CONSERVAREA EMBRIONILOR PRIN

CONGELARE

La temperatura ambiantă de 18-200 C, embrionii pot fi păstraţi cel mult 5 ore (intervalul
maxim de timp de la recoltare până la transfer). La temperatura de 37-380 C, într-un mediu de
cultură adecvat, embrionii pot fi păstraţi 12-24 de ore. Stocarea pe termen lung a embrionilor nu
este posibilă decât prin congelarea în azot lichid (-1960 C).
Transferul de embrioni este asociat, de cele mai multe ori, cu congelarea embrionilor. În
Europa, cca 47% din embrionii recoltaţi sunt congelaţi înainte de a fi transferaţi. Ratele de
gestaţie obţinute în urma transferării embrionilor congelaţi sunt de 40-50%.
Congelarea embrionilor a permis reducerea costurilor embrio-transferului, deoarece
numărul femelelor receptoare care trebuie pregătite nu depinde de numărul embrionilor
recoltaţi, embrionii excedentari sunt congelaţi şi transferaţi atunci când sunt disponibile vaci
receptoare. Aceasta permite ca operaţiunea de transfer a embrionilor să devină independentă
de recoltarea acestora, de asemenea permite o mai bună sincronizare între stadiul de
dezvoltare al embrionilor şi statusul reproductiv al femelelor receptoare (intervalul de timp de la
estru până la transferul embrionilor).
Pe de altă parte, congelarea permite schimburile de embrioni între ferme sau între ţări.
Congelarea embrionilor face posibil transportul acestora pe distanţa lungi, care se realizează cu
mai puţine riscuri şi cheltuieli, comparativ cu transportul animalelor şi operaţiunile de carantină.
De asemenea, congelarea este importantă pentru crearea “băncilor de embrioni”, care
asigură o mai eficientă utilizare a potenţialului genetic al femelelor superioare şi conservarea
speciilor sau raselor rare sau pe cale de dispariţie.

1. PRINCIPIILE CONGELĂRII EMBRIONILOR

Spre deosebire de spermatozoid, embrionul este un ansamblu de celule bogate în apă,

are talie mare şi evoluează în timp. Congelarea embrionilor pune mari probleme datorită
influenţei negative a doi factori: gheaţa intracelulară, care lezează membrana citoplasmatică şi
deshidratarea bruscă a celulelor embrionare.
Un alt fenomen delicat este reîncălzirea mediului în timpul congelării, care se produce
între -40 C şi -200 C. Pentru a preveni reîncălzirea, trebuie indusă cristalizarea mediului de
congelare a embrionilor - seeding.
Embrionii trebuie congelaţi într-un interval de maximum 3-4 ore de la recoltare. Se
congelează numai embrionii de calitate bună şi foarte bună, deoarece rezistă mai bine la
congelare.
Supravieţuirea embrionilor în timpul congelării este asigurată de răcirea controlată a
mediului şi de substanţele crioprotectoare care atenuează şocul osmotic şi stabilizează
membranele celulare în timpul congelării. Se utilizează două categorii de crioprotectori:
- crioprotectori penetranţi: glicerol, dimetil sulfoxid (DMSO), 1,2-propandiol (propilen
glycol) (PROH), etylen glycol, etc;
- crioprotectori nepenetranţi: sucroza, galactoza, polivinilpirolidona, arabinoglicanii, etc.
Dacă embrionii sunt lăsaţi în contact cu crioprotectorii un timp îndelungat, la temperatura
camerei, aceştia devin toxici. Cel mai utilizat crioprotector pentru congelarea embrionilor de
bovine este glicerolul, în concentraţie de 1,4 moli sau 10% volum.
Principiul de bază al congelării embrionilor constă în extragerea apei din celule, cu
ajutorul crioprotectorilor şi scăderea treptată a temperaturii. De la temperatura laboratorului,
până la - 70C, scăderea temperaturii se face cu 10 C/minut. La temperatura de -70 C, se induce
cristalizarea mediului de congelare (seeding) cu ajutorul unei baghete metalice, care a fost
ţinută în azot lichid. După aceea, temperatura continuă să fie coborâtă cu 0,30 C/minut, până la
minus 30-350C, după care paietele cu embrionii se imersează în azot lichid (-1960 C).
 2. PROCEDEE DE CONGELARE A
EMBRIONILOR

În ultimii ani, procedeele de congelare a embrionilor au fost îmbunătăţite, ceea ce a

permis supravieţuirea embrionilor de bovine şi ovine în proporţie de peste 90%, iar ratele de
gestaţie, după transferul nechirurgical al embrionilor, să fie de cca 50%.
Ovocitele, embrionii în stadii timpurii de dezvoltare, embrionii micromanipulaţi (bisecţie,
biopsie, clonare) şi embrionii de suine nu sunt congelaţi cu succes, înregistrându-se rate foarte
scăzute de supravieţuire.
Bazate pe principiile criobiologiei, s-au dezvoltat mai multe procedee de congelare a
embrionilor: congelarea controlată, metoda “one step”, vitrificarea şi congelarea ultrarapidă.
Aceste procedee permit ca ratele de supravieţuire a embrionilor de bovine, ovine, caprine (în
stadiile de morulă şi blastocist) să ajungă la 90-100%, iar ratele de gestaţie în urma transferului
embrionilor congelaţi/decongelaţi să fie de 40-50%.
Congelarea/decongelarea controlată a embrionilor constă în următoarele etape:
- introducerea embrionului într-o soluţie de 1,4 M Glicerol şi echilibrarea osmotică, timp
de 10-20 de minute, la temperatura camerei;
- aspirarea în paiete de 0,25 ml în următoarea ordine: coloană cu soluţie de glicerol, bulă
de aer, coloană cu soluţie de glicerol şi embrionul, bulă de aer, coloană cu soluţie de glicerol
până la umplerea paietei (Fig. 23);
- închiderea paietei cu un dop de plastic, de 1/4;
- răcirea treptată cu 10 C/minut, până la temperatura de minus 6-70 C;
- inducerea cristalizării (seeding) la temperatura de minus 6-70 C, timp de 5 minute;
- scăderea lentă a temperaturii, cu 0,30 C/minut, de la -70 C până la -280 C;
- scăderea temperaturii, cu 0,10 C, de la -280 C până la -350C;
- imersarea în azot lichid (-1960 C);
Glicerolul este utilizat mai frecvent ca agent crioprotector deoarece este mai puţin toxic
pentru embrioni.
Decongelarea implică şi rehidratarea controlată a embrionilor, pentru a preveni şocul
osmotic şi degradarea celulelor embrionare.
Decongelarea se face în aer, la temperatura camerei, timp de 5-6 secunde, după care,
în apă la temperatura de +20-350 C, timp de 20 secunde.
După decongelare, conţinutul paietei, cu embrionul, este golit în 3,3 ml soluţie (1 ml
zaharoză + 6,7 ml glicerol), timp de 5 minute, după care se transferă, pentru 5 minute, în 3,3 ml
soluţie (1 ml zaharoză + 3,3 ml glicerol + 3,3 ml PBS (0,4% BSA)), se transferă în a treia soluţie
de 3,3 ml (1 ml zaharoză + 6,7 ml PBS (0,4 BSA)) pentru 5 minute.
După îndepărtarea crioprotectorului, embrionii sunt transferaţi într-un mediu de cultură:
Emcare – Embryo holding solution sau PBS+0,4% BSA şi se apreciază viabilitatea acestora
după criterii morfologice. După evaluare, embrionii sunt aspiraţi în alte paiete de 0,25 ml, în
aceleaşi medii proaspete şi transferaţi la femelele receptoare.
Congelarea controlată a embrionilor de bovine este urmată de rate de supravieţuire de
95-100%, iar ratele de gestaţie depăşesc 50%.
Rate superioare de supravieţuire se obţin în urma congelării embrionilor clasificaţi
morfologic foarte buni şi buni. Embrionii de bovine în vârstă de 7 zile (morule compacte,
blastocişti) rezistă mult mai bine la congelare, comparativ cu embrionii în alte stadii de
dezvoltare.
Metoda „one step”, cu transfer direct al embrionilor este o metodă de congelare
utilizată din ce în ce mai frecvent. Etapele congelării sunt aceleaşi ca şi în cazul congelării
controlate cu glicerol.
 Principiul metodei constă din introducerea, în aceeaşi paietă atât a mediului de
congelare (cu ethylen glycol), cât şi a mediului de diluţie (zaharoză) sau numai mediul de
congelare ViGro Ethylene Glycol Freeze + 0,1 M sucroză. Deosebirea constă în aceea că, după
decongelare, substanţa crioprotectoare se diluează direct în paietă, iar embrionii nu mai sunt
evaluaţii morfologic.
Etapele congelării:
- embrionii sunt plasaţi în mediul de congelare cu ethylen glicol 1,5 M sau în mediul
ViGro AG Freeze (1,4 M ethylen glycol cu arabinogalactan) sau ViGro Ethylene Glycol Freeze
Plus (1,4 M ethylen glycol + 0,1M sucroză) şi menţinuţi, pentru echilibrare, între 5 şi 10 minute,
la temperatura de 20-300 C;
- embrionii sunt aspiraţi în paiete cu capacitatea de 0,25 ml, conform Fig. 23;
- paietele cu embrionii sunt introduse în camerele de congelare, la temperatura de – 6-70
C şi lăsate 5 minute pentru echilibrare;
- după echilibrare, se efectuează seedingul, după care paietele se menţin la temperatura
de – 6-70 C, încă 5 minute;
- se continuă scăderea temperaturii cu 0,50 C/minut, până la –320 C;
- la –320 C, paietele se imersează în azot lichid.

Pregătirea paietelor cu embrioni pentru congelare

Decongelarea constă din menţinerea paietei în aer cca 5 secunde, după care se
introduce în apă caldă la 20-350 C, timp de 20 de secunde.
După decongelare, se agită paieta, cele două medii se amestecă, iar embrionul vine în
contact cu mediul de diluţie. Paieta se introduce direct în pistoletul de transfer. Transferul se va
efectua în maximum 5 minute de la decongelare.
Metoda de congelare “un pas” are avantaje practice deoarece permite transferul direct al
embrionilor, din aceeaşi paietă, similar cu IA.
Prin aplicarea acestui procedeu de congelare, ratele de gestaţie sunt mai scăzute (30-
50%), deoarece, după decongelare, nu se mai evaluează calitatea embrionilor şi nu se elimină
cei care nu au supravieţuit congelării.
Vitrificarea este o metodă mai simplă de congelare, care se răspândeşte din ce în ce
mai mult. Principiul constă din faptul că anumite soluţii, atunci când se răcesc excesiv, devin
foarte vâscoase, fără să se formeze cristale de gheaţă, soluţiile trec într-o stare amorfă, cu
aspect sticlos (vitros).
Acest procedeu de congelare necesită concentraţii mari de substanţe crioprotectoare şi
viteze mari de răcire şi decongelare. Principalul inconvenient este acela că, în general,
crioprotectorii concentraţi sunt toxici pentru embrioni. Mediul de vitrificare este un amestec de
glicerol şi 1,2-propandiol.
Echilibrarea termică şi osmotică a embrionului se efectuează la temperatura camerei,
embrionul este introdus într-o soluţie salină (PBS) cu 10% glicerol, 20% propandiol şi 20% ser
fetal de viţel (FCS), timp de 10 minute. După aceea, embrionul se transvazează în mediul de
congelare care conţine 25% glicerol şi 25% propandiol. În paieta de 0,25 ml se aspiră 1 M
zaharoză, se lasă o bulă de aer de cca 4-6 mm, se aspiră mediul de congelare cu embrionul, se
lasă o bulă de aer şi se aspiră 1 M zaharoză, după care se închide paieta şi se imersează direct
în azot lichid.
În vederea decongelării, paieta se introduce în baie de apă la +200 C. După
decongelare, conţinutul paietei se colectează într-o plăcuţă Petri şi se lasă 10 minute, după care
se transvazează în altă plăcuţă cu 1 M zaharoză. După această ultimă diluţie, embrionul este
trecut în mediu de cultură la +370 C şi se examinează morfologic. Se pare că embrionii în
stadiul de morulă rezistă cel mai bine la acest procedeu de congelare.
După decongelare, se poate efectua transferul direct al embrionului. În acest scop, se
agită paieta, în aşa fel încât mediul cu embrionul să vină în contact cu zaharoza, timp de 10
minute. Prezintă dezavantajul că embrionii nu mai sunt examinaţi după decongelare, ne mai
fiind posibilă eliminarea celor care nu au supravieţuit congelării.
Congelarea ultrarapidă. Embrionii de bovine, în stadiile de morulă şi blastocist, pot
supravieţui şi unei congelări rapide. Astfel, mediul de congelare cu embrionii se răceşte cu 120
C/minut, până la -300 C, după care paietele se imersează direct în azot lichid. Este necesar un
crioprotector permeabil (2-3,5 M glicerol) şi zaharoză (0,25-0,50 M). Ca şi în cazul vitrificării,
datorită concentraţiei mari de crioprotectori, este necesară echilibrarea termică şi osmotică
prealabilă a embrionilor.
Ratele de supravieţuire a embrionilor după decongelare sunt destul de scăzute (33%).
Embrionii altor specii de animale (ovine, caprine, ecvine) sunt congelaţi, mai frecvent,
prin metoda de congelare/ decongelare controlată. Ratele de supravieţuire după congelare sunt
de 90%, iar ratele de gestaţie sunt de cca. 50%. La fel ca şi la bovine, embrionii în stadiile de
morulă şi blastocist tânăr se pretează cel mai bine la congelare. Blastociştii expandaţi
supravieţuiesc în proporţie de 60-80%. În urma congelării/ decongelării controlate a
blastociştilor expandaţi s-au obţinut rate de gestaţie de 45%.