Dezvoltarea unei metode in cromatografia in faza inversa

* Atributele generale ale unei metode cromatografice noi: - rezolutie adecvata a analitilor studiati - timpi scurti de separare - robusta (nu este afectata puternic de variatii ale conditiilor de lucru)

* Etapele dezvoltarii unei metode

1. Stabilirea scopului;
2. Selectarea metodei de pregatire a probei; 3. Alegerea detectorului

Atributele unei bune separari:

- 0.5 K 20 - Rezolutie 2

- Presiune de operare 15MPa

- 0.9 asimetrie 1.5 Optimizarea cu un solvent organic
Alegerea solventului organic: 1. 2. 3. Acetonitril Metanol Tetrahidrofuran

Selectarea modului de separare

Solutul se dizolva in apa sau in solventi organici ?

Ghid de lucru in HPLC

Timpul(tm ) necesar fazei mobile sa traverseze o coloana HPLC de 4.6-mmdiametru, estimata cu ecuatia tm Ld2c/ (2F), unde L este lungimea coloanei(cm), dc este diametrul coloanei(mm), siF este debitul(mL/min)

1:1

1:1

1:1

Dezvoltarea in triunghi a unei metode HPLC. THF este tetrahidrofuran.

Dupa optimizarea solventului, se poate imbunatati si rezolutia prin: - Descresterea debitului - Cresterea lungimii coloanei - Descresterea dimensiunilor particulei

Temperatura ca variabila
- Afecteaza retentia relativa a diferitilor compusi - Influenteaza separarea compusilor ionici si a moleculelor cu substituenti polari

Separarea cu gradient
Volumul util de lucru (dwell) volumul dintre punctul in care solventii sunt amestecati si inceputul coloanei; Timpul util de lucru (dwell) timpul necesar gradientului sa intre in coloana

tD =

volumul dwell (mL)

debitul (mL.min)

Masurarea timpului util de lucru

Elutia cu gradient reprezinta o modalitate utila de abordare a separarii? Prima separare cromatografica a unui amestec nou trebuie facuta prin elutie cu gradient Daca t/tG > 0.25, se utilizeaza elutia cu gradient. Daca t/tG < 0.25, se utilizeaza elutia izocrata. Solventul izocratic utilizat should have the composition applied to the column halfway through the period t

Pentru separari mai dificile - se schimba solventul - se utilizeaza coloane mai lungi - se utilizeaza particule cu dimensiuni mici - se modifica fazele