Prelevarea 

sputei se face din expectoratia de dimineata, cand pacientul isi face de

obicei “toaleta bronhiilor”. In prealabil bolnavul va efectua o gargara cu ser fiziologic
steril7 sau cu apa fiarta si racita daca recoltarea se face la domiciliu. Pacientul trebuie
instruit asupra obtinerii sputei propriu-zise si nu a salivei sau a secretiilor  nazale2-4.
Pacientii care nu pot expectora trebuie asistati de cadre medicale (prin folosirea de
aerosoli care induc sputa sau pozitii drenante).
Produsul este prelevat intr-un recipient steril, cu gat larg, prevazut cu capac. In infectiile
acute este suficient sa se recolteze un volum de 1-2 ml secretie purulenta.
Specimenul este transportat la laborator imediat pentru a fi examinat in interval de cel
mult o ora de la prelevare. Nu exista modalitati optime de conservare a probelor.
Refrigerarea la 4ºC previne multiplicarea contaminantilor, conserva unii patogeni, dar
scade pana la anulare izolarea altora, de exemplu, Haemophilus influenzae.
La tusitorii cronici, pentru diagnosticul infectiilor fungice bronhopulmonare, cantitatea de
sputa eliminata trebuie sa fie mai mare: de exemplu, toata sputa de la expectoratia
matinala sau cea expectorata in interval de 1-2 ore. La laborator nu se primesc probe
colectate in 24 de ore pentru ca multiplicarea microorganismelor saprofite determina
rezultate false.
Prelevatele care sunteaza contaminarea oro-faringiana sunt preferate de microbiolog,
dar metodele invazive folosite: aspiratia traheala, bronhoscopia cu aspiratie, aspiratia
pulmonara transtoracica etc, fac ca numarul acestora sa fie redus.
Produsul patologic primit la laborator este atent examinat macroscopic, deoarece
aspectul acestuia este particular in anumite afectiuni:
• sputa mucoasa, aerata – in bronsite acute si astm bronsic;
• sputa mucopurulenta – in traheobronsite cronice, bronhopneumonii;
• sputa purulenta – in abcese pulmonare, bronsiectazii;
• sputa sanghinolenta – in TBC si neoplasme.
Pentru examenul bacteriologic propriu-zis, se pregatesc 3 bai cu aproximativ 20 ml ser
fiziologic steril in cutii Petri. Se preleveaza din proba fragmente mucopurulente si se
spala succesiv in cele 3 bai2. Manipularea se face cu o ansa cu fir gros.
De pe un fragment mucopurulent din ultima baie de spalare, se absoarbe excesul de
lichid pe un dreptunghi de hartie de filtru si se fac 3 frotiuri care se coloreaza:
• Giemsa pentru urmarirea reactiei inflamatorii (PMN);
• Gram pentru urmarirea bacteriilor;
• Ziehl-Neelsen pentru urmarirea bacililor acido-alcoolo- rezistenti4.
Examenul microscopic  stabileste calitatea produsului patologic hotarand astfel care
vor fi probele supuse insamantarii pe medii de cultura. Pentru acest lucru se
examineaza frotiul colorat Gram cu obiectivul de 10x. Raportul celule inflamatorii/celule
malpighiene mai mic de 5 indica o proba nesatisfacatoare (nepurulenta, avand
contaminare oro-faringiana masiva)2;3.
Probele gasite corespunzatoare vor fi examinate in continuare cu imersie.
Comunicarea asocierii semnificative a unei bacterii cu celulele inflamatorii din sputa
orienteaza rapid tratamentul antimicrobian al pacientilor pneumonici. Se iau in
considerare numai germenii prezenti intre filamentele de fibrina si cei intraleucocitari; se
va acorda putina importanta germenilor care “bureaza” celulele poligonale mari,
originare din epiteliul bucal.
In cazul bacterioscopiei prelevatelor necontaminate, pe frotiurile din exsudat pleural,
probe biopsice, prezenta bacteriilor este semnificativa in orice cantitate3.
Frotiul colorat Giemsa ofera detalii asupra citologiei sputei, celulele expectorate fiind
impartite in celule inflamatorii (PMN, limfocite, macrofage, eozinofile) si celule de
exfoliere a epiteliului respirator (celule cilindrice ciliate, celule metaplazice).
Produsul patologic este reprezentat de spută şi secreţii bronşice sau
nazofaringiene.
Tehnica de recoltare clasică, denumită tehnica ‘’plăcilor tuşite’’, constă în
însămânţarea directă a produsului patologic de la nivelul tractului respirator pe mediul
Bordet-Gengou, fără a utiliza instrumentar de recoltare. Placa se ţine la o distanţă de 30
cm de gura pacientului, iar acesta expectorează pe suprafaţa mediului.
            Cea mai eficientă metodă de prelavare constă însă, în recoltarea exudatului
nazofaringian cu ajutorul unui tampon special, confecţionat din alginat de calciu sau
dracon (vata este toxică pentru germen), înfăşurat pe o sârmă subţire flexibilă.
Tamponul se introduce în nară până întâmpină rezistenţă, se menţine pe loc 30 de
secunde pentru a se încărca cu secreţie, apoi este retras şi introdus în eprubeta
protectoare.
Se mai pot recolta aspirate bronşice sau nazofaringiene.
Dacă prelucrarea probelor nu se face direct, se utilizează mediu de transport de
tip Amies cu cărbune, mediu cărbune-sânge,etc.
            Posibilitate de izolare a bacilului este mai crescută în perioada prodromală
(catarală) şi scade în timpul perioadei de stare.
1.       Examen direct
 Aspiratele bronşice sau nazofaringiene se pretează la examinarea directă prin
imunofluorescenţă. Produsele se etalează pe lamă, se usucă, se fixează şi se
colorează cu anticorpi anti-pertussis sau anti-parapertussis marcaţi cu fluoresceină. O
imunofluorescenţă negativă nu exclude prezenţa bordetelei.
2.       Izolarea germenului
 Mediile utilizate pentru izolarea Bordetelei pertussis trebuie să fie proaspăt
preparate şi să conţină substanţe care să absoarbă acizii graşi şi produşii toxici din
mediul de bază (agar) care distrug germenii (exemplu: mediul Bordet-Gengou şi agarul
cu sânge  şi cărbune).
3. Identificarea se face  pe baza caracterelor culturale şi biochimice.
C. Diagnostic  serologic  permite cercetarea în dinamică a anticorpilor specifici
prin reacţii de fixare a complementului şi de aglutinare.
Testele se pozitivează doar din săptămâna a treia de boală, corespunzător
creşterii titrului de anticorpi specifici.