Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Schema DGN Vir. Cultivarea Virusurilor
Schema DGN Vir. Cultivarea Virusurilor
1
2.cercetarea 2. modificările
caracterelor caracteristice
biochimice si de apărute pe
metabolism culturile
celulare, 1.reacţii antigen-
OGE anticorp
animale de
experienţă
3.determinarea
structurii antigenice 3. reacţii antigen-
prin: anticorp
reacţii de 2. tehnici de detectare a
aglutinare ADN
reacţii de microbian
precipitare
reacţii de umflare a
capsulei 4. detectare a
ADN–ului -reacţii
4. tehnici de detectare a de hibridizare,
ADN amplificare genică
microbian (PCR)
5. Determinarea
patogenităţii
germenului izolat prin:
o teste in vitro
o teste in vivo (boala
experimentală)
5 Antibiograma DA
METODE
INDIRECTE
6 1. detectarea 1. detectarea 1. Detectarea
anticorpilor din serul anticorpilor din anticorpilor din serul
bolnavilor (anticorpii se serul bolnavilor bolnavilor
urmăresc în dinamică) o Seroconversia: o anticorpii se urmăresc
cresterea în
titrului de anticorpi dinamică
în probele de ser reacţii biologice
recoltate la interval cutanate de diagnostic
de 10-14 zile (IDR) - rar
o (demonstrarea
unei infecţii
recente, actuale
Microscopul cu fluorescentă
Piese importante ale acestui tip de microscop sunt sursa de radiaţii (de ex. o lampă care emite
radiaţii UV), setul de filtre (caloric, de excitaţie, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat Filtrul
caloric absoarbe radiaţii emise de lampă (sunt emise şi radiaţii UV şi radiaţii calorice). Filtrele de
2
excitaţie permit trecerea spre preparat a radiaţiilor cu lungime de undă mică (ex. UV). Sunt radiaţii de
excitaţie. Filtre de baraj asigură protecţia; nu permit trecerea radiaţiilor de excitaţie nocive spre ochiul
celui care examinează (lumina emisă de fluorocromi trece). Alegem filtrele (de excitaţie şi baraj) în
funcţie de fluorocromuî utilizat.
Condensatorul măreşte contrastul imaginii. In afară de piesele deja menţionate, mai sunt necesare
obiective acromate (obiectivul cu imersie trebuie să aibă diafragmă iris), lichidul de imersie care
trebuie să nu aibă fluorescentă (ex. glicerina tamponată neutră) şi lame cu grosimea de 1 milimetru.
Este recomandată utilizarea unui dispozitiv monocular.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescentă
Preparatele microscopice sunt tratate cu flurocromj (compuşi organici care după iradiere cu
radiaţii ultraviolete absorb radiaţia excitantă, intră în stare de excitaţie iar atunci când revin în starea
normală pierd energia acumulată şi emit radiaţii luminoase). Există mai mulţi fluorocromi, spre
exemplu auramina O, acridin-oranj R, rhodamina B, tripaflavina etc. Culoarea luminii emise depinde
de fluorocromuî (ex. culoarea este galbenă pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinaţia
de auramina O - rhodamina B etc).
Substanţele (fluorocromi) care se pot lega covalent de anticorpi, marcând complexe Ag-Ac
(complexe care devin astfel fluorescente) pot fi foarte utile în diagnosticul microbiologic, atât în prima
etapă (frotiu din p.p.) cât şi în identificare. Dacă marcajul se realizează cu izotiocianat de fluoresceină,
lumina emisă va avea culoare verde; dacă marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină, lumina emisă
va avea culoare portocalie.
Utilizarea microscopiei cu fluorescentă în diagnosticul microbiologic al tuberculozei, leprei, tusei
convulsive etc.
3
În funcţie de provenienţa celulelor, culturile celulare se clasifică în:
- culturi de origine animală sau umană
- culturi de celule embrionare sau adulte
- culturi de celule normale sau tumorale
Culturile celulare primare sunt culturi realizate direct din ţesuturile sursă.
Liniile celulare stabilizate derivă din culturile primare, se menţin în viaţă timp nelimitat prin
subcultivări.
4
- colectarea celulelor izolate în vas colector – se f ace prin filtrare pentru a obţine numai
celule izolate
- repetare tripsinizării pân ă la epuizarea ţesutului, în timpul tripsinizării vasul colector
se păstrează la temperatura de 4C pentru inactivarea tripsinei
- centrifugarea suspensiei de celule izolate, îndepărtarea supernatantului (tripsina),
spălare cu SST, în final suspendarea celulelor în mediu nutritiv
- controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan (se colorează
celulele moarte) – pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie să fie vii)
- numărarea celulelor, ajustarea lor la concentraţie de 300000 celule/ml, repartizare
volume egale în flacoane de culturi celulare
- incubare în poziţie culcată
- urmărirea formării culturii cu microscopul invers
Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de câteva ori (4-
6) după care celulele mor (apoptoză)
Culturile realizate din ţesuturi embrionare pot fi subcultivate de mai multe ori (celule
nediferenţiate), de 60-80x, după care mor.
Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit. Aceste se obţin din ţesuturi tumorale
(HeLa, KB, Detroit, etc) sau din culturi celulare efectuate din ţesuturi normale care au suferit
transformare malignă spontană (Vero). Liniile celulare sunt bine caracterizate, se manevrează
5
uşor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.
6
2. Izolarea virusurilor pe oul de găină embrionată
7
Membrana proprie
Embrion
Coaja oului
Cavitatea amniotică
Cavitatea alantoideană
Sacul vitelin
8
Inocularea pe membrana corioalantoideană
- la ovoscop se notează pe coajă poziţia camerei de aer şi zona unde membrana
corioalantoideană este cel mai bogat vascularizată
- se antiseptizează coaja în cele două locuri notate anterior
- se perforează cu un ac coaja în zona camerei de aer
- cu o freză se decupează un triunghi din coajă la nivelul membranei
- se perforează membrana proprie şi se aspiră aerul din camera de aer cu ajutorul unei
tetine din cauciuc (membrana proprie se dezlipeşte de membrana corioalantoideană)
- se îndepărtează porţiunea vizibilă din membrana proprie, evidenţiindu-se direct
membrana corioalantoideană
- se depune pe membrană produsul de inoculat cu o pipetă
- după inoculare se astupă orificiile create cu lamelă de sticlă şi parafină
9
Este necesară cunoaşterea metodelor de contenţie a animalelor
Înainte de inoculare animalele sunt marcate, dacă este necesar sunt
anesteziate
(intervenţii dureroase), iar locul inoculării se epilează şi se antiseptizează.
Inocularea se face prin diferite căi:
- intradermic
- subcutanat
- intramuscular
- intravenos
- intraperitoneal
- intranazal
- intracerebral
Suspensiile virale sunt inoculate prin injecţie, inhalare, ingestie, badijonare, etc…
10
antigen din preparatul montat pe lamă (preparat
histologic sau suspensie de pe culturi de celule
infectate)
11
- nu este necesar microscop special
antigen din preparatul montat pe
lamă (preparat histologic sau
suspensie de pe culturi de celule
infectate)
12