UNIVERSITATEA ”OVIDIUS” DIN CONSTANTA FACULTATEA DE FARMACIE

REZIDENȚIAT SPECIALIZAREA: LABORATOR FARMACEUTIC

Validarea metodelor bioanalitice noi

Coordonator Științific: Conf. Univ. Dr. COSMIN ADRIAN ROSCA

REZIDENT AN II: Farm. Daniela JERCĂIANU

 Validarea metodelor bioanalitice noi

Scopul validării

Experiențele de laborator se caracterizează prin exactitate, precizie

(repetabilitate, reproductibilitate) și prin limita de detecție. Acestea depind de
proprietățile componenților probei de analizat, de tipul experienței și de sistemul de
detecție utilizat.
Considerând două metode, una manuală și una automată, se observă că
ambele metode pot suferi probleme cauzate de cronometrare sau de viteză de
reacție. Metoda automată va avea o eliberare mai precisă a debitului reactivului
folosit. Imprecizia se va regăsi în cazul ambelor metode, aceasta se va reflecta într-o
concentrație mai mică a analitului și abordarea lentă a echilibrului. Pentru a urmări
desfășurarea unei reacții se poate utiliza un înregistratestea or și astfel se obține o
performanță optimă. Controlul neglijent al temperaturii sau timpul de cronometrare
slab are reflecție asupra coeficienților de variație. Precizia experienței devine astfel
nefavorabilă.
Se produc continuu noi documente de orientare pentru a se determina dacă o
metodă analitică poate fi utilizată pentru o analiză cantitativă sau dacă este mai
convenabil ca o metodă standard să fie înlocuită de una nouă. Materialele de
orientare și reglementările sunt produse de agenții interne și internaționale pentru
validarea noilor metode de analiză, asigurând totodată protecția sănătății publice,
calitatea alimentelor, apei, a solului și a mediului înconjurător.
Metodele de analiză folosite în aplicațiile medicale necesită un grad înalt de
validare, costuri mari și se realizează într-un număr redus de laboratoare.
Ghidurile internaționale sunt elaborate de către organizații internaționale,
precum sunt:
 AOAC International, International Association of Official Analytical
Chemists;
 FAO, Food and Agriculture Organisation of the United Nations;
 IAEA, International Atomic Energy Agency;
 IUPAC, International Union of Pure and Applied Chemistry;
 ISO, International Organisation for Standardisation.

Ghidurile elaborate de către aceste instituții internaționale se pot aplica

în conformitate cu diferitele politici locale. Reglementările sunt încrise în Clinical
Laboratory Improvement – CLIA, aflate sub tutela FDA.
Definițiile și criteriile de validare a metodelor analitice și bioanalitice nu sunt
universale, ele diferă în funcție de reglementările agențiilor.Principalii parametrii de
validare sunt exactitatea și precizia ( fidelitatea). În funcție de scopul pentru care
sunt utilizate și de informațiile oferite, există 3 tipuri de procedee analitice:
1. Metode sau tehnici calitative - oferă informații despre prezența sau absența
unui analit în probă
2. Metode semicantitative – oferă informații asupra concentrației, acestea fiind
utilizate pentru a stabili dacă analitul este prezent în probă și în ce
concentrație, și anume mai mare sau mai mică decât concentrația de referință
3. Metode cantitative – folosite pentru determinarea exactă a concentrației unui
analit în probă și a incertitudinii care este inclusă în valoarea obținută pentru
concentrația analitului.

Profilele preciziei

Profilele preciziei sunt mijloace folosite pentru compararea a două experiențe

diferite realizate cu două metode pentru același analit. Studiile de precizie se pot
efectua în condiții diferite, dar pot fi influențate de o serie de variabile:
 Temperatura
 Calitatea și sursa reactivilor
 Reproductibilitatea eliberării reactivului
 Zgomotul de fond al instrumentului cu care se face măsurarea semnalului
analitic

Precizia este mai mare atunci când toate studiile de precizie se fac în același
laborator ( intralaborator) comparativ cu cele interlaboratoare, când datele utilizate
provin de la mai multe laboratoare.
În cazul studiilor intralaboratoare se pot deosebi două cazuri:
 Studii intraexperimentale (intraassays) – profilul se obține când replicarea se
face într-un singur ciclu, folosind același lot de reactivi
 Studii interexperimentale – profilul se obtine prin compararea ciclurilor obținute
în diferite zile; în acest caz, precizia obținută este mai slabă.

Metoda dozei eficace

Determinarea concentrațiilor analiților în cazul probelor biologice necesită o

cât mai mare precizie. De aceea se utilizează metoda dozei eficace în care
estimarea concentrației de analit se face prin imuno-încercări cu precizie maximă.
Pentru aceasta se prepară serii de diluții ale soluției standard de analit ce urmează a
fi supuse experiențelor: se prepară, de asemenea, serii de soluții de analit a căror
concentrație este necunoscută. După efectuarea acestor serii se reprezintă grafic
răspunsurile pentru fiecare serie în funcție de log 10 al factorului de diluție. Se obțin 2
curbe similare.

Estimarea exactității

Exactitatea se caracterizează prin capacitatea unei metode de a oferi rezultate

corecte. Experimentul trebuie să asigure dozarea întregii cantități de analit, astfel se
va obține regăsirea a 100% a analitului existent inițial în probă, fără pierderi,
interferențe sau reactivitate încrucișată. Este necesar a se folosi un material de
referință standard, iar concentrația analitului este cunoscută cu o mare exactitate.
Atunci când nu sunt disponibile materiale de referință standard exactitatea se
stabilește prin compararea rezultatelor cu rezultatele obținute cu o metodă validată
înainte.
Se aplică teste de intralaborator pentru elucidarea efectelor de matrice și a
interferențelor.
1. Standardizarea soluțiilor ca bază a exactității experiențelor
 Standardele și probele se presupune că reacționează cu reactivii
experimentali în acelasi mod
 Se admite că sunt absente efectele de matrice
 Soluțiile standard trebuie să fie ale unei soluții stoc a unui material înalt
purificat
 În cazul unei molecule complexe sau al unui hormon, standardul este
considerat a fi o concentrație stabilită, fixă sau o unitate de valoare (măsură)
care se bazează pe o comparație cu o curbă standard directoare, preparată
cu un standard internațional.

2. Efectele de matrice sunt cele datorate compoziției mediului probei, ale

componenților străini
Regăsirea unei cantități cunoscute de analit din matricea unei probe servește la
dovedirea exactității. Materialul trebuie să fie pur, iar matricea să nu interfere cu
reacțiile ce au loc. Se iau două volume egale din matricea probei, iar în una din ele
se introduce un volum dat de analit.
Se determină apoi prin măsurători diferența de semnal dintre proba cu analit și
proba cu analit+analit adăugat și se calculează raportul concentrație probă
netratată/concentrația adăugată. Apoi se determină regăsirea procentuală. Regăsirile
mici se explică prin asocierea analitului cu componenții matricei, pierderii de analit la
manipularea probei sau a concentrației nepotrivite de reactivi folosiți pentru
experiențe.
3. Interferenți
 Interferenții sunt sunt substanțele care pot fi prezente în probă, diferite de
analit, ce pot duce la găsirea unei concentrații mai mare sau mai mică decât cea
reală a analitului.
Speciile chimice înrudite cu analitul interacționează frecvent cu reactivii folosiți
în experiențe în același mod, astfel producând o experiență pozitivă sau o
supraestimare a concentrației analitului.Acest tip de interferențe poartă numele de
reactivitate încrucișată sau interferență specifică. Se poate evalua cantitativ prin
efectuarea unei determinări în absența analitului.
În imunoexperimente se folosesc și metode bazate pe reactivitate încrucișată
pentru a realiza imunoexperiențe.
4. Investigarea prin experimente calitative
Experimentele calitative au rolul de a stabili prezența sau absența analitului în probă
prin procedee de detecție.În analiza clinică este necesară precizarea promptă cu da
sau nu a prezenței unui anticorp, care indică o boală neglijând concentrația lui.
Metodele automate dau rezultate de tip numeric ce trebuie transformate intr-o
variantă de tip da sau nu, concept uzitat adesea în metodologia de
validare.Conversia la un răspuns binar da/nu necesită o valoare prescurtată cu o
concentrație acceptată.
Proba se poate caracteriza ca fiind:
 Adevărat pozitivă, când ambele metode dau rezultate pozitive
 Adevărat negative, când ambele metode dau rezultate negative
 Fals pozitivă, pentru noul experiment pozitiv și pentru experimentul negativ
acceptat
 Fals negativă, pentru noul experiment negativ și pentru experimentul pozitiv
acceptat.

Concluzia la care s-a ajuns este aceea că metoda cantitativă duce întotdeauna la
rezultate corecte.Datele fals pozitive nu impun o problemă așa mare ca cele fals
negative, cele fals negative pot fi deosebite de o diagnoză greșită cu urmări grave.
Prin experimente screening calitative se pot defini următorii parametri importanți în
validare:
 Sensibilitatea egală cu procentul pozitiv identificat
 Specificitatea egală cu procentele negative identificate
 Eficiența egală cu procentul rezultatelor corecte
Se consideră că sensibilitatea este cea mai importantă dintre acestea , indicând
rezultatele fals negative.
În limbajul comun, termenii de specificitate și selectivitate sunt deseori
interschimbabili. O metodă este specifică dacă este adecvată pentru un singur analit,
în timp ce o metodă este selectivă dacă poate fi utilizată pentru mai mulți analiți, care
pot fi însă diferențiați. Reprezintă capacitatea unei metode de a cuantifica cu
acuratețe și specific analitul sau analiții în prezența altor compuși. Selectivitatea
implică capacitatea de a separa analitul de produșii de degradare, metaboliți. În cazul
medicamentelor, specificitatea este capacitatea de a analiza analitul în prezența altor
componenți, produși de degradare și matricea.
IUPAC și AOAC utilizează termenul de selectivitate mai mult decât cel de
specificitate.

Test de validare a susceptibilității antibiotice

Acest test este foarte des solicitat laboratoarelor clinice pentru a stabili care antibiotic
este sensibil la microorganismele izolate clinic. Metoda primară folosită presupune:
 Cultivarea microorganismului pe o placă de agar, în prezența sau absența
antibioticului pe un mic disc de hârtie de filtru plasat pe suprafața agarului
 Creșterea culturii prin incubare la 37 grade peste noapte
 Un nivel fără creștere în jurul discului de hârtie de filtru arată că
microorganismul este susceptibil la acel antibiotic.
Această metodă durează minim 8 ore sau câteva zile, în funcție de viteza de creștere
a microorganismului.
Noua metodă este mai rapidă, necesită doar 25 minute și presupune:
 Suspendarea microorganismelor într-un lichid de cultură și incubarea lor la 37
grade timp de 20 minute, în absența și în prezența unui antibiotic
 Se folosește aceeași concentrație de antibiotic
 Se măsoară activitatea respiratorie prin metodă electrochimică : dacă
activitatea respiratorie este mai mică de 90% din măsurătoarea de control
efectuată în absența antibioticului , microorganismul este sensibil la acel
antibiotic.
Compararea rezultatelor permite următoarea clasificare:
 Adevărat pozitiv, nu arată nici o creștere prin metoda plăcii de agar și
activitatea respiratorie micșorată prin noua metodă
 Fals pozitiv, implică o creștere pe placa de agar, dar activitatea respiratorie
este micșorată prin noua metodă
 Adevărat negativ, creștere pe agar și nici o sarcină de creștere a respirației
 Fals negativ, nici o creștere în jurul rondelei pe placa de agar, nici o creștere a
activității respiratorii

Acest test trebuie să fie aprobat reglementar înainte de a fi utilizat în laborator.

Determinarea homocisteinei plasmatice prin metodologia fluorescentă de polarizare

imunoexperimentală
 Homocisteina, un aminoacid care contine o grupare thiol, se formează prin
demetilarea intracelulară a metioninei. În plasmă homocisteina se găsește în
principal legată de proteine dar sunt prezente de asemenea și forme libere, oxidate și
disulfidice.
Nivelul homocisteinei plasmatice variaza in functie de cele 2 căi de
metabolizare ale acesteia. Prima ar fi trans-sulfurarea la cisteină, prin intermediul
enzimei cistationin beta-sintetaza (CBS), enzimă care necesită vitamina B6 drept
cofactor. A doua cale ar fi remetilarea la metionina necesitând prezența unor enzime
(metilentetrahidrofolat reductaza MTHFR si metionin-sintetaza), care au co-substrat
acidul folic și co-enzima vitamina B12. Astfel, nivelul homocisteinei în sânge este
invers proporțional cu nivelul plasmatic al folaților, vitaminei B12 și piridoxal 5-
fosfatului (vitamina B6) și implicit cu aportul exogen al acestor vitamine.
Hiperhomocisteinemia (un nivel plasmatic >12-15 μmol/L) apare in situatiile in
care este blocata una din cele 2 cai de metabolizare. Hiperhomocisteinemia severa
care conduce la homocisteinurie este produsa de defecte genetice, cel mai frecvent
fiind deficitul homozigot de CBS cu o incidenta de 1 la 300 000 nasteri. Acesti
pacienti prezintă retard mental, tromboembolism arterial și dezvoltă ateroscleroză
precoce.
Concentrațiile mari de homocisteină (HCY) plasmatică depind de creșterea
riscului bolii cardiovasculare. Principala formă de existență a ei este disulfură a ei
însăși, cisteină sau albumină. Prima etapă de măsurare este cea a tratamentului cu
un agent reducător( ditiotreitol –DTT) pentru a obține HCY în forma ei liberă. Pe de
altă parte, unii aminoacizi ca L-cisteina sau L- metionina sunt prezenți în plasma
umană în concentrații mai mari decât HCY și pot interfera detecția HCY.
Pentru a se combate acest aspect se face o conversie a HCY în S-adenozil –
L-homocisteină (SAH). S-a produs un anticorp monoclonal împotriva SAH, folosind o
reacție competitivă în care anticorpul leagă fie SAH, fie analogul SAH- fluoresceinat
(trasor) la temperatura camerei 20 min.
În final, regăsirile sunt în limite acceptabile.

Reactivitatea încrucișată

Reactivitatea încrucișată este un parametru experimental pentru specificitate,

cu o importanță desăvârșită pentru metodele imuno-experimentale, cînd un anumit
analit este testat în prezența unei specii foarte apropiate. Se întâmplă în cazul în
care în ser sunt detectați diverși metaboliți ai unui medicament. Pentru a asigura
uniformitatea, reactivitatea încrucișată este masa sau concentrația interferentului
necesar pentru a deplasa 50% din standard.
Reactivitatea încrucișată în % este egală cu 100 ori raportul dintre
concentrația analitului și concentrația interferentului la 50% răspuns. Se evaluează
comparând capacitatea fiecărui material reactant încrucișat de a înlocui analitul.
 Acest parametru depinde de selectivitatea unui anticorp pentru un anumit
epitop (partea moleculei unui antigen de care se leagă un anticorp) și se poate
controla prin designul atent al imunogenului folosit pentru a produce anticorpi.
Poziția de atașare și natura legăturii haptenului la proteina purtătoare este de
o majoră importanță pentru selectivitate. Conjugatul hapten-purtător trebuie să fie
preparat în acelasi fel ca și conjugatul hapten-analit folosit pe parcursul
experimentului, astfel încât epitopii similari să fie disponibili pentru legarea
anticorpului.
Haptenul 2,4-dinitrofenol poate fi legat la o proteină purtătoare prin reacția cu
2,4-dinitrofluorbenzen ( reactiv Sanger) cu grupele amino primare ale resturilor
lizinei, astfel formând un anticorp ce leagă preponderent 2,4-dinitrofenilizina, față de
2,4-dinitrofenol.
Reactivitatea încrucișată este studiată mai ales pentru mlecule asemănătoare.

Utilizarea unor derivați de hapten pentru prepararea

imunogenului
Termenul heterologie se folosește în experimentarea selectivității. Heterologia
se produce când se utilizează diferite haptene pentru a produce imunogen și specii
marcate. De exemplu, un experiment estradiol produce un imunogen prin legarea
estradiolului la un purtător proteinic, prin gruparea 11-hidroxi, iar speciile marcate cu
enzimă se obțin prin cuplarea estronei cu peroxidază prin grupa 11-hidroxi, folosind
același reactiv de legare.
Heteropuntea are loc când se folosește grupa succinil ca punte în imunogen,
iar grupa glutaril este folosită pentru conjugatul hapten marcat. Heterositul se
produce când aceeași grupă de legare se conectează la diferite situuri pe hapten
cum sunt grupa 11-hidroxi și 17-hidroxi pe estrogen.
Heterologia reduce constanta de asociere pentru haptenul marcat cu un
anticorp, iar haptenul liber se poate detecta ușor la concentrații reduse.
Heterologia îmbunătățește limitele de detecție, crescând semnificativ reacțiile
încrucișate ce au loc cu analiți similari. Se constată în concluzie că anticorpii cu cea
mai bună selectivitate se produc când imunogenii se prepară prin cuplarea
haptenelor la un sit depărtat din regiunile în care speciile interferente au mici
diferențe structurale.
În cazul morfinei, prepararea imunogenului și a conjugatului enzimă-hapten se
face în același mod pentru fiecare încercare testată. Aceste teste cu heterosit cu
morfină denotă că substituția lui R cu grupe de legare dă cea mai bună selectivitate
pentru morfină față de codeină.
Interferenții nespecifici măresc sau scad aparent rezultatul unui astfel de
experiment fără a reacționa specific cu anticorpul sau cu antigenul. Compuși precum
lipidele, pigmenții și enzimele endogene pot să se adsoarbă sau lega nespecific la
faza solidă sau la reactivi sau pot afecta detecția. Pentru a împiedica adsorbția
nespecifică a proteinelor au fost proiectați reactivi potriviți. Pentru saturarea
suprafețelor suportului fără anticorp se folosește albumina sau alte proteine astfel
fiind blocată o altă legare.
Există o interferență unică în unele probe ce conțin anticorpi la unul dintre
reactanți în imunoexperiment. Anti-insulina endogenă este prezentă în serul
pacienților tratați cu insulină de bou sau de porc și invalidează măsurătorile nivelului
de insulină prin încercări.

Exemplificarea analizei ANOVA a unor date bioanalitice

Analiza statistică a datelor bioanalitice cuprinde:

 Curba standard de calibrare neprelucrată
 Curba de regresie
 Limita de detecție
 Controlul calitativ al probelor
 Graficul de control pentru probele de control – calitate (QC) și pentru
funcționari
O eroare mare sau egală cu 5%arată că există o problemă analitică ce impune
rezolvare. O eroare de 1% impune analistului să examineze atent datele și să repete
analizele.
Tehnica ANOVA constă în transformarea logaritmică a datelor de calibrare și
anume concentrația, zilele, repetițiile. Cei mai importanți termeni ai tehnicii ANOVA
sunt : repetiția și produsul repetițiexconcentrație. O cale de monitorizare a punctelor
în jurul curbei standard de regresie este aceea de a construi un grafic de control
pentru deviația standard, calculată din suma pătratelor reziduale. Când curba arată o
deviație standard în afara limitelor trebuie examinate datele aberante și eliminate.
Limita de determinare cantitativă este concetrația cea mai mică inclusă în
curba standard și este utilizată pentru interpolarea concentrațiilor necunoscute ale
probelor. Criteriul pentru determinarea acestei concentrații se bazează pe
interferențele zgomotului de fond, deci raportul semnal/zgomot și pe
reproductibilitatea răspunsului. În fiecare ciclu se determină diferența dintre
concentrația cea mai mică și zgomotul de fond. Media diferențelor se testează
statistic față de media răspunsului zgomotului de fond. Dacă diferența este
nesemnificativă calibratorul nu se include în curba standard. Variația răspunsului
poate fi evaluată prin compararea mediei răspunsului celei mai mici concentrații cu
deviația standard calculată din răspunsurile la o asemenea concentrație.

Planuri de control pentru probe de control-calitate

Planurile trebuie să fie concepute folosind rezultatele probei de control-calitate
ale validării. Pentru fiecare concentrație control-calitate se constituie 2 planuri de
control, unul pentru exactitatea zilnică, iar altul grafic al domeniului de monitorizare a
reproductibilității.
Pentru a se putea valida un șir de date ale unui ciclu analitic, trebuie să se
facă cel puțin un control calitativ al datelor pentru fiecare concentrație, date care să
nu cuprindă mai mult de un rezultat eronat pentru un set de date QC (control
calitate). Modificarea mediei și a domeniului limitelor de control se face doar după ce
se constată că rezultatele controlului de calitate sunt conforme. Datele eronate se pot
identifica pe baza efectelor semnificative în ANOVA și prin graficele de control.
ANOVA înseamnă Analiza Varianței. ANOVA a fost fondată de Ronald Fisher în anul
1918. Numele Analysis Of Variance a fost derivat pe baza abordării în care metoda
folosește variația pentru a determina mijloacele dacă sunt diferite sau egale.
Este o metodă statistică utilizată pentru testarea diferențelor dintre două sau mai
multe mijloace. Este utilizat pentru a testa diferențele generale, mai degrabă decât
diferențele specifice între mijloace. Evaluează semnificația unuia sau mai multor
factori prin compararea mijloacelor variabile de răspuns la niveluri diferite de factori.
 Bibliografie

1. I. Hemmila, Clin. Chem , 1985,359-370

2. D.S. Smith, MHH Al.-Hakiem and J. Landon, Ann Clin. Biochem, 1981, 253-
274
3. D. Hawcroft, T. Hector and F. Rowell, Quantitative Bioassay, Wiley, New
York, 1984
4. E.P.Diamandis and T.K. Christopoulus, Anal. Chem. 62, 1990
5. A. Johannsson, in Principles and Practice of Imunnoassay, C. Price and D.
Newman, Eds., Macmillan, New York, 1991
6. C. Price and D. Newman, in Principles and Practice of Immunoassay, C. Price
and D. Newman, Macmillan, NeW York, 1991
7. R.M. Nakamura, Y. Kasahara and G.A. Rechnitz. Eds.. Immunochemical
Assays and Biosenzor Technology for the 1990, American Society for
Microbiology, Washington, D.C., 1992.
8. H.N. Eisen and G.W. Siskind, Biochemistry3, 1964,
9. D.S. Kabakoff, in Enzyme-Immunoassay, E.T. Maggio, Boca Raton, 1980
10. B.K. Van Weemen and A.H.W.M. Schuurs, Immunochemistry 12,1975.