IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR

PRIN REACTII ANTIGEN-ANTICORP.

METODE GENETICE DE IDENTIFICARE
LP 5
 Reacţii antigen – anticorp

Componentele structurale ale virusurilor joacă rol de antigen, provoacă răspuns imun din partea
organismului infectat → producere de anticorpi.
Reacţia antigen – anticorp este specifică, antigenul poate fi legat numai de anticorpul ce s-a produs ca
răspuns la stimulul antigenic respectiv.
- detectarea unui antigen necunoscut cu ajutorul unui anticorp cunoscut (metode de diagnostic directe)
- detectarea anticorpilor din serul bolnavilor cu antigene cunoscute (serodiagnostic, metode de diagnostic
indirecte).
Daca antigenul corespunde anticorpului, se formează complexul imun antigen- anticorp.
În funcţie de cum se vizualizează/detectează formarea complexului imun există mai multe metode bazate pe
reacţii antigen-anticorp:
- reacţii de precipitare: complexele imune formează precipitat
- reacţii de aglutinare: complexele imune formează aglutinat
- Reactii cu markeri - reacţii în care elementul cunoscut este marcat – se detectează elementul marcat din
complexul imun format
- Reacti i de neutralizre
- RFC – se detectează consumarea complementului (acesta se leagă de complexele imune)
Metode genetice de identificare

-2-
 1. Reacţii de precipitare
Pot avea loc în medii lichide (metode folosite în bacteriologie) sau în medii solide (metode folosite în
virusologie)
A. Reacţii de precipitare în mediu lichid
Reactii de precipitare în amestec (în toată masa lichidului) reactii de floculare
- testul Ramon – titrarea toxinei difterice
o se pun în contact, în amestec în tuburi, cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina
difterică, Ag) cu cantităţi variabile de Ac la care titrul este cunoscut
o cantitatea maximă de precipitat se găseşte în tubul unde există echivalenţă între titruri
o cunoscând titrul Ac, se poate afla titrul toxinei
- testul VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin) + în diagnosticul
sifilisului
Reactii de precipitare în inel
- reactia Ascoli – diagnosticul retrospectiv al infecţiei cărbunoase
o se pun în contact suspensia preparată din fragmentul de organ (conţine Ag) cu serul anticărbunos
(conţine Ac), în aşa fel încât să nu se amestece
o precipitatul se formează la zona de contact dintre cele 2 coloane de lichid
- stabilirea grupelor Lancefield la streptococi beta hemolitici
Reacţia de precipitare în tuburi capilare - determinarea prezenţei proteinei reactive în serul bolnavilor
Reacţia de precipitare pe lamă
In serul bolnavilor cu CID apar produşi de degradare a fibrirmogenului, -pe o lamă de sticlă câte o picătură -3-
din
diluţia de ser de cercetat cu ser antifibirinogen.
 Reacţii de precipitare
• B. Reacţia de precipitare în mediu solid (gelifiat)
Difuzia simplă (metoda Mancini)
• determinarea cantitativă din serul de bolnav a unor fracţiuni proteice:
imunoglobulinele IgA, IgG, IgM (imunograma) sau a complementului.
• In gelul de agar se înglobeaza o concentraţie optimă un antiser: anti IgA sau anti IgG sau anti IgM sau anticomplcmem,
• în gel se introduc diferiţi coloranţi pentru deosebirea Ig
• în godeuri se introduce cu o pipetă automată de 5 pic. din fiecare ser de cercetat
• După termostatare la 37^ C, din godeuri vor migra antigenele proteice care vor întâlni antiserurile înglobate în gel şi vor
determina în jurul godeurilor cercuri de precipitare cu diametre variabile. Comparând aceste diametre cu diametrele
standard cu concentraţia cunoscute din diferite proteine (din pliantele trusei), se poate stabili cantitatea de Ig sau
complement conţinută de serurile de cercetat.
Difuzia dublă
• Difuzia radiată dublă (metoda Quchterlony)
• gelul de agaroză se toarnă pe lame din sticlă,
• se ştanţează godeurile în care se pun faţă în faţă Ag şi Ac care vor migra radiar până la realizarea unei linii de precipitare,
(proteinei ”C" reactive, determinarea tipului M streptococic, etc).
• Difuzia dublă (metoda Elek-Quchterlony-Frobisher)- pentru determinarea toxinogenezei bacililor difterici.
• în mijlocul unei plăci Petri cu geloză EOF se face un şanţ ≈7/0,5 cm,
• se introduc 0,5 ml antitoxină difterică (ser antidifteric nefenolat) şi se lasă la termostat cu capacul întredeschis 2 ore,
timp în care va difuza serul antitoxic, apoi şanţul se plombează cu geloză simplă.
• se însămânţează tulpinile de bacili difterici de studiat în striuri ┴pe şanţ, se incubează la termostat 37” C, 24-48 h.
• Apariţia în unghiul dintre striul de cultură şi şanţul cu anticorp antitoxină difterică a unei linii de precipitare, semnifică
existenţa unui bacil difteric toxigen.
 Reacţii de precipitare
Difuzia în gel combinată cu migrarea în câmp electroforetic
• Imunoelectroforeza (IEF)
• Este o electroforeză asociată cu o imunodifuzie simplă în gel.
• Pe o lamă degresată se toarnă gel de agar, după întărire se ştanţează un şanţ central fără a se
îndepărta geloza.
• De o parte şi alta a şanţului se ştanţează 2 godeuri. Se umple un godeu cu ser de cercetat, iar
celălalt cu ser uman normal.
• Lama se aşează într-o cuvă de electroforeză.
• proteinele din ser vor migra sub acţiunea câmpului electric în funcţie de greutatea moleculară,
încărcătura electrică şi compoziţia gelului.
• întâlnirea dintre proteinele serice (antigenele) şi serul antiproteină umană (anticorpi) va detennina
apariţia unor arce de precipitare specifice.
• Contraimunoclectroforcza (CIEF)
• dublă difuzie în care deplasarea Ag şi Ac este accelerată de un câmp electric.
• în gelul de agar sau agaroză cu pH 8,2-8,6, se practică 3 grupe de godeuri faţă în faţă.
• Metoda este utilizată pentru antigenele care în câmp electric migrează către anod.
• în godeurile dinspre catod (polul negativ) se pipeteaza Ag necunoscute, iar in godeurile dinspre
anod (polul pozitiv) se pipetează Ac cunoscuţi şi specifici antigenului pe care îl identificăm.
• în câmp electric cei doi reactivi se deplasează rapid şi în sens contrar, dacă sunt omologi, se
întâlnesc în proporţii echivalente şi formează o linie de precipitare.
• Citirea se face după 30-60 min.
• Este folosită pentru decelarea rapidă a antigenelor în umori (Ag HBs, alfa fetoproteina, Haemophilus
influenzae, Neisseria meningitidis).
 2. Reacţii de aglutinare
• Antigenele: de natură corpusculară, aglutinogene,
Anticorpii: aglutinine
• Antigenele care corespund cu anticorpii formeaza
aglutinatul (reţea tridimensională de complexe imune),
vizibil cu ochiul liber sub forma de grunji.
• Reacţii de aglutinare pe lamă/ tuburi (directa)
- se aplică pentru stabilirea structurii antigenice a speciei
bacteriene, includerea acesteia în serogrupe, serotipuri
- pe o lamă de microscop curată şi degresată se pun:
ola o extremitate a lamei – o picatură de SF , în care suspensionăm
colonia de cercetat; va rezulta o suspensie omogenă
o la cealaltă extremitate – o picătură de ser aglutinant (conţine Ac cunoscut)
 reacţie pozitivă – în picătură vor apărea grunji
 reacţie negativă – picătura rămâne omogenă
Reacţii de aglutinare pe suport
Elementul cunoscut al reacţiei imune este ataşat de un suport:
- hematie – hemaglutinare pasivă (hematia nu participă direct în
reacţia ag-ac)
- particulă latex - latexaglutinare
- proteina A extrasă din tulpina de stafilococ Cowan – coaglutinare
 Reacţii de aglutinare
• Reacţii de aglutinare indirecta
• Testul Coombs indirect (aglutinarea indirectă simplă),
• este o tehnică pentru măsurarea Ac antieritrocitari incompleţi, (care se găsesc în serul
bolnavului).
• în prima fază se realizează punerea în contact a anticorpilor antieritrocitari cu hematiile standard,
la 37°C,
• în al 2-lea timp se pune în contact serul bolnavului cu hematiile care au fixat anticorpii
antieritrocitari, la temperatura camerei.
• Dacă în serul bolnavului sunt Ac antieritrocitari, pe lamă vor apărea grunji (aglutinine), test +
• diagnosticul de anemie hemolitică, pentru determinarea compatibilităţii transfuzionale, mai ales
pentru Rh.
• Reacţia de aglutinare artificială (pasivă)
• Este reacţia în care macromoleculele de Ag se fixează pe substraturi corpusculare neutre,
• Când corpusculul este hematie, reacţia se numeşte hemaglutinare
Când reacţia este pozitivă, hematiile sunt unite prin Ac, iar depozitul de pe fundul godeului este
cu marginile crenelate.
• Când reacţia este negativă, hematiile se depun pe fundul godeului în buton.
• Când corpusculul este latex, reacţia se numeşte latex-aglutinare.
• • Reacţia de coaglutinare – rc. Ag-Ac atunci când Ac capătă formă corpusculară prin legarea de
proteina A stafilococică. (proteinei M a streptococului, grupurilor streptococice, etc.)
 3. Reactia cu markeri -reacţie Ag-Ac în care complexele nu se văd şi se evidenţiază cu markeri.

Reacţia de imunofluorescenţă (RIF)

Fluorocromii:
 se leagă covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat →emit fluorescenţă dacă se expun la raze UV
→izotiocianatul de fluoresceină (galben-verzui), rodamina (portocalie) →nu sunt stabili în timp
Metoda directă
Preparatul de examinat se montează pe lamă. Se adaugă conjugatele. → ag corespunzătoare anticorpilor
marcaţi, se formează complexele imune. Prin spălare se îndepărtează conjugatele nelegate. Preparatul se examinează
la microscopul cu fluorescenţă. Puncte fluorescente pe fond întunecat –rez. +.

anticorp marcat cu fluorocrom

Metoda indirectă
La preparatul montat pe lamă se adaugă anticorpi specifici nemarcaţi. Daca exista Ag. corespunzatoare se formează
complexele imune. Prin spălare se îndepărtează ac nelegaţi. Se adaugă anticorpi antiglobulinici marcaţi cu fluorocrom. Dacă
există în preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline. Examinarea: la fel ca la metoda directă.
anticorp antiglobulină marcat cu fluorocrom

anticorp specific antigenului căutat în preparat

 Reactia cu markeri
Metode imunoenzimatice (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay)
Permit detectarea antigenelor libere şi a anticorpilor. Este posibilă determinare cantitativă.
La reacţii participă:
 un reactant imunologic cunoscut ataşat de un suport solid (plăci cu godeuri, lame, baghete). Se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali,
proteina A)
 un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza
 substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare detectabilă spectrofotometric (determinare cantitativă)
substanţe pentru stoparea reacţiei (baze sau acizi puternici) Reacţiile au loc în aparate automate, semiautomate.
Între reacţii – spălare cu soluţii tampon

Detectarea antigenelor

anticorpi specifici

anticorpi marcaţi enzimatic antigen?

substrat cromogen

Detectarea anticorpilor
stoparea reacţiei

anticorp antiglobulinic marcat

anticorp?

antigen cunoscut

-10-
 Reactia cu markeri
• Testul RIA (Radioimmunoassay) - radioimunoanaliza
• Antigenele sunt marcate cu izotopi radioactivi (3H, '^3I,
4C).

• Pentru un Ac dat este o competiţie specifică între o

cantitate cunoscută de Ag marcat radioactiv şi Ag
nemarcat (în cantitate necunoscută).
• Se măsoară radioactivitatea complexului Ag-Ac astfel: fie
Ac este în prealabil fixat pe un suport insolubil, fie
complexul este precipitat cu un ser anti-globulină.
• Concentraţia Ag nemarcat se află comparând
radioactivitatea complexului Ag- Ac cu o curbă standard.
• în practică RIA este utilizată pentru dozarea hormonilor,
medicamentelor, Ag HBs.
 4. Reacţia de neutralizare
• reacţie Ag-Ac în care ambele componente se află în stare solubilă.
• Există un exces de Ag care are o acţiune biologică nocivă.
• în urma formării complexelor Ag-Ac acţiunea nocivă dispare. Ag specific biologic activ se combină cu Ac corespunzător,
ducând la neutralizarea (blocarea) proprietăţilor biologice agresive, metabolice, de multiplicare etc., ale diferitelor Ag.
• în principiu această reacţie se desfăşoară în 2 moduri.
• In vivo 1. se pun în contact Ag (toxina, virusul) cu serul imun neutralizam ce conţine Ac anihilanţi (antitoxine, antivirali),
după o perioadă de incubare, timp în care se formează imunocomplexe specifice,
• 2. inocularea amestecului la un animal sensibil, observându-se prezenţa sau absenţa efectului biologic specific.
• Daca efectul biologic specific al Ag-lui nu se produce, înseamnă că proprietatea biologică a Ag-lui a fost neutralizată de
Ac neutralizanţi specifici din serul imun, deci gazda sensibilă rezistă inoculării, reacţie pozitivă.
• Dacă nu este corespondenţă între Ag şi Ac, Ag biologic activ, va produce anumite efecte pe substratul celular (intoxicarea
animalului, apariţia efectului citopatic pe culturi celulare, etc.), reacţie negativă.
• Se foloseşte şi în teste intradermice(IDR) unde poate fi urmărită neutralizarea unor toxine: toxina diftericâ, cu efect
dermonecrotic (testul Schick) sau eritrotoxina streptococică, în scarlatină (testul Dick)
• In vitro, reacţia ASLO, care se face în infecţii streptococică.
• Efectul nociv al streptolizinei constă în liza hematiilor. Peste serul de cercetat (se fac diluţii binare), se adaugă
streptolizină ”0”. Se lasă un timp de contact, dacă există Ac antistreptolizină ”0” (ASLO), aceştia se unesc cu Ag (SLO) şi
neutralizează efectul hemolitic al acestora.
• în timpul 2, se adaugă o suspensie de hematii (de grup O). Reacţia se citeşte după 4 h. Dacă lichidul este incolor şi
hematiile sunt depuse la fundul tubului, intacte, reacţia este pozitivă. Dacă nu sunt Ac, streptolizină îşi manifestă efectul
hemolitic asupra hematiilor adăugate şi se produce hemoliza, în cazul reacţiei negative.
• - Reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIHA)- identificarea virusurilor hemaglutinante şi în serodiagnosticul infecţiilor
• peste diluţiile de ser o doză determinată de hemaglutinină şi suspensia de hematii.
• Reacţia +: în prezenţa Ac inhibitori omologi hemaglutininei, hematiile sedimentează în buton.
• Reacţia -: în absenţa acestor Ac, hematiile aglutinează în pelicula care tapisează fundul godeuiui sau tubului.
 5. Reacţia de fixare a complementului (RFC)
Complementul:
se leagă de complexul imun
lizează hematiile din complexul imun

Reacţie pozitivă: lipsa hemolizei – hematiile se depun la fundul eprubetei

Reacţie negativă: hemoliză

ac?

ag sistem hemolitic (eritrocit + ac = CI)

complement

-14-
 6. Identificarea microorganismelor prin detectarea acizilor nucleici
Genomul conţine secvenţe specifice pentru fiecare microorganism, detectarea prezenţei acestora într-un produs patologic sau în culturi celulare are valoare
diagnostică.

1. Metode de hibridizare
Principiu: fragmente monocatenare de oligonucleotide marcate (sonde), având secvenţă cunoscută (caracteristică unui virus) se vor ataşa pe baza
complementarităţii de secvenţe complementare situate pe acizii nucleici ale microorganismului de identificat.
Etape de lucru:
- extragerea acizilor nucleici
- denaturarea acizilor nucleici şi fixarea acestora pe un suport
- hibridizare: adăugarea sondelor (marcate enzimatic, cu fluorocrom sau cu substanţe radioactive) şi ataşarea acestora de secvenţele omoloage
- eliminarea sondelor nefixate
- vizualizarea hibridizării
Vizualizarea se face în funcţie de tipul marcajului folosit.
AT T G C A AT
CG CG
denaturare GC G C
TA TA

a. FISH (Fluorescent in situ hybridization)

Marcajul folosit este element fluorescent

FISH pentru 16S rRNA bacterian

-15-
 b. Metoda Southern blot
Se detectează secvenţe specifice de nucleotide de ADN. Etape:
- extragerea ADN-ului
- denaturarea ADN-ului – se obţin lanţuri monocatenare
- fragmentarea lanţurilor cu enzime de restricţie (acestea acţionează în locusuri determinate, rezultând fragmente de lungime diferită, caracteristice)
- separarea electroforetică a fragmentelor în gel de agaroză (separarea se face în funcţie de mărimea fragmentelor)
- transferarea pe membrană de nitroceluloză
- adăugarea sondelor marcate cu substanţe radioactive – ataşarea de secvenţele omoloage
- se îndepărtează sondele în exces, nelegate
- vizualizare prin autoradiografie

– secvenţe de ADN prezente

Probele 3,4,8,10
Proba 6 – secvenţă de ADN prezentă, dar clivată de enzima de restricţie în 2 componente de greutate
moleculară mai mică
Probele 1,2,5 nu prezintă secvenţa de ADN căutată
c. DNA microarray
- Foloseşte principiul hibridizării
- Poate detecta expresia a mii de gene simultan
- Aplicabilitate: determinarea nivelelor de expresie a genelor, determinarea secvenţelor de acizi nucleici

Pe principiu similar se bazează metodele:

 Northern blot – se detectează ARN, este necesară revers-transcriptaza
 Western blot (protein immunoblot)– se detectează proteine

1 – markeri proteici 2-6

probe

-17-
2. Reacţia în lanţ a polimerazei (PCR – polimerase chain reaction)
Se detectează secvenţe specifice de acid nucleic după o prealabilă amplificare. Etapele de lucru - detectarea ADN-ului
- extragerea ADN-ului
- amplificare: se realizează în aparatul PCR şi constă din mai multe cicluri identice
- denaturare (940C)
- alinierea primerilor (500C) – 2 secvenţe de oligonucleotide care se leagă prin complementaritate pe cele două catene la o anumită distanţă între ele.
- sinteza lanţurilor complementare (720C ) – elongaţie; este necesară prezenţa enzimei
polimerază (Taq) şi a nucleotidelor – se formează lanţurile complementare astfel se dublează cantitatea de ADN
- reluarea ciclului de n ori – se obţin 2n copii ale secvenţei de identificat

- vizualizarea produşilor de amplificare

- produşii de amplificare obţinuţi se separă electroforetic
- colorare cu bromură de etidiu
- vizualizare cu raze UV – prelucrare computerizată
Multiplex PCR – se amplifică mai multe gene odată

Real time PCR

RT-PCR - este necesară revers-transcriptaza

-18-
 3. Metode de tipizare moleculară (genotipare)
Metodele sunt folosite pentru diferenţierea diferitelor tulpini bacteriene din cadrul aceleiaşi specii, având utilitate practică de exemplu în stabilirea
clonalităţii tulpinilor izolate în context de epidemie şi identificarea sursei de infecţie (anchetă epidemiologică).
Metodele au putere discriminatorie mare.
a. PFGE – pulse field gel electrophoresis
- Extracţia ADN-ului şi înglobarea în gel de agaroză (discuri)
- Digestia ADN-ului cu enzima de restricţie
- Electroforeza fragmentelor de macrorestricţie în gel de agaroză
- Colorare cu bromură de etidiu
- Vizualizarea fragmentelor în lumină ultravioletă

b. MLST- multilocus sequence typing

- permite tipizarea la nivelul mai multor locusuri genetice odată.
- are putere discriminatorie foarte mare
- permite evidenţierea variaţiilor genetice la nivel de specie
- baze de date cu evidenţa geografica a diferitelor tulpini http://www.mlst.net/

-19-