Laborator #3

Evidentierea cromozomilor umani

 În celulele somatice umane existǎ 46 de cromozomi
care formeazǎ 23 de perechi

 Pentru evidenţierea cromozomilor umani se parcurg

trei etape:
1. obţinerea de celule în diviziune
2. oprirea diviziunilor în metafazǎ
3. obţinerea preparatelor microscopice
OBŢINEREA DE CELULE ÎN DIVIZIUNE

 Se poate realiza direct (maduva hematogena) si

indirect (cultura de celule)

 Metoda indirectǎ este mai des folositǎ, dintre care

cultura de limfocite este preferata deoarece dureazǎ
numai 3 zile şi poate fi stimulatǎ pentru a obţine un
indice mitotic crescut
Cultura de limfocite
Cultura de limfocite din sângele periferic se realizeazǎ în
3 timpi:
 recoltarea de sânge, prin puncţie venoasǎ;

 însǎmânţarea mediului de culturǎ;

 menţinerea la termostat la 37◦ C, timp de 72 de ore.

OPRIREA DIVIZIUNILOR ÎN METAFAZǍ
 Pentru oprirea diviziunilor în
metafazǎ, cel mai des este folositǎ
colchicina şi derivaţii sǎi.

 Dupǎ adǎugarea colchicinei,

cultura se va menţine în
Cochicina continuare la termostat timp de
douǎ ore.

 Colchicina va distruge fusul de

diviziune
OBŢINEREA PREPARATELOR MICROSCOPICE

1. Hipotonizarea - se adaugǎ peste sediment o soluţie

hipotonǎ (KCl 0,075 M) şi se introduce la termostat
pentru 20-30 de minute

2. Fixarea – se adaugǎ peste sediment un amestec

fixator din alcool etilic absolut şi acid acetic glacial,
în proporţie de 3:1, pentru 2-3 minute.
OBŢINEREA PREPARATELOR MICROSCOPICE

3. Etalarea – sedimentul se resuspendǎ în 1ml de fixator

proaspǎt şi cu ajutorul unei pipete, se dispune proba
pe o lamǎ portobiect

4. Colorarea – dacǎ dorim o colorare uniformǎ folosim

coloranţi bazici: soluţie Giemsa

5. Examinarea – iniţial se vor selecta cele mai bune

metafaze, care ulterior vor fi studiate cu un obiectiv
mai puternic
OBŢINEREA PREPARATELOR MICROSCOPICE
 Dispunerea sistematizatǎ a cromozomilor unei celule
somatice în perechi şi grupe de cromozomi, pe baza
criteriilor morfologice, în ordinea descrescǎtoare a
mǎrimii lor se numeşte cariotip.

 cazurile normale sunt necesare 2-3 cariotipuri

 în prezenţa anomaliilor de numǎr sau structurǎ sunt

necesare mai multe; cel puţin 2 cariotipuri pentru
fiecare linie celularǎ.
 Examinarea metafazelor
Aspect cromozomi in profaza, Cromozomi nebandati- metafaza
prometafaza si metafaza
 Examinarea metafazelor
Metafaza 1- bandare G Metafaza 2-bandare G
 Cariotipul
Cariotip 46,XX Cariotip 46,XY
 CRITERII DE IDENTIFICARE A CROMOZOMILOR
UMANI
1. Lungimea cromozomului, reprezentatǎ de:
 lungimea absolutǎ, exprimatǎ în microni,
 lungimea relativǎ (Lr), exprimatǎ în procente din
lungimea unui set haploid normal, în care gonozomul
este X.
 În funcţie de lungime cromozomii se împart în: mari,
mijlocii şi mici.
 CRITERII DE IDENTIFICARE A CROMOZOMILOR
UMANI
2. poziţia centromerului, se apreciazǎ prin indicele
centromeric (IC):

3. raportul dintre braţe (R):

În funcţie de IC şi R, cromozomii se împart în:

 Metacentrici(M)
 Submetacentrici (SM)
 Acrocentrici (A)
 CRITERII DE IDENTIFICARE A CROMOZOMILOR
UMANI
4. Sateliţi 5. Constrictii secundare
 CRITERII DE IDENTIFICARE A CROMOZOMILOR
UMANI
6. Situsurile fragile sunt
regiuni cromozomice la nivelul
cǎrora se produc mai frecvent
rupturi

Majoritatea situsurilor fragile

sunt considerate markeri
normali

Excepţie face un situs fragil

FRAXA situat pe braţul lung al
cromosomului X (Xq27), asociat
cu retard mintal (sindromul X
fragil)

Studii recente sugerează că Sagetile indica

unele situsuri ar putea avea un situsurile fragile la
rol în progresia tumorală: nivelul
rupturile în aceste situsuri cromozomilor
produc inactivarea unor gene
supresoare de tumori
CRITERII DE IDENTIFICARE A CROMOZOMILOR UMANI

7. Marcajul în benzi este o metodǎ de identificare a

perechilor de omologi, deoarece dupǎ tratarea chimicǎ
sau termicǎ a preparatelor microscopice, se pot
evidenţia de a lungul cromatidelor benzi, care au
aceeaşi dispoziţie pe cromozomii omologi.

 Existǎ douǎ categorii de benzi:

1. benzi care marcheazǎ întreg cromozomul
2. benzi care marcheazǎ anumite regiuni
Benzi care marcheaza intreg cromozomul

Benzi G Benzi R
Benzi care marcheaza intreg cromozomul

Comparatie intre bandare G si bandare R

Benzi care marcheaza intreg cromozomul

Metafaza- bandare Q Cariotip- bandare Q

Benzi care marcheaza anumite regiuni

Benzi C Benzi T
 Benzi care marcheaza anumite regiuni

Benzi NOR – corespunzǎtoare

regiunilor organizatorilor
nucleari

In imaginea alaturata se observa

detectia cromozomilor ce prezinta
NOR, (a) tehnica FISH, (b) bandare
DAPI