UNIVERSIATEA DE VEST DIN TIMIȘOARA

FACULTATEA DE CHIMIE, BIOLOGIE, GEOGRAFIE

ENZIMOLOGIE
RAPORT DE LABORATOR

Marian Gheorghe

Biochimie

Anul III

Grupa 2
 Laborator 1

Metoda Lowry de determinare a proteinelor

Enzimele sunt proteine, iar aminoacizii pot reduce molibdații reactivului Folin-Ciocâlteu.
Concentrația lor dintr-o soluție poate fi determinată citind extincția produșilor de reacție.

Reactivi:

- R. Folin-Ciocâlteu
- Soluție 4 g NaOH + 10 g Na2CO3 + 0.2 g dublu tartrat de Na și K (adusă la 1 L apă
distilată)
- Soluție CuSO4 0.5% 100 mL
- Reactiv alcalin de Cu
- albumină serică bovină (1mg/mL) - BSA
- Soluție amilază

Se face soluție BSA și se adaugă reactivii corespunzător. După 30 min la temperatura

camerei și se citește extincția la 660 nm. Se citește și pt. martor, care în loc de BSA conține apă
distilată.

Nr crt BSA H2O (mL) A1 A2 Amediu Amediu-

Amartor
Martor - 0.200 0.08 0.076
1 0.020 0.180 0.145 0.141
2 0.040 0.160 0.183 0.204
3 0.060 0.140 0.244 0.241
4 0.080 0.120 0.26 0.271
5 0.100 0.100 0.310 0.320
6 0.120 0.80 0.358 0.389
7 0.140 0.60 0.396 0.410
8 0.160 0.40 0.473 0.450
9 0.180 0.20 0.518 0.556
10 0.200 - 0.598 0.618
 0.6

0.5
f(x) = 0.49 x + 0
R² = 0.99
0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Absorbanțele:

P1 = 0.516
P2 = 0.516
M1= 0.034
M2 = 0.034

Concentrația ambelor probe se calculează după ecuația dreptei:

y = ax + b

Înlocuind în formulă valorile citite, se obține:

0.276 = 0.493x + 0.004 deci x = y – b / a = 0.551

Conținutul în proteine:

p = c x f iar c = 0.551 x 5 = 2.755

 Laborator 2

Metoda de dozare a activității alfa-amilazice cu iod

Amilaza scindează amidonul în dextrine și zaharuri reducătoare. Iodul, cu amidonul

rămas formează un compus albastru.
Citirea se face la 595 nm. Activitatea amilazei rezultă din scăderea cantității reziduale
din cantitatea inițială de amidon.

Reactivi:

- amidon 1%
- tampon citrat-fosfat 0.15 M, pH 4.6
- iod/iodura M/1000
- soluție de amilază

Aparatură

- termostat
- spectrofotometru

1) Curba de etalonare

Se pipetează în 10 eprobete cantități de substrat (0.5, 0.45...0.05) și se aduce la 1 mL cu

tampon citrat fosfat 0.15 M, pH 4.6. Se adaugă 5mL iod-iodură M/1000 și 10 mL apă distilată.
Se spectrofotometrează la 595 nm.

Vol. amidon Vol. tampon Absorbanta

E1 0,5 0,5 0,019
E2 0,45 0,55 0,177
E3 0,4 0,6 0,268
E4 0,35 0,65 0,341
E5 0,3 0,7 0,425
E6 0,25 0,75 0,415
E7 0,2 0,8 0,576
E8 0,15 0,85 0,640
E9 0,1 0,9 0,735
E10 0,05 0,95 0,781
P1 0,332
P2 0,149
M1 0,729
M2 0,750
 Chart Title
0.900
0.800
f(x) = 0.15 x + 0.03
0.700 R² = 1
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

Absorbanțele medii:

Am = 0.332
Mp = 0.7395

A = (0,7395 – 0,332) x 1000 = 551, 048

Laborator 3

Influența temperaturii asupra activității enzimatice

Din scindarea enzimatică a cazeinei rezultă produși de hidroliză solubili în acid

tricloracetic. Conținutul lor în tirozină și triptofan se poate determina spectrofotometric în soluție
alcalină.

Reactivi:

- cazeină 2%, pH 10
- NaOH 0.5 M
- TCA 5%
- Reactiv Folin-Ciocâlteu
- Tampon fosfat 0,05 M pH 8
- HCl 0.2 N
- L(-) – tirozină 1mM
 Se pipetează în 11 eprubete 0, 40, 80...400 microlitri soluție tirozină 1 mM. Se
completează până la 2 mL cu HCl 0.2 N.
Se adaugă câte 4 mL NaOH 0.5 N apoi 1.2 mL reactiv F-Ciolcâlteu, sub agitare.
După 20 de min la temperatura camerei, se citește la 578 nm.

Reacția de colorare

Se pipetează:

- 1mL filtrat
- 1 mL soluție HCl 0,2 N
- 4 mL soluție NaOH 0,5 N
- 1,2 mL F-Ciocâlteu cu apă 1:2

După 20 min la temperatura camerei, se citește la 578 nm.

Curba de etalonare pentru tirozină

0.400
f(x) = 0.01 x − 0.1
0.350 R² = 0.98

0.300

0.250

0.200
Linear ()
0.150

0.100

0.050

0.000
20 30 40 50 60 70 80

Influența temperaturii asupra activității enzimatice

Abs P1 P2 M1 M2 Pmed Mmed Y X
25º 0,051 0,062 0,051 0,036 0,057 0,044 0,013 -0,022
37º 0,14 0,141 0,02 0,02 0,141 0,02 0,121 0,021
50º 0,311 0,216 0,024 0,016 0,264 0,02 0,244 0,072
60º 0,311 0,317 0,035 0,027 0,314 0,031 0,283 0,089
75º 0,413 0,361 0,039 - 0,337 0,039 0,348 0,115

0,244 = 2.4147x + 0,681, deci x = 0.181

 Laboratorul 4

Cinetică enzimatică

Activitatea enzimelor crește odată cu concentrația de substrat, până la un anumit punct de

saturare.

Catalizarea are loc în 2 pași, respectiv formarea complexului enzimă-substrat, apoi

eliberarea produșilor de reacție.

Reactivi:

- amidon Zulkovsky 1% se aduce la 100 mL cu apă distilată

- Tampon citrat fosfat 0.15 M, pH 4.6
- Soluție iod/iodură M/1000
- Soluție alfa-amilază, diluție 1/500

Calculul cineticilor

Concentrația soluției de amidon.................x mg/mL (Cf)

1000 mg......................................................100 mL

Ci x Vi = Cf x Vf, deci Cf = Ci x Vi / Vf

C1. Ci x Vi / Vf deci Cf = 10 x 14 / 20 = 7 mg/mL

C2. Ci x Vi / Vf deci Cf = 6 mg/mL

C3. Ci x Vi / Vf deci Cf = 5 mg/mL

C4. Ci x Vi / Vf deci Cf = 4 mg/mL

C5. Ci x Vi / Vf deci Cf = 3.5 mg/mL

C6. Ci x Vi / Vf deci Cf = 3 mg/mL

C7. Ci x Vi / Vf deci Cf = 2.5 mg/mL

C8. Ci x Vi / Vf deci Cf = 2 mg/mL

 Laboratorul 5

Entraparea glucoamilazei în gel de alginat

Reactivi

- Soluție alginat de sodiu 2%

- Soluție CaCl2 1.5%
- Soluție AMG diluată cu soluție citrat-fosfat pH 4.6 0.15 M)

2 mL soluție alginat de sodiu 2% se amestecă sub agitare magnetică ușoară cu 0.5 mL

AMG diluat. Se pipetează 30 mL soluție CaCl2 1.5%.

Masa totală a biluțelor de alginat = 0.2597 g

Mb1 = 0.115 g
Mb2 = 0.0117 g

A1 = 0.605
A2 = 0.585 Am = 0.595
I1 = 0.668
I2 = 0.674
M1 = 0.962
M2 = 0.990 Mm = 0.976

Am = (0.976 – 0.595) / 0.976 x 5 x 1000/5 = 390.36 mg amidon/mL enz. x min

Ai1 = (0.976 – 0.668) / 0.976 x 5 x 1 / 5 x 0.0115 = 27.439 mg amidon/mL enz x min

Ai2 = (0.976 – 0.674) / 0.976 x 5 x 1 / 5 x 0.117 = 2.644 mg amidon/mL enz x min
Ai1 + Ai2 / 2 = 15.041

Randmentul de imobilizare = (15.041 x 0.2597 / 390.36 x 0.05) x 100 = 1