UNIVERSITATEA DE ŞTIINȚE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” DIN IAŞI

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE
SPECIALIZARE: CONTROLUL ȘI EXPERTIZA PRODUSELOR
ALIMENTARE

Coloranți artificiali

Coordonator științific,
Asist. univ. dr. Gabriela Frunză
Student,
Merinde Iuliana
Nistor Loredana
Picus Agness
 Cuprins
Introducere
Capitolul I. Cercetări privind obținerea și utilizarea lor
Capitolul II. Efecte colaterale nadorite
Capitolul III. Limitări în utilizarea
Capitolul IV. Aspecte contraversate
Capitolul VI. Curiozități
Capitolul VII. Bibliografie

2
 Introducere

Colorantul alimentar sau aditiv de culoare este orice colorant, pigment sau substanță care
conferă culoare atunci când este adăugat la alimente sau băuturi. Acestea vin sub multe forme
constând din lichide, pulberi, geluri și paste. Colorantul alimentar este utilizat atât în producția
comercială a alimentelor, cât și în gătitul casnic. Coloranții alimentari sunt, de asemenea, utilizați
într-o varietate de aplicații non-alimentare, inclusiv produse cosmetice , produse farmaceutice,
proiecte de artizanat la domiciliu și dispozitive medicale.
Oamenii asociază anumite culori cu anumite arome, iar culoarea mâncării poate influența
aroma percepută în orice, de la bomboane la vin.
Aditivii de culoare sunt folosiți în alimente din mai multe motive, inclusiv:
 Pentru a face mâncarea mai atrăgătoare, atrăgătoare, apetisantă și informative
 Compensați pierderea de culoare datorită expunerii la lumină, aer, temperaturi extreme,
umiditate și condiții de depozitare
 Corectează variațiile naturale de culoare
 Îmbunătățește culorile care apar în mod natural
 Oferă culoare alimentelor incolore și „distractive”
 Permiteți consumatorilor să identifice produsele la vedere, cum ar fi aromele de
bomboane sau dozele de medicamente
Coloranții sunt clasificați ca, coloranți sintetici naturali si identic naturali sau artificiali.
Vopselele naturale sunt obținute din surse vegetale, animale sau minerale. Culorile artificiale
provin din produse petroliere extrem de purificate.
Coloranții artificiali sunt substanțe obținute prin sinteză chimică care, într-o cantitate foarte
mică, sunt capabile să imprime culoarea lor alimentelor în care au fost adăugate.
Folosirea coloranților artificiali a început la debutul secolului XIX. La acea vreme nu erau
restricții cu privire la utilizarea lor în industria alimentară. Drept urmare s-au înregistrat cateva

3
cazuri de buz în acest sens: mulți oameni au murit datorită consumului de alimente colorate cu
derivați arsenici, derivați ai plumbului sau mercurului.
Alimentele erau colorate pentru a masca diluarea acestora. De exemplu, laptele era colorat cu
nuanță gălbuie. Acest procedeu era atât de răspânndit încât lumea considera acest lapte ca fiind
proaspăt.
În industria alimentară, la nivel mondial, se folosesc annual circa 7 mil. de kg de coloranți
artificiali.

Coloranții artificiali sunt prezenți în aproape toate produsele alimentare.

Ei se clasifica astfel:
1) Azoici (conțin în molecula lor ca grupare cromoforă una sau mai multe legături –N=N- ;
sunt cei mai utilizați și cei mai ușor de preparat)
2) Grupa triamilmetanului (conțin un atom de carbon central de care se leagă trei nuclee
aromatice purtătoare de grupări hidroxilice, amine și amine substituite)
3) Xantenici ( se obțin prin reacție de condensare)
4) Grupa indigoului

4
 CAPITOLUL 2 CERCETĂRI PRIVIND OBȚINEREA ȘI UTILIZAREA
LOR, EFECTE COLATERALE NEDORITE ȘI LIMITĂRI ÎN UTILIZARE

I. Coloranți artificiali azoici

Aceștia se clasifică în:

A. Tartrazina ( E102 )

Tartrazina este o substanță organică ce se obține prin sinteză chimică din gudron de
cărbune, folosită ca pigment pe scară largă datorită puterii sale de a colora în galben sau de a
forma împreună cu alți coloranți (albastru brillian sau verde S) diferite nuanțe de verde.
Folosirea acesteia se face comform legislației în vigoare, cu respectarea dozelor maxime
admise.
La nivel European, limitele maxime sunt:
-100mg/kg aliment ( brânzeturi topite, conserve de mazăre, pasta de pește, vinuri
aromatizate);
-250mg/kg aliment ( crustacee, semipreparate).
Reacții adverse:
 Cuzează reacții alergice consumatorilor suferinzi de astm, rinită sau urticarie;
 Prezintă potential toxic pentru limfocitele umane în vitro;
 Afectează negativ starea organelor interne, în special al rinichilor și ficatului;

5
  În combinașie cu alți coloranți (carmozină și galben apus de soare) cauzează
hiperactivitate (ADHD) la copii
 Cauzează tulburări ale glandei tiroide.

B. Galben portocaliu ( E110 )

E110 este un colorant azoic obținut prin sinteză chimică plecând de la hdrocarburi aromatice care
colorează alimentele în galben oranj.
În UE dozele permise în prepararea alimenteor se situează la:
-5mg/L (kg) :lactate fermentate, creme, deserturi;
-35 mg/kg: preparate din fructe, sosuri
-200 mg/kg: la pește
Reacții adverse:
 Induce imunosupresie când este ingerat în doze mai mari de 67 mg/kcorp/zi;
 Nu ar potențial carcinogenic și genotoxic;
 Poate cauza reacții alergice la persoanele care au o anumită intoleranță la aspirină, reacție
care se manifestă prin diaree, vomă, migrene;
 Este considerat ca un aditiv sigur pentru alimentație.

C. Azorubina (E122)

6
 E122 este sarea disodică de hidrocarburi aromatice. Aceasta se prezintă ca o pulbere
roșie, solubilă în apă, puțin solubilă în alcool etilic.
Dozele permise în produsele alimentare se situeaza:
- 100-250mg/kg
Reacții adverse:
- produce reacții alergice persoanelor ce sunt sensibile la aspirină și agravează astmul;
- erupții cutanate, edem, cancer al vezicii urinare;
- alimentele ce conțin azorubină nu sunt recomandate copiilor pentru că această
substanță produce sindromul hiperactivității și lipsei de concentrare.

D. Amaranth ( E123)

E123 este sarea trisodică produs prin sinteza chimică din grudon de cărbune sau produși
ai petrolului. Aceste este un colornat roșu hidrosolubil care trebuie să corespundă multor cerințe
de puritate.
Limite admise: 30 mg/kg
Reactii adverse:
-calcifiere și hiperplazie;
-imunosupresie;
-poate avea efect emriotoxic;
-în doze mari are efect genotoxic, citostatic și citotoxic.

7
 E. Negru brillant (E151)

E151 este sarea tetrasodică de hidrocarbură aromatică. Acest colorant " pur" este
hidrosolubil, solubil și în alcool etilic.
Limite admise: 100-250mg/kg.
Reacții adverse:
-este metabolizat la om în acid sulfanilic;
-nu afectează organele interne;
-nu prezintă potențial toxic sau carcinogenic.
II. Grupa triamilmetanului
Din această grupă fac parte:
A. Albastru brillant (E133)

E133 este sintetizat din hidrocarburi aromatice. E133 se prezintă sub formă de pudră sau de
granule de culoare albastru-roșiatic, solubilă în apă.
Limite admise: 20-200 mg/kg aliment
Reacții adverse:
-poate fi absorbit în sânge;
-nu afectează funcția reproductivă;
-nu prezintă potential toxic sau carcinogen.

8
 B. Verde brillant (E142)

E142 este obținut pe cale sintetică din gudron de cărbune. Acesta este folosit pentru a da
culoarea verde a produselor alimentare.
Limite admise: 10-100 mg/kg aliment.
Reacții adverse:
-poate colora celula vie;
-utilizat în oftalmologie pentru identificarea diverselor afecțiuni ale suprafeței ochilor;
-nu sunt studii concludente care să indice un potential carcinogenic.

III. Grupa Xanteici

A. Eritrozina ( E127)

E127 reprezintă sarea disodică a tetroiodoflurosceină. Aceasta este solubilă în apă și în

alcool etilic. Este un colorant alimentar de culoare roșie-roz, ce conține iod, folosit în special
pentru compoturi și alte alimente.
Limite admise: 200 mg/kg aliment.
Reacții adverse:
-hiperactivitate;
-poate afecta funcția reproductivă;
-efect mutagenic;

9
 -poate cauza creșterea nivelului de iod în sânge;
-poate cauza tumori ale glandei tiroide și hipofizei.

IV. Quinoleinici
A. Galben de quinoleină (E104)

E104 reprezintă o mixtură de sulfonați sodici. Acest colorant are culoarea galbenă și
este solubil în apă.
Limite admise: 10-30 mg/kg aliment.
Reacții adverse:
-nu are efecte genotoxice sau carcinogene și nu afectează activitatea reproductivă;
-poate avea efecte mutagene asupra celulelor umane;
-hiperactivitate și scăderea capacității intelectuale la copii.

V.Grupa indigoului
A. Indigotina (E132)

E132 reprezintă o mixtură de săruri sodice disulfonate. Indigotina este un colorant

sintetic ce dă culoarea albastră alimentelor. Acest colorant se mai numeşte şi carmin indigo şi
poate fi prezent pe etichetele alimentelor sub una din denumirile de mai sus.
Limite admise: 50-500 mg/kg aliment.
Reacții adverse:
-reacții alergice;

10
-nu prezintă potential carcinogetic sau genotoxic;
-in doze mari poate prezenta toxicitate.

11
 CAPITOLUL IV CURIOZITĂȚI

 Cercetătorii Universităţii Southampton au descoperit că sănătatea copiilor poate fi pusă în

pericol de consumul alimentelor procesate cu coloranţi alimentari sintetici care au în
compoziţie benzoat de sodiu. Aceste substanţe cresc hiperactivitatea în cazul copiilor cu
vârste cuprinse între 3 şi 9 ani.
 Un alt studiu publicat în revista Science concluzionează ca minorii hiperactivi (cu cel mai
înalt grad de hiperactivitate măsurat printr-un test special), în a căror dieta au fost incluse
numeroase produse alimentare procesare cu coloranţi alimentari sintetici, au o capacitate mai
scăzută de a-şi aminti imagini.
 Colorantul alimentar sintetic galben-tartrazina
Deşi nu a fost interzis momentan decât în Norvegia, colorantul alimentar sintetic galben-
tartrazina a fost acuzat de numeroase potenţiale pericole pentru sănătate. Cele mai
importante sunt
– anomaliile cromozomiale;
– limfoamele;
– astmul;
– insomniile;
– comportamentul agresiv/violent;
– hiperactivitatea;
– tumorile tiroidiene;
– alergiile;
– efectele negative neurochimice şi comportamentale;

12
 Lucrări științifice

Determinarea simultană a coloranților sintetici din iaurt prin HPLC

1. Introducere
Acest articol raportează o metodă de determinare a coloranților sintetici din iaurturi și
băuturi din lapte. Inițial a fost dezvoltată o metodă de extracție a coloranților artificiali pentru
pre-tratarea probelor pentru a extrage majoritatea coloranților artificiali. Apoi, coloranții au fost
analizați prin HPLC-PAD folosind eluții de gradient.
Iaurtul este un produs obținut prin fermentarea laptelui cu bacteriile acidului lactic
Streptococcus salivarius spp. thermophilus și Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus ( Trejo,
Corzo-Martínez, Wilkinson, Higginbotham, & Harte, 2014 ). Iaurtul poate conține maximum
30% (greutate / greutate) ingrediente lactate ( MAPA, 2007 ), în timp ce băutura cu lapte, în
conformitate cu legislația braziliană, trebuie să conțină cel puțin 51% lapte (greutate / greutate),
zer sau derivate din lapte reconstituite sau nu, fermentat sau nu, și poate avea un aditiv sau
microorganisme ( MAPA, 2005 ).
Utilizarea aditivilor alimentari este o practică comună în întreaga lume. Coloranții sintetici
alimentari sunt cel mai interesant grup de aditivi alimentari folosiți în industria alimentară,
deoarece culoarea unui produs este importantă pentru atractivitatea sa pentru consumator
( Kucharska & Grabka, 2010 ). Cu toate acestea, domeniul lor de utilizare și dozarea sunt
restricționate strict în întreaga lume ( Sun, Sun, Li, Zhang și Yang, 2013 ). În Brazilia, utilizarea
și limita maximă a coloranților în alimente este controlată de Agenția Națională de Supraveghere
Sanitară (ANVISA), pe baza unei rezoluții legislative ( ANVISA, 1999 ).
Alimentele pot fi colorate cu coloranți alimentari naturali sau sintetici. Coloranții
alimentari naturali pot fi izolați de plante, ciuperci sau insecte adecvate ( Zeng, Wang, Zhang și

13
Tong, 1993 ). Coloranții sintetici sunt de asemenea utilizați pe scară largă pentru colorarea
alimentelor nu numai pentru a îmbunătăți aspectul și culoarea, ci și pentru a menține culoarea
naturală în timpul procesării sau depozitării ( Ghoreishi și colab., 2012 , Llamas și colab., 2009 ).
Coloranții sintetici prezintă mai multe avantaje, în comparație cu coloranții naturali, precum
stabilitatea ridicată în raport cu lumina, oxigenul și pH-ul, uniformitatea culorilor, contaminarea
microbiologică scăzută și costurile de producție relativ mai mici ( Alves, Brum, Andrade, &
Netto, 2008 ).
Următoarele coloranți sintetici azoici sunt permise în alimentația din Brazilia: Tartrazină
(INS102), Sunset yellow (INS110), Azorubine (INS122), Amaranth (INS123), Ponceau 4R
(INS124) și Allura Red (INS129).
Coloranții alimentari autorizați care nu sunt azoici sunt: Eritrozina (INS127), Patent Blue
V (INS131), Indigo Carmine (INS132), Brilliant Blue FCF (INS133) eo Green Green FCF
(INS143).
Coloranții sintetici sunt compuși organici cu o structură chimică care conține legături duble
alternând cu legături unice, inele aromatice simple sau conjugate și compuși azoici.
Azocoloranții sunt capabili să fie reduceți de enzimele azoreductazei din bacteriile intestinale și
în celulele hepatice cu eliberarea de amine aromatice în organism ( Huang și colab., 2003 , Rafii
și colab., 1997 ). Acest lucru poate provoca dureri de cap frecvente la adulți, în timp ce copiii
devin adesea distrași și hiperactivi ( Hawley & Buckley, 1976 ).
Aceste efecte fac ca cunoștințele despre componentele alimentare să fie o problemă
importantă pentru detectarea și informațiile despre coloranții sintetici din produsele alimentare și
băuturi. Spre dezvoltarea acestor cunoștințe, multe metode analitice au fost dezvoltate folosind
determinarea spectrometrică ( Blanco și colab., 1996 , El-Sheikh și Al-Degs, 2013 , Ni și colab.,
2001 , Santos și colab., 2010 ), Raman spectroscopic ( Uhlemanna și colab., 2012 ),
voltammetrie ( Gan și colab., 2013 , Ghoreishi și colab., 2012 , Ni și colab., 1997 ), electroforeză
capilară ( Hildenbrand și colab., 1999 , López-Montes și colab., 2013 , Prado și colab., 2006 ) și
cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție a matricei de diode (HPLC-DAD)
(Kirschbaum, Krause, Pfalzgraf și Bruckner, 2003 ) pentru determinarea coloranților sintetici în
produse alimentare și băuturi. Aceste tehnici necesită o pregătire prealabilă a eșantionului și pot
fi utilizate oriunde de la o diluare simplă urmată de filtrare până la tehnici mai avansate, cum ar

14
fi extracția în fază solidă (SPE), prin centrifugarea și sonicarea eșantioanelor pentru a extrage tot
colorantul. Complexitatea preparatului probei va depinde de tipul de eșantion analizat.

2. Experimental
2.1 . Instrumentaţie
Analiza cromatografică a fost realizată cu un cromatograf lichid din Shimadzu (Kyoto,
Japonia), care conține un sistem de operare linie Prominence cu un solvent cu pompă cuaternar
tip LC-20AT, injector automat SIL-20ACHT, detector UV-Vis cu o gamă de fotodiode SPD-
M20A , cuptor de coloană CTO-20AC, modul de comunicare între microcomputer și model
HPLC CBM-20A, degazator DGU-20A5. Pentru prepararea soluțiilor de referință și eșantion au
fost utilizate un pipetor manual Ecopipette CAPP (10–100 mL) și tuburi agitatoare PA162
PACHANE, o centrifugă marca Cientec CT-5000DR și un pipetor automat Thermo Scientific
(100-1000 μL). S-a utilizat un spectrometru UV / VIS Lambda 25 (Perkim Elmer) pentru
achiziția spectrului de absorbție a coloranților sintetici. PH-ul soluției tampon a fost măsurat
printr-un pHmetru din seria OAK 21, OAKTON (Vernon Hills, IL, SUA).

2.2 . Produse chimice și reactivi

Toate substanțele chimice au fost de calitate analitică și au fost utilizate fără purificare
suplimentară. Apa a fost purificată cu un sistem Milli-Q (Millipore, SUA). Metanolul (grad
HPLC) a fost achiziționat de la Panreac PAI-ACS (Barcelona, Spania), acetonitril (grad HPLC) a
fost achiziționat de la Burdick & Jackson ACS (Muskegon, MI, SUA) și metanol PA de la
PROQuímios (Rio de Janeiro, Brazilia) . Au fost analizați următorii coloranți sintetici alimentari:
Tartrazină (INS 102), Bordeaux-S (INS 123), Ponceau-4R (INS 124), Eritrosină (INS 127) și
Fast Green (INS 143) de la Sigma (St. Louis, MO , STATELE UNITE ALE AMERICII);
Twilight Yellow (INS 110) de la Aldrich; Azorubină (INS 122) din Fluka (St. Louis, MO, SUA);
40 Roșu (INS 129), Indigo Carmine (INS 132) și Brilliant Blue (INS 133) din Sigma – Aldrich
(St. Louis, MO, SUA). S-a preparat o soluție de 0,35 mol L −1 K 4 Fe (CN) 6 · 3H 2 O (RK)
prin dizolvarea a 15 g solid (Neon, Brazilia) în 100 ml apă. S- a preparat o soluție de amoniac de
2 mol L- 1 prin diluarea a 10 ml soluție concentrată (Vetec, Brazilia) în 90 ml apă. S-a preparat o
soluție 1 mol L −1 ZnSO 4 · 7H 2 O (RZn) dizolvând 28,7 g de solid (Alphatec, Brazilia) în 100
ml apă. Soluție 0,13 mol L -1 CH 3 COONH 4a fost preparat prin dizolvarea a 77,1 mg (Vetec,

15
Brazilia) în 100 ml apă. Soluțiile de referință și reactivi au fost depozitați în sticle de chihlimbar,
cu excepția soluțiilor de hidroxid de amoniu și acetat de amoniu. Acestea erau pregătite zilnic.

2.3 . Determinarea purității coloranților

Unii coloranți sintetici se vând cu impurități, ceea ce determină puritatea acestora. Pentru a
determina puritatea, 100 mg de colorant este dizolvat în 100 ml de apă purificată și aceasta a fost
luată ca soluție de referință. Procentul de puritate a fost calculat în consecință ( Minioti,
Sakellariou și Thomaidis, 2007 ). În această ecuație, sunt considerate următoarele variabile:
factorul de diluare al soluției măsurate din soluția standard; absorbția soluției de măsurare cu
referire la apă; concentrația soluției de referință; și absorbția specifică a soluției apoase a
colorantului la 1% (greutate / greutate).

2.4 . Prepararea soluției de referință a colorantului

Ținând cont de puritatea fiecărui colorant sintetic, s-au preparat soluții mixte de referință în
concentrații cuprinse între 0,5 și 25 mg L 1, amestecând standardele individuale și diluându-le cu
apă. Toate soluțiile au fost depozitate la frigider la 4 ° C și au rămas stabile timp de trei luni.
Coloranții au fost determinați la 427 nm (INS 102), 480 nm (INS 110), 515 nm (INS 122), 520
nm (INS 123), 508 nm (INS 124), 527 nm (INS 127), 505 nm ( INS 129), 610 nm (INS 132),
629 nm (INS 133) și 624 nm (INS 143).

2.5 . Probă Cincisprezece probe de iaurt și băuturi din lapte fermentat cu arome diferite au
fost achiziționate de pe piețele comerciale din Recife (Pernambuco, Brazilia). Toate probele au
fost depozitate la frigider, la 5 ° C, până la analiză.

2.6 . Extragerea coloranților din probe

Ca o etapă necesară pentru precipitarea proteinelor, trei probe care conțin 10 g de iaurt sau
băutură de lapte au fost amestecate cu 0,5 ml de K 4 Fe (CN) 6 · 3H 2 O (0,35 mol L −1 ) și 0,5
ml ZnSO 4 · 7H 2 o (1 mol L -1 ) într - un 50 tub ml Falcon. Soluția a fost agitată cu un agitator
de tub (PA162 PACHANE) imediat după fiecare adăugare și lăsată să stea timp de 10 min. După
acest interval de timp, 10 ml soluție metanol: hidroxid de amoniu (2 mol L −1)) (80:20), soluția a
fost agitată și centrifugată folosind o centrifugă (Cientec CT-5000DR) la 6000 rpm și 4 ° C timp

16
de 10 min. Etapa centrifugală a fost repetată de două ori mai mult, de fiecare dată cu adăugarea a
10 ml metanol: hidroxid de amoniu, pentru a extrage culorile maxime posibile din probe.
După fiecare centrifugare, fracțiile au fost colectate și transferate în același balon
volumetric de 50 ml și volumul acestuia a fost completat cu apă purificată. O alicotă a soluției
finale (1 ml) a fost filtrată prin filtre de membrană de 0,45 μm din Millipore (Brazilia) folosind o
seringă de plastic cu o capacitate de 10 ml Plascalpand și transferată într-un flacon cu o
capacitate de 1,5 mL de Uniglas și apoi injectată în cromatograf. Concentrația fiecărei probe a
fost determinată prin HPLC-PAD.

2.7 . Evaluarea procentului de extracție a coloranților

Pentru a determina procentul de colorant extras, trei probe care conțin 10 g de iaurt (alb,
fără coloranți), au fost amestecate cu volume corespunzătoare fiecărui colorant din soluția de
referință la 5 mg L −1 . Probele au fost preparate conform punctului 2.6. După fiecare
centrifugare, fracția a fost transferată într-un balon volumetric de 50 ml și volumul acesteia a fost
completat cu apă purificată. Concentrația fiecărei fracții a fost măsurată prin HPLC-PAD și
procentele de extracție au fost calculate și comparate cu valoarea de 5 mg L 1 .

2.8 . Condiții cromatografice

Pentru separare a fost utilizată o coloană NUCLEODUR C18ec (Macherey – Nagel,
Dueren, Germania, 150 mm × 4,6 mm id), cu o modificare octadecilă de densitate medie,
terminată cu particule sferice de 3 μm în formă sferică și cu o sarcină de carbon de 17,5%. Faza
mobilă a constat din eluentul A, acetat de amoniu 1% (pH 7,0, ajustat cu hidroxid de amoniu); și
eluentul B, metanol: acetonitril (80:20). Programul de eluție a gradientului este prezentat în
tabelul 1 . Volumul injecției a fost de 20 µL. Debitul a fost de 1,2 mL min -1 , temperatura
coloanei a fost menținută între 38–40 ° C și faza mobilă a fost trecută printr-un filtru de
membrană 0,45 μm. Coloranții alimentari au fost determinați la 427-624 nm.

3 . Rezultate și discuții
3.1 . Determinarea purității coloranților
Procesul de fabricație poate reduce conținutul de coloranți ( Kirschbaum și colab., 2003 )
prin formarea sărurilor anorganice ca subproduse, de exemplu NaCl, conducând astfel la

17
rezultate eronate sau nesigure. Din acest motiv, investigarea purității coloranților este o etapă
preliminară importantă pentru minimizarea sau chiar eliminarea acestui tip de eroare.
Lungimea de undă maximă de absorbție a fost utilizată pentru analiza cromatografică cu un
detector cu matrice fotodiodă.
Stabilitatea soluției de referință a fost determinată prin compararea răspunsului
instrumental generat de stocarea soluției de referință cu semnalul analitic generat de o soluție
proaspăt preparată. Soluțiile apoase au fost diluate 1:10 sau 1:20, în funcție de soluție.
Absorbanța de la 370 la 800 nm a fost măsurată în ziua în care soluțiile de referință au fost
preparate și apoi la fiecare 30 de zile folosind un spectrometru vizibil UV. În această lucrare,
toate soluțiile de coloranți au fost depozitate la 4 ° C la întuneric și au fost stabile cel puțin 3
luni. În literatura de specialitate ( Minioti și colab., 2007 ), se raportează că aceste soluții au o
stabilitate minimă de două luni atunci când sunt depozitate în frigider în flacoane de chihlimbar.

3.2 . Extragerea coloranților din probe

Au fost testate patru metodologii pentru prepararea eșantionului pentru a precipita
proteinele și lipidele și a menține coloranții în supernatant. Primul test s-a bazat pe metoda de
preparare a eșantionului pentru determinarea acizilor benzoici și sorbici din lapte și produse
lactate ( ISO 9231, 2008 ), pentru a precipita proteinele prezente în probe. În prima parte a
acestui test, 25 ml NaOH (0,1 mol L −1 ) și 40 la probele de iaurt au fost adăugate mL de
metanol. Această etapă a fost exclusă din testele următoare, deoarece chiar dacă extragerea
colorantului sintetic a avut succes, soluția finală ar fi prea diluată, ceea ce ar putea împiedica
detectarea și / sau cuantificarea analitelor în probe reale.
Al doilea test a fost realizat pentru a verifica dacă a apărut precipitația proteinelor și dacă
solubilitatea colorantului în supernatant a crescut; volume mici de reactivi RK și RZN și zece ml
de apă: hidroxid de amoniu (9.1) au fost adăugate la stadiile de pretratare și, respectiv, de
solubilitate. Deși precipitația a fost observată în mod eficient, soluția rezultată a rămas turbidă,
ceea ce indică faptul că coloranții nu au fost dizolvați total și, ca urmare, materialul solid nu a
fost precipitat complet.
O altă strategie a implicat un amestec de hidroxid de amoniu ( ISO, 2000 , Zenebon și
colab., 2008 ) și soluții de metanol ( Bonan, Fedrizzi, Menotta și Elisabetta, 2013 ) în proporție
de 8: 2 metanol: hidroxid de amoniu (2 mol L −1 ), pentru a testa dacă solubilitatea colorantului

18
sintetic în supernatant a crescut. Obiectivul acestui test este de a verifica dacă prezența
solventului organic face ca sărurile (provenite de la RK și RZN, de exemplu) să migreze în faza
apoasă și să se aglomereze mai ușor, anticipând precipitația proteinelor. Când nu a fost utilizat
niciun solvent organic, soluția a devenit turbidă și nu s-a format precipitat mic, ca în primul test.
A patra Testul a fost efectuat cu adăugarea de metanol pentru a forma un amestec de
extracție cu soluție de hidroxid de amoniu într - un raport de 1: 1 (MeOH: NH 4 OH (aq)). Cu
această soluție, separarea între supernatant și precipitat a crescut considerabil în comparație cu al
doilea test. Prin urmare, sa decis să se efectueze un al patrulea test creșterea proporției de solvent
organic până la 8: 2 (MeOH: NH 4 OH (aq)), care apoi a dat un supernatant mult mai clar și
material solid total precipitat.

3.3 . Evaluarea procentului de extracție a coloranților

Trei extracții de coloranți din probe au fost realizate folosind metoda propusă descrisă la
punctul 3.2. Procentele de extracție au fost calculate după fiecare extracție pentru a verifica dacă
o parte substanțială a analitului a fost extrasă din eșantion. Procentul de extracție a fost calculat
comparativ cu concentrația probei (5 mg L −1 ) și sunt prezentate în tabelul suplimentar S1 .

3.4 . Optimizarea separării

O metodă simplă de a determina zece coloranți alimentari într-o singură procedură este
avantajoasă pentru analiza de rutină. Spre aceasta, eluarea gradientului a fost testată pentru a
obține o separare completă a coloranților artificiali. Trei teste inițiale au fost evaluate cu
următoarele: tampon fosfat (pH 6,0) și metanol; tampon cu acetat de amoniu (pH 6,5) și metanol;
și 1% (m / v) soluție de acetat de amoniu la pH 6,0 și un amestec de metanol: acetonitril (80:20).
Tamponul de acetat de amoniu este cunoscut ca un modificator pentru purificarea și separarea
coloranților alimentari azoici ( Dinç și colab., 2005 , Garcia-Falcon și Simal-Gandara, 2005 ,
Minioti și colab., 2007 ).

3.5 . Validarea metodei

Ecuații liniare ale soluțiilor de referință mixte, coeficienții de determinare (R 2 ), limitele
de detecție (LOD), limitele de cuantificare (LOQ), rezoluția (Rs), timpul de retenție (tR) și
repetabilitatea (intra-test) RSD (%) din fiecare colorant sintetic studiat

19
 Curbele de calibrare au fost urmărite pentru o soluție mixtă de coloranți în intervalul 0,5
până la 25 mg L -1 din fiecare colorant și ecuațiile de calibrare au fost determinate folosind zona
de vârf a substanțelor. În cazul colorantului INS 143, s-a utilizat suma zonelor de vârf ale două
semnale.
3.6 . Aplicație la probe reale
Metoda dezvoltată a fost aplicată pentru a analiza cincisprezece probe de iaurt și băutură de
lapte.

4 . Concluzii
O metodă a fost dezvoltată pentru a determina zece coloranți alimentari artificiali, acceptați
comercial în Brazilia și în alte țări, în probe de iaurt și băuturi din lapte. În acest scop, inițial, a
fost dezvoltată o metodă de preparare a probelor, care a implicat o etapă de extracție simultană
pentru cei zece coloranți artificiali. Metoda de extracție a fost simplă, rapidă și cu costuri
moderate. Deși a fost utilizată o centrifugă pentru a amesteca soluțiile, în comparație cu costul
metodelor de extracție mai sofisticate, cum ar fi extracția în faze solide, metoda dezvoltată în
această lucrare a fost ieftină. Metoda a fost validată, iar concentrația de colorant la probe a variat
de la 0,89 la 75,30 mg L −1 pentru INS 110 și, respectiv, INS 102. Concentrația anumitor
coloranți artificiali la probele reale a fost sub limita superioară de 1000 mg / 100 g. Printre
coloranții artificiali cuantificați în eșantioane de iaurt și băuturi din lapte, INS 122 a fost
identificat la 33% din probe. Metoda dezvoltată s-a dovedit specifică pentru coloranții artificiali,
dar nu și pentru colorantul natural Annatto.

Strategia de screening SWATH-MS pentru determinarea coloranților

alimentari din condimente de către UHPLC-HRMS

1 . Introducere
Culorile naturale sau artificiale (adică cele sintetice) sunt adăugate la multe alimente
pentru a le îmbunătăți atractivitatea și pentru a compensa variațiile sau pierderile care pot apărea
în principal în timpul procesării sau depozitării. Deși există numeroase culori derivate natural,
cum ar fi turmericul, paprika, șofranul, extractul de sfeclă, carotenoidele sau cochinele , industria

20
alimentară preferă adesea culorile artificiale datorită eficienței lor, excelente stabilitate și cost
relativ redus. De-a lungul anilor, unii dintre acești aditivi artificiali au fost eliminați sau
interzisați în multe țări, din cauza impactului lor dăunător asupra sănătății consumatorilor.În
plus, cercetătorii de la Universitatea din Southampton au legat așa-numitele „Southampton șase”
(adică Tartrazine, Allura Red AC, Ponceau 4R, Quinoline Yellow, Sunset Yellow FCF și
Azorubine) la hiperactivitate crescută la copii ( McCann și colab., 2007 ). Ca urmare a acestor
îngrijorări crescânde cu privire la efectele adverse asupra sănătății ( Amchova, Kotolova și Ruda-
Kucerova, 2015 ), o tendință majoră în industria alimentară este acum înlocuirea culorilor
sintetice din alimente cu cele naturale, în ciuda provocărilor privind fezabilitatea, stabilitatea și
cost ( Oplatowska-Stachowiak și Elliott, 2017, Scotter, 2015 ). Pentru a încuraja tranziția,
Agenția pentru Standarde Alimentare (FSA) din Marea Britanie a publicat linii directoare pentru
înlocuirea lor ( Chapman, 2011 ).
Chiar dacă legislația privind aditivii alimentari este specifică fiecărei țări, pot fi folosiți
doar aditivi menționați în mod explicit în lege ( Lehto și colab., 2017 ). Europa și Elveția aprobă
în condiții specifice (adică din punct de vedere al concentrării și tipului de alimente) utilizarea
Tartrazinei (E102), Quinoline Yellow (E104), Sunset Yellow FCF (E110), Eritrosină (E127),
Allura Red AC (E129) , Azorubină (E122), Amaranth (E123), Ponceau 4R (E124), albastru
patentat (E131), indigo carmină (E132), albastru strălucitor (E133), verde S (E142) și negru
strălucitor (E151) ( CH / 817.022 .31, 2017 ).
În acest context, pentru a asigura încrederea și sănătatea consumatorilor, a fost necesară o
metodă analitică adecvată pentru detectarea și identificarea rapidă a condimentelor atât de
coloranți neautorizați, cât și de culori artificiale autorizate sau delistate. Mai mult, extracția și
determinarea simultană a acestora în produse alimentare au fost rareori raportate în literatura de
specialitate și s-au concentrat, de obicei, pe un număr relativ limitat de compuși analizați fie prin
HPLC-DAD-MS ( Ma, Luo, Chen, Su, și Yao, 2006 ) sau LC -MS ( Ates și colab., 2011 , Tsai și
colab., 2015 ). În afară de aceste metode, există un număr mare de alte abordări LC-MS (/ MS)
sau LC-UV / Vis, dar sunt axate fie pe culori artificiale (autorizate sau delistate) ( Feng și colab.,
2011 ,Harp și colab., 2012 , Ji și colab., 2011 , Martin și colab., 2016 , Tang și colab., 2014 ,
Yoshioka și Ichihashi, 2008 ) sau coloranți ilegali de tip Sudan ( Botek et al., 2007 , Enríquez-
Gabeiras et al., 2012 , Genualdi și colab., 2016 , Li și colab., 2010 , Zacharis și colab., 2011 ,
Zhu și colab., 2014 ).

21
 În ultimii ani, metodele de screening cu scanare completă folosind spectrometrie de masă
de înaltă rezoluție (HRMS) se dovedesc a fi o alternativă promițătoare la metodele cu triplu
cvadrupol, deoarece maximizează numărul de analite care pot fi ecranizate și sunt, în general,
concepute pentru a minimiza pregătirea probelor. , timp și cost de analiză ( López, Callao, &
Ruisánchez, 2015 ).

2 . Material si metode
2.1 . Chimicale
Toți coloranții și standardele interne au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Buchs,
Elveția), cu excepția acidului 4-aminocarminic (EGT Chemie, Tägerig, Elveția), Acid red 88
(Rocceline) (Chemie Brunschwig, Basel, Elveția) și New Red ( Standarde LGC, Teddington,
Middlesex, Marea Britanie). Tetrahidrofuranul (THF) (grad HPLC) a fost achiziționat de la
Acros Organics (Sigma-Aldrich, Buchs, Elveția), în timp ce metanol (MeOH) și acetonitril
(ACN) (ambele grade LC-MS) au fost achiziționate de la JT Baker (Avantor Performance
Materials, Deventer , Olanda) și acetat de amoniu (grad LC-MS) au fost achiziționate de la
Sigma-Aldrich (Buchs, Elveția). Apa a fost generată de un sistem ultra purificare a apei Purelab
(Elga, High Wycombe, Buckinghamshire, Marea Britanie).

2.2 . Probele de teren

Condimentele au fost cumpărate de pe piețele locale și din supermarketurile din Elveția.
În total, s-au recoltat 87 de probe de câmp, inclusiv condimente (de exemplu, paprika, curcuma,
ardei iute, nucșoară, chimen, sumac) și amestecuri de condimente (cum ar fi curry, tandoori,
tikka masala, Ras-el-hanout sau cuscus).

2.3 . Pregătirea unei mostre

Aproximativ 1 g de condimente sau amestec de condimente a cântărit și s-a extras cu 10 ml
de solvent de extracție (H 2 O / MeOH / ACN / THF 9: 1: 5: 5, v / v / v / v) timp de 30 min sub
agitare magnetică. Soluția s-a centrifugat la 970 g timp de 5 minute și s-a filtrat o alicotă a
supernatantului rezultat printr-un filtru PTFE de 0,2 um pe un flacon de LC chihlimbar. Dacă
extractul era încă tulbure, acesta a fost diluat cu solventul de extracție (de patru ori în unele
cazuri și filtrat pentru a doua oară.

22
2.4 . Metoda analitică
Două microlitre din extracte de condimente au fost injectate pe un sistem AD ExionLC AD
cuplat la un sistem QTOF X500R (Sciex, Framingham, Massachusetts, SUA) echipat cu o
interfață încălzită de nebulizator. Separarea a fost realizată folosind un gradient pe o coloană
ACQUITY UPLC BEH C18 de la Waters (1,7 μm, 2,1 × 100 mm) la 50 ° C și o fază mobilă
constând din 10 mM tampon de acetat de amoniu (faza A) cu MeOH (faza B), la un debit de 0,5
ml / min. Gradientul a început la 2% MeOH timp de 1 min, a fost crescut la 95% MeOH în 10
min, apoi la 99% MeOH în 2 min și a rămas la 99% MeOH timp de 0,5 minute.

2.5 . Clădirea bibliotecii

Deoarece o bibliotecă comercială MS / MS nu era disponibilă, aceasta a fost creată
folosind standarde. Deoarece majoritatea coloranților au niveluri de puritate sub 95%, au fost
injectate folosind metoda LC descrisă în secțiunea 2.4 . Au fost utilizate în acest scop șase
coliziuni energetice diferite: (-) 20, (-) 30, (-) 40, (-) 50 V și (-) 35 ± 15 V și (-) 40 ± 20 V. Pentru
compușii care pot fi ionizați în moduri pozitive și negative, ambii au fost adăugați la bibliotecă.
Biblioteca a cuprins coloranți ilegali precum Sudan (de exemplu, Sudan I-IV, Sudan Red B,
Sudan Orange G), culori artificiale autorizate și cele delistate (de exemplu Ponceau SX (E125),
Citrus Red 2 (E121) sau Yellow 2G (E107)) și alți coloranți care au fost descoperiți în diverse
produse alimentare în ultimii ani, cum ar fi Basic Red 46 ( Ruf și colab., 2012 ), Reactive Red
195 ( Müller-Maatsch et al., 2016 ) sau 4 acid amino-carminic ( Sabatino și colab., 2012 ). Lista
completă a celor 96 de compuși este prezentată în tabelul S1 .

2.6 . Criterii de detectare și identificare

Un compus s-a considerat detectat dacă s-au îndeplinit următoarele criterii: timpul de
retenție (RT) a fost ± 0,1 min din RT de referință, eroarea de masă a fost sub sau egală cu 5 ppm,
lovitura de bibliotecă a corespuns compusului propriu-zis și cromatografică lățimea vârfului a
fost superioară 0,09 min. Compusul a fost considerat identificat dacă fie doi ioni (în general
precursorul și un ion de produs) îndeplinesc criteriile de detecție sau dacă, pe lângă criteriile de
detecție, scorul de atingere a spectrului de bibliotecă pentru precursor a fost superior 70. În acest
caz, un rezultat pozitiv rezultatul a fost considerat ca fiind identificat sau confirmat fără

23
ambiguitate. Într-adevăr, în conformitate cu orientările UE (Decizia Comisiei 2002/657 / CE, de
punere în aplicare a Directivei 96/23 / CE a Consiliului privind performanța metodelor analitice
și interpretarea rezultatelor, 2002 ), sunt necesare cel puțin trei puncte de identificare pentru
substanțele autorizate și patru pentru cele interzise. În prezenta analiză HRMS, au fost asigurate
minimum 4,5 puncte de identificare: 2 pentru precursor și 2,5 pentru fiecare ion produs.
Pragul de toleranță la deviație pentru RT a fost stabilit la 0,1 min, așa cum recomandă protocolul
SANCO / 12571/2013 pentru validarea metodei de screening ( SANCO / 12571/2013, 2015 ). O
excepție a fost făcută pentru două perechi de compuși izobari (Azorubine / Ponceau 4R și Sudan
IV / Sudan Red B)care se eluează îndeaproape și al căror prag de RT a trebuit să fie stabilit la
0,05 min pentru a permite diferențierea și a evita rezultate pozitive false.
Nu au fost aplicate criteriile de identificare a raportului intensității ionilor, utilizate în mod
obișnuit în metode cantitative LC-MS / MS. Motivul este că variațiile performanțelor de
fragmentare cauzate de matricea eșantionului pot apărea (în special la niveluri de concentrație
scăzute ( Dasenaki, Bletsou, Koulis și Thomaidis, 2015 )), deci ar fi extrem de obositor să luăm
în considerare acest parametru.

2.7 . Proiectare de validare calitativă

Două condimente diferite, un amestec de curry și paprika măcinată, au fost utilizate pentru
validare și a fost selectat un subset de patruzeci și unu de compuși.
Rata falsă negativă și falsă pozitivă a fost calculată folosind probe cu vârf, care au fost preparate
prin extragerea a 3 g de condimente cu 30 ml soluție de extracție (vezi Secțiunea 2.3) timp de 30
min sub agitare magnetică urmată de centrifugare și filtrare (0,2 μm filtru PTFE). Apoi, o alicotă
de 905 μL din extractul filtrat a fost picurată cu 50 µL de soluție de dopare (amestec de mai
mulți coloranți), 25 µL din amestecul de standarde interne (5 ug / mL de Sudan I-d5 și Sudan III-
d6 și 40 pg / ml de Congo Red-d8) și 20 pL de Red Reactive 195 la 750 pg / ml sau E102 la 500
pg / ml. Ambele extracte au fost picurate într-o manieră pe care le-au conținut între unu și
treizeci și trei de compuși. În total, au fost preparate patruzeci de flacoane cu fiecare analit
adăugat la întâmplare în douăzeci dintre ele (zece din fiecare extract). Soluțiile flaconului au fost
apoi injectate pe sistemul UHPLC-HRMS folosind condițiile descrise în secțiunea 2.4 .
Concentrațiile injectate ale compușilor ( tabelul 2) a corespuns la limita de identificare (LOI)
determinată în timpul pre-validării.

24
 Cele trei standarde interne etichetate au fost folosite pentru a monitoriza performanța
instrumentelor în timpul secvenței. De asemenea, s-au injectat semifabricate cu solvenți în toată
secvența pentru a se asigura că nu există nicio reportare. Doi operatori diferiți, fără cunoștință
prealabilă despre care și câți compuși conțin flacoanele, au reprocesat eșantioanele și rezultatele
au fost apoi calculate.

2.8 . Test de repetabilitate

Repetabilitatea intra-zi și inter-zi au fost evaluate atât cu extracte de curry cât și de paprika
și un subset reprezentativ de 24 de compuși: Roșu acid 1, Roșu acid 88, Acid galben 9, Allura
roșu alternativ, galben anilin, roșu de bază 46, roșu citrus 2 , Eritrosina, Fast Garnet GBC, New
Red, Orange II, Para Red, Ponceau 3R, Ponceau 6R, Ponceau SX, Red 10B, Rodamina B, Sudan
I, Sudan IV, Sudan Red 7B, Sudan Red G, Sunset Yellow FCF, Tartrazine și Roșu toluenic.
Ambele extracte au fost picurate cu acești analizați în LOI care a fost estimată în timpul pre-
validării și cu amestecul de standarde interne. Aceste extracte cu condimente au fost preparate și
analizate.

3 . Rezultate și discuții
3.1 . Dezvoltarea metodei
3.1.1 . Pregătirea unei mostre
În ceea ce privește toate metodele analitice multiclase sau reziduuri multiple, a fost
necesară o pregătire generică și simplă a eșantionului nu numai pentru că nu a fost necesară o
extracție cantitativă, ci și luând în considerare diferitele proprietăți fizico-chimice ale
compușilor. Într-adevăr, acestea acoperă o gamă largă de polarități, de la coloranții ilegali
lipopili relativ apolari, cum ar fi Sudan IV (logP 8.5) până la coloranți foarte polari, cum ar fi
Tartrazina (logP −2.33), Amaranth (logP −2.2) și Acid Yellow 9 (logP -0.6) (date din
chemicalize.com , 29.06.2018), necesitând un sistem de solvent adecvat pentru ambele tipuri.
Prin urmare, amestecul de solvent cuaternar (H 2O / MeOH / ACN / THF) a fost testat cu apă la
22, 45 și 72%. Cel mai mare raport testat (72% apă) a prezentat cele mai mici recuperări pentru
coloranții de tip Sudan, în timp ce cele două raporturi rămase au obținut recuperări similare între
ele. Pentru coloranții artificiali, care sunt relativ mai hidrofili, nu a fost observată nicio diferență

25
semnificativă între proporțiile de apă de 72 și 45%. Prin urmare, selecția finală a amestecului cu
45% apă, corespunzând H 2 O / MeOH / ACN / THF la 9: 1: 5: 5 (v / v / v / v) , respectiv.

3.1.2 . Condiții cromatografice

Așa cum am menționat mai sus, din moment ce compușii analizați au acoperit o gamă
largă de polarități, diferite condiții cromatografice au fost evaluate începând cu selecția chimiei
coloanelor. Coloana Synergi-Polar RP (2,5 µm, 2,1 × 100 mm, Phenomenex), care este o fază
fenil legată de eter și este polarizată, a oferit o bună separare a coloranților ilegali, dar nu a
culorilor artificiale, deci un miez fuzionat Coloana Kinetex bifenil (2,6 μm, 2,1 × 100 mm,
Phenomenex) și coloana ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm, Apele) au fost
evaluate pentru îmbunătățirea formei de vârf și a separării. Coloana ACQUITY UPLC BEH C18
s-a dovedit a fi cea mai bună alegere chiar dacă unele vârfuri prezintă încă semne de coadă, de
exemplu Red Red 46 sau Azure B. Având în vedere gama largă de compuși, acest lucru nu a
putut fi evitat.
În concluzie, cea mai bună formă de separare și vârf pentru majoritatea coloranților care au fost
adăugați la bibliotecă au fost obținute folosind o coloană ACQUITY BEH C18 la 50 ° C și un
tampon de acetat de amoniu 10 mM (faza A) cu MeOH (faza B)la un debit de 0,5 ml / min.

3.1.3 . Condiții spectrometrice de masă

SWATH-MS este un mod de achiziție (DIA) independent de date care folosește ferestre
de izolare cu lățime fixă sau variabilă Q1 (masiv cvadrupol). Toți precursorii acestor ferestre
sunt transferați în celula de coliziune, fragmentată și apoi analizată de detectorul TOF. Ferestrele
Q1 acoperă întreaga gamă de masă necesară, ceea ce duce la achiziția completă a spectrelor MS /
MS de înaltă rezoluție pentru fiecare ion precursor dintr-un eșantion. Întrucât s-a demonstrat că
se poate obține o identificare îmbunătățită atunci când se utilizează ferestre relativ înguste
(pentru a ține cont de regiunile de masă cu densitate mai mare de ioni), s-au aplicat ferestre cu
lățime variabilă ( Zhang și colab., 2015). Cu toate acestea, lățimea optimă a ferestrelor este
dependentă de probă, datorită diferențelor de compoziție intrinsecă ale diverselor condimente și
amestecuri de condimente. Prin urmare, pentru a determina densitățile ionice în intervalul de
masă studiat și, în consecință, lățimea ferestrelor, patru mirodenii (paprika, curcuma, ardei dulce,
ardei iute) și opt amestecuri de condimente (tandoori, garam masala, cuscus, curry, ras au fost

26
selectate și extras el-hanout, cajun, satay și un „șapte condimente” conform procedurii descrise
în secțiunea 2.3. Au fost apoi injectate folosind metoda LC-MS atât în moduri negative cât și
pozitive. Datele TOF-MS au fost utilizate pentru a calcula densitatea de ioni din fiecare probă
pentru fiecare mod pe intervalul de masă scanat. Ferestrele SWATH-MS rezultate au fost
calculate utilizând calculatorul de ferestre variabile SWATH (versiunea 1.1), care este un șablon
de tabel Excel furnizat de Sciex, care generează ferestrele calculând numărul de ioni precursori și
ținând cont de intensitățile acestora ca factor de ponderare ( Zhang și colab., 2015 ). Deoarece
profilurile rezultate au fost relativ similare pentru toate condimentele, indiferent dacă sunt în
mod pozitiv sau negativ, s-a decis utilizarea acelorași ferestre SWATH-MS pentru toate tipurile
de mirodenii.

3.1.4 . Limita de identificare (LOI)

LOI a fost stabilită ca cea mai mică concentrație testată pentru care un compus a fost
identificat în mod satisfăcător la toate probele cu vârf. Criteriile de identificare sunt descrise în
secțiunea 2.6 . Pentru a determina această LOI, soluțiile standard ale coloranților au fost
preparate în solventul corespunzător la 1 mg / ml și diluate succesiv până la 10 ng / ml.
Concentrația sub care nu mai erau îndeplinite criteriile de identificare a fost determinată ca LOI
în solvent. Această concentrare a fost apoi confirmată prin extinderea atât a ardeilor, cât și a
extractelor de curry. Dacă rezultatele nu erau de încredere, concentrațiile au fost crescute până
când răspunsul a devenit fiabil. Acest prag de concentrare în matrice a fost apoi determinat ca
LOI.
Coloranții ilegali, în special Sudan Red 7B, Sudan Orange G, Banda de rodamină Acid Red 88,
au fost cei mai sensibili, cu un LOI estimat la 10 ng / ml. Observații similare în limitele
cuantificării au fost raportate într-un alt studiu care a inclus și tipuri de coloranți (artificiali și
ilegali) ( Tsai și colab., 2015 ). Într-adevăr, acești compuși s-au eluat la sfârșitul cromatogramei
cu o concentrație mare de MeOH, îmbunătățind procesul de desolvare și, prin urmare,
sensibilitatea la SM, în timp ce compușii cel mai puțin sensibili s-au eluat cu concentrație mare
de apă.

3.2 . Validare calitativă

27
 Scopul unei analize calitative este de a asigura prezența sau absența unui analit într-un
eșantion la un anumit nivel de concentrație. Validarea calitativă a metodelor de screening este
utilă și necesară pentru a evalua aplicabilitatea și limitările potențiale ale procedurii aplicate,
precum și pentru a îmbunătăți cunoștințele privind limitele de concentrație ale analitului și
specificul metodei. Acest tip de validare a fost aplicat pe scară largă medicamentelor veterinare,
dopajului, pesticidelor sau antibioticelor, dar mai puțin frecvent în domeniul analizei alimentare,
cu excepția pesticidelor și a reziduurilor de medicamente veterinare. Deoarece nu este necesară
cuantificarea, recuperarea metodei, precizia și precizia nu au fost luate în considerare.
Selectivitatea este considerată ca fiind capacitatea metodei de a discrimina între analit și alți
compuși care ar putea fi prezenți în condimente.ioni m / z , măsurate la masa exactă pentru
fiecare compus, verificarea RT, distribuția izotopică a ionului precursor și spectrele MS / MS
obținute la energiile de coliziune specifice.
Pentru detectarea coloranților la specii, rata falsă pozitivă a fost de 0%, cu excepția galbenului de
anilină și a portocaliu, cu rate de 5%. Rata falsă negativă a fost de 0% pentru toți compușii, cu
excepția Amaranth (E123), cu o rată de 5%. În stadiul de identificare, rata falsă pozitivă a fost de
0% pentru toți compușii, iar rata falsă negativă a fost de 0%, cu excepția Red Red 195 și
Amaranth (E123), care au rate de 5 și, respectiv, 10%. Pentru toți compușii, cu excepția
Amaranth, concentrația testată a corespuns LOI.

3.3 . Test de repetabilitate

Repetabilitatea intra-zi și inter-zi au fost evaluate atât cu extracte de curry cât și de
paprika și un subset reprezentativ de 23 de compuși: Acid Red 1, Acid Yellow 9, Allura Red AC,
Yellow Aniline, Basic Red 46, Citrus Red 2, Eritrosina, Fast Garnet GBC, New Red, Orange II,
Para Red, Ponceau 3R, Ponceau 6R, Ponceau SX, Red 10B, Rodamina B, Sudan I, Sudan IV,
Sudan Red 7B, Sudan Red G, Sunset Yellow FCF, Tartrazine și Toluidine Red. Ambele extracte
au fost picurate cu acești analizați în LOI.

3.4 . Aplicație pentru eșantioane de teren

Pentru a evalua aplicabilitatea metodei propuse în analiza de rutină, probele de teren au
fost colectate în Elveția cu aproximativ nouăzeci de mirodenii și amestecuri de condimente
analizate. La eșantion au fost adăugate trei standarde interne etichetate, Sudan I-d5, Sudan III-d6

28
și Congo Red-d8 și utilizate ca controale de calitate interne pentru a asigura fiabilitatea analizei.
RSD-urile RT erau extrem de reproductibile, deoarece erau sub 0,25% pentru toate standardele
interne. Precizia masei a fost, de asemenea, evaluată pentru a asigura fiabilitatea analizelor și
interpretarea rezultatelor. În modul pozitiv, erorile de masă pentru Sudan I-d5 și Sudan III-d6 au
fost întotdeauna sub 10 ppm, cu excepția o dată pentru ambele, dar în analize diferite, astfel încât
s-a considerat că nu a existat nicio schimbare semnificativă a exactității masei.

4 . Concluzii
Instrumente hibride, cum ar fi QTOF utilizate în acest studiu, sunt un instrument atractiv
pentru detectarea și identificarea compușilor în matrici provocatoare, deoarece acestea furnizează
nu numai precizia în masă, ci și informațiile privind spectrele MS / MS și, astfel, o selectivitate
crescută. Aceste caracteristici de performanță sunt asociate cu sensibilități îmbunătățite,
apropiate de cele ale instrumentelor MS / MS Rezultatele obținute în studiul de față cu analiza
unei game largi de coloranți și culori artificiale din condimente demonstrează că tehnica de
screening SWATH-MS cuplată cu o pregătire rapidă și generică a eșantionului este un
instrument ideal pentru monitorizarea conformității în laboratoarele de reglementare. Un sistem
ridicat de precizie a masei a fost obținut cu sistemul la o rezoluție de masă suficientă indiferent
de condiment sau amestec de condimente. În concluzie, îmbunătățirile HRMS din ultimii ani în
ceea ce privește hardware-ul și software-ul fac din aceasta o tehnică perfect potrivită
provocărilor întâmpinate în domeniul analizei alimentare.

29
Bibliografie
Banu C. și coordonatori 2010 Aplicații ale aditivilor și ingredientelor în industria alimentară
Ed. ASAB, București
Carmen Hura 2004 Aditivi alimentari CERMI Iași
https://prezi.com/winrk8kcij7v/colorantii-artificiali/?fbclid=IwAR3jSEmcfG3MirfBYE-
XrDAy0yIICODSfMs9GKgAkbsoHVio3X4WSuhFecc
https://www.scribd.com/presentation/341962134/Coloranti-artificiali?
fbclid=IwAR3r3lQOrv4mEDpwwMnBe78BHgNsGKNskF_edbEMvTY_TeyJ1PwyPY8oboU

30