Sunteți pe pagina 1din 50

Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti

Facultatea De Inginerie Medicală

Nanomateriale generatoare de
oxigen pentru tratamentul diabetului

Student: Cunțan Georgian


Conducător Științific: Șl. Dr. Ing. Ionela Andreea Neacșu

București
Ianuarie 2021
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

CUPRINS
Introducere..............................................................................................................2

DIABET ZAHARAT....................................................................................................4

Problematica abordată.....................................................................................................4

Ingineria tisulară...............................................................................................................5

NANOBIOMATERIALE GENERATOARE DE OXIGEN....................................................7

Proprietați........................................................................................................................7

Peroxizi anorganici solizi...................................................................................................7

Peroxid de hidrogen (H2O2)..............................................................................................8

Materiale fluorurate.........................................................................................................9

Metode de sinteză CaO2 prin precipitarea din soluție.....................................................11

Metoda de sinteză PCL-F-CaO2 prin metoda electrospray................................................15

Nanobiomateriale generatoare de oxigen în terapia diabetului.............................22

Generalități.....................................................................................................................22

PDMS-CaO2.....................................................................................................................24

Metode de sinteză..........................................................................................................25

Metode de caracterizare.................................................................................................37

Concluzii................................................................................................................42

Bibliografie............................................................................................................45

1
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

INTRODUCERE

Unul dintre domeniile promițătoare care au un efect considerabil asupra sănătății


umane este nanotehnologia. De fapt, nanotehnologia se ocupă cu studiul construcției,
proiectării, caracterizării și aplicării sistemelor și dispozitivelor printr-o metodă controlată de
dimensiune și formă la o scară de lungime nanometrică (10 -9m) pentru a îmbunătăți calitatea
și proprietățile materialelor. În ultimele decenii, procesele folosite în tehnologia
nanobiomaterialelor s-au îmbunătățit enorm. Nanobiomaterialele sunt substanțe cu unități
structurale fundamentale: particule, fibre sau alte componente de bază de dimensiuni mai mici
de 100 nm în cel puțin o dimensiune care în ultimul timp au început sa fie utilizate în vederea
studierii, diagnosticării și vindecării bolilor, de asemenea, numărul cercetătorilor specializați
în nanotehnologie ce activează în domeniul ingineriei țesuturilor crește rapid. Aplicațiile
nanotehnologiei în științele medicale sunt descrise ca „nanomedicină” sau „nano-
biomedicină”. Nanobiomaterialele pot fi construite prin două metode: „top-down” și „bottom-
up”. În metoda de top-down, materialele sunt descompus în constituenții fundamentali și
utilizează în mod obișnuit tehnici termice și chimice. Pe de altă parte, în metoda bottom-up,
structuri compuse sunt construite prin combinarea constituenților la nivel atomic.
Câteva dintre metodele semnificative de nanoconstrucție de tip bottom-up și top-down
sunt: separarea fazelor, electrospinning, gravarea chimică, depunerea filmului subțire,
depunerea chimică a vaporilor, procesele de auto-asamblare, fotolitografia, nanoimprimarea și
tehnologia cu fasciculul de electroni sau litografia cu nanosfere care au fost dezvoltate pentru
a fabrica nanobiomateriale cu nano-topografie ordonata sau aleatorie. Prin scăderea
dimensiunii materialului la scală nanometrică, raportul suprafață la volum este considerabil
crescut, ceea ce poate duce la îmbunătățirea unor proprietăți precum multifuncționalitatea,

2
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

solubilitatea și cele fizico-chimice (proprietăți: electrice, mecanice, catalitice, optice,


magnetice.
Întrucât nanobiomaterialele pot imita țesuturile naturale și pot coopera prin metode
biologice la nivel molecular, nanomaterialele joacă un rol cheie în motivarea creșterii și
funcționării celulare în timp ce ghidează restaurarea țesuturilor, iar utilizarea acestor materiale
poate rezolva dificultățile descrise mai sus. De asemenea, prin utilizarea mai multor metode,
inclusiv razele ultraviolete (UV), oxid de etilenă, filtrare cu filtre de 0,22 μm sau plasmă,
nanobiomaterialele pot fi simplu sterilizate. Prin modificarea suprafeței nanobiomaterialelor
prin nano-metode avansate, interacțiunea biomaterial-celulă poate fi îmbunătățită.
Nanotehnologia a fost utilizată într-o varietate de domenii, cum ar fi stocarea
informațiilor, electronică, alimentație și agricultură, chimie (catalizatori), transportul
medicamentelor, produse farmaceutice, secvențierea ADN (folosind nanopori) , livrarea ADN
în celule, monitorizarea și diferențierea celulelor, diagnosticul și vindecarea bolii și ingineria
țesuturilor. [1]

3
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

DIABET ZAHARAT

Problematica abordată
Apariția crescândă a diabetului zaharat în întreaga lume a condus la etichetarea
diabetului drept epidemie a secolului al XXI-lea. Pacienții diabetici au o probleme
cardiovasculare cum ar fi neuropatia, nefropatia sau retinopatia. Diabetul zaharat, o tulburare
metabolică, se caracterizează prin afectarea absorbției glucozei la nivel celular. Mecanistic,
este o boală complexă cauzată de o combinație de modificări genetice multiple și factori de
mediu care declanșează o succesiune de evenimente ce cauzează o creștere în concentrația de
glucoză din sânge (hiperglicemie).
Diabetul zaharat este de trei tipuri:
 Tip1-insulino-dependent(type 1 diabetes mellitus-T1DM)
Este o boală autoimună ce are două potențiale cauze: una virală(incă nu a fost
identificată) și una gentică (genele HLA DR3 si HLA DR4 sunt puternic asociate cu diabetul).
Proteinele virale se leagă de celulele beta și complexul MHC-I(proteine de suprafață).
Celulele citotoxice T recunosc asta ca antigen generează anticorpi. Celulele beta sunt distruse
de anticorpii, ceea ce duce la inflamarea cronică a pancreasului care poate dura ani și zeci de
ani de zile ceea ce duce la distrugerea mai multor celule beta. Simptomele încep să apară încă
din copilărie.
 Tip2-noninsulino-dependent(type 1 diabetes mellitus-T2DM)
Reprezintă 90-95% din totalul cazurilor de diabet. Simptomele apar la maturitate sau
la o vârstă înaintată. Recent, din cauza creșterii BMI-ului populației și a scăderii activității
fizice, chiar și copii obezi au simptome de diabet zaharat. Celelalte celule din organsim devin
rezistente la insulină(asta înseamnă ca in sânge glicemia o sa rămana ridicată), hiperglicemia
4
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

stimulează producția de insulină care , în timp, scade activitatea celulelor beta ceea ce duce la
scăderea producției de insulină ceea ce înseamnă că o sa avem în permanență hiperglicemie.
 Diabet gestațional

5
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Ingineria tisulară
Ingineria țesuturilor a deschis o fereastră nouă pentru tratamentul diabetului. Această
zonă a științei a avut multe succese în dezvoltarea substitutelor pentru repararea țesuturilor
deteriorate și refacerea funcționalității acestora. Transplantul de insule (IT) pentru a reface
masa celulelor beta în T1DM sau pentru a compensa numărul redus de celule beta din T2DM
poate îmbunătăți afectarea producției de insulină.Cu toate acestea, lipsa de organe și cerința
de agenți imunosupresori pentru transplant sunt în mod clar principalele obstacole pentru
utilizarea clinică a acestei abordări.
Generarea de celule beta din celule stem cu sursă embrionară sau hematopoietică ar fi
o abordare ideală pentru a prepara cantități adecvate de masă de celule beta. Pe de altă parte,
transplantul de organe devine o alternativă viabilă la terapia cu insulină, care se bazează pe
furnizarea unei mase de celule beta adecvate pentru a restabili o glicemie normală.
Transplantul pancreatic de organ integral (WOP) și IT(transplant de insule pancreatice) ca
două strategii curative paralele au fost efectuate pentru a atenua T1DM. În ultimele decenii au
fost făcute rapoarte încurajatoare despre transplantul de WOP cu succes și s-a demonstrat că
transplantarea simultană de pancreas și rinichi poate îmbunătăți rezultatele.
S-a arătat că șansa de supraviețuire a țesutului înlocuit în primul an de transplant
simultan de rinichi și pancreas, pancreas după transplant renal și doar pancreas a fost de: 89%,
86% și respectiv 82%, în timp ce a scăzut la 71%, 65%, respectiv 58%, în termen de 5 ani de
la transplant. Prin urmare, mulți receptori de organe trebuie re-transplantați câțiva ani mai
târziu. Xenotransplantul a fost introdus ca o soluție pentru a depăși lipsa de organe; cu toate
acestea, este asociat cu un risc crescut de respingere a grefei și de transmitere virală.
Este bine stabilit că transplantul de organe poate fi asociat cu diverse complicații. De
exemplu, primitorii de transplant pot dezvolta diabet zaharat care în sine este considerat o
sursă de o serie de consecințe care duc la pierderea grefei. Sensibilitatea ridicată la infecțiile
fungice, bacteriene și virale este o altă preocupare importantă în această strategie. Același
fenomen poate afecta transplantul de celule beta care poate compromite succesul implantării.
S-a raportat că sunt implicați mai mulți agenți și mecanisme de reglare a creșterii
celulei β atât in vitro, cât și in vivo. Celulele transplantate au fost însămânțate pe o schelă 3D
care a acționat ca o barieră împotriva sistemului imunitar, pe lângă asigurarea unui transport
adecvat de substanțe nutritive, oxigen și produse reziduale. Într-un pancreas artificial, trebuie
să existe un acces adecvat la oxigen și glucoză și îndepărtarea deșeurilor metabolice. De fapt,
6
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

ingineria țesuturilor a fost explorată pentru a defini agenții înrudiți și a-i utiliza în cadrul
micromediului 3D cu scopul de a sprijini viabilitatea și funcționalitatea celulelor pancreatice.
De exemplu, s-a dovedit că joncțiunile adherens (desmozomii), proteine transmembranare ce
leagă două celule una de alta, au un rol critic în funcționalitatea și viabilitatea celulelor
secretoare de insulină.
Mai multe studii au raportat că schelele (scaffolds) de hidrogel polietilenglicol (PEG)
ar putea furniza și imita joncțiunea aderentă a celulei în microambientul celulelor β secretoare
de insulină. Bernard și colab. (2012) au proiectat un sistem de cultură celulară realizat dintr-
un microplacă pe bază de hidrogel PEG. Ei au observat că celulele β formează agregate în
hidrogeluri. Celulele agregate au prezentat mai multă viabilitate și funcționalitate celulară
(secreția de insulină) decât culturile monocelulare. Kelly și colab. (2010) au dezvoltat un
PEG-ECM pentru a imita interacțiunea micro-mediu a insulelor. În acest scop, a fost fabricat
un hidrogel care conține PEG, colagen de tip I, colagen de tip IV, fibrinogen, fibronectină,
laminină și vitronectină. Celulele secretoare de insulină au fost apoi încapsulate în hidrogelul
PEG-ECM. O creștere semnificativă a viabilității celulare și a nivelului de secreție de insulină
a fost raportată de acest grup. Principala complicație asociată cu agregarea celulelor insulare
este condițiile de hipoxie care apar în sit din cauza unui nivel insuficient de oxigen, ducând la
necroză și moarte celulară. [1]

7
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

NANOBIOMATERIALE GENERATOARE DE OXIGEN

Proprietați
Insulele lui Langerhans sunt una dintre cele mai costisitoare în ceea ce privește
oxigenul, datorită activității lor metabolice ridicate. În pancreas, insulele sunt formate din
două tipuri de celule producătoare de hormoni endocrini (celule α și ß). ß-Celulele sunt
responsabile pentru secreția de insulină.Un aport insuficient de oxigen poate afecta profund
funcționalitatea acestor celule și poate duce la diabet. În plus, radicalii liberi sunt produși în
timpul condițiilor de hipoxie care determină oprirea ciclului celular, dăunând ADN-ului. Prin
urmare, o distribuție adecvată de nutrienți, în special oxigen, este esențială pentru succesul în
terapia diabetului. S-au făcut multe încercări pentru a depăși astfel de impedimente. Pentru
prima dată, Bloch și colab. (2006b) au introdus o tehnică nouă în fotosinteza naturală pentru a
genera oxigen pentru insulele pancreatice încapsulate. Într-un studiu similar, celulele insulelor
au fost încapsulate în agar, alginat și chitosan pentru a primi selectiv oxigen și a elimina
deșeurile (Colton, 2014). Cu toate acestea, inaccesibilitatea la un nivel suficient de oxigen a
rămas în continuare problematică. Recent, cercetătorii au adoptat câteva nanobiomateriale noi
cu capacitatea de a produce oxigen pentru a explora o modalitate de depășire a livrării de
oxigen. Nanobio-materialele generatoare de oxigen se descompun în oxigen atunci când sunt
expuse la apă. Cele mai comune nanobiomateriale generatoare de oxigen, precum și
mecanismele lor de oxigenare, sunt descrise mai jos.

Peroxizi anorganici solizi


În ultimul deceniu, peroxizii anorganici solizi precum percarbonatul de sodiu
(Na2CO3), peroxidul de calciu (CaO2) și peroxidul de magneziu (MgO2) au fost utilizate pe
scară largă în aplicații de inginerie a țesuturilor. Aceste materiale sunt descompuse în peroxid
de hidrogen (H2O2) atunci când reacționează cu apă. Reacțiile asociate sunt prezentate în eq:
CaO 2 ( s ) + H 2 O →Ca ( OH )2 ( s ) + H 2 O 2 (0)
Mg O2 ( s )+ H 2 O → Mg ( OH )2 ( s )+ H 2 O2 (0)
( N a2 C O3 )2 +3 H 2 O2 → 4 Na+ 2C O−2 3 +3 H 2 O 2 (0)

8
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

CaO2, datorită purității sale ridicate (70% puritate) și disponibilității comerciale, a


devenit unul dintre cele mai interesante nanobiomateriale generatoare de oxigen. Pe de altă
parte, MgO2 are cea mai lentă viteză de reacție datorită solubilității sale.
Producerea de hidroxizi metalici și peroxid de hidrogen în timpul descompunerii
nanobiomaterialelor generatoare de oxigen este una dintre cele mai importante preocupări
asociate cu utilizarea acestor materiale în ingineria țesuturilor. Producerea unor astfel de
subproduse influențează nivelul pH-ului micro-mediului. PH-ul ar putea fi stabilizat prin
utilizarea unor soluții tampon.
În plus, acumularea de H2O2 stimulează profund formarea radicalilor liberi și afectează
viabilitatea celulară. Catalaza, ca agent antioxidant, a fost utilizat pentru a garanta
descompunerea H2O2 în oxigen și apă. Prin urmare, preocupările care decurg din toxicitatea
H2O2 au fost rezolvate prin adăugarea de catalază la mediul de cultură celulară sau la schele.
Mecanismele prin care catalaza descompune H2O2 sunt prezentate în eq 4 și 5:
+¿ (aq )¿
2+ ¿ (aq )+2 H ¿

H 2 O2 ( aq )+ 2 F e3+ ¿ aq → O g + 2 F e
( ) ( )
2 ¿
(0)
3+¿ ( aq) ¿
+ ¿ (aq )→ 2H 2 O (l )+ 2F e ¿
3+ ¿ ( aq ) +2 H
H 2 O 2 ( aq )+ 2 F e ¿
(0)
În studiul lor, Harrison și colab. (2007) au conceput un scaffold din poli(lactic-co-
glicolic acid)(PLGA) în care au încorporat percarbonat de sodiu(Na 2CO3). Ei au raportat că
eliberarea completă de oxigen a avut loc pe parcursul a 3 zile. Pentru a încetini oxigenarea,
același grup de cercetare a efectuat un alt studiu (Oh și colab., 2009b). În acest caz, au
încapsulat CaO2 în PLGA și au arătat eliberarea sa consistentă de oxigen până la 10 zile in
vitro. De asemenea, au evaluat efectul diferitelor rapoarte molare de CaO 2 (variind de la 0% la
10%) în construcția CaO2-PLGA în eficiența oxigenării. Conform rezultatelor lor, 5% greutate
/ volum% - CaO2 s-a dovedit a fi mai eficient comparativ cu alte concentrații atunci când este
expus celulelor.

Peroxid de hidrogen (H2O2)


Rata descompunerii spontane a peroxidului de hidrogen la oxigen este foarte mică. Pe
de altă parte, acumularea de H2O2 în țesut amenință soarta celulelor prin medierea formării
radicalilor liberi. Pentru a depăși astfel de obstacole, enzima catalază este adăugată în medii
(pentru aplicații in vitro) sau schele tehnice (pentru aplicații in vivo). Catalaza, ca enzimă
antioxidantă, transformă peroxidul de hidrogen al speciilor de oxigen în apă și oxigen și, prin
urmare, își minimizează citoxicitatea. Microencapsularea H2O2 în unele nanobiomateriale este
o strategie eficientă pentru livrarea sigură, consistentă și localizată de oxigen. O oxigenare
9
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

prelungită a fost realizată prin sinteza PVP / H 2O2 / PLGA / catalază / hidrogel (Li și colab.,
2012). În acest scop, H2O2 a fost atașat la poli (vinil pirolidonă) (PVP) și complexul PVP /
H2O2 rezultat a fost încapsulat în PLGA pentru a forma o microsferă miez-coajă(core-shell
method). Microsfera a fost apoi încorporată în hidrogel care conține catalază. Autorii au arătat
că eliberarea de oxigen în această construcție a fost susținută timp de până la 14 zile.
Abdi și colab. (2011) a realizat cu succes oxigenarea prin microîncapsularea
particulelor de H2O2 într-o construcție în două straturi. Au plasat peroxidul de hidrogen într-
un strat intrinsec de PLGA care era înconjurat de un strat secundar compus din alginat. Au
arătat că particulele de H2O2 sunt eliberate din PLGA în stratul secundar și descompuse în
oxigen de către enzima catalază legată de alginat.

Materiale fluorurate
Perfluorocarburile (PFC), ca un nanobiomaterial promițător generator de oxigen, au
atras atenția cercetătorilor datorită capacității lor de a produce o cantitate mare de oxigen.
PFC-urile se descompun în oxigen și dioxid de carbon la expunerea la apă. Incapsularea PFC
în alginat sa dovedit a fi o strategie eficientă pentru susținerea și localizarea livrării de oxigen,
crescând oxigenarea până la 1 săptămână (Khattak și colab., 2007). Autorii au sugerat
potențialele aplicații ale unei astfel de strategii în încapsularea celulelor, în special celulele
pancreatice.
În plus față de biocompatibilitate, rata de eliberare a oxigenului nanobiomaterialelor
generatoare de oxigen este un alt factor important care ar putea influența direct maturarea
țesuturilor. În scopul de a furniza o cantitate satisfăcătoare de oxigen, rata de oxigenare
trebuie ajustată pentru a evita explozii sau eliberarea foarte îndelungată de oxigen. Există
câțiva factori, cum ar fi temperatura, pH-ul, cantitatea de peroxid și tipul de mediu care ar
putea afecta profund cantitatea și consistența oxigenării din nanobiomaterialele generatoare de
oxigen (Soleymani și colab., 2011). De exemplu, rata de oxigenare se reduce odată cu
scăderea temperaturii mediului. Pe de altă parte, așa cum am menționat mai devreme în acest
capitol, încorporarea particulelor de peroxid în unii polimeri este o modalitate de a ajusta rata
și durabilitatea eliberării de oxigen. De exemplu, spre deosebire de compușii hidrofobi,
materialele hidrofile cresc eliberarea de oxigen datorită difuziei rapide a oxigenului în
interiorul acestora (Harrison și colab., 2007; Fraker și colab., 2011).
Seifu și colab. (2011) au introdus recent particule de zeolit fluorurat ca noi
nanobiomateriale generatoare de oxigen în ingineria țesuturilor. Au indicat faptul că
10
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

particulele de zeolit fluorurate încorporate uniform în schelele din poliuretan și concentrația


de oxigen au crescut semnificativ. Pe baza rezultatelor culturii celulare și a măsurătorilor de
viabilitate celulară, acest tip de schelă ar putea furniza în siguranță livrarea de oxigen către
celule. [1]

11
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Metode de sinteză CaO2 prin precipitarea din soluție


Pentru obținerea nanoparticulelor de CaO2

Există două metode generale pentru sintetizarea peroxizilor. Prima implică încălzirea

oxidului într-un curent uscat de oxigen pur, fără CO2. Această metodă este favorizată pentru

obținerea de peroxizi care sunt considerabil mai stabili decât oxidul corespunzător, de

exemplu, pentru prepararea BaO2. De fapt, BaO2 este produs industrial prin încălzirea BaO la

500 ◦C în oxigen pur. Sinteza SrO2 mai puțin stabil necesită condiții mai drastice, și anume

încălzirea oxidului la o temperatură de 350 ◦C într-o bombă care conține oxigen cu presiune

ridicată (250 atm). În cele din urmă, CaO2, cel mai puțin stabil dintre cele trei, nu poate fi

sintetizat în mod convenabil prin combinarea directă a oxidului cu oxigenul.

A doua tehnică, care este mai potrivită pentru pregătirea de peroxizi mai puțin stabili,

implică precipitarea peroxidului insolubil din soluția apoasă prin adăugarea de H2O2 la o

soluție de sare metalică. De exemplu folosind pentru sinteză CaO2, ecuația(6):

CaC l 2+ H 2 O2 → CaO2 +2 HCl (0)


Adăugarea de amoniac apos pentru a neutraliza HCI, forțează reacția să favorizeze

precipitarea peroxidului, ec. (7):

2 HCl+ 2 N H 3 → 2 N H 4 Cl (0)
1. Prepararea soluției de CaO2:

Trei grame de clorură de calciu s-au dizolvat în 30 ml apă distilată, 15 ml soluție de


amoniac (1 M) și un 120 ml de PEG 200 au fost adăugați în amestecul sub agitare. Apoi, 15
ml de H2O2 30% s-au adăugat în amestec cu o viteză de 3 picături pe minut. Procedeul de
preparare a fost efectuat într-un pahar de sticlă deschis amestecat continuu, V = 0,25 L, la
temperatura camerei. Viteza agitatorului a fost menținută constantă pentru toate
experimentele. După 2 ore de agitare, s-a obținut o soluție limpede și incoloră până la gălbuie.
2. Precipitarea nanopulberii de CaO2:

Pentru a precipita produsul, o soluție de NaOH (pH 13) a fost adăugat pentru a forma
un mediu bazic. Acest lucru a fost făcut până când s-a atins o valoare a pH-ului de 11,5. La
adăugarea NaOH, amestecul a fost schimbat într-o suspensie de culoare albă. Precipitatul alb
12
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

a fost separat prin centrifugă și după procesul de centrifugare pulberea a fost spălată de trei ori
cu soluție de NaOH. În cele din urmă, s-au făcut două spălări suplimentare cu apă distilată
până la atingerea pH-ului final de 8,4 pentru apa reziduală. Precipitatul rezultat a fost uscat la
80 ° C timp de 2 ore într-un cuptor evacuat.
3. Analiza nanopulberii:
Analiza XRD a fost făcută pe pulberi de CaO2 pentru a se identifica materialul. Un
rezultat reprezentativ este prezentat în Fig. 1, cele trei vârfuri dominante: 2θ = 30,1, 35,6, 47,3
se potrivesc cu XRD de CaO2 (numărul cardului 03-0865). Rezultatul XRD a dovedit cu tărie
că compusul CaO2 a fost format prin această procedură.

13
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Imaginile de microscopie electronică prin transmisie relevă faptul că particulele de

CaO2 sunt nanocristale fațetate cu agregare scăzută și dimensiuni medii scăzute cu o

distribuție moderată a dimensiunii.

14
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Au fost formate nanoparticule stabilizate de peroxid de calciu printr-o tehnică

îmbunătățită și simplă. Procesul este spontan și nu sunt necesare echipamente sau surse de

energie suplimentare. Metoda de preparare a peroxidului de calciu se bazează pe procedura de

oxidare-hidroliză-precipitare, cu polietilen glicol 200 ca modificator de suprafață.

Nanoparticulele pure, stabilizate de peroxid de calciu au rămas la scară nanometrică în toate

etapele. [2]

15
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Metoda de sinteză PCL-F-CaO2 prin metoda electrospray


Microparticulele au fost preparate prin tehnica electrospray. O imagine de ansamblu

asupra strategiei sintetice este demonstrată în Figura 2, împreună cu diferiții componenți și

masele și concentrațiile lor respective utilizate în proiectarea microparticulelor. Au fost

pregătite trei microparticule diferite (M): mai întâi, microparticule bazate exclusiv pe

PCL(policaprolactona) (PCL-M); în al doilea rând, o combinație de PCL și CPO (PCL-CPO-

M); și în cele din urmă, PCL, F-127 (Pluronic F-127 ) și CPO (PCL-F-CPO-M). Toți au fost

pregătiți urmând aceeași procedură, așa cum este descris în secțiunea experimentală. Pe scurt,

o soluție de PCL (100 mg / ml) a fost preparată și omogenizată timp de 3 ore și apoi agitată

timp de 2 ore. După aceea, Pluronic F-127 (10 mg / ml) a fost adăugat la amestecul de reacție

și agitat în continuare timp de încă 3 ore. Apoi, s-a adăugat soluția CPO (50 mg / ml) și s-a

agitat timp de 3,5 ore. Ulterior, soluția de amestec a fost supusă tehnicii de electrospray,

urmată de evaporarea solventului pentru a furniza microparticulele. Apoi, microparticulele au

suferit mai multe etape de spălare și, după uscare, au fost produse PCL-F-CPO-M.

Pluronic F-127, este un polimer aplicabil clinic, cu biocompatibilitate ridicată și

toxicitate scăzută,care poate fi utilizat ca aditiv hidrofil atunci când interacționează cu PCL.

Mai mult, fuzionarea F-127 cu PCL îmbunătățește caracteristicile PCL-ului, cum ar fi

umectabilitatea suprafeței și crește porozitatea suprafeței datorită interacțiunii dintre cele două

componente, care la rândul său îmbunătățește performanța biologică a amestecului

16
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig.1 O prezentare schematică a strategiei de fabricație pentru tehnica electrospray în proiectarea și pregătirea
PCL-M, PCL-CPO-M și PCL-F-CPO-M și un tabel care prezintă masele și concentrația utilizate pentru diferitele materiale
pentru pregătirea soluțiilor Solventul utilizat pentru prepararea soluțiilor a fost diclormetan (DCM).

-prepararea și omogenizarea unei soluțiii de 100 mg/mL CH2Cl2(diclorometan):lihid

incolor, volatil, nemiscibil cu apa, miscibil cu multi solventi organici

-adăugarea unei soluții de peroxid de calciu CPO(calcium peroxide)(CaO 2), urmată de

agitare magnetică timp de 3 ore

-viteza de infuzie pentru tehnica de electrospray a fost ajustată la 3,0 mL / h în pompa

de perfuzie și volumul din soluția de polimer din seringă a fost de 3,0 ml. Seringa utilizată în

acest proces a fost de sticlă, iar acul a fost realizat din oțel inoxidabil și plastic (0,42 mm

diametru intern și 1 inch). A fost aplicată o tensiune de 12 kV. Faza pozitivă a fost atașată la

17
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

vârful acului, iar ground-ul a fost atașat la o placă metalică din oțel inoxidabil acoperită cu

folie de aluminiu și situată sub placa colectoare conținând 100 ml soluție de metanol. Apoi, s-

a aplicat tensiunea și soluția inițială de PCL a fost evacuată în formă spirală (conul Taylor).

Ulterior, la evaporarea solventului, au fost colectate microparticulele de pe placă.

Fig.2. O imagine de ansamblu schematică a strategiei de proiectare și fabricare a microparticulelor poroase


generatoare de oxigen (M) și a impactului pozitiv al acestora asupra proliferării celulare prin livrarea susținută de oxigen.

Diferitele microparticule fabricate au fost bine caracterizate. Analiza difracției cu raze

X (XRD) a microparticulelor (PCL-M, PCL-CPO-M și PCL-F-CPO-M) sunt prezentate în

Figura 3A. Reflecțiile tipice ale PCL au fost identificate cu două faze la 21,30 ° și 23,60 °,

care sunt caracteristice naturii semi-cristaline a PCL (Figura 3A-i). Mai mult, principalele

vârfuri caracteristice ale CPO sunt situat la 30,20 °, 35,58 °, 47,31 °, atribuit CaO2 conform

codului JCPDS 01-085-0514 (Figura 3A-ii și iv) .36 Vârfurile atribuite carbonatului de calciu

(CaCO3) (card nr. 01- 072-0506 și 01-083-0578) și Ca (OH) 2 (card nr. 00-044-1481) se

găsesc, de asemenea, în difractograma. În plus, reflexiile PCL au fost identificate în XRD al

PCL-CPO- M și PCL-F-CPO-M și vârfurile legate de CPO au fost, de asemenea, observate cu

18
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

claritate și intensitate adecvate (Figura 3A-iii și iv). Aceste vârfuri sunt în concordanță cu cele

prezentate în literatură, ceea ce confirmă faptul că CPO a fost încorporat cu succes în

microparticulele studiate. Mai mult, după interacțiunea dintre materiale, reflexiile

caracteristice ale PCL au fost menținute, iar prezența fazelor intermediare nu a fost observată.

Fig.3.A. Difractie de raze X (XRD) i) PCL-M, ii) CPO, iii) PCL-CPO-M, and iv) PCL-F-CPO-M

19
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig.3.B. FTIR i) CPO, ii) PCL-M, iii) PCL-CPO-M, și iv) PCL-F-CPO-M.

În plus, materialele au fost caracterizate prin FTIR (Figura 3B). CPO a arătat banda de
absorbție la 3000-3700 cm − 1,care este atribuit modului de alungire al grupelor -OH din
CPO transformate în molecule de apă și în banda de 1635 cm − 1 referindu-se la deformarea
HOH a H2O fără reziduuri (Figura 3B-i). Vârfuri corespunzătoare modului de vibrație O-Ca-
O de îndoire a CaO2 și CO32 din grupul calcitar putea fi observată în intervalul larg de 1600-
1300 cm − 1, confirmându-se astfel cu rezultatele XRD ale materialelor cu CPO (Figura 3A-
ii, iii și iv) .37 Banda de absorbție la 875 cm − 1 este atribuită puntea de oxigen (OO) a
CPO.Toate vârfurile importante ale PCL, cum ar fi 2945 cm − 1, corespund benzilor asociate
vibrațiilor de alungire asimetrică υas (CH2); întinderea simetrică υs (CH2) la 2865 cm − 1;
alungire carbonil la 1725 cm − 1 υ (C = O), 1473, 1397 și 1361 cm − 1 (CH2)
bending(îndoire); alungire în faza de linie cristalină la 1295 cm – 1 υcr (C-O; C-C); întinderea
asimetrică υas (C-O-C) la 1241 cm − 1; și vibrația de întindere ν (OC-O) la 1188 cm − 1 au
fost de asemenea identificate (Figura 3B-ii). Benzile caracteristice pentru PCL

20
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Morfologia diferitelor microparticule fabricate a fost investigată utilizând microscopia


electronică cu scanare (SEM) și analiza SEM cu energia de dispersie a razelor X (EDS)
(Figura 4A-F). Microparticulele PCL-M (Figura 4A) au fost în mare parte rotunde și au variat
între 18 și 28 μm, cu o dimensiune medie de 23,00 ± 0,46 μm diametru (Figura 4G). SEM a
dezvăluit că aceste microparticule au fost dispersate, spre deosebire de particulele CPO, care
pot crește suprafața microparticulelor. Mai mult, cartografierea EDS a confirmat că PCL-M
nu conține CPO (Figura 4D). PCL-CPO-M a prezentat morfologie în mare parte ovală, deși au
fost observate și unele particule rotunde și au apărut pe suprafața sa microstructuri cu
morfologie dreptunghiulară și ușor spongioasă (Figura 4B).

Fig 4. Scanning electron microscopy (SEM) image of the various microparticles (A) PCL-M, (B) PCL-CPO-M, and
(C) PCL-F-CPO-M. The SEM-Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) of the (D) PCL-M, (E) PCL-CPO-M, (F) PCL-F-
CPO-M. The size distribution presented in the histogram of the (G) PCL-M, (H) PCL-CPO-M, and the (I) PCL-F-CPO-M.

Cartografierea EDS a relevat prezența calciului (Ca) în PCL-CPO-M, indicând faptul


că un strat CPO acoperea microparticulele ovale sau rotunde de PCL-M (Figura 4E). Aceste
rezultate coroborează rezultatele XDR (Figura 3A-iii) și FTIR (Figura 3B-iii). Dimensiunea

21
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

PCL-CPO-M a crescut în comparație cu PCL-M până la dimensiunea particulelor de 46,00 ±


0,75 μm în diametru (Figura 4H).
Morfologia suprafeței microparticulelor s-a schimbat în mod clar după adăugarea
Pluronic F-127 (PCL-F-CPO-M) (Figura 4C). Microparticulele și-au menținut forma sferică;
cu toate acestea, suprafața a prezentat o caracteristică mai spongioasă. Prezența Pluronic F-
127 a favorizat o scădere a dimensiunii micro-particulelor, pentru o medie de 17,00 ± 0,34 μm
(Figura 4I). Imaginea EDS a PCL-F-CPO-M a confirmat, de asemenea, prezența CPO în
microparticule (Figura 4F)
[3]

22
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

NANOBIOMATERIALE GENERATOARE DE OXIGEN ÎN


TERAPIA DIABETULUI

Generalități
Livrarea de celule ß ca celule producătoare de insulină către pancreas este una dintre
cele mai eficiente strategii pentru terapia diabetului. Cu toate acestea, există unele provocări
asociate cu o astfel de strategie, inclusiv răspunsul imun al corpului, incapacitatea de a asigura
o cantitate suficientă de oxigen și îndepărtarea deșeurilor metabolice care trebuie adresate.
După fiecare implantare, în special în cantități mari, neovascularizarea precoce necesită
suficient timp pentru a fi realizată (aproximativ câteva săptămâni). Prin urmare, eliberarea de
oxigen ar trebui susținută pentru a oferi suficient timp pentru neovascularizare și maturare a
țesuturilor modificate. Eliminarea perioadei de hipoxie între transplant și formarea
neovascularizării ar putea reduce dramatic moartea celulară indusă de hipoxie și necroză.
Au fost dezvoltate mai multe strategii pentru livrarea suficientă de oxigen către, de
exemplu, stimularea preneovascularizării în locul implantării, promovarea neovascularizării
timpurii folosind factori angiogeni precum celulele endoteliale și factorii de creștere
endotelial vascular, utilizarea purtătorilor de oxigen din cadrul nanobiomaterialelor și
generarea in situ de oxigen prin nanobiomateriale generatoare de oxigen.
Dintre strategiile menționate mai sus, oxigenarea in situ este considerată cea mai de
dorit datorită capacității sale de a furniza suficient oxigen la implantare fără a fi nevoie de
intervenții chirurgicale suplimentare. Au fost investigate diferite biomateriale pentru
capacitatea lor de oxigenare. În ciuda marelui succes, eliberarea rapidă de oxigen de către
nanobiomaterialele generatoare de oxigen rămâne încă provocatoare. Trebuie subliniat faptul
că compoziția chimica ale nanobiomaterialelor generatoare de oxigen ar putea afecta profund
23
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

rata de eliberare a oxigenului. De asemenea, s-a constatat că încorporarea nanobiomaterialelor


generatoare de oxigen în polimerii hidrofobi ar putea încetini oxigenarea.
Recent, cercetătorii s-au concentrat pe dezvoltarea unei strategii adecvate pentru a
încorpora nanobiomaterialele generatoare de oxigen în construcțiile de inginerie a țesuturilor.
De fapt, schelele generatoare de oxigen pot fi clasificate ca o nouă generație de schele în
ingineria țesuturilor, în special în masele de țesuturi mari care au nevoie de mai mult aport de
sânge pentru a spori supraviețuirea celulelor. Astfel, sistemele de eliberare a oxigenului
furnizează oxigen pentru celulele stem în mod durabil, ceea ce depășește limitările de difuzie
a oxigenului în țesuturile de bio-inginerie. În acest fel, nanobiomaterialele generatoare de
oxigen sunt combinate cu schele. Grupul Harrison de la Universitatea Wake Forest a
combinat frecvent nano-biomateriale generatoare de oxigen cu schele (scaffolds) folosite
frecvent în ingineriea tisulară. Într-un studiu recent, au folosit particule generatoare de oxigen
pe bază de peroxid de calciu într-o schelă 3D de PLGA. Rezultatele au arătat supraviețuirea
celulară îmbunătățită și neovascularizare după implantare. Aceste caracteristici ar fi utile în
ingineria țesuturilor pentru țesuturile mari. În acest scop, s-au realizat diferite forme de schele,
cum ar fi filmele (Harrison și colab., 2007), nanofibrele electrospun (Wang și colab., 2010) și
hidrogelurile (Li și colab., 2012), prin încorporarea oxigenului- generând nanobiomateriale în
construcțiile de inginerie a țesuturilor.
Pedraza și colab. (2012)[4] au dezvoltat un nou compozit realizat din poli-
dimetilsiloxan (PDMS)- încapsulat cu - peroxid de calciu (PDMS-CaO 2). Au urmărit creșterea
disponibilității oxigenului în timpul perioadei timpurii de acceptare a celulelor implantate
(engraftment period), în timp ce apare o întârziere inevitabilă în angiogeneză. În acest scop, a
fost determinat efectul constructului sintetizat asupra viabilității celulare a liniei de celule β și
a insulelor pancreatice de șobolan.
Au arătat că PMDS, ca un biopolimer foarte hidrofob și stabil, a prelungit eliberarea
de oxigen din PDMS-CaO2 printr-o scădere a absorbției apei, astfel încât fiecare probă a
eliberat 0,026 mM oxigen pe zi, timp de până la 42 de zile. Conform rezultatelor lor, PDMS-
CaO2 a minimizat în mod semnificativ efectele negative ale condițiilor de hipoxie asupra
liniei celulare β MIN6 și a insulelor pancreatice de șobolan până la 14 zile în comparație cu
PDMS fără CPO. Autorii au sugerat cu tărie aplicarea potențială a unui astfel de construct în
generarea și livrarea susținută de oxigen în cadrul implanturilor. Cu toate acestea, trebuie
efectuate investigații suplimentare pentru a asigura aplicațiile in vivo ale acestor materiale.[1]

24
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

25
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

PDMS-CaO2
Proprietăți:
Există un timp imediat, după implantare si inainte de angiogeneza din interorul
implantului, în care celulele pancreatice suferă de hipoxie ceea ce duce la necroză și apoptoză,
precum și trecerea la metabolismul anaerob și conservare energetică. Furnizarea suficientă a
oxigenului pentru implanturile care conțin celule foarte metabolic active, cum ar fi insulele
pancreatice, este deosebit de dificilă. Nu numai că rata consumului de oxigen pentru insulele
pancreatice este crescută în comparație cu multe alte tipuri de celule, ele sunt, de asemenea,
susceptibile la afectarea funcțională chiar și la tensiuni moderate de oxigen(diferente
moderate de concentrație).
În primele zile după implantarea dispozitivului, în absența infiltrării vasculare,
concentrația maximă de oxigen apare la limitele exterioare ale implantului și scade progresiv
cu pătratul distanței în direcția radială spre interior. Densitățile ridicate ale implantului (multe
celule/ unitatea de volum) exacerbează și mai mult hipoxia, prin creșterea sarcinii metabolice
generale. Astfel, proiectarea dimensiunilor corespunzătoare a dispozitivului și a încărcărilor
celulare pentru a limita hipoxia în cadrul unui transplant este o sarcină dificilă, care duce în
mod obișnuit la scări ale dispozitivului care nu sunt practice pentru implantarea clinică.
Limitarea sau eliminarea perioadei hipoxice dintre implantare și dezvoltarea unei
rețele vasculare complet funcționale în interiorul implantului, ar reduce dramatic moartea
celulară indusă de hipoxie. Astfel de metode includ pre-vascularizația locului transplantului,
accelerarea vasculației prin eliberarea factorilor de creștere(vascular endothelial growth factor
VEGF), încorporarea purtătorilor de oxigen în biomateriale sau generarea in situ de oxigen
suplimentar. Generarea in situ de oxigen este o abordare extrem de dorită, deoarece nu
necesită intervenții chirurgicale multiple și asigură oxigen suplimentar imediat după
implantare. Au fost investigați diferiți agenți pentru potențialul lor de generare a oxigenului,
de la descompunerea electrochimică a apei până la fotosinteza microalgelor până la utilizarea
camerelor de oxigen. Deși toți acești agenți evidențiază potențialul generării de oxigen in situ
pentru a spori viabilitatea celulară, cei mai mulți dintre aceștia complică locul transplantului
prin creșterea dimensiunii dispozitivului implantabil și / sau, eventual, prin introducerea de
produși secundari toxici. O sursă puternică de generare a oxigenului este descompunerea de
peroxizi solizi, în special peroxid de calciu, care este activat hidrolitic pentru a genera oxigen
prin reacția prezentată în Eq.1:
2 CaO2 +4 H 2 O →2 Ca ( OH )2+ 2 H 2 O2 → 2Ca ( OH )2 +2 H 2 O+O2 (0)
26
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Cu toate acestea, generarea de oxigen prin hidratarea peroxidului solid este prea
rapidă, ducând la condiții de hiperoxid care duc la acumularea intermediarului reacției: a
peroxidului de hidrogen și la susceptibilitatea crescută a reacțiilor secundare, cum ar fi
generarea de radicali hidroxilici (OH-).Radicalii hidroxil sunt oxidanți puternici și
reacționează,relativ nediscriminabili cu cei mai mulți compuși organici.
Incapsularea peroxidului solid într-un polimer ar putea servi la temperarea reactivității
sale hidrolitice. A fost publicată o platformă solidă de peroxid care folosește pelicule de acid
poli (lactic-co-glicolic) (PLGA), prin care potențialul generator de oxigen al acestor materiale
a fost arătat prin proliferarea îmbunătățită a fibroblaștilor și reducerea necrozei într-un model
de șoarece cu lambou de piele(skin flap muse model). Cu toate acestea, beneficiile filmelor au
fost de scurtă durată, iar cinetica reacției a fost mai puțin controlată din cauza degradării
hidrolitice a PLGA(polimer hidrofil). În plus, a fost necesară suplimentarea cu enzima
catalază pentru a atenua citotoxicitatea. Astfel, cocultura acestor materiale cu celule mai puțin
rezistente decât fibroblastele, în special cele sensibile la stresul radicalilor liberi, cum ar fi
celulele β, este extrem de nedorită.
Stiudiul prezentat urmărește fabricarea unui biomaterial generator de oxigen prin
încapsularea peroxizilor solizi într-un material hidrofob, biostabil, polidimetilsiloxan
(PDMS).
Prin încapsularea peroxidului solid într-un biomaterial foarte hidrofob, am introdus o barieră
difuzională care reduce substanțial reactivitatea sa, modulând în consecință eliberarea de
oxigen pentru mai mult de 40 de zile. Reactivitatea peroxidului încapsulat este puternic
dictată de viteza de difuzie a apei în PDMS, deoarece permeabilitatea la apă în PDMS este
foarte scăzută, iar prin încorporarea particulelor de peroxid solid permeabilitatea la apă crește
puțin. Mai mult, difuzia și permeabilitatea oxigenului în PDMS este deosebit de mare,
asigurând astfel difuzia eficientă a oxigenului din material și în mediul înconjurător. Cu acest
grad de control, geometria și dimensiunile discului, precum și încărcarea peroxidului de
calciu, pot fi manipulate pentru a obține cinetica de eliberare dorită a oxigenului. Având în
vedere că reactivitatea peroxidului este reversibilă, generarea in situ de oxigen depinde și de
condițiile de oxigen din jur, permițând astfel o altă modulare a cineticii.

Metode de sinteză

27
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

 Generarea de oxigen pe termen lung prin materiale PDMS-CaO2.

Peroxidul solid a fost încapsulat în PDMS la 25% greutate / greutate (Fig. 5A), iar
potențialul generator de oxigen al sistemului a fost monitorizat neinvaziv într-un incubator
folosind senzori de oxigen. Cu tensiunea țintă de oxigen a incubatorului setată la 0,05 mM
oxigen, sistemul reprezintă un sistem deschis, în care schimbul de gaz între soluție și aer au
avut loc la rate de difuzie limitate. Fig. 5B rezumă concentrația medie zilnică de oxigen în
soluțiile care conțin discuri PDMS-CaO2, precum și pentru discul de control numai PDMS.
Pentru discul de control numai PDMS, oxigenul a rămas constant la 0,05 ± 0,0001 mM,
confirmând stabilitatea incubatorului și lipsa producției de oxigen. Adăugarea unui singur disc
PDMS-CaO2 a dus la o creștere semnificativă a oxigenului în soluție. În prima săptămână,
concentrația de oxigen a fluctuat, în medie 0,16 ± 0,017 mM. În a doua săptămână, nivelurile
de oxigen au fost în medie de 0,12 ± 0,003 mM, în timp ce pentru următoarele 4 săptămâni
(17-45 d) nivelurile de oxigen au fost în medie de 0,073 ± 0,007 mM. Astfel, în timpul
primelor 2 săptămâni, aceste discuri generează oxigen la un grad care duce la trecerea de la un
mediu hipoxic la cel apropiat de condițiile de cultură celulară optime.

Fig. 5. A

28
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig.5.. B

 Atenuarea morții celulare induse de hipoxie prin discul PDMS-CaO2

Pentru a evalua capacitatea unui disc PDMS-CaO2 de a genera suficient oxigen pentru
a minimiza moartea celulară indusă de hipoxie, celulele MIN6, o linie celulară β, au fost
cultivate peste noapte în condiții hipoxice (0,01 mM) cu sau fără un disc PDMS-CaO2.
Supraviețuirea celulară a fost evaluată și comparată cu celulele cultivate la tensiunea standard
de oxigen (0,20 mM). Așa cum se arată în Fig. 6, cocultura celulelor MIN6 hipoxice cu
PDMS-CaO2 a prevenit moartea celulelor, evidențiată de niveluri crescute de bromură de
metiltiazolilfenil-tetrazoliu (MTT) și proteine totale, cu scăderi concomitente ale eliberării
lactatului dehidrogenazei (LDH) și ale activității caspazei.
Comparativ cu controalele normoxidice (0,20 mM), supraviețuirea celulei MIN6 în
condiții hipoxice (0,01 mM) cu discul PDMS-CaO2 a fost comparabilă sau chiar îmbunătățită,
cu niveluri statistice identice de MTT și proteine totale, precum și scăderi semnificative ale
LDH eliberarea și activitatea caspazei (P <0,05). Adăugarea unui disc PDMS-CaO2 în
condiții de cultură normoxică a dus la o creștere moderată, dar statistic semnificativă a

29
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

proteinelor totale și la scăderea eliberării LDH și a activității caspazei. Aceste rezultate din
urmă indică un beneficiu al prezenței materialului generator de oxigen chiar și în condiții
normoxidice.

Fig. 6. Incubarea celulelor beta MIN6 într-un mediu de cultură pentru 24 de ore.

 Prevenirea morții și anumitor disfuncții celulare a insulelor pancreatice induse


de hipoxie-prin intermediul discului PDMS-CaO2.

Expunerea insulelor pancreatice hipoxiei a rezultat în scăderea activității metabolice a


MTT(>60%)(Fig.6.A) și creșterea eliberării LDH și a activității caspazei (Fig. 7 C și D).
Activitatea crescută a caspazei sub hipoxie este modestă în comparație cu creșterile LDH,
indicând dominanța necrozei față de apoptoză la momentele testate. Așa cum era de așteptat,
hipoxia a dus la disfuncție în secreția de insulină stimulată de glucoză (Fig. 7B), cu o scădere
a indicelui de stimulare (glucoză ridicată / scăzută) de la puternic (15,30) la practic care nu
răspunde (1,2). Condițiile hipoxice au dus rapid la fragmentarea sferoidului celular și la
30
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

creșterea permeabilității membranei celulare, după cum reiese din LIVE/DEAD Imaging (Fig.
7E). Alternativ, s-a observat o îmbunătățire substanțială a supraviețuirii insulelor cu
adăugarea unui singur disc PDMS-CaO2, cu o creștere semnificativă a activității metabolice
celulare globale și scăderi complementare ale eliberării LDH și ale activității caspazei.
Răspunsul la glucoză al insulelor a fost menținut, cu secreția de insulină stimulată
comparabilă cu cea din martori, dar la un indice global de stimulare redus (6,94) datorită
secreției crescute de insulină bazală. Acest lucru a fost susținut în continuare de imagini vii /
moarte, care prezentau sferoide insulare foarte intacte, foarte viabile.

31
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig. 7. Celule insulare pancreatice (rat islet 1500IEQ) incubate timp de 6 ore in conditii hipoxice

 Proliferarea îmbunătățită pe termen lung a celulelor coculturate cu discuri


PDMS-CaO2
Efectele pe termen lung ale materialului PDMS-CO2 asupra proliferării și viabilității
celulelor sub tensiuni reduse (0,05 mM) de oxigen au fost investigate prin incubarea celulelor
MIN6 (3 × 105 celule pe godeu) cu un singur disc PDMS-CaO2 timp de 3 săptămâni ( Fig. 8).
La această încărcare a celulei și tensiunea oxigenului, predicția studiului a fost menținerea

32
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

numărului total de celule pentru controale, în timp ce celulele suplimentate cu un disc PDMS-
CaO2 ar prolifera datorită disponibilității crescute de oxigen.

Fig. 8. Celulele beta Min6 au fost incubate 3 saptămâni sub condiții de oxigen considerate hipoxice 0,05mM

Așa cum era de așteptat, viabilitatea globală a celulelor pentru controale a rămas
constantă pe parcursul experimentului, fără nicio modificare a activității metabolice MTT (P
= 0,101). Dimpotrivă, celulele MIN6 cultivate sub oxigen scăzut cu un disc PDMS-CaO2 au
crescut rapid în activitatea metabolică în primele 3 zile și au ajuns la un nivel echivalent cu
mai mult de două ori mai mare decât martorii (medie de 2,32 ± 0,31 ori de la 3 la 23 zile, P
<0,001). Nu a fost observată nicio modificare semnificativă a viabilității între zilele 7 și 23
pentru acest grup (P = 0,141). Dacă discul PDMS-CaO2 a fost îndepărtat, măsurătorile MTT
efectuate 3 zile mai târziu au fost statistic echivalente cu cele din controalele cu oxigen scăzut

33
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

(Fig. 4A; liniile punctate urmăresc citirile înainte și după îndepărtarea discului în zilele 3, 7 și
17).
În general, celulele β cultivate la 0,05 mM oxigen cu discul PDMS-CaO2 (Fig. 6) au
fost statistic echivalente cu celulele martor cultivate la tensiunea standard de oxigen (0,20
mM) (Fig. 9). Introducerea discului PDMS-CaO2 în celule la nivelul de oxigen de 0,2 mM, cu
toate acestea, nu a afectat în mod substanțial activitatea metabolică celulară generală per
absorbanță MTT (Fig. 9). Această lipsă de beneficii la o concentație normală de oxigen indică
faptul că oxigenul nu mai este factorul limitativ pentru proliferarea MIN6; mai degrabă alți
factori, cum ar fi disponibilitatea glucozei sau inhibarea contactului, previn creșteri
suplimentare ale proliferării celulare. Controalele discului PDMS(fără CaO2) au fost statistic
identice cu controalele fără materiale (Fig. 9 și 10), verificând faptul că prezența doar a
PDMS-ului nu are niciun efect asupra supraviețuirii celulare.
Conținutul de ADN al celulelor din cadrul acestor grupuri experimentale a urmat
tendințe similare cu rezultatele MTT: ADN-ul total pentru godeurile cultivate cu discurile
PDMS-CaO2 a fost de 2,51 ± 0,36 ori mai mare decât la martorii în condiții identice de
oxigen scăzut din ziua 7 până la 24 ( Fig. 4B; P <0,001), indicând o creștere substanțială și
susținută a numărului total de celule pe parcursul experimentului.
Imagini confocale în timp viu / mort (Fig. 8.C) ale celulelor MIN6 cultivate sub
tensiune scăzută de oxigen (0,05 mM) au dezvăluit viabilitate sporită și proliferarea celulelor
atunci când discul PDMS-CaO2 era prezent. În plus, celulele incubate cu discuri PDMS-
CaO2 au avut tendința de a forma sferoide celulare mai mari, datorită fie creșterii celulelor în
grupuri, datorită agregării.

34
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

35
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig. 9. Viabilitatea celulelor MIN6, cuantificată prin testul metabolic MTT, cultivată la 20% tensiune de oxigen
(0,20 mM) cu un singur disc PDMS-CaO2 (diamante solide), un singur disc PDMS (diamante gri) sau fără niciun disc
( diamante deschise). Nu s-a detectat nicio diferență statistică între grupurile ce au avut doar PDMS și grupurile fară disc,
cu excepția zilei 14 (P = 0,44). O diferență statistică semnificativă între grupul care conține discul PDMS-CaO2 și celelalte
condiții au fost detectate în zilele 10 și 14. Barele de eroare reprezintă deviația standard din medie, cu n = 3 pe condiție.

Fig. 10. Viabilitatea celulelor MIN6, cuantificată prin testul metabolic MTT, cultivată la 5% tensiune de oxigen
(0,05 mM) cu un singur disc PDMS-CaO2 (diamante solide), un singur disc PDMS-unic (diamante gri) sau fără niciun disc (
diamante deschise). Nu s-a detectat nicio diferență statistică între discurile PDMS și grupuri fără disc după 3 zile (P =
0,78). Barele de eroare reprezintă deviația standard din medie, cu n = 3 pe condiție)

 Viabilitate îmbunătățită a celulei β pentru construcții 3D de agaroză care conțin


discuri PDMS-CaO2
Pentru a evalua potențialul materialelor generatoare de oxigen într-un implant 3D
proiectat de țesut, celulele MIN6 (25 × 105 celule totale) au fost cultivate în construcții de
agaroză timp de 3 zile în condiții hipoxice (0,05 mM) sau normoxice (0,20 mM) cu o disc
PDMS plasat central (control) sau PDMS-CaO2 (Fig. 9A).

36
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig. 11. Viabilitate crescută a celulelor β MIN6 în construcțiile care conțin disc PDMS-CaO2. (A) Schema
construcțiilor de agaroză care conține un singur disc PDMS-CaO2 de 25% în greutate / greutate. Discul interior PDMS-
CaO2 avea 8 mm diametru și 1 mm înălțime, iar adăugarea construcției exterioare MIN6 / agaroză a dus la o construcție
finală de 10 mm diametru / 3 mm înălțime. (B)Modificarea pliurilor în viabilitatea MIN6, evaluată prin testul metabolic
MTT, peste valorile inițiale de încărcare a celulei după 3 zile de cultură, 25 × 105 celule MIN6 în construcții de agaroză
fără sau cu un disc PDMS-CaO2. Valorile pliurilor peste 1 reprezintă o creștere a viabilității celulei în timpul perioadei de
cultură. Eroare = SD, n = 3. * P <0,05, testul t al studentului. (C) Imagini confocale reprezentative z-stivuite ale celulelor β
MIN6 colorate cu vii / moarte (vii, verzi; moarte, roșii) și coincuse cu discuri numai PDMS (control, superior) sau PDMS-
CaO2 (inferior) fie 0,2 mM ( Stânga) sau 0,05 mM (Dreapta) oxigen. (Bare de scară, 200 μm.)

Fig. 7B rezumă modificarea pliurilor a activității metabolice MTT a fiecărui grup,


comparativ cu controalele din ziua 0. La oxigen 0,20 mM, nu s-a observat nicio îmbunătățire
a viabilității celulare pentru niciunul dintre grupuri după cultura de 3 zile. Cu toate acestea,
pentru construcțiile de control cultivate la 0,05 mM oxigen, viabilitatea celulelor a fost
substanțial redusă (53%). Viabilitatea celulelor la 0,05 mM oxigen a fost semnificativ
îmbunătățită atunci când a fost prezent un disc PDMS-CaO2 (93%), dovedindu-se statistic
identic cu grupul de oxigen 0,20 mM (P = 0,52). Imaginile vii / moarte ale secțiunilor
transversale ale constructelor au prezentat diferite modele de viabilitate celulară după 3 zile în
cultură (Fig. 11C). Pentru construcțiile de control, o margine de celule vii poate fi distinsă pe
marginea exterioară a constructului, înconjurând un miez central de celule moarte. Așa cum
era de așteptat, grosimea miezului viabil este puțin mai mare pentru starea de cultură a
oxigenului mai ridicată. Acest model este tipic pentru implanturi, prin care cea mai mare
tensiune de oxigen este la periferia implantului. Dimpotrivă, această demarcare viabilă este
absentă atunci când este prezent discul PDMS-CaO2. Deși un număr ușor mai mare de celule
viabile poate fi observat în condiții normoxice, celulele vii și moarte sunt amestecate în felie
și nu este vizibilă nicio preferință spațială. Aceste rezultate indică faptul că gradientul de
37
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

oxigen care duce de obicei la buzunarele interioare ale celulelor moarte sau disfuncționale
este absent atunci când un disc PDMS-CaO2 este plasat central în interiorul construcției.

 Efectul disponibilității oxigenului asupra viabilității celulei β.


Pentru a caracteriza pe deplin relația dintre viabilitatea celulei β și disponibilitatea
oxigenului, disponibilitatea oxigenului în structurile de agaroză a fost variată prin (i)
încărcarea totală a celulei(variază de la 5 la 25 × 10 5 celule per construct), (ii) tensiunea
externă a oxigenului(condiții hipotoxice (0,05mM) și normoxice (0,20mM)) și (iii) prezența
sau absența materialului generator de oxigen(disk de PDMS sau PDMS-CaO2 așezat la centru)
. Modelarea prin simulare folosind softul multiphysics COMSOL a fost utilizată pentru a ajuta
la prezicerea gradienților de oxigen din structurile 3D de agaroză. Rezultatele modelării nu
numai că asigură o distribuție spațială a oxigenului în întreaga construcție, dar pot fi folosite
și pentru a prezice cantitativ volumul procentual al constructului expus la hipoxie severă, care
poate fi apoi utilizat pentru a prezice și / sau caracteriza rezultatele experimentale.

Fig. 12. Modele de simulare multipfazică a gradienților de oxigen din construcțiile 3D de agaroză care conțin fie
disc PDMS, fie PDMS-CaO2

Pentru o încărcare celulară de 25 × 10 5 celule, în grupul control se formează un nucleu


hipoxic substanțial în cazul oxigenului minim(cu un volum de 61% cu concentrații de 0mM
oxigen), iar în cazul oxigenului maxim, nucleul hipoxic este ameliorat(5% vol la 0 mM
oxigen)
Modelele prezic că introducerea unui disc generator de oxigen reduce semnificativ
zonele de hipoxie sub tensiune scăzută de oxigen (11% vol la 0 mM oxigen) și elimină
hipoxia pentru constructele sub tensiune standard de oxigen. Pe măsură ce încărcarea celulei
este redusă la 15 × 105 celule, gradienții de oxigen din structuri devin mai puțin pronunțați. În
condiții de oxigen extern scăzut (0,05 mM), o porțiune mai mică din construcție este sever
hipoxică (12% vol la 0 mM oxigen), indicând faptul că încărcarea cu celule mai puține
38
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

servește la creșterea disponibilității globale de oxigen. Simulările prezic că adăugarea discului


PDMS-CaO2 elimină aceste regiuni hipoxice. La 0,2 mM oxigen extern, regiunile sever
hipoxice sunt minime pentru această încărcare a celulei (<0,5%), limitând astfel beneficiul
discului PDMS-CaO2. Pentru celulele 5 × 105, gradienții de oxigen sunt minimi, iar tensiunea
de oxigen din structurile de control este menținută cu mult peste zero oxigen atât la tensiunile
de oxigen înconjurătoare cât și la cele standard. Adăugarea discului PDMS-CaO2 crește doar
nivelurile de oxigen. În general, aceste modele prezic o îmbunătățire moderată până la
substanțială a viabilității celulare pentru încărcări celulare de la 15 ×10 5 la 25 × 105 celule,
atunci când sunt cultivate într-un mediu cu oxigen scăzut (0,05 mM). De remarcat, modelele
de simulare nu iau în considerare proliferarea și remodelarea celulară, restrângând astfel
precizia lor la culturile inițiale.
Pentru a corela predicțiile modelului de disponibilitate a oxigenului cu rezultatele
experimentale, celulele MIN6 au fost încărcate în structuri de agaroză și incubate atât în
condiții de oxigen scăzute (0,05 mM), cât și în condiții standard (0,20 mM) de oxigen la cele
trei densități celulare testate: 5 × 105, 15 × 105 și 25 × 105 celule MIN6 per construct (Fig.
13). Rezultatele sunt exprimate ca creșterea pliurilor fiecărui grup de PDMS-CaO2 peste
controlul său corespunzător (numai PDMS), prin care valorile de pliere mai mari de 1,0 indică
faptul că discul PDMS-CaO2 are un efect pozitiv asupra viabilității celulei, iar valorile mai
mici de 1,0 indică un efect dăunător. O tendință care poate fi observată cu ușurință este că,
pentru toate densitățile de încărcare a celulelor, creșterea pliurilor grupurilor PDMS-CaO2
peste controale este mai mare pentru condițiile hipoxice. Pentru densități relativ mici de
încărcare a celulelor (5 × 105 celule), grupurile tratate au viabilitate mai mică în comparație cu
martorii (<1,0) atât la tensiunile de oxigen atât scăzute, cât și la cele standard, prezentând o
scădere a viabilității celulei atunci când sunt prezente discurile PDMS-CaO2. Pentru 15 × 10 5
celule, discul PDMS-CaO2 este dăunător la 0,20 mM oxigen, dar are un efect neutru la 0,05
mM oxigen. La cea mai mare încărcare de celule testată, 25 × 105 celule, viabilitatea
grupurilor tratate este mai mare decât cea a martorilor, la ambele tensiuni de oxigen.

39
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Fig. 13. Testare în vitro colorimetrică influențată de densitatea celulară

În general, se observă o tendință generală de creștere a viabilității celulare la


adăugarea discului PDMS-CaO2 pe măsură ce crește încărcarea celulei atât în condiții de
cultură de oxigen scăzute, cât și în condiții standard. Aceste rezultate se corelează puternic cu
predicțiile modelării multifizice. [4]

40
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Metode de caracterizare
1. Activitatea metabolică a celulelor MIN6 a fost evaluată prin testul MTT (Promega).
Probele au fost spălate o dată, suspendate în 250 μL de mediu plus 28 μL de colorant
MTT și incubat timp de 1 oră. După aceea, 185 μL de soluție stop / solubilizare a fost
adăugată (o soluție ce vine cu chitul de reacție are rolul de a opri reacția prin solubilizarea
formazanului pentru a putea fi înregistrată absorbanța) în fiecare eprubetă,apoi au fost
depozitate, învelite în parafilm, timp de 24 de ore pentru a permite solubilizarea completă
a cristalelor de formazan. Ulterior, 120-μL din fiecare probă au fost încărcate într-o placă
cu 96 de godeuri și absorbția la 570 nm a fost măsurată utilizând un cititor de microplacă
Spectramax M5(Molecular Devices).
1.1. Celulele viabile cu metabolism activ transformă MTT în formazan. Celulele moarte
pierd această. Astfel, formarea culorii servește ca un marker util și convenabil numai
pentru celulele viabile. Absorbanta masurata la 570 nm este proportionala cu numarul
de celule viabile.
1.2. Testul MTT este o măsură a activității metabolice a celulelor analizate; cu cât
activitatea metabolică este mai mare în eșantion, cu atât semnalul este mai mare.

2. Proteine totale. Pentru proteina totală, 300 pl de celule au fost spălate cu PBS și suspendat
în 400 μL de 0,1 M NaOH prin pipetare viguroasă. Conținutul de proteine a fost
determinat prin testul de proteine BCA Kit: 25 μL de probă de celule și 200 μL de reactiv
de lucru au fost placat într-o placă cu 96 de godeuri limpede optic și incubat timp de 30
min la 37 Celsius și absorbanța a fost măsurată la 562 nm cu a cititor de plăci
2.1. PBS- soluție tampon Dulbecco(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) are multiple
roluri
2.1.1. Oferă celulelor apă și anumiți ioni anorganici esențiali pentru metabolismul
celular normal.
2.1.2. Servește nu numai ca fluid de irigare și transport, ci și ca diluant menținând în
același timp osmoreglarea, echilibrul optim și constant al gradienților de presiune
osmotică între compartimentele intracelulare și extracelulare.
2.1.3. Menține ph celular în intervalul fiziologic 7,2-7,6
2.1.4. Atunci când este combinat cu un carbohidrat (CHO), cum ar fi glucoza
(C6H12O6), acesta furnizează principala sursă de energie pentru procesele
metabolice celulare.
41
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

2.2. Testul acidului bicinchoninic (test BCA)


2.2.1. Cantitatea de Cu2+ ,provenit de la sulfatul de cupru(II), redus este direct
proporțională cu cantitatea de proteină prezentă în soluție(Cu 2+ se poate lega de
cisteină,tirozină sau triptofan);
2.2.2. Cupru(Cu+ se leaga de acidul bicinchoninic și formează un complex violet ce
absoarbe lumină la 560 nm
2.2.3. Cantitatea de proteină prezentă în soluție poate fi cuantificată prin măsurarea
spectrelor de absorbție(cu Spectramax M5)și compararea cu soluțiile proteice de
concentrație cunoscută.

3. Eliberare de LDH este o metoda chimică de derminare a citotoxicității.


Eliberarea de LDH a fost cuantificată pe supernatanții colectați prin trusa de detectare a
citotoxicității (Roche): 100 μL de probă de supernatant și 100 μL de amestec de reacție au
fost plasate într-o placă cu 96 de godeuri limpede optic și incubată timp de 30 de minute
la 22 grade C; reacția enzimatică a fost oprită prin adăugarea a 50 μL de HCI 1M, iar
absorbanța a fost măsurată la 492 nm cu un cititor de plăci (măsurători triplicate). Pentru
MIN6, LDH a fost exprimat ca unități arbitrare (AU) / μg proteine totale, dintre care UA
reprezintă citiri de absorbanță × 100. Pentru insulele pancreatice de șobolan, nivelurile de
LDH au fost peste pragul absorbantei și au fost ulterior diluate de la 5 la 10 ori pentru
măsurare. Astfel, LDH este exprimat ca AU. Valorile LDH nu au fost normalizate pentru
proteina totală pentru insule, având în vedere nivel ridicat de proteine ale matricei
extracelulare în insulele de cultură, care domină măsurătorile totale ale proteinelor.

42
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

3.1. LDH(lactat dehidrogenază) este o enzimă stabilă, prezentă în toate celulele, ce e rapid
eliberată în exteriorul celulei din cauza deteriorării membranei celulare.
3.2. O creștere a cantității de celule moarte sau deteriorate de membrană plasmatică
rezultă o creștere a activității enzimei LDH în supernatantul de cultură. Această
creștere a cantității de activitate enzimatică în supernatant se corelează direct cu
cantitatea de formazan format într-o perioadă limitată de timp. Prin urmare, cantitatea
de culoare formată în test este proporțională cu numărul de celule lizate. Colorantul
formazan format este solubil în apă și prezintă un aspect larg absorbție maximă la
aproximativ 500 nm, în timp ce sarea de tetrazoliu INT arată nicio absorbție
semnificativă la aceste lungimi de undă
3.3. Chitul de determinare al citotoxicității fabricat de PROMEGA, folosește același
principiu doar că alt colorant “luciferin” care este convertit în semnal bioluminescent
de către o enzimă ce vine cu chitul lor, Ultra-Glo™ rLuciferase (Reacția necesită
ATP). Intensitatea luminoasă este direct proporțională cu deteriorarea celulară.

4. Activitatea Caspazei. Generarea caspazei a fost evaluată de Caspase-Glo 3/7 Test


(Promega), prin care activitatea caspazei în celule a fost cuantificată prin incubarea a 100
μL de probă de celule și 100 μL de reactiv Caspase-Glo într-o placă albă, opacă, cu 96 de
godeuri. Luminescența a fost înregistrată după 90 de minute de incubație la 22 grade C.
Pentru MIN6, activitatea caspazei a fost normalizată la proteine totale măsurate.
4.1. Caspaza-3 este o enzimă foarte importantă în cascada de activare secvențială a
diverselor caspaze (apoptoză celulară),este parțial sau total responsabil de scindarea
proteolitică a multe proteine cheie, cum ar fi enzima nucleară poli (ADPriboză)
polimerază (PARP-enzimă responsabilă de repararea ADN-ului).
4.2. Caspaza-7 a fost identificată ca un contribuitor major la executarea apoptozei.
Caspaza-7, ca și caspaza-3, este o caspază efectoare care este responsabilă pentru
scindarea anumitor substraturi cu rol în declanșarea unor factori de transcripție pentru
remodelarea celulară, cum ar fi PARP.
4.3. Setul de testare a activității Caspase-3 este un test fluorescent care detectează
activitatea caspazei-3 în celulele lizate. Conține un substrat fluorogen (N-AcetylAsp-
Glu-Val-Asp-7-amino-4-metilcumarină sau Ac-DEVD-AMC) pentru caspaza-3. În
timpul testului, caspase-3 activat scindează acest substrat între DEVD și AMC,

43
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

generând AMC puternic fluorescent care poate fi detectat folosind un cititor de


fluorescență cu excitație la 380 nm și emisie între 420 - 460 nm.
4.4. Scindarea substratului apare numai în celulele lizatele sau apoptotice; de aceea,
cantitatea de AMC produs este proporțională cu numărul de celule apoptotice
4.5. Similar cu caspazele-2 și -3, caspaza-7 clivează preferențial substratul(DEVD-AMC)
în urma recunoașterii secvenței: DEVD

Figură 1

4.6. Luminescența este proporțională activitatea caspazei prezentă . Reactivul Caspase-


Glo® 3/7 se bazează pe proprietățile luciferazei termostabilă (Luciferază
recombinantă Ultra-Glo ™), care este formulată pentru a genera un „tip de strălucire”
stabil; semnal luminiscent și îmbunătățește performanța într-o gamă largă de condiții
de testare.
4.7. Testul Caspase-Glo® 3/7 este conceput pentru a fi utilizat cu format cu plăci
multiple, făcându-l ideal pentru screeningul automat al activității caspazei sau
apoptozei. Testul a fost automatizat în format de 96, 384 și 1536 godeuri.

5. (LIVE/DEAD™ Viability/Cytotoxicity Kit) Viabilitatea celulei a fost vizualizată / Trusa


de viabilitate / citotoxicitate (Invitrogen) și imagistică un microscop confocal inversat
Leica SP5. Au fost colectate alicote omogene de volume identice din fiecare grup pentru
a permite compararea între tratamente. Celulele au fost pe scurt clătite în HBSS o dată și
incubat timp de 45 de minute într-un PBS compus de 4 μM calceină AM și 8 μM etidiu

44
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

homodimer-1 (5). Celulele au fost apoi clătite în HBSS și plasate pe o lamă de sticlă
pentru vizualizare printr-un microscop confocal cu scanare fluorescentă pentru viu celule
(verzi) (excitație, 494 nm; emisie, 517 nm) și moarte celule (roșii) (excitație, 528 nm;
emisie, 617 nm). Pentru insulițe și au fost colectate și combinate imagini multislice (5 μm)
folosind software-ul Leica.
5.1. Kitul EarlyTox Live / Dead Assay Kit conține doi markeri pentru celulele vii sau
moarte care pot fi utilizați pe celulele mamiferice. Calcein AM este un marker de
celule vii utilizat pe scară largă. Calceina AM non-fluorescentă pătrunde în
membrana celulară intactă și este transformată în calceină, forma fluorescentă, de
esteraze intracelulare. Celulele vii sunt colorate cu fluorescență verde intensă în
citosol. Pentru testele de proliferare celulară sau alte teste în care se dorește doar
colorarea celulelor vii, calceina AM poate fi utilizată ca reactiv independent așa cum
este prevăzut în setul EarlyTox ™ Live Cell Assay Kit (P / N R8342 pentru kitul
Explorer, P / N R8343 pentru Bulk trusa).
5.2. Ethidium homodimer-III (EthD-III) este practic non-fluorescent și impermeabil la o
membrană plasmatică intactă. În cazul compromiterii integrității membranei celulare
care este asociată cu moartea celulelor, EthD-III intră în celule și se leagă de acizii
nucleici, rezultând fluorescență roșie aprinsă în celulele moarte. Evenimentele
citotoxice care afectează integritatea membranei celulare pot fi evaluate cu exactitate
folosind această metodă.
5.3. Semnalele fluorescente de la calceină și EthD-III pot fi detectate folosind un cititor de
microplacă fluorescentă SpectraMax și analizate rapid utilizând un protocol
preconfigurat în SoftMax® Pro Software pentru a determina cantitățile relative de
celule vii și moarte.
5.4. Este posibil ca evenimentele citotoxice care nu afectează membrana celulară să nu fie
evaluate cu exactitate folosind această metodă. Nivelurile de fluorescența de fond
sunt inerent scăzute cu această tehnică de testare deoarece coloranții sunt practic non-
fluorescenți înainte de a interacționa cu celulele.[4]

45
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

CONCLUZII

În acest studiu, s-a urmărit încapsularea peroxidului de calciu în discurile PDMS


pentru a fi utilizat ca biomaterial generator de oxigen adecvat pentru susținerea viabilității și
funcționării celulelor în condiții hipoxice. Fără încapsulare, compușii pe bază de peroxid
eliberează rapid oxigen la contactul cu apa, rezultând concentrații de oxigen inutilizabile și
tranzitorii. Prin încapsularea peroxidului solid într-un biomaterial foarte hidrofob, am introdus
o barieră difuzională care reduce substanțial reactivitatea sa, modulând în consecință
eliberarea de oxigen pentru mai mult de 40 de zile. Reactivitatea peroxidului încapsulat este
puternic dictată de viteza de difuzie a apei în PDMS, deoarece permeabilitatea la apă în
PDMS este foarte scăzută, deși este probabil crescută prin încorporarea particulelor de
peroxid solid. În plus, difuzia și permeabilitatea oxigenului în PDMS este deosebit de mare,
asigurând astfel difuzia eficientă a oxigenului din material și în mediul înconjurător. Cu acest
grad de control, geometria și dimensiunile discului, precum și încărcarea peroxidului de
calciu, pot fi manipulate pentru a obține cinetica de eliberare dorită a oxigenului. Având în
vedere că reactivitatea peroxidului este reversibilă, generarea in situ de oxigen depinde și de
condițiile de oxigen din jur, permițând astfel o altă modulare a cineticii.
Scopul studiului a fost urmărirea și evaluarea capacității acestui material de a păstra
viabilitatea și funcționarea celulelor în condiții hipoxice pentru celulele β. Cocultura de
materiale generatoare de oxigen cu celule MIN6 β și insulele pancreatice de șobolan a
demonstrat că discurile PDMS-CaO2 atenuează dramatic moartea și disfuncția celulelor
induse de hipoxie, limitând activarea căilor de stres celular și trecerea la metabolismul
anaerob. Mai mult, acest efect poate fi observat pe termen lung, dovadă fiind supraviețuirea
susținută a celulelor de peste 3 săptămâni în cultură. Îndepărtarea discurilor PDMS-CaO2 din

46
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

grupurile tratate întărește teoria conform căreia îmbunătățirile observate se datorează exclusiv
eliberării de oxigen și nu datorită unui artefact sau a unei protecții inițiale împotriva hipoxiei.
De asemenea, trebuie remarcat faptul că nu au fost utilizate în acest studiu materiale pentru
eliminarea radicalilor liberi sau a peroxizilor, spre deosebire de alte rapoarte publicate care
utilizează peroxizi solizi în care catalaza a fost utilizată pentru toate studiile experimentale.
Evaluarea discurilor PDMS-CaO2 încorporate în hidro-gelurile au ilustrat, de
asemenea, beneficiile acestor materiale generatoare de oxigen atunci când celulele sunt
expuse la condiții hipoxice. Amplasarea discurilor generatoare de oxigen în centrul
construcției a dus la cel mai mare beneficiu prin scăderea gradienților interni de oxigen. Acest
lucru este verificat prin rezultate de modelare predictivă, care s-au corelat puternic cu
rezultatele experimentale prin care activitatea metabolică celulară a fost comparabilă cu
constructele cultivate la presiuni de oxigen de patru ori mai mari. Imagistica distribuției
viabile a celulelor β în construcțiile de agaroză a permis evaluarea proliferării și remodelării
celulare ca răspuns la disponibilitatea oxigenului. Construcțiile de control au prezentat modele
de viabilitate tipice pentru disponibilitatea limitată a oxigenului, cu celule vii retrogradate pe
o margine subțire pe marginea exterioară a constructului și un nucleu de celule predominant
moarte. Construcțiile care conțin discuri PDMS-CaO2, însă, au ilustrat o distribuție uniformă
a celulelor predominant vii, indicând un model divergent în remodelarea celulară. Acest lucru
stabilește în continuare că discul PDMS-CaO2 ameliorează hipoxia centrală oferind o sursă
suplimentară de oxigen provenind din centrul constructului, acolo unde este cel mai necesar.
Studiile care urmăresc să evalueze corelația dintre disponibilitatea oxigenului și
viabilitatea celulelor β ilustrează beneficiile acestor materiale generatoare de oxigen în cadrul
construcțiilor 3D atunci când oxigenul este limitat. Scăderile încărcării celulelor au scăzut
efectul pozitiv al materialelor PDMS-CaO2, probabil din cauza ratei totale mai mici a
consumului de oxigen, care, atunci când este asociat cu eliberarea de oxigen de pe discurile
PDMS-CaO2, are ca rezultat un surplus local de oxigen. Condițiile de hiperoxie pot fi la fel
de dăunătoare pentru celule ca hipoxia, în special pentru celulele care sunt mai sensibile la
stresul radicalilor liberi, cum ar fi celulele β. Prin urmare, utilizarea acestor materiale în
construcții restrânse trebuie să fie relegată la scenarii în care este posibil să se dezvolte
gradienți nocivi de oxigen. Așa cum se ilustrează în acest studiu, modelarea matematică poate
fi utilizată pentru a prezice ce încărcări celulare și geometrii implanturilor vor duce la limitări
de oxigen. Prin urmare, dozarea materialului generator de oxigen, încărcarea peroxidului,
geometria și raportul suprafață / volum, pot fi ulterior adaptate.
47
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Deoarece discurile PDMS-CaO2 sunt cele mai benefice la densități mari de încărcare a
celulelor, ele reprezintă un instrument ideal pentru îmbunătățirea oxigenării țesuturilor
prelucrate pe bază de celule, în special în perioada inițială de gravare. Prin suplimentarea
oxigenului în timpul perioadei precare de vascularizație, pierderea celulară indusă de hipoxie
ar putea fi redusă. Se prevede că implanturile bazate pe PDMS ar fi foarte de dorit pentru
transplanturilor, având în vedere profilul său de siguranță clinică dovedit și utilizarea prolifică
în administrarea locală a agenților. Cu proprietăți de aderență reduse, inserția PDMS poate fi
îndepărtată cu ușurință odată ce peroxidul solid încorporat este expirat sau suplimentarea
locală de oxigen nu mai este dorită. Deși un potențial dezavantaj al acestei abordări este că:
anumite căi ce stimulează eliberarea factorilor de creștere angiogenă induse de hipoxie ar fi
suprimate și ar putea întârzia vascularizarea implantului, anticipăm că acest efect ar putea fi
atenuat prin livrarea codului de factori proangiogeni. În general, am demonstrat utilitatea
materialelor noastre pentru a atenua moartea celulară indusă de hipoxie, ceea ce ar fi extrem
de dorit pentru păstrarea viabilității celulelor transplantate după transplant, în special pentru
implanturile pentru care dozarea celulară este critică pentru eficacitate, cum ar fi în
transplantul de celule β pentru diabetul de tip 1.

48
Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti
Facultatea De Inginerie Medicală

Bibliografie[1] M. Gholipourmalekabadi et al., “Oxygen-generating nanobiomaterials


for the treatment of diabetes: A tissue engineering approach,” in Nanobiomaterials in
Soft Tissue Engineering: Applications of Nanobiomaterials, Elsevier Inc., 2016, pp.
331–353.
[2] J. Khodaveisi, H. Banejad, A. Afkhami, E. Olyaie, S. Lashgari, and R. Dashti,
“Synthesis of calcium peroxide nanoparticles as an innovative reagent for in situ
chemical oxidation,” J. Hazard. Mater., vol. 192, no. 3, pp. 1437–1440, Sep. 2011, doi:
10.1016/j.jhazmat.2011.06.060.
[3] A. I. Morais et al., “Electrospraying oxygen-generating microparticles for tissue
engineering applications,” Int. J. Nanomedicine, vol. 15, pp. 1173–1186, 2020, doi:
10.2147/IJN.S237334.
[4] E. Pedraza, M. M. Coronel, C. A. Fraker, C. Ricordi, and C. L. Stabler, “Preventing
hypoxia-induced cell death in beta cells and islets via hydrolytically activated, oxygen-
generating biomaterials,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 11, pp. 4245–
4250, Mar. 2012, doi: 10.1073/pnas.1113560109.

49