4.5.4. Alte biotehnologii conexe transferului de embrioni.

Pe baza noutăţilor ştiinţifice oferite de biologia celulară şi

moleculară a ultimilor 20 de ani, speculaţia predicţiei a ceea ce se va
întâmpla în secolul următor în domeniul biotehnologiilor aplicate în
reproducţia animală, pare a fi o mare îndrăzneală. Astfel, cu ocazia celui
de-al 7-lea Colocviu Ştiinţific al Asociaţiei Europene de Transfer
Embrionar, POLGE (1991) a prezentat o lucrare de sinteză în acest
sens, apreciind că extinderea biotehnologiilor conexe transferului de
embrioni este, nu numai utilă, ci şi oportună, atât pentru elucidarea unor
probleme încă insufîcient cunoscute, cât şi sub aspectul lor economic,
intrinsec.
În studiu se apreciază că direcţiile prioritare în care aceste
biotehnologii îşi găsesc materializarea practică sunt: a) fecundaţia in
vitro (FIV); b) crioconservarea gameţilor şi embrionilor; c)
micromanipularea gameţilor şi embrionilor.
Întrucât problematica fecundaţiei in vitro şi cea a crioconservării
gameţilor şi embrionilor a constituit subiectul unor subcapitole
precedente, în cele ce urmează vom trece pe scurt în revistă realizările
din domeniul micromanipulării acestor entităţi biologice şi implicaţiile
acestuia în practica zootehnică.

4.5.4.1. Separarea spermatozoizilor purtători de cromosom Ysau X

Rezultatele consistente din domeniul separării populaţiilor de
spermatozoizi proveniţi de la masculii animalelor domestice şi purtători
de cromosom Y sau X, sunt de dată destul de recentă (JOHNSON şi
colab.,1989; JOHNSON, 1991). Totuşi, acestea au fost luate în
considerare, întrucât există deja date încurajatoare în ceea ce priveşte
rata fertilităţii, ca urmare a inseminării.

108
 Procesul separării spermatozoizilor Y şi X se bazează, în principiu,
pe diferenţele dintre aceştia cu privire la cantitatea totală de ADN pe
care cei doi cromosomi o deţin. Dificultatea separării spermatozoizilor
unor anumite specii, cum este cazul suinelor, se datorează faptului că
această diferenţă de conţinut ADN nu depăşeşte 3,4 - 3,6 %, aspect ce
se repercutează negativ asupra preciziei separării, care nu depăşeşte 30
- 60 % (JOHNSON, 1992). Totuşi, la celelalte specii, tehnicile de
separare a spermatozoizilor purtători de cromosom X sau Y, au condus
la rezultate promiţătoare.
Cele mai cunoscute metode de separare a spermatozoizilor în
funcţie de cromosomul pe care îl poartă sunt: citometria în flux,
electroforeza, tehnica TLCCD (Thin - layer countercurrent distribution ==
distribuţie contra curent în strat subţire); centrifugarea; tehnici
imunologice şi migrarea în substanţe albuminoase (Figura 20.)
Unul dintre marile neajunsuri ale metodologiei amintite este viteza
de separare scăzută (în medie 400000 celule spermatice / oră), care nu
permite producerea pe scarâ largâ a dozelor destinate inseminărn via
cervix.

Figura 20. Clasificarea metodelor de separare a spemiatozoizilor X şi Y

109
Figura 21. Separarea spermatozoizilor prin metoda citometriei în flux

Din acest considerent, la unele specii, inseminarea cu

spermatozoizi separaţi se realizează intraoviductal, prin tehnici
chirurgicale uzuale, însă rata concepţiei este cu ceva mai scăzută.
Datorită vitezei scăzute a procesului de separare a
spermatozoizilor Y şi X este practic exclusă utilizarea pe scară largă a
unor doze astfel condiţionate. Totuşi, ele ar putea dobândi o valoare
aparte dacă materialul spermatic, astfel prelucrat, ar fi dirijat spre
programele de producere in vitro a embrionilor.
Din punctul de vedere al eficienţei se pare că metoda citometriei în
flux este cea mai atractivă, însă costurile pe care aceasta le implică prin
aparatura necesară determină o fezabilitate economică limitată (Figura
21.).

110
4.5.4.2. Sexarea embrionilor
Stabilirea timpurie a sexului embrionar a devenit posibilă datorită
progreselor deosebite înregistrate în domeniile citogeneticii şi a geneticii
moleculare.
După cum se ştie, sexul genetic al individului se stabileşte odată cu
încheierea fecundaţiei, prin alăturarea, în embrionul nou format,
cromosomului X, prezent în ovocită, cromosomilor X sau Y, prezenţi în
spermatozoid.
În general, în vederea diagnosticării sexului se operează pe
embrionii aflaţi în stadiile de morulă sau blastocist, deoarece sunt mai
toleranţi la micromanipulare, prin aplicarea mai multor categorii de
metode şi anume: citogenetice; imiaiologice; enzimatice şi moleculare
(Figura 22.)

Figura 22. Principalele metode pentru determinarea sexului embrionar.

Metodele citogenetice
Metodele citogenetice de sexare a embrionilor, presupun analiza
cariotipului celulelor trofoblastice aflate în metafază, prelevate de la
embrion de 11-14 zile. Metoda şi-a dovedit eficacitatea prin rezultatele
comunicate de către HARE şi colab. (1976), care au obţinut primul viţel

111
dintr-un embrion sexat la 13 zile după fecundaţie. Ulterior SINGH şi
HARE (1980), au aplicat acelaşi procedeu pe embrioni în vârstă de 6-8
zile, mai uşor de obţinut şi care pot fi ulterior crioconservaţi. Totuşi, prima
reuşită privitoare la sexarea embrionilor datează din 1968, când
GARDNER şi EDWARDS au raportat transferul unor blastocişti sexaţi de
iepure.
Marele neajuns al metodelor citogenetice de sexare constă în
caracterul lor invaziv, necesitând prelevarea unor celule embrionare prin
microchirurgie. De asemenea, complexitatea tehnicii şi durata analizei,
face procedeul puţin aplicabil în practică, mai ales că rata gestaţiei
obţinută consecutiv transferului embrionilor sexaţi, arareori depăşeşte
30%.
Acelaşi obiectiv al determinării sexului embrionar poate fî atins şi
prin aplicarea unor tehnici de evidenţiere a cromatinei sexuale,
cunoscută ca şi corpusculul Barr.
După cum se cunoaşte, cromatina sexuală rezultă din inactivarea
unui cromosom X la femele, însă nu la nivelul tuturor celulelor. Din acest
motiv, evidenţierea corpusculului Barr în celulele embrionare are o
efîcienţă limitată.

Metodele imunologice
Metodele imunologice de sexare a embriomlor se bazează pe
identificarea la suprafaţa celulelor mascule a unui antigen de
histocompatibilitate, numit Ag H-Y (EICHWALD şi SILMSER, 1955).
Pomind de la acest principiu, WHITE şi colab., (1984), au descris o
tehnică de imunofluorescenţă indirectă pentru identificarea embrionilor
bovini masculi, iar WAGNER şi HOPPE (1982), utilizând anticorpi
monoclonali anti H-Y, au ajuns la rezultate similare, amplificând precizia
sexării la peste 85 %.

112
 În principiu, aceste metode presupun punerea în evidenţă a
antigenului H-Y, prin utilizarea unui anticorp specifîc masculilor care,
adiţionat mediilor de cultură determină stoparea dezvoltării embrionilor
masculi. După îndepărtarea lui, aceştia îşi reiau dezvoltarea, embrionii
femeli nefiind afectaţi de această reacţie.
Varianta de sexare ce implică folosirea anticorpilor monoclonali anti
H-Y, constă în evidenţierea antigenului specific masculilor prin
imunofluorescenţă.
În ciuda faptului că sunt metode neinvazive s-a constatat că
aplicarea lor conduce la rate scăzute ale gestaţiei consecutiv transferului
embrionilor sexaţi.

Metodele enzimologice
Metodele enzimologice de sexare a embnonilor se bazează pe
cercetările lui (RIEGER, 1984), care constată că unele enzime celulare
sunt codificate de către gene de pe cromozomul X. În consecinţă,
cantitatea acestor enzime este de două ori mai mare în celulele femele,
decât în cele mascule, fapt ce dovedeşte că enzimele respective sunt X -
linkate. Astfel, dozarea activităţii unor enzime ca hipoxantin guanin
fosforibozil transferaza (HGPRT), alfa galactozidaza, (a-gal), adenozil
fosforibozil transferaza (APRT), fosforibozil pirofosfat (PRPP) şi ß-
hexozaminidaza, din blastomere izolate, a permis sexarea embrionilor la
un grad avansat de siguranţă. De asemenea, printr-o tehnică
colorimetrică s-a dozat enzima glucozo - 6 - fosfat dehidrogenaza,
constatându-se că şi aceasta poate servi ca indiciu de detenninare a
sexului embrionar la animale.
Avantajul major al acestei categorii de metode este acelaşi caracter
neinvaziv, deci inofensiv faţă de embrion. Cu toate acestea, în ciuda

113
optimismului manifestat, metodele enzimologice au rămas în umbră, în
special datorită apariţiei şi diversificării metodelor geneticii moleculare.

Metodele moieculare
Determinarea sexului embrionar la nivel molecular depinde de
capacitatea evidenţierii, prin diferite metode, a unor secvenţe ADN
specifice cromosomului Y. Cercetările efectuate de BISHOP şi colab.
(1983) au demonstrat posibilitatea clonării şi secvenţializării unor
fragmente ale cromosomului Y uman.
Aplicând metoda hibridizării in situ, o serie de cercetători au reuşit
sexarea embrionilor bovini, prin marcarea radioactivă a unor secvenţe
nucleotidice, în experimente de hibridizare.
La ora actuală, cea mai răspândită metodă de determinare a sexului
embrionar rămâne tehnica de amplificare în lanţ, cunoscută ca tehnica
PCR, la care se adaugâ RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphisrn). Siguranţa acestor tehnici depăşeşte 95 % reuşindu-se
obţinerea, pomind de la embrioni astfel sexaţi, a unei rate a gestaţiei de
peste 40 % (LEONARD şi colab., 1987).
Totuşi, cu toate rezultatele încurajatoare, aplicarea în condiţii de
fermă a sexării nu şi-a găsit încă pe deplin materializarea.

4.5.4.3. Micromanipularea embrionară

Biotehnologiile cu aplicabilitate în reproducţia mamiferelor au creat
posibilitatea obţinerii de ovocite şi embrioni în stadii ale dezvoltării dorite,
ce constituie materia primă pentru orice tip de micromanipulare, fie ea
chiar şi genetică. Apariţia şi perfecţionarea continuă a
micromanipulatoarelor a permis efectuarea unei mari varietăţi de

114
operaţiuni de microchirurgie la nivel de gameţi şi embrioni cum ar fî
secţionarea embrionară, extracţii de celule embrionare, pronuclei,
fragmente de nuclei şi altele.
Prin deschiderea acestor posibilităţi, aplicarea metodelor de
inginerie genetică cum ar fi transferul de gene, de nuclei diploizi sau
clonarea au devenit realităţi incontestabile.

Secţionarea embrionilor în vederea producerii gemenilor

homozigoţi

Obţinerea, la ora actuală, a gemenilor genetic identici este posibilă

prin aplicarea unei game variate de tehnici. Dintre acestea, utilizarea
blastomerelor individuale sau a grupelor de blastomere este prima
metodă cercetată şi larg utilizată la toate speciile (Figura 23)
Reuşita acestor demersuri pomeşte de la premisa că blastomerele
individuale sunt capabile să se dividă şi chiar să se dezvolte normal,
formând un nou embrion, în condiţiile unei culturi in vitro adecvată. Acest
fapt a fost demonstrat la şobolan (NICHOLAS şi HALL, 1942), la iepure
(SEIDEL, 1952), la şoarece (TARKOWSKI 1959) iar mai recent la ovine
(WTLLADSEN 1979, 1980) şi la bovine (WILLADSEN, 1981).

115
 Figura 23 Producerea gemenilor identici prin secţionare embrionară

Tehnica pusă la punct de WILLADSEN cuprinde separarea

blastomerelor, în stadiul embrionar de 2 - 8 celule şi transferul acestora
în zone pellucida ovocitare din care ovoplasma a fost îndepărtată.
Embrionii nou reconstituiţi sunt împachetaţi în agar, apoi introduşi pentru
o perioadă de 48 - 72 de ore în oviduct ovin ligaturat, în vederea
refacerii. UIterior, aceştia sunt recuperaţi, examinaţi morfologic şi
transferaţi la femele receptoare.
O altă tehnică similară, larg utilizată în practică, presupune
secţionarea embrionului aflat în stadiu de morulă sau blastocist timpuriu
(HAHN, 1980). Avantajele acestei tehnici constau, pe de o parte în faptul
că se lucrează pe embrioni recoltaţi nechirurgical, şi în faptul că
manopera propriu-zisă de secţionare este mai simplă, necesitând un
echipament mai puţin sofîsticat, deci mai ieftin.
Toţi aceşti semi-embrioni pot fî cultivaţi până la stadiul de blastocist
şi apoi congelaţi, ceea ce permite producerea de produşi identici, dar cu
vârste diferite, în funcţie de momentul transferului lor la femelele
receptoare.

116
 Producerea de chimere animale
Chimerele animale sunt, după cum se ştie, organisme rezultate din
comasarea unor blastomere provenite de la doi sau mai mulţi embrioni
proveniţi de la aceeaşi sau, de la specii diferite.
La ora actuală se recunoaşte posibilitatea existenţei a două tipuri
de chimere şi anume chimerele naturale şi cele artificiale.
Chimerele naturale pot apare întâmplător, în cadrul procesului de
reproducţie sexuată, în timp ce chimerele artificiale sunt produse de
către om prin tehnici de laborator adecvate.
Primele chimere artifîciale au fost obţinute de călre TARKOWSKI
(1961) la şoarece.
În ceea ce priveşte metodologia, se cunosc două forme de obţinere
a chimerelor: prin comasare şi prin injectare de blastomere.
Chimerele obţinute prin comasarea blastomerelor sau a jumătăţilor
de embrion heterologe, au primit denumirea de chimere de sinteză.
Chimerele de injecţie se obţin prin injectarea blastomerelor unui embrion
în embrioblastul altuia.
Chimere de sinteză au fost obţinute la taurine (BREM şi colab.,
1984) şi şoarece (TARKOWSKI şi colab., 1961), iar chimere de injectare
la şoarece (GARDNER 1968, 1978), iepure (GARDNER, 1974) şi oaie
(TUCKER şi colab., 1974).
Perfecţionarea metodelor de producere a chimerelor animale a
permis anularea limitelor naturale dintre specii. Un astfel de exemplu îl
constituie comasarea blastomerelor ovine şi caprine, rezultând produsul
denumit "caproid", o chimeră interspecifîcă.

Clonarea la mamifere
Prin clonarea organismelor se înţelege totalitatea procedeelor ce
permit obţinerea reproductibilă a unui număr mare de "copii genetice" a

117
unor organisme cu însuşiri cunoscute. În realizarea acestor organisme,
identice genetic, s-a pornit de la ipoteza că, dacă patrimoniul genetic al
unei celule somatice cuprinde totalitatea genelor organismului, atunci o
grefă de nucleu diploid din aceste celule, într-un zigot, trebuie să permită
regenerarea unui individ complet. Pentru a testa această ipoteză,
BRIGGS şi KING (1952) au efectuat primele grefe de nucleu, aparţinând
unor celule somatice de broască (Rana Pipiens), în zigot enucleat
obţinând produşi vii.
Cu toate că primele modificări genetice la mamifere au fost
raportate în urmă cu peste 10 ani, evoluţia acestor cercetări ar putea fi
accelerată numai cu condiţia dispunerii de un număr foarte mare de
embrioni, fapt posibil de realizat prin perfecţionarea programelor de
producere în vitro a acestora (HAMMER şi colab., 1985; MILLER şi
colab, 1986).
Mult mai multe date s-au acumulat în domeniul multiplicării în vitro
a embrionilor, respectiv clonarea acestora (PRATHER şi FIRST, 1990).
Manopera de clonare embrionară se realizează la ora actuală prin două
metode de bază şi anume: prin secţionare sau prin transfer de nuclei
blastocitari.
Eficienţa multiplicării, sau clonării, prin secţionarea mecanică a
embrionilor, aflaţi în stadiul de morulă sau blastocist, este limitaţă
datorită numărului redus de fragmente embrionare care pot efectiv să
redevină embrioni integri în urma cultivării în vitro. Obţinerea unei clone
prin această tehnică, presupune transferul fiecărui fragment embrionar
într-un ovocit enucleat sau zona pellucida receptoare unde, acesta va
reveni la forma iniţială (WILLADSEN, 1982). Din aceste considerente,
operaţiunea de clonare se realizează în principal prin transfer de nuclei,
metoda asigurând obţinerea, cel puţin teoretic, a unui număr nelimitat de
clone, deci de viitori produşi, identici din punct de vedere genetic.

118
 Cea mai recentă şi mai mediatizată acţiune de acest gen a fost
obţinerea în 1997, de către colectivul coordonat de Willmut, a clonei
Dolly, oaia provenitâ din transferul unei celule somatice într-un ovocit
enucleat. Acest eveniment a produs o vie preocupare socială datorită
faptului că a permis ulterior producerea unor clone la o specie de
maimuţe apropiate fîlogenetic de om.
Motivaţia continuării cercetărilor în acest domeniu este ancoratăâ în
studiul mecanismelor fundamentale implicate în acest demers, dar şi în
raţionamente economice, întrucât este cunoscută importanţa diferitelor
specii de mamifere ca sursă de organe destinate medicinii umane.

Transferul de gene
Progresele recente ale ingineriei genetice şi microchirurgiei
embrionare, au condus la identificarea unor posibilităţi de obţinere a
organismelor modificate genetic (OMG) prin inserarea în genomul
embrionar a unor gene sau grupe de gene, ce codifică anumite însuşiri
morfoproductive.
Stadiul optim pentru inserarea genelor străine pare a fi cel zigotal,
datorită exprimării maxime a genelor transferate chiar şi la nivelul liniei
germinale.
Principalele metode de producere a organismelor modificate genetic
sunt: injectarea directă de AND în pronucleii zigotali, vezicula germinală
ovoplasmatică sau chiar în ovoplasmă; tehnica vectorilor retrovirali sau
spermatici şi tehnica ce presupune utilizarea aşa numitului "tun de
particule" (Figura 24). În fine, o tehnică aplicată recent, deocamdată
numai la şoareci, presupune utilizarea ca vectori a celulelor embrionare
carcinomatoase.
Microinjecţia de ADN la nivelul diferitelor structuri ovocitare sau
embrionare reprezintă la ora actuală cel mai eficient procedeu de
transfer al genelor (Figura 25). Pe această cale, până la ora actuală s-au

119
obţinut modificarea genetică la iepuri, oaie, porc şi bovine (HAMMER şi
colab. 1985, BREM şi colab. 1985, CHURCH şi colab. 1986, WARD şi
colab. 1986).

Figura 24 Principalele metode de producere a animalelor 'transgenice''

Figura 25. Transferul de gene prin microinjectarea pronucleară

120
 Tehnica obţinerii organismelor modificate genetic prin intermediul
vectorilor retrovirali, descrisă prima dată de JAENISCH (1976), se
foloseşte de ADN-ul acestora, ca mijloc de incorporare primară şi apoi
de transfer a genelor dorite spre celulele ţintă, ce se doresc a fi
modificate genetic.
Avantajele oferite de către vectorii retrovirali constau în obţinerea
unui procent mai mare de celule care integrează virusul şi exprimă
ulterior gena transferată, fără ca infecţia provocată de acesta să afecteze
celula gazdă.
Toate aceste tehnici, dintre care multe par desprinse din literatura
science fiction, îşi găsesc, pe zi ce trece, o tot mai largă aplicabilitate.
Totuşi, în ciuda optimismului cercetătorilor, evoluţia lor va depinde, sine
qua non, de un element simplu şi anume: acceptarea din partea
publicului larg. Din păcate, la această oră se constată manifestarea unei
reticenţe qvasi unanime, motivată parţial de insuficienta informare, dar şi
de o serie de aspecte etice pe care acest domeniu le incumbă şi care, nu
au fost încă lămurite pe deplin.

121