dimensiuni mici, anemie hemolitică
– Teste de screening anormale (la nou născuţi)
• Teste de laborator pentru evaluarea Hb:
– HLG + lamă – morfologia globulelor roşii
– Electroforeza Hb - pH alcalin 8,6 – agaroză, acetat
- migrare spre anod fcţ.de sarcină
- pH acid 6,2 – agar
- diferenţe de sarcină
- separare variante ce migrează împreună
(de ex., HbC de HbE, HbS de HbD)
- HPLC – timpi de retenţie diferiţi faţă de HbA

3
 5/22/2019

Electroforeza Hb

Hemoglobinopatii
prin deficit calitativ
sinteza unor hemoglobine anormale
anemia falciformă (HbS), hemoglobinopatia C (Hb C)

prin deficit cantitativ

sinteza unor cant. insuficiente de Hb normală
talasemii
Anemia falciformă
(siclemie, drepanocitoză, hemoglobinopatie S)

• mutație punctiformă în structura genei β-globinice

• HbS – 2 catene α normale și 2 catene β mutante (βS - Glu 6 înlocuit cu Val) =>
polimerizarea deoxiHb S => formare rețea polimeri fibroși => distorsionarea
eritrocitelor (eritrocite falciforme, în formă de seceră)

• Efecte - fenomene vasoocluzive => anoxie tisulară localizată => durere => moartea
celulelor din zona afectată
- episoade algice, anemie hemolitică cronică, susceptibilitate crescută la
infecții, accidente vasculare, crize anginoase, hiperplazie medulară cu modificări
osoase consecutive

4
 5/22/2019

Formă homozigotă
Transmitere autozomal recesivă – indivizi care au moștenit 2 gene mutante, câte una de la
fiecare părinte
Amploarea fenomenului de siclizare – creșterea formei deoxi HbS – scăderea presiunii O2
la altitudini mari, creșterea pCO2, acidoză, deshidratare, creșterea conc 2,3 –DPG

Forma heterozigotă
Incidență 1:12 în rândul populației afro-americane – prezența unei gene normale și a unei
gene mutante – purtători heterozigoți de Hb AS
Eritrocitele heterozigoților prezintă HbA și HbS
În general asimptomatici - speranță de viață relativ normală

Electroforeza Hb în gel de agaroză

- diagnosticarea formei heterozigote
şi a siclemiei
- pH alcalin sau acid
- Hb S migrează mai lent către anod
comparativ cu HbA - absența Glu
încărcat negativ din cele două catene
β , electronegativitate redusă

Hemoglobinopatia C
- Modificări în catena β - Glu din poz 6 înlocuit cu Val şi Asp din 73 cu Asn
- Pacienții homozigoți prezintă anemie hemolitică cronică, gravitate redusă
- Nu necesită tratament specific

Methemoglobinemia
• Grupa prostetică - hemina - oxidarea hemului (Fe2+ -> Fe3+)
• Incapabilă să lege oxigenul
• Fiziologic, MetHb formată este redusă rapid la Hb sub acțiunea methemoglobin
reductazei, vitaminei C şi GSH

Poate fi înnăscută - mutații ale lanțurilor α sau β, deficit de

NADPH – methemoglobin reductază
dobândită – ingestie de medicamente, nitriți, nitrați
sub acțiunea unor compuși endogeni
(de ex., radicali liberi)
• Nou născuții mai predispuși (capacitate 2x mai mică de reducere a
MetHb la Hb)
• Clinic – cianoză ciocolatie, nuanță ciocolatie a sângelui, hipoxie,
anxietate, cefalee, dispnee
• Tratament - albastru de metilen, vitamină C (doze mari)

5
 5/22/2019

Talasemii
Afecțiuni hemolitice ereditare - dezechilibru al sintezei lanțurilor globinei
În mod normal sinteză coordonată a lanțurilor globinei – α2β2
Talasemii fără sinteză de lanțuri globinice – α0 sau β0 talasemie
Talasemie cu sinteză deficitară de lanțuri globinice
• β talasemii – absenţa/sinteza redusă lanțuri β
• Lanțurile α nu formează tetrameri stabili –>
precipită –> moartea prematură a celulelor
•Gena β-globinei are 2 copii în genomul celular

β talasemie minoră - deficitară o singură genă –

nu necesită tratament de specialitate

β talasemie majoră (anemia Cooley) – ambele

gene deficitare – necesită transfuzii regulate

• Manifestările apar după naștere -> anemie

severă în primii 2 ani de viață

α talasemii
• Sinteza redusă/absenţa lanțuri α- globinice – deleţie

• 4 copii ale genei α-globinei - câte o pereche pe fiecare

cromozom 16 -> diferite grade ale deficitelor cantitative

Numai una dintre cele 4 gene afectată

Fără manifestare clinică, purtător silențios de α talasemie

Două gene afectate

α talasemie minoră

Trei gene afectate –

Hemoglobinopatie H (HbH, tetrameri β) grade variabile
de anemie hemolitică

Toate cele 4 gene afectate

Deces intrauterin sau imediat după naștere
(nu se sintetizează Hb F)

6
 5/22/2019

Dozarea hemoglobinei

• Mai multe forme de Hb prezente în mod normal în sânge

Deoxihemoglobina (HHb)
Oxihemoglobina (O2Hb)
Carbhemoglobina (CO2Hb)
Methemoglobina (MetHb)
• Se determină împreună în sângele total
• În anumite situații clinice diferitele forme trebuie determinate separat

Valoare semiologică

• depistarea si monitorizarea anemiei şi policitemiei

• valorile obținute se corelează cu HCT și numărul de eritrocite

Metode de dozare a hemoglobinei

• Metode spectrofotometrice - bazate pe măsurarea derivaţilor coloraţi stabili ai

hemoglobinei reduse

• Metode gazometrice - prin saturarea hemoglobinei cu oxigen, CO şi

determinarea cantităţii de Hb, în funcţie de cantitatea
de gaz fixată

• Metode bazate pe dozarea fierului din Hb (conţinut fix de fier - 0,338%)

• Dozare în analizoare automate de hematologie - după liza hematiilor

Metoda spectrofotometrică de dozare a Hb (metoda Drabkin)

Principiu
Fericianura de potasiu transformă ionii Fe2+ în Fe3+ -> Methemoglobină
Methemoglobină + Cianură de potasiu -> Cianmethemoglobină

7
 5/22/2019

Valori de referință ale Hb – diferite în funcție de vârstă și sex

- la adulți 13,5 – 18 g/dL bărbaţi
12 – 16 g/dL femei

Valori critice Hb < 5g/dL – insuficiență cardiacă, deces

Hb > 20g/dL – hemoconcentrare - tromboză

Variații fiziologice

Valori scăzute - sarcină (scade cu 2-3 g/dL)

- nou născuţi - anemie fiziologică (până la 9g/dL în săpt 11-12 de
viață, mai pronunțată la prematuri)
- vârstnici - scădere graduală
- nivelurile de la adult sunt atinse în jur de 14 ani
Valori crescute - efort fizic intens
- la altitudini mari
- fumători

Variații patologice

Valori scăzute ale Hb ANEMIE

Valori crescute –> ERITROCITOZĂ/POLICITEMIE

• Mai multe tipuri de anemii, clasificate în funcție de:

Hematocrit (HCT) - volum eritrocite/volum sanguin total, exprimat procentual
- la adulții tineri - B 39-49%; F 35-45%
Numărul de eritrocite - exprimat în nr. eritrocite x 106 /μL (mm3)
- la adulții tineri - B 4,3-5,7; F 3,8-5,1
Aspectul morfologic al eritrocitelor pe frotiu
Indici eritrocitari medii
- Pentru evaluarea eritrocitelor dpdv al volumului și conținutului în Hb
- Calculați pe baza HCT și nr. eritrocite
VEM - volum eritrocitar mediu – volum ocupat de un singur eritrocit
CHEM - concentrația eritrocitară medie de Hb – conc medie de Hb dintr-un
volum dat de eritrocite
HEM - hemoglobina eritrocitară medie – conținut mediu de Hb pe eritrocit
RDW - lărgimea distribuției eritrocitare – cuantifică heterogenitatea
volumului eritrocitar

8
 5/22/2019

Clasificare anemii în funcție de VEM

1. Anemii normocitare (VEM normal)

Anemia posthemoragică
Anemia hemolitică
Anemii datorate secreției scăzute de eritropoietină (insuf. renală, boli hepatice)

2. Anemii microcitare (VEM scăzut) - datorate sintezei deficitare de Hb, deficit de

Fe sau alterarea utilizării Fe
Anemia feriprivă - cea mai întâlnită formă de anemie de pe glob
Anemia din bolile cronice
Talasemii

3. Anemii macrocitare (VEM crescut)

Megaloblastice
Prin deficit de vitamină B12 (în diete strict vegetariene, malabsorbție de B12 –
anemie pernicioasă (deficit al factorului intrinsec)
Prin deficit de folați (dietă deficitară, necesar crescut, malabsorbție)
Non megaloblastice

Fierul
◊ microelement – necesar zilnic < 100 mg
◊ mineral esențial
• trasport și depozitare oxigen – componentă a hemului din Hb și Mb
• reacții de oxidoreducere – transfer de e-
donor de e- – ioni feroși Fe2+
acceptor de e- – ioni ferici Fe3+
• respirație celulară – centre Fe-S, grupări hem ale cit - lanț transportor de H+ și e-

◊ cantitate totală de fier în organism ≈ 4-5 g

! Fierul în stare liberă – potențial toxic ridicat
• element redox, acceptă sau cedează e- oxigenului => SRO (radicali liberi) -
damage to cellular components
• fiziologic – conc. fierului liber în organism f mică – legat de proteine

9
 5/22/2019

Proteine ce conțin fier

• Heminice – Fe2+ inclus în gruparea prostetică hem

Hemoglobina, Mioglobina, Citocromi, Catalaze, Peroxidaze
• Non-heminice – Fe2+ legat direct de partea proteică
Transferina, Hemosiderina, Feritina

Metabolismul fierului
• totalitatea reacțiilor biochimice necesare menținerii homeostaziei fierului

Absorbție
Transport
Utilizare
Depozitare
Excreție

❶ Absorbție
◊ în enterocite, porțiunea proximală a duodenului
◊ strict controlată
– menține homeostazia fierului (mec. ineficiente de excreție a excesului de fier)
◊ în acord cu necesitățile organismului
- 15-20 mg Fe din alimente – absorbit ≈ 10%
↑ cu 20-30% în anemii, sarcină, menstruație

◊ Surse de fier
Heminic (Fe2+) – surse animale– mult mai ușor absorbit
Non heminic (Fe3+ ) – surse vegetale
- necesită transformare în Fe2+ (ferrireductaza, vit C și HCl)

◊ Absorbția ambelor forme

- ↓ în prez Ca2+

10
 5/22/2019

❷ Transport
• ca Fe3+, legat de transferină
Transferina (Tf)
• glicoproteină sintetizată în ficat
• β1 globulină cu Mr ≈ 76 kDa
• capacitate mare de legare a Fe3+ (2 mol Fe3+ / mol Tf)
- fiziologic 1/3 din Tf este saturată cu Fe3+
• transportă Fe3+ → absorbit la nivel intestinal către țesuturi (utilizare/depozitare)
→ eliberat în urma degradării eritrocitelor senescente

11
 5/22/2019

Transferina
• scade în reacţiile de fază acută, malnutriţie
• evaluată direct sau ca şi TIBC

Captarea Fe3+ la nivel celular:

• Legarea transferinei la receptori specifici TfR1 şi TfR2
• Internalizare prin endocitoză
• Disocierea Fe3+ la pH acid lizozomal
• Reciclare transferină și receptori - transport invers în afara celulei

❸ Depozitare

• fiziologic 2/3 din Fe legat de Hb (2.5-3g)

• ca Fe2+ în macrofagele din splină, ficat,
măduvă, intestin (0.5-1.5 g)
• legat de proteine specifice

Feritină

• Fe2+ rapid mobilizabil (muc. intestinală, ficat, măduvă osoasă, eritrocite, plasmă)
• conține ≈ 23% Fe2+
• structură multimerică - 24 subunități proteice ce înconjoară 3000 - 4500 ioni Fe2+
• nivelul fiziologic al feritinei circulante
- foarte scăzut, crește direct proporțional cu depozitele de Fe2+
→ Cel mai bun indicator pentru cantitatea de fier depozitată în organism
(rezerve de fier)
→ Creşte în reacţii de fază acută – rezultate false privind statusul fierului
→ Scade în anemii feriprive, hemoragii

12
 5/22/2019

Hemosiderina
• formă parțial degradată a feritinei
• solubilitate în apă redusă, eliberează Fe2+ mult mai greu
• vizibilă în microscopia optică prin colorația Perl (albastru de Prusia)
• prezentă în cantități crescute în condiții patologice – hemocromatoză

Hemocromatoza
• acumulare progresivă, excesivă de fier (for up to 50 g)
• depunere în parenchim hepatic, pancreatic, alte organe
→Acțiune toxică asupra comp. celulare prin formare de radical liberi
- peroxidare lipide membranare
- lezare ADN
- ↑ sinteza colagen
◊ Hemocromatoza dobândită
• aport excesiv (transfuzii repetate)
• utilizare ineficientă (anemie sideroblatică,
β-talasemie)
• afecț hepatice (ciroza alcoolică)

◊ Hemocromatoză ereditară
• mutații genice hepcidină

Terapie - flebotomie
- chelatori Fe2+ -desferoxamina

13
 5/22/2019

Silbernagl/Lang, Color Atlas of Pathophysiology © 2000 Thieme All rights reserved.

❹ Utilizare
• sinteză compuși heminici
non heminici
• transport, depozitare O2
• metabolism oxidativ
• proliferare și creștere celulară – ribonucleotid reductază
• activitate antioxidantă - catalaze, peroxidaze
• activitate pro-oxidantă benefică – mieloperoxidaza din neutrofile

❺ Excreție

• cca 0.5-1 mg / zi
• fecale (fier depozitat ca feritină prin descuamarea fiziologică a
celulelor epiteliale intestinale), urină, transpirație
• mai accelerată la femei (menstruație, lactație, sarcină)

14
 5/22/2019

Investigarea în laborator a metabolismului fierului

• Determinare sideremie
• Determinare transferină/ TIBC
• Determinare % saturație transferină - saturare <15% - deficit de Fe
- saturare >50% - încărcare cu Fe

• Dozare feritină serică

• Dozare protoporfirină IX din hematii - < 1μmol/L hematii
- creşte în deficit de Fe, porfirii

□ Diagnostic diferențial al anemiilor

□ Evaluarea anemiei feriprive, talasemiei, anemiei sideroblastice
□ Diagnostic supraîncărcari cu fier si hemocromatoze
□ Monitorizare pacienţi cu risc de deficit de fier: femei însărcinate,
donatori de sânge, copii mici, pacienţi hemodializaţi

15
 5/22/2019

Sideremie – conc. fierului seric

Interval de referință 90-140 g/100ml bărbați
80-120 g/100ml femei
Variați fiziologice
• sex, ritm circadian (valori mai scăzute seara cu 10-30%), vârstă, sarcină, ciclu
menstrual
Variații patologice
Hipersideremii Hiposideremii
• ↑ degradării eritrocitelor • aport deficitar
anemie hemolitică anemie feriprivă
• ↓ eritropoezei malabsorbție
anemie pernicioasă • ↑ eliminării
• ↑ eliberării din depozite hemoragii acute/cronice
afecțiuni hepatice acute (necroza) sarcină
• ↑ cantității absorbite • sechestrare Fe în cel sist.
hemocromatoza, hemosideroza reticuloendotelial
infecții, neoplasme,
artrită reumatoidă

Det. sideremie – metodă colorimetrică

pH=4.8
1. Transferină-Fe3+ + agent reducător (Acid ascorbic) Transferină + Fe2+
2. Fe + ferozină → complex colorat în roșu
2+

3. Determinare absorbție la 570 nm, proporțional cu conc. Fe în probă

Determinare transferină/ TIBC
◊ Direct – metodă imunoturbidimetrică
◊ Indirect - capacitate totală de legare pe transferină (TIBC)
1. Saturare transferină prin adaugare exces Fe3+ (FeCl3)
2. Precipitare exces Fe3+ cu MgCO3
3. Determinare Fe3+ în supernatant
Determinare % saturație transferină (fiziologic - 20 - 50%)
% saturație = (sideremie x 100)/ TIBC
Determinare feritină
• Met imunochimice (ELISA, chemiluminiscență, imunoturbidimetrie)
• Indicator al depozitelor de fier, modificări precoce in caz de deficit de fier
• Marker pentru hemocromatoză și hemosideroză
• Cel mai bun indice al depozitelor de Fe - normal – >12 μg/L
<12 μg/L – deficit de Fe

16
 5/22/2019

Determinarea sideremiei:

Material biologic: ser (vacutainer cu dop roşu cu sau fără gel)

separare de cheag în maxim 2 ore
Stabilitate – 7 zile la RT
- 3 săpt. la 2-8oC
- congelare la -20oC – câţiva ani
Calibrare – variabilă - cel puţin două controale de nivel diferit
- obligatoriu la schimbare reactiv
Control de calitate – zilnic (recomandat)
Interferenţe – Hb

Deficit de fier Intoxicaţie cu fier

- cauze variate – aport redus - cauze variate – transfuzii
- pierderi de sânge - nutriţie parenterală
în tubul digestiv - eritropoeză scăzută (IR)
- boli maligne - hemocromatoză
- parazitoze

3 stadii: Hipersideremie
a. Depleţie rezerve fier – feritină Feritină crescută – 500-5000 μg/L
scăzută TIBC scăzut
b.Eritropoeză deficitară – Hb % saturare > 70%
normal, proto IX crescut, TIBC
crescut, % saturare scăzut
c. Anemie feriprivă
– anemie microcitară, hipocromă
- Hb scăzută
- hiposideremie

17
 5/22/2019

Relație sideremie – TIBC - % saturație în condiții patologice

Patologie Sideremie TIBC Saturație%

Anemie feriprivă ↓↓ ↑↑ ↓↓
Anemie boli inflamatorii ↓/ ↓↓ ↓↓ ↓→
cronice/ maligne
Anemie hemolitică ↑ ↓ ↑

Anemie pernicioasă ↑ ↓ ↑↑

Hemoragii ↓ ↑→ ↓
Hemocromatoză ↑↑ ↓ ↑↑

Hepatite acute ↑ ↑→ ↑

18