Lucrare laborator biofizica

Student: Vicol Andrei- Vlad

Grupa: Fizica medicala, Anul 2

Scopul lucrarii:
Investigarea la nivel unimolecular a interactiunii dintre peptide alameticina si bistraturi
lipidice artificiale

Rezumatul lucrarii:
Modele de auto-organizare a moleculelor lipidice în suprastructuri moleculare
Lipidele sunt molecule amfipatice, adică au o regiune hidrofilă şi una hidrofobă. În
consecinţă, atunci când intră în contact cu o soluţie apoasă tind să adopte orientări specifice bine
definite. Tendinţa este să evite contactul dintre lanţurile hidrofobe şi mediul apos şi să formeze o
fază internă hidrofobă.
Bistratul lipidic reprezinta o structura in care două monostraturi paralele de fosfolipide
care interacţionează între ele prin intermediul cozilor hidrocarbonate, formând un miez hidrofob
continuu, în timp ce capetele polare sunt expuse la mediul apos şi interacţionează cu moleculele
de apă. S-a demonstrat că structura de auto-organizare “favorită” a majorităţii fosfolipidelor şi
glicolipidelor într-un mediu apos este de bistrat lipidic. Formarea unui bistrat lipidic este un
proces spontan, de auto-organizare, datorat proprietăţilor intrinseci de amfipaticitate a lipidelor.
Miceliul reprezinta o structura în care cozile hidrocarbonate ale lipidelor interacţionează
între ele prin intermediul forţelor van der Waals. Rezultatul net al celor două tipuri majore de
interacţiuni este obţinerea unui sistem molecular cu energie potenţială totală minimă. Deoarece
intensitatea forţelor van der Waals este mică, există un număr minim de molecule de lipide care
trebuie să interacţioneze colectiv pentru a obţine o structură micelară în stare de echilibru; 2-3
lipide nu formează o micelă, numărul minim fiind de ordinul sutelor.
Lipozomii sunt vezicule artificiale formate dintr-o membrană fosfolipidică bistratificată.
Formarea lipozomilor este un proces de auto-asamblare care este determinat de natura amfipatică
a fosfolipidelor.
Forţele implicate în procesul de auto-organizare al lipidelor sunt: forţele de interacţiune
van der Waals între cozile hidrocarbonate (hidrofobe) ale lipidelor, forţele de interacţiune
electrostatică între capetele polare ale lipidelor şi forţele de tip ”legătură de hidrogen” între
capetele polare şi moleculele de apă. Această intercorelare de interacţiuni multiple favorizează
fenomenul de hidrofobicitate şi mediază formarea bistraturilor lipidice ca structuri unitare şi în
stare de energie minimă.
Formarea bistratului lipidic pe
cale experimentala
Este posibilă realizarea a două monostraturi de o parte şi de alta a unui orificiu
practicat într-un film de Teflon care separă două medii apoase şi apoi combinarea acestora în
dreptul orificiului astfel încât să se formeze un bistrat. Monostraturile apar sub orificiu la
interfaţa aer – soluţie electrolitică şi apoi nivelele soluţiilor apoase sunt ridicate deasupra lui.
Datorită interacţiunilor de tip dipol-dipol exercitate între capetele polare ale lipidelor şi
moleculele de apă şi a interacţiunilor de tip van der Waals între capetele hidrocarbonate ale
moleculelor lipidice, în partiţia din filmul de Teflon se poate forma o structură de bistrat lipidic
artificial

Peptida alameticina:
Alameticina este o peptide antifungica descoperita pentru prima data in culturile de
ciuperci Trichoderma viride si este bogata in aminoacizi hidrofobi, care sustin structura
secundara de α -helix. Monomerul de alameticina prezint un moment dipolar (pozitiv la capatul
N- terminal si negative la capatul C- terminal al helixului)
Pana la atingerea unei concentratii
critice, monomeri de alameticina se absorb
la interfata bistratului lipidic, determinand
o subtiere a bistratului. Datorita faptului ca
alameticina se poate insera in bistratul
lipidic doar cu capatul N- terminal,
penetrarea biomembranei de catre
monomerii de alameticina, poate avea loc
doar intr-un singur sens al campului
electric transmembranar.
 Dispozitivul experimental:

Dispozitivul experimental este reprezentat de o cuvă din policarbonat împărţită în

două compartimente separate de un film de Teflon (cu o grosime de 5 – 20 m) ce prezintă o
apertură circulară (cu diametru de aproximativ 100 µm) la nivelul căreia se formează membrana
artificială. Cele două compartimente sunt umplute cu soluţii apoase. Pentru a facilita izolarea
electrică între cele două celule, suprafaţa de contact dintre acestea şi partiţia de Teflon a fost
acoperită cu o peliculă subţire din vaselină siliconică. Pe partea superioară, cuvele prezintă câte
două orificii în care se fixează electrozii de Ag/AgCl şi pipetele (cu care se modifică nivelul
soluţiilor din cele două cuve). Apertura filmului de Teflon trebuie realizată în aşa fel încât
marginile să fie cât mai fine (netede) pentru ca bistratul să fie stabil. Pentru realizarea acesteia, o
bucată dintr-o membrană de Teflon este interpusă între doi electrozi metalici între care se iniţiază
o descărcare electrică. După câteva astfel de descărcări electrice, scânteia dintre cei doi electrozi
va topi filmul într-o regiune limitată şi se va genera astfel o apertură circulară, a cărei diametru
depinde de intensitatea curentului electric de descărcare, precum şi de numărul de descărcări
succesive implicate în această procedură. Valoarea tensiunii (câteva mii de volţi) şi durata
pulsului (câteva milisecunde) necesare pentru a perfora filmul, depind de distanţa dintre
electrozi, de grosimea filmului şi de calitatea materialului din care acesta este făcut.
Modalitate de lucru:
1. Se realizează o soluţie fiziologică ce va fi utilizată ca soluţie electrolitică în cuvele „celulei
BLM” şi o soluţie de lipide de 1% (w/v) L-α-fosfatidilcolină dizolvată în n-pentan.
2. Filmul de Teflon este montat între cele două cuve, care sunt poziţionate astfel încât volumele
lor să ”comunice” doar prin intermediul orificiului din filmul de Teflon. Pentru a mări
stabilitatea mecanică a bistratului lipidic ce urmează a fi format, orificiul din filmul de Teflon se
pre-tratează cu o soluţie de 10% (v/v) hexadecan în n-pentan.
3. În cele două compartimente se vor introduce volume egale din soluţia electrofiziologică
preparată, astfel încât suprafaţa de separaţie lichid-aer să fie sub orificiul din filmul de Teflon.
4. Pe suprafaţa de separaţie apă-aer din fiecare dintre cele două compartimente se va depune,
cu ajutorul unei pipete cu capilar de sticlă, un volum mic (~6 µl) din soluţia de lipide de 1% (w/v)
L-α-fosfatidilcolină dizolvată în n-pentan.
5. După aproximativ 2 minute, timp necesar evaporării cvasi-complete a solventului, se ridică
(simultan sau succesiv) nivelul lichidului din cele două compartimente deasupra orificiului din
partiţia de Teflon (ex.: se mai adaugă încă 800 µl în fiecare compartiment), conducând astfel la
formarea bistratului artificial la nivelul aperturii.
6. Se introduce in compartimentul cu electrodul pozitiv peptida antifungica alameticina.
7. Se aplica o deferenta de potential astfel incat alameticina sa penetreze bistratul creat si sa
formeze oligomeri (pori aposi voltaj- dependent).
(Starea subconductiva a unui oligomer este in directa legatura cu numarul monomerilor care
alcatuiesc oligomerul.)

8. Se analizeaza comportamentul ansamblului creat.