Schema diagnosticului virusologic

Nr.crt. BACTERIOLOGIE VIRUSOLOGIE PARAZITOLOGIE

METODE
DIRECTE
1 Recoltarea Diferita in functie de Diferita in functie Diferita in functie de
produsului pp recoltat de pp recoltat pp recoltat
patologic
2 Examenul 1. examen macroscopic 1. examen Examen
direct al macroscopic-nu coproparazitologic:
produsului 2. examen microscopic
patologic – microscopie optică 2. examen 1. examen macroscopic
o preparat nativ microscopic
o coloraţie negativă o evidenţierea 2. examen microscopic
o coloraţie simplă incluziilor o metode directe
o coloraţii compuse virale – preparat nativ, în
microscopie optică ser
3. evidenţierea o microscopie fiziologic
antigenelor bacteriene electronică preparat nativ în
prin metode serologice soluţie lugol
frotiu colorat
4. detectarea ADN-ului o metode de examinare
microbian (reacţii de 3. reacţii antigen- în strat gros
hibridizare, amplificare anticorp o metode de concentrare
genică – PCR) (evidenţierea o metode larvoscopice
antigenului) o amprenta anală

4. detectarea 3. detectarea ADN-ului

ADN-ului - reacţii - reacţii de
de hibridizare, hibridizare, amplificare
amplificare genică genică
(PCR) (PCR)
3 Cultivare Izolarea germenului în Cultivarea Cultivarea paraziţilor
cultură pură virusurilor  însămânţarea se
 însămânţarea si face
cultivarea pe  culturi pentru paraziţii
medii de celulare, unicelulari pe medii
cultură linii încălzite la 37°C, 1sau
 inoculare la celulare mai multe zile
animale de  animale de  animale de
laborator laborator laborator
 oul de
găină
embrionat
4 Identificare Identificarea Identificarea
germenului izolat din virusului izolat
cultură pură
1. cercetarea 1.prin examen
caracterelor de cultură microscopic
si morfotinctoriale

1
 2.cercetarea 2. modificările
caracterelor caracteristice
biochimice si de apărute pe
metabolism  culturile
celulare, 1.reacţii antigen-
 OGE anticorp
 animale de
experienţă
3.determinarea
structurii antigenice 3. reacţii antigen-
prin: anticorp
reacţii de 2. tehnici de detectare a
aglutinare ADN
reacţii de microbian
precipitare
reacţii de umflare a
capsulei 4. detectare a
ADN–ului -reacţii
4. tehnici de detectare a de hibridizare,
ADN amplificare genică
microbian (PCR)

5. Determinarea
patogenităţii
germenului izolat prin:
o teste in vitro
o teste in vivo (boala
experimentală)
5 Antibiograma DA
METODE
INDIRECTE
6 1. detectarea 1. detectarea 1. Detectarea
anticorpilor din serul anticorpilor din anticorpilor din serul
bolnavilor (anticorpii se serul bolnavilor bolnavilor
urmăresc în dinamică) o Seroconversia: o anticorpii se urmăresc
cresterea în
titrului de anticorpi dinamică
în probele de ser reacţii biologice
recoltate la interval cutanate de diagnostic
de 10-14 zile (IDR) - rar
o (demonstrarea
unei infecţii
recente, actuale

Microscopul cu fluorescentă

Piese importante ale acestui tip de microscop sunt sursa de radiaţii (de ex. o lampă care emite
radiaţii UV), setul de filtre (caloric, de excitaţie, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat Filtrul
caloric absoarbe radiaţii emise de lampă (sunt emise şi radiaţii UV şi radiaţii calorice). Filtrele de

2
excitaţie permit trecerea spre preparat a radiaţiilor cu lungime de undă mică (ex. UV). Sunt radiaţii de
excitaţie. Filtre de baraj asigură protecţia; nu permit trecerea radiaţiilor de excitaţie nocive spre ochiul
celui care examinează (lumina emisă de fluorocromi trece). Alegem filtrele (de excitaţie şi baraj) în
funcţie de fluorocromuî utilizat.
Condensatorul măreşte contrastul imaginii. In afară de piesele deja menţionate, mai sunt necesare
obiective acromate (obiectivul cu imersie trebuie să aibă diafragmă iris), lichidul de imersie care
trebuie să nu aibă fluorescentă (ex. glicerina tamponată neutră) şi lame cu grosimea de 1 milimetru.
Este recomandată utilizarea unui dispozitiv monocular.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescentă
Preparatele microscopice sunt tratate cu flurocromj (compuşi organici care după iradiere cu
radiaţii ultraviolete absorb radiaţia excitantă, intră în stare de excitaţie iar atunci când revin în starea
normală pierd energia acumulată şi emit radiaţii luminoase). Există mai mulţi fluorocromi, spre
exemplu auramina O, acridin-oranj R, rhodamina B, tripaflavina etc. Culoarea luminii emise depinde
de fluorocromuî (ex. culoarea este galbenă pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinaţia
de auramina O - rhodamina B etc).
Substanţele (fluorocromi) care se pot lega covalent de anticorpi, marcând complexe Ag-Ac
(complexe care devin astfel fluorescente) pot fi foarte utile în diagnosticul microbiologic, atât în prima
etapă (frotiu din p.p.) cât şi în identificare. Dacă marcajul se realizează cu izotiocianat de fluoresceină,
lumina emisă va avea culoare verde; dacă marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină, lumina emisă
va avea culoare portocalie.
Utilizarea microscopiei cu fluorescentă în diagnosticul microbiologic al tuberculozei, leprei, tusei
convulsive etc.

Cultivarea virusurilor pe culturi celulare

Virusurile pot fi izolate pe celule vii, receptive.

Cultura celulară: sistem biologic in vitro alcătuit din celule izolate vii, care îşi păstrează
capacitatea de multiplicare şi nu se organizează în ţesuturi.
Condiţii necesare pentru păstrarea în viaţă a celulelor din cultura celulară:
- condiţii aseptice
- mediu nutritiv (mediu de cultură lichid ce conţine substanţe nutritive, sursă de energie,
factori de creştere, vitamine, sistem tampon, indicator, antibiotice şi antifungice) –
mediile comercializate Eagle, Hanks, M199
- pH adecvat
- temperatură constantă
- atmosferă cu 10% CO2

3
În funcţie de provenienţa celulelor, culturile celulare se clasifică în:
- culturi de origine animală sau umană
- culturi de celule embrionare sau adulte
- culturi de celule normale sau tumorale

Culturile celulare primare sunt culturi realizate direct din ţesuturile sursă.
Liniile celulare stabilizate derivă din culturile primare, se menţin în viaţă timp nelimitat prin
subcultivări.

Realizarea culturilor primare din ţesuturi solide

- se prelevă ţesutul sursă în condiţii aseptice
3
- se fragmentează ţesutul în bucăţi de aprox. 1 mm , se spală cu soluţie salină tamponată
(SST) pentru îndepărtarea sângelui
- disocierea enzimatică a celulelor: tripsinizarea fragmentelor tisulare în soluţie de
tripsină 0,25% (enzimă proteolitică, desface legăturile peptidice) pe agitator magnetic
(ajută la desfacerea legăturilor intercelulare)

4
 - colectarea celulelor izolate în vas colector – se f ace prin filtrare pentru a obţine numai
celule izolate
- repetare tripsinizării pân ă la epuizarea ţesutului, în timpul tripsinizării vasul colector
se păstrează la temperatura de 4C pentru inactivarea tripsinei
- centrifugarea suspensiei de celule izolate, îndepărtarea supernatantului (tripsina),
spălare cu SST, în final suspendarea celulelor în mediu nutritiv
- controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan (se colorează
celulele moarte) – pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie să fie vii)
- numărarea celulelor, ajustarea lor la concentraţie de 300000 celule/ml, repartizare
volume egale în flacoane de culturi celulare
- incubare în poziţie culcată
- urmărirea formării culturii cu microscopul invers

Culturi provenite din celule:

- normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se multiplică pân ă acoperă peretele
flaconului, realizează o cultură monostrat (fenomenul inhibiţiei de contact)
- tumorale: se multiplică şi după acoperirea suprafeţei disponibile, cresc în mai multe
straturi şi în suspensie

Subcultivarea culturilor celulare

După 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizează substanţele nutritive, sursele de
energie, se acidifică mediul. Pentru menţinerea celulelor în viaţă, acestea trebuie pasate,
subcultivate. Se realizează prin versenizare:
- celulele se detaşează de pe peretele flaconului cu soluţie de EDTA (versen)
- se centrifughează
- se spală cu soluţie SST
- se resuspendează în mediu nutritiv
- se verifică viabilitatea celulelor, se numără celulele şi se ajustează la concentraţia
optimă. Se repartizează volume egale în flacoane de cultură celulară.

Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de câteva ori (4-
6) după care celulele mor (apoptoză)
Culturile realizate din ţesuturi embrionare pot fi subcultivate de mai multe ori (celule
nediferenţiate), de 60-80x, după care mor.
Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit. Aceste se obţin din ţesuturi tumorale
(HeLa, KB, Detroit, etc) sau din culturi celulare efectuate din ţesuturi normale care au suferit
transformare malignă spontană (Vero). Liniile celulare sunt bine caracterizate, se manevrează
5
uşor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.

Inocularea suspensiilor virale în culturile celulare, identificarea izolatelor virale

- se îndepărtează mediul nutritiv şi se introduce în flacon suspensia virală pregătită în

prealabil.
- după o incubare de 1 oră (penetrarea virusurilor în celulele receptive) suspensia se
decantează, se adaugă mediu de întreţinere (mai sărac în substanţe nutritive decât
mediul nutritiv, dar care permite supravieţuirea celulelor)
- se incubează
- în zilele următoare se urmăresc modificările survenite în cultura celulară.
Identificarea izolatelor se face prin metode nespecifice şi specifice.
Metode nespecifice:
 urmărirea efectelor citopatice (desprinderea celulelor de pe suprafaţa pereţilor, rotunjirea
celulelor, agregarea lor în ciorchine, formarea sinciţiilor)
· detectarea incluziilor virale
· hemadsorbţia – se folose şte la detectarea replicării virale în cazul în care virusul nu
produce efect citopatic (virusul ifluenza): membrana celulelor în care se replică
virusul are structura modificată, hematiile adăugate aderă de acestea
· interferenţa: se bazează pe faptul, că o celulă deja infectată cu un virus nu poate fi
infectată cu un alt virus – se folose şte pentru detectarea virusurilor neproducătoare de
ecp
· formarea plajelor
· transformarea spontană
· microscopia electronică
Metode specifice
· detectarea antigenelor virale prin reacţii antigen-anticorp
· detectarea acizilor nucleici virali – reac ţii de hibridizare, PCR

6
2. Izolarea virusurilor pe oul de găină embrionată

7
 Membrana proprie

Camera de aer Membrana

corioalantoideană

Embrion
Coaja oului

Cavitatea amniotică

Cavitatea alantoideană
Sacul vitelin

Inocularea virusurilor se poate face pe:

- membrana corioalantoideană
- cavitatea alantoideană sau amniotică
- sacul vitelin
- venele alantoidiene
- embrion

8
Inocularea pe membrana corioalantoideană
- la ovoscop se notează pe coajă poziţia camerei de aer şi zona unde membrana
corioalantoideană este cel mai bogat vascularizată
- se antiseptizează coaja în cele două locuri notate anterior
- se perforează cu un ac coaja în zona camerei de aer
- cu o freză se decupează un triunghi din coajă la nivelul membranei
- se perforează membrana proprie şi se aspiră aerul din camera de aer cu ajutorul unei
tetine din cauciuc (membrana proprie se dezlipeşte de membrana corioalantoideană)
- se îndepărtează porţiunea vizibilă din membrana proprie, evidenţiindu-se direct
membrana corioalantoideană
- se depune pe membrană produsul de inoculat cu o pipetă
- după inoculare se astupă orificiile create cu lamelă de sticlă şi parafină

4. Izolarea virusurilor în animale de laborator

La această metodă se recurge în momentul în care celelalte metode sunt
nesatisfăcătoare.
4

9
 Este necesară cunoaşterea metodelor de contenţie a animalelor
Înainte de inoculare animalele sunt marcate, dacă este necesar sunt
anesteziate
(intervenţii dureroase), iar locul inoculării se epilează şi se antiseptizează.
Inocularea se face prin diferite căi:
- intradermic
- subcutanat
- intramuscular
- intravenos
- intraperitoneal
- intranazal
- intracerebral

Suspensiile virale sunt inoculate prin injecţie, inhalare, ingestie, badijonare, etc…

Reacţia de imunofluorescenţă (RIF)

Fluorocromii:
- se leagă covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat
- emit fluorescenţă dacă se expun la raze UV
- izotiocianatul de fluoresceină (galben-verzui), rodamina (portocalie)
- nu sunt stabili în timp

1.1 Metoda directă

Preparatul de examinat se montează pe lamă. Se adaugă conjugatele. În cazul în
care se găsesc ag corespunzătoare anticorpilor marcaţi, se formează complexele imune.
Prin spălare se îndepărtează conjugatele nelegate. Preparatul se examinează la
microscopul cu fluorescenţă. Puncte fluorescente pe fond întunecat: în preparatul
examinat au fost prezente antigenele căutate (rezultat pozitiv).
Absenţa punctelor fluorescente: în preparat nu au fost prezente antigenele căutate
(rezultat negativ).

10
 antigen din preparatul montat pe lamă (preparat
histologic sau suspensie de pe culturi de celule
infectate)

anticorp marcat cu fluorocrom

1.2 Metoda indirectă

La preparatul montat pe lamă se adaugă anticorpi specifici nemarcaţi. . În cazul în
care există ag corespunzătoare anticorpilor, se formează complexele imune. Prin spălare
se îndepărtează ac nelegaţi. Se adaugă anticorpi antiglobulinici marcaţi cu fluorocrom.
Dacă există în preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline.
Examinarea: la fel ca la metoda directă.

anticorp antiglobulină marcat cu fluorocrom

anticorp specific antigenului căutat în preparat

Metoda imunoperoxidazică (IPO)

- marcare enzimatică – peroxidaz ă (descompune peroxidul); vizualizarea se realizează
prin adăugarea substratului cromogen – rezult ă un precipitat maroniu, insolubil,
vizibil la microscopul optic
- se realizează la fel ca şi RIF
- avantaje: - preparatele pot fi păstrate în timp

11
- nu este necesar microscop special
antigen din preparatul montat pe
lamă (preparat histologic sau
suspensie de pe culturi de celule
infectate)

anticorp marcat cu peroxidază

Metode imunoenzimatice (RIE, ELISA - enzyme-linked immunosorbent

assay)
Permit detectarea antigenelor libere şi a anticorpilor. Este posibilă determinare
cantitativă. La reacţii participă:
- un reactant imunologic cunoscut ataşat de un suport solid (plăci cu godeuri, lame,
baghete). Se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A)
- un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza
- substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare detectabilă
spectrofotometric (determinare cantitativă)
- substanţe pentru stoparea reacţiei (baze sau acizi puternici)
Reacţiile au loc în aparate automate, semiautomate.
Între reacţii – spălare cu soluţii tampon

12