CROMATOGRAFIA

Cromatografia grupeaz o variat

i important grup de metode care permit

cercet torului s separe compu i foarte asem n tori din amestecuri complexe. n toate separ rile cromatografice proba este dizolvat ntr-o faz mobil : gaz, lichid sau fluid supercritic. Aceast faz este frecvent numit eluent, iar dup ce trece de cap tul coloanei se nume te eluat. Metoda cromatografic a fost descoperit de botanistul rus Mihail Tsvet, n 1906 i a fost folosit nti pentru separarea unor substan e colorate pe coloan sau ca eluate colorate. Dac substan ele sunt incolore, prezen a lor pe coloan sau n eluate se recunoa te prin alte metode. Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorb ia amestecului de substan e (solidlichid;lichid-lichid; gaz-lichid) pe un material adsorbant, urmat de desorb ia succesiv (cu ajutorul unui dizolvant adecvat eluant) a componentelor din amestec. Coloana de adsorbant poate fi nlocuit , n unele variante cu o foaie de hrtie poroas preparat n mod special (cromatografie pe hrtie) sau cu un strat sub ire de adsorbant fixat pe o plac de sticl , cu ajutorul unui liant (cromatografie n strat sub ire). Separarea compusului de analizat de poten ialele interferen e este unul din pa ii esen iali n analiza chimic . Cromatografia este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru a realiza aceste separ ri analitice. Aplica iile cromatografiei cresc exponen ial cu timpul, n mare parte datorit faptului c ea i g se te aplica ii n toate ramurile tiin ei. Este rapid , simpl , cu costuri relativ reduse i variabilitate mare relativ la alegerea metodei de separare. O analiz cromatografic se rezum n general la urm toarele concepte fundamentale: proba este dizolvat n faza mobil ; faza sta ionar este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafa a unor particule de solid utilizate pentru a mpacheta coloana; faza mobil este trecut peste faza sta ionar nemiscibil ; aceasta se nume te elu ie; solutul care are o mare afinitate fa de faza mobil se va mi ca prin coloan foarte ncet; componen ii probei se vor separa n benzi discrete vizibile la detector, i rezult cromatograma. Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asem n toare. Ea poate fi de asemenea utilizat pentru determin ri cantitative i calitative ale speciilor separate,
1

n termeni de informa ie calitativ , o cromatogram furnizeaz timpul de reten ie al speciilor sau pozi iile acestora pe faza sta ionar dup un timp de elu ie specific. Cromatografia poate fi extrem de util pentru recunoa terea prezen ei sau absen ei unor componen i n amestec ce con ine un num r limitat de specii cunoscute. Confirmarea identit ii serve te i pentru alte investiga ii, i nu n ultimul rnd cromatografia serve te ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice. Informa ia cantitativ este principalul motiv pentru care cromatografia are o att de larg folosin . Ea se bazeaz pe compararea mai multor n l imi sau suprafe e ale picurilor analitice cu etaloane. Analiza bazat pe aria picurilor, care este independent de efectele de deformare este mult mai precis i de aceea mult mai comun . Oricum, toate datele cantitative sunt dependente de prepararea standardelor i calibr rile succesive ale coloanei folosind aceste standarde. F r exactitate i calibrare precis a datelor, nici o dat cromatografic nu poate fi considerat exact . Sunt 5 categorii de cromatografii: y y y y de adsorb ie; de parti ie; cu schimb de ioni; prin excluziune molecular ; Metodele de cromatografie pot fi de asemenea clasificate n dou moduri: cromatografia planar i cromatografia pe coloan . Ele sunt bazate pe interac iunea fizic , ceea ce nseamn i faza mobil sunt n contact. n cromatografia pe coloan , faza sta ionar c faza sta ionar

y de afinitate.

este introdus n interiorul unui tub ngust i faza mobil este introdus n tub cu ajutorul presiunii sau a greut ii proprii. n contrast, cromatografia plan folose te o faz sta ionar care este depus pe o suprafa plan sau n hrtie. Faza mobil se deplaseaz prin faza sta ionar datorit ac iunii capilare sau a greut ii. Atunci cnd un amestec de componente este supus analizei cromatografice, au loc doua procese concurente. Primul dintre acestea cuprinde fenomenele de interactiune dintre componentii analizati (denumiti soluti n cromatografie) si fazele cromatografice, determinnd retentia (respectiv sorbtia) lor diferentiata si, n cele din urma, separarea. Cel de-al doilea fenomen este de natura cinetica si are drept rezultat dispersia (largirea) zonei n care se gaseste solutul n timp ce strabate sistemul cromatografic. n momentul introducerii n coloana solutul se gaseste ntr-o zona ngusta, nsa n timpul deplasarii n coloana el se disperseaza, fenomen ce
2

se opune separarii si este nedorit. Pentru a putea optimiza o separare cromatografica, trebuie cunoscute relatiile matematice care caracterizeaza ambele fenomene mentionate: retentia solutului si dispersia zonei de elutie a acestuia. Teoria proceselor cromatografice are ca obiect tocmai stabilirea acestor relatii. Prima teorie a proceselor cromatografice a fost elaborata de Martin si Synge n 1941 si se numeste teoria talerelor. Prin analogie cu talerele fizice existente n coloanele de distilare cu talere, ei au introdus notiunea de taler teoretic. Teoria talerelor este teoria cromatografiei 717e42h ideale, care presupune ca solutul se gaseste n echilibru ntre cele doua faze. n realitate, datorita trecerii continue a moleculelor de solut dintr-o faza n alta pe masura ce ele strabat coloana, acest echilibru de fapt nu este atins niciodata. Modelul talerului teoretic transpune sistemul real continuu ntr-un sistem ideal discontinuu, pe baza urmatoarelor ipoteze:  Coloana este mpartita n segmente de lungime egala numite talere teoretice, iar naltimea unui asemenea segment se numeste naltime echivalenta a talerului teoretic (H).   n fiecare taler are loc un proces de echilibru al fiecarui solut ntre faza mobila si faza stationara. Solutul nu difuzeaza dintr-un taler n altul. Cu ct naltimea echivalenta a unui taler este mai redusa, vor avea loc un numar mai mare de echilibre elementare de repartitie n coloana si separarea va fi mai buna. Asadar, numarul de talere teoretice reprezinta o masura a eficientei coloanei si a capacitatii sale de separare. Modelul talerului teoretic se aplica la toate tipurile de separare cromatografica, nsa numai pentru compusii cu izoterme de distributie liniare (cu picuri de elutie simetrice). El permite elucidarea unor probleme legate de dinamica migrarii si retentia cromatografica, fara a lua nsa n considerare perturbarile produse de difuzie sau alte fenomene care se opun echilibrului. De asemenea, aceasta teorie permite determinarea vitezei de deplasare a solutului n coloana, ct si a concentratiei n zona de elutie a solutului, distributie care n cazul cromatografiei ideale are forma unei curbe de tip Gauss. Cromatografia de lichide, gaze i de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate att pe tipurile de faze mobile i sta ionare ct i tipurile de echilibre implicate n transferul solutului ntre faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide i fluide supercritice. Fazele sta ionare
3

variaz

i tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze. Cromatografia de adsorb ie utilizeaz o faz sta ionar solid i o faz mobil care este

un lichid sau un gaz. Solutul poate fi adsorbit la suprafa a particulelor solide, unde echilibrul dintre starea adsorbit i solu ie produce separarea moleculelor solutului. n cromatografia de parti ie faza sta ionar este un film sub ire pe suprafa a unui suport solid. Solutul stabile te un echilibru ntre lichidul sta ionar i faza mobil (lichid sau gazoas ). n cromatografia de schimb ionic anionii sau cationii sunt lega i covalent de o faz sta ionar solid , frecvent o r in sau o faz solid tare i amorf . O faz mobil lichid este utilizat . Ionii solutului de sarcin opus sunt atra i de faza sta ionar datorit for elor electrostatice. Cromatografia de excluziune molecular este mai comun denumit de gel permeabil sau de filtrare cu gel. Aceast tehnic separ moleculele dup m rime i moleculele mari trec cu o vitez mai mare dect moleculele mici. Nu exist interac iuni atractive. n loc, faza mobil gazoas sau lichid este trecut printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu i pe cele mici. Moleculele mari curg peste f r a intra n gel, i ele elueaz primele. Cromatografia de afinitate este bazat pe interac iunea ntre un tip de molecule de solut i un al doilea tip, acestea legate covalent de faza sta ionar . Cnd un amestec este trecut prin coloan , doar un tip de molecule de solut reac ioneaz cu moleculele legate i formeaz leg turi la r in . Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind pH-ul sau t ria ionic a solventului . n cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat cu ajutorul unei pompe de cauciuc ntr-un port injector, care vaporizeaz proba. Probele gazoase pot fi injectate folosind osiring adecvat . Un gaz inert purt tor poart proba prin coloana ce con ine faza sta ionar . Gazul purt tor serve te ca faz mobil . Dup traversarea coloanei, particulele separate de solut intr ntr-un detector. R spunsul este afi at pe un calculator ca func ie de timp. n cromatografia pe strat sub ire (TLC), un spot de prob este aplicat peste o bucat de hrtie sau sticl avnd faza sta ionar impregnat . Cap tul suprafe ei de hrtie sau sticl este apoi scufundat ntr-o cantitate de solvent, care serve te ca faz mobil . Solventul migreaz dea lungul fazei sta ionare, separnd componen ii probei n lungul drumului s u. Cnd solventul ajunge n vecin tatea p r ii superioare, este nl turat cantitatea suplimentar de solvent i este l sat s se usuce. C iva dintre componen ii probei sunt vizibili n acest moment.Alte m sur tori sunt n mod curent efectuate pentru a detecta to i componen ii
4

probei . Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) refer noile proceduri de cromatografie de lichide bazate pe o instrumenta ie sofisticat . Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare.

Detec ie Foarte multe detectoare sunt angajate n separ rile cromatografice. Detec ia absorban ei moleculare UV-VIS este cea mai comun . Detectorul ideal este necesar s aib : y y y y y sensibilitate adecvat ; bun stabilitate i reproductibilitate; timp de r spuns scurt; r spuns liniar la diferite ordine de concentra ie; stabilitate pe un larg domeniu de temperatur ; durat lung de via i u urin n utilizare.

Monocromatorul este adesea o component a instrumentului UV-VIS. El permite scan ri spectrale, ceea ce nseamn capacitatea de a varia lungimea de und a radia iei n mod continuu ntr-un domeniu larg. Fantele monocromatorului joac un rol important. Fanta de intrare serve te ca surs de radia ie. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determin ri cantitative n care detaliul spectral este important, n compara ie cu analiza calitativ .

Metode de prelucrare a informa iei cromatografice Metoda standardului intern furnizeaz cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativ deoarece ea elimin incertitudinile introduse de simpla injec ie. n aceast metod , o cantitate exact m surat de substan este ad ugat fiec rui standard sau probe. Standardul intern trebuie s fie ales astfel nct el s se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei. De asemenea, picul standard trebuie s fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substan din picul de standard intern serve te apoi ca parametru analitic. Metoda normaliz rii ariilor este o alt aproximare utilizat pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injec ie. n aceast metod , aria tuturor picurilor complet eluate este calculat . Concentra ia analitic este g sit ca raport al ariei de pic la aria total a tuturor picurilor. O cromatogram :

ilustreaz r spunsul detectorului la un compus de analizat din prob la ie irea acestuia din este util att pentru determin rile cantitative ct i calitative; furnizeaz o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizeaz informa ia cantitativ despre Cteva forme de band pe cromatogram este posibil s depind de concentra ia

coloan ca func ie de timp sau de volum de faz mobil ad ugat ;

cantitatea de component iar pozi ia picului serve te pentru identificarea compusului din prob ; compusului de analizat n fazele mobil parte . i sta ionar i de comportamentul fiec rui compus n