Izolarea i confirmarea speciei Listeria monocytogenes

IZOLAREA I CONFIRMAREA LISTERIA DIN PRODUSE ALIMENTARE

Genul Listeria spp., cuprinde ca principal reprezentant specia L. monocytogenes i speciile nrudite subdivizate n 16 serovariante. Pentru microbiologia alimentar intereseaz n mod deosebit L. monocytogenes, deoarece aceasta este patogen pentru om i animale. Pop i Nicolau, (1994), consider c cel puin 40% din cazurile de mbolnvire au origine alimentar.

 Ene Livia i colab., (1994), consider c din 81 de tulpini de Listeria izolate, 74 tulpini, deci 91,36 sunt L. monocytogenes i 7 tulpini, respectiv 8,64% au fost L. Ivanovii . Carnea crud i organele (creierul) n special de oaie, carnea de porc, .a. preparatele din carne, produsele culinare, petele i mai ales proodusele din pete etc., pot fi contaminate cu listerii. Pstrarea la frigider, favorizeaz multiplicarea Listeria, deoarece este recunoscut ca fiind un germene psihrotrof, iar temperaturi de 2-50C mbogesc alimentele n listerii.

Genul Listeria cuprinde urmtoarele specii: Listeria mponocytogenes cu rol cert n producerea mbolnvirilor la om, Listeria ivanovii, Listeria murayi, Listeria grayi, L. welshimeri .

 Listeria spp., se dezvolt pe medii obinuite, pe bulion nutritiv i pe geloz simpl, prefernd mediile cu snge sau ser i mediile care conin zaharuri. Temperatura optim de incubare este de 20-240C, la care produce culturi bogat ciliate n medii lichide. Mobilitatea listeriilor este caracteristic i se manifest prin micri de naintare nsoite de rostogolire, datorit nvrtirii n sensul acelor de ceasornic, datorate discului M de la baza flagelului.

 L. monocytogenes este aerob i microaerofil; Se dezvolt bine la pH de 5-9,0, cu un optim de 7,2-7,6 i n limite largi de temperatur; de la 300C la 370C. Pe suprafaa agarului cu snge , la 370C, n 48 de ore formeaz colonii mari de 0,4-1,5 mm, translucide, gri-albicioase, care devin opace pe msura trecerii timpului.

 Listeria monocytogenes este o bacterie Gram pozitiv, care se prezint sub form de bastonae fine, cu o lungime de 1-8 microni i o lime de 0,3-0,8 microni, cu capetele rotunjite. Prezint dispoziie caracterisic sub forma literelor V, Y sau n palisad. Sunt izolate sau grupate cte dou, paralel sau n lanuri. Este asemntoare morfologic cu bacilul rujetului. Prezint ns deosebiri de mobilitate, respectiv listeria are o mobilitate accentuat mai ales la temperaturi de 18-200C, dar care lipsete sau este prezent la rare elemente bacteriene la 370C. Mobilitatea listeriei se datoreaz celor 1-4 cili prezeni, dispui peritrich. Listeria nu capsuleaz i nu formeaz spori.

 Mobilitatea i producerea cililor este determinat de temperatura de dezvoltare. Pe bulionul simplu, dup 24 de ore se observ cretere microbian, mediul devine tulbure, iar la agitare se produc valuri, ceea ce constituie o caracteristi cultural distinct. Uneori la suprafaa mediului formeaz o pelicul. Prin nvechire cultura sedimenteaz i formeaz un depozit vscos aderent, care prin agitare determin formarea unei spirale ce se ridic din profunzimea mediului pn la suprafa.

 Pe geloza nutritiv formeaz colonii mici, uniforme, fine, semitransparente, nepigmentate, cu reflexe albstrui, aspect evideniate mai bine atunci cnd coloniile sunt examinate n lumina natural i la un unghi de 450.

 Pe agar snge n jurul coloniilor se constat o zon foarte mic de hemoliz, fiind uneori nevoie de ndeprtarea coloniilor pentru a constata zona de hemoliz. Dei se consider c listeriile sunt hemolitice, unii autori nu au putut stabili nici o corelaie ntre capacitatea hemolitic i gradul de patogenitate. Dezvoltarea este favorizat de prezena unor vitamine i aminoacizi prezeni n snge i ser, de prezena argininei, histidinei, metioninei i triptofanului

 METODA ORIZONTAL SR ISO 11 290/2005, prevede mai multe etape de lucru: 1. ETAPA PREMBOGIRE - presupune introducerea probei (25 g) n 225 ml de bulionul semiFraser, incubat la 300C, timp de 18-24 ore. 2. ETAPA MBOGIRE - utilizeaz ca medii de mbogire selectiv bulionul Fraser. Izolarea selectiv - a fost efectuat prin nsmnarea prin striere, n mod obligatoriu a primului mediu un mediu cromogen - Compass L. mono de ex., iar al doilea mediu utilizat la alegere Oxford sau Palcam. Selectarea coloniilor cu aspect morfologic caracteristic. Metoda utilizeaz mediului Compass L. mono, mediu cromogen foarte practic. Confirmarea s-a efectuat prin subcultivarea coloniilor i confirmarea tulpinilor obinute prin teste morfologice, biochimice etc.

 Interpretare nsmnarea mediului Palcam i prezena Listeria este vizualizat astfel: colonii de dimensiuni mici, de 0,5-1mm, culoare gri, cu un halou negru n jurul acestora dup incubare 18-24 de ore i colonii de 1-2mm, gri-verzui, cu halou extins n jurul coloniilor.

 Selectivitatea mediului ete asigurat de acriflavin, ceftazimid i polimixin. Mediul ncorporeaz: un sistem indicator pe baz de esculin i fier, care n prezena Listeria se percepe o coloraie neagr a coloniilor i un halou negricios, datorat hidrolizei esculinei n prezena fierului i un indicator cu manitol i rou fenol care recunoate contaminarea cu sue Staphylococcus i Enterococcus care fermenteaz manitolul.

Listeria spp. in Palcam medium

Interpretare:

Pe mediul OXFORD Listeria prezint colonii de dimensiuni mici, de 0,5-1mm, culoare gri, gri-oliv, cu un halou negru n jurul acestora dup incubare 18-24 de ore i colonii de 1-2mm, gri-nchis sau negru, cu halou extins n jurul coloniilor sau n toat masa mediului dac s-a dezvoltat un numr mai mare de colonii.

Listeria spp., pe mediul Oxford

Principiul utilizrii mediului COMPASS L. mono condiii excelente pentru creterea L. monocytogenes, clorura de sodiu menine echilibrul osmotic n mediu, Listeria hidrolizeaz X-glucozida, rezult un produs din precipitat de culoare albastr, att n centrul coloniei, ct i n masa coloniei, microflora bacterian de asociaie este inhibat de clorura de litiu i a unele ceftazimide. Pe mediul mediul COMPASS L. Mono cololoniile sunt albastru-verzui, nconjurate cu un halou opac, dup incubare 24-48 de ore, n culturile tipice, sunt considerate L. monocytogenes, colonii albastru-verzui, fr halou n jurul coloniilor, sunt considerate alte specii de Listeria spp.

Listeria monocytogenes in Compass L. mono medium

4. CONFIRMAREA s-a efectuat prin subcultivarea coloniilor i confirmarea tulpinilor obinute prin teste morfologice, biochimice etc. Testele biochimice obligatorii pt. Listeria spp.: testul mobilitii - pozitiv, testul hemolizei - variabil, testul Camp - variabil, fermentarea zaharuri, reacia indolului - negativ, reacia esculinei - pozitiv .

 Pentru identificarea speciei L. monocytogenes, se verifica urmtoarele caractere biochimice:

Fermentarea xilozei - NEGATIV i ramnozei - POZITIV; hidroliza esculinei - POZITIV, testul oxidazei - NEGATIV , Testul hemolizei POZITIV, Testul CAMP - POZITIV la STAPHYLOCOCCUS AUREUS, - NEGATIV la RODCOCCUS EQUI. .

Izolarea i confirmarea Clostridiilor sulfito-reductoare n produsele alimentare de origine animal

- Bacteriile anaerobe aparin unei mari varieti de familii i genuri, care n ultimii ani au suferit profunde remanieri taxonomice, datorit rezultatelor obinute prin intermediul biologiei moleculare. - Procesul, care este nc n derulare, vizeaz unii taxoni ai bacteriilor anaerobe nesporulate, n special genurile Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus .

 Clostridiile sunt larg rspndite n sol, la nivelul colonului omului i animalelor. Unele clostridii produc mbolnviri cu sindroame specifice: tetanosul, botulismul, gangrene gazoase sau emfizematoase, .a. Aspectul microscopic al clostridiilor este important, deoarece aceste bacterii au morfologie distinctiv, relativ carcteristic, sunt Gram pozitive, sub form de bacil, sunt anaerobe nesporulate, prezint morfologie caracteristic.

 Clostridiile care produc lecitinaz pot fi cultivate pe medii cu glbenu de ou, cum este mediul Nagler. Clostridiile lecitinazo-pozitive sunt urmtoarele: Cls. perfringens, Cls. novyi, Cls. bifermentans, Cls. sordelii i Cls. baratii. Clostridiile lecitinazo-negative sunt: Cls. botulinum, Cls. butyricum, Cls. cadaveris, Cls. clostridiiforme, Cls. dificile, Cls. histolyticum, .a.

 Cls. perfringens este Gram pozitiv, de form bacilar, bacilii sunt scuri, aezat izolat sau grupai cte doi, avnd capetele tiate drept asemntor cu B. anthracis sau uor rotunjite. Cls. perfringens este anaerob, fiind n acelai timp anaerobul cel mai tolerant fa de oxigenul liber. Lungimea bacilului variaz ntre 0,8-6 micrometri, iar limea este de 0,8-1,2 micrometri, fiind astfel cea mai groas clostridie.

 n frotiurile directe efectuate din carne proaspt contaminat, dar mai ales din organe, colorate prin metoda Gram sau cu albastru de metilen se observ un spatiu liber, necolorat n jurul bacterie care corespunde capsulei sale. Bacilul este aciliat, imobil. El poate forma capsul n organismul animal, dar i n mediile cu ser. n culturile proaspete este Gram pozitiv, dar n culturile vechi (au reacie acid), devin Gram negativi.

 Crete la temperaturi de 45-47C, aceasta fiind considerat selectiv i diferenial n acelai timp, n mod deosebit fa de Cls. botulinum, dar i fa de celelalte clostridii. ETAPA DE MBOGATIRE pe bulion cu ficat sau bulion cu tioglicolat, bulion-glucoz-amidon-cistin, ETAPA DE IZOLARE SELECTIVA se paseaz pe medii solide de tipul agar cu sulfit i polimixin B-neomicin, agar cu sulfit polimixin-sulfadiazin (SPS), agar cu lactoz glbenu de ou i neomicin (WillisHobbs), agar Zeissler cu neomicin.

 pe mediile lichide bacilul are cretere abundent cu producere de gaze i tulbur intens mediul, creterea devenind observabil n 4-6-8ore, n cazul nsmnrilor abundente sau n cazul unui numr mare de bacterii care se gsesc n substrat (alimente). La 12 ore de la nsmnare cultura ncepe s sedimenteze iar mediul lichid ncepe s se clarifice.

 Se dezvolt bine pe mediu cu lapte eventual turnesolat, n care produce un coagul buretos, care se retract reprezentnd cam 1/5 din volumul iniial. Aceste caractere stau la baza testului cu lapte turnesolat care se efectueaz n microbiologia alimentar.

 n bulionul cu snge produce hemoliz, mediul cptnd o coloratie brun i un miros de acid butiric, dei n prezent testul producerii hemolizei se practic mai frecvent pe medii solide. Aspectul coloniilor pe agar Zeissler este de: colonii mari, netede, lucioase, uor bombate, uneori pigmentate n verde i inconjurate de hemoliz beta, dar i de o zon mai larg de hemoliz incomplet.

 Pe agarul Willis-Hobbs, Cls. perfringens produce colonii roii datorit acidului produs din fermentarea lactozei, nconjurate de un halou opac rezultat din activitatea lecitinazic. Cls. perfringens se dezvolt pe ser coagulat far s produc lichefierea acestuia. Pe mediul cu creier, se dezvolt abundent, fr s-l nnegreasc, dar producnd o coloraie roie, mai mult n profunzime.