UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ „ION IONESCU DE LA

BRAD” DIN IAŞI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ
MASTER INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE
SPECIALIZAREA SISTEME AVANSATE DE PROCESARE ȘI CONTROLUL CALITĂȚII
PRODUSELOR AGROALIMENTARE

PRINCIPII MODERNE APLICATE

ÎN CONTROLUL
MICROBIOLOGIC AL
ALIMENTELOR

Coordonator științific,
Şef lucr. dr.Florin Daniel LIPŞA Masterant,
Răileanu Monica
 METODE DE EVALUARE A NUMĂRULUI DE MICROORGANISME
(METODE CLASICE ȘI RAPIDE)
Metode clasice de evaluare a numărului de microorganisme
1.Determinarea numărului total de bacterii aerobe mezofile
Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se
dezvoltă la suprafața lichidelor, a mediilor solide.
Bacteriile mezofile reprezintă grupul majoritar de temperaturi
minime la 15-20ºC, temperaturi optime în intervalul 30-40ºC și maximum
la temperaturi peste 45ºC.
Principalele grupe de produse alimentare pentru care se recomandă analiza sunt:
Pâine și produse de panificație, Lapte și produse lactate, Pește și produse din pește, Carne și
produse din carne, Uleiuri, grăsimi și semințe de oleaginoase, Ouă și produse pe bază de ouă,
Zahăr și produse zaharoase, Fructe, legume și produse derivate, Băuturi alcoolice și nonalcoolice,
Produse de cofetărie și patiserie, Cereale și produse de cereale, Condimente, supe, sosuri, salate,
Înghețate, Apă, Ceai, cafea, cacao, Alte alimente.
 Principiul de determinare a numărului de bacterii aerobe mezofile

 Mod indirect -> număr de colonii generate de celulele microorganismelor prezente în probă,
în contact cu un mediu nutritiv, după termostatare la 37ºC, timp de 48 de ore.
Indicator: numărul de bacterii mezofile
Mod de lucru
 2 plăci Petri sterile: 1 cm² de probă de analizat, sau câte 1 cm² diluție inițială Se realizează
prima diluție decimală, se repetă operația cu diluția următoare, folosind o pipetă sterilă pentru
fiecare probă. Se toarnă câte cca. 15 cm² mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de
45±5ºC.
Mediile se uniformizează prin rotire în plan orizontal, sunt lăsate în repaus până la
solidificare. Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluția inoculată,
temperatura la care se va face termostatarea.
Plăcile ce conțin mediul solidificat se plasează cu capacul în jos, pentru 48 de ore, în
termostat cu temperatura de 37ºC.
2. Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri

Drojdiile-microorganisme eucariote Principiul metodei

(mono sau pluricelulare), se reproduc Numărul de drojdii și mucegaiuri

asexuat prin înmugurire sau sciziune. se apreciază indirect, pe baza

Majoritatea drojdiilor sunt saprofite și coloniilor generate de celulele acestor
multe dintre ele au activitate microorganisme prezente în proba de
fermentativă. analizat, care se formează când proba
Mucegaiurile- microorganisme sau o diluție a acesteia vine în contact
eucariote, prezintă organe de cu un mediu nutritiv gelozat, după
reproducere diferențiate și sunt agenții termostatare la 25º C timp de 72 de
mucegăirii ore.
 3. Determinarea bacteriilor sporulate aerobe și anaerobe

Genul Bacillus, Gram Pozitive, cilindrice, mobile, cu dimensiuni diferite, cu

capete drepte sau rotunjite, singulare sau asociate în unghiuri (Bacillus subtilis)
sau lanțuri. Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu
diamentru mai mic sau egal decât cel al celulei, fiind poziționați central sau
terminal.
Principiul metodei
Determinarea microorganismelor sporulate aerobe și anaerobe estimează
numărul de microorganisme în stare sporulată prezente per g sau ml produs.
Pasteurizare la 80ºC timp de 10 minute, (sunt distruse toate formele
vegetative), se răcește și se inoculează în medii specifice, cultivarea -în condiții
particulare (aerobe sau anaerobe).
Proceduri particulare de analiză: bacteriile sporulate aerobe mezofile din
zahăr sau bacteriile aerobe sporulate din lapte.
 4.Determinarea microorganismelor osmofile

Mod de lucru:
Principiul metodei
Mucegaiurile, drojdiile și bacteriile -10 g probă de analizat, se transferă în
mediu de diluare 90 ml, se obține prima
osmofile- cresc în medii cu concetrații ridicate
diluție.
de zahăr sau sare, produc alterări care conduc -2 plăci Petri, cu pipeta:1 ml de probă de
analizat + cca. 15ml mediu de cultură
la modificarea calității senzoriale și a valorii
fluidificat și temperat la temperatura de
nutritive a alimentelor. 45±5ºC.
-mediile se uniformizează rapid prin
Examen indirect, pe baza coloniilor
rotire
formate microorganismele prezente în proba -repaus până ce se solidifică
-termostatare plăci cu capacul în jos în
de analizat, sau o diluție a acesteia, prin
mod diferit pentru bacteriile osmofile
cultivarea pe medii specifice solidificate, față de drojdii și mucegaiuri osmofile.
suplimentate cu 10% zahăr sau sare, după
termostatare optimă.
 5. Determinarea bacteriilor de putrefacție

Principiul metodei
Bacteriile de putrefacție-microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine
animală până la produși simpli, gaze, NH₃, H₂S, compuși indolici, amine biogene.
Formarea de mucus, apariția mirosului neplăcut și modificarea gustului sunt primele semne
care indică alterarea prin putrefacție.
Genurile de bacterii de putrefacție sunt: Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Proteus,
Clostridium etc.
Mod de lucru:
10g de suspensie +90 ml apă peptonată -> omogenizare un minut.
1.Pentru determinarea bacteriilor cazeinolitice:
-diluții decimale, se fac inoculări în mediu PCA suplimentat cu 1% cazeină sau 10% lapte prin
tehnica Koch.
-uniformizare rapidă a mediilor
-repaus până la solidificare
-termostatare cu capacul în jos la o temperatură de 37ºC.
Bacteriile care au capacitatea de a hidroliza cazeina prezintă în jurul coloniilor o zonă incoloră
comparativ cu restul mediului care este opac. Bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice
extracelulare care difuzează în exteriorul coloniilor și hidrolizează cazeina.
 2. Determinarea produșilor finali ai hidrolizei proteinelor- testul HIL
Testul H- evidențiază prezența hidrogenului sulfurat rezultat din hidroliza
proteinelor
-eprubetă:1 ml suspensie + 9 ml apă peptonată sterilă
-deasupra lichidului se plasează o hârtie sterilă îmbibată în acetat de plumb
-termostatare la temp. de 37ºC, timp de 48 de ore
-dacă hârtia se innegrește, proba va fi pozitivă, ca urmare a formării de sulfură
de plumb.
Testul I- evidențierea prezenței indolului
-eprubetă: 1 ml suspensie + 9 ml de apă peptonată sterilă
-termostatare la 37ºC, timp de 48 de ore și se adaugă 1 ml reactiv Kovacs sau
Erlich.
Apariția unui inel de culoare roșie indică prezența indolului și proba se
consideră pozitivă.
Testul L- evidențiază bacteriile care lichefiază gelatina
Din suspensia inițială se recoltează cu ansa și se înțeapă în tub de gelatină într-
o eprubetă sterilă. Se termostatează timp de 7 zile la temperatura de 20ºC.
 Metode rapide, clasice și moderne de evaluare a calității
microbiologice a alimentelor

Aplicarea principiilor moderne pentru evaluarea calității

microbiologice a alimentelor, în acord cu conceptele metodei HACCP
(Hazard Analysis Control Critical Points), și utilizarea criteriilor de apreciere
recomandat de Comisia Internațională de Specificații Microbiologice
pentru Alimente (ICMSF) presupun analiza unui număr mare de probe.
Prin metode rapide, care să ofere raspunsuri prompte și ușor de
interpretat.
Principiile moderne de evaluare a calității microbiologice în industria
alimentară vizează în principal trei categorii de proceduri analitice:
-tehnici de evaluare calitativă, pentru evidențierea selectivă a unor
microorganisme indicatori, prin teste care să ateste prezența sau absența
acestora;
-tehnici de evaluare cantitativă, pentru determinarea încărcăturii microbiene,
care să reflecte microbiota totală sau pe grupe specifice de
microorganisme;
-tehnici de izolare și caracterizare a unor microorganisme din microbiota
nespecifică, în special pentru evidențierea potențialului patogen,
toxicogen sau de alterare.
*în prezent nu există metode general valabile care să îndeplinească cerințele
particulare pentru analiza specifică a diverselor produse alimentare.
 1.Proba reductazei
Principiul metodei
Metodă indirectă de apreciere a numărului de microorganisme vii din produs,
corelația dintre gradul de contaminare și durata de producere a modificării culorii unor
indicatori redox (albastru de metilen și resazurina), sub acțiunea enzimelor din
categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente în produs. În forma oxidată,
indicatorii redox au culoarea albastru iar prin reducere se transformă în leucoderivați
incolori. Această analiză este pretabilă pentru determinarea calitații microbiologice a
laptelui materie primă.
Tipul indicatorului și concentrația acestuia determină durata analizei și culoarea
probei, se apreciază gradul de contaminare și calitatea microbiologică a produsului.
->indicator-albastru de metilen: proba are culoare albastra inițial, se transformă în
incolor
->resazurina își schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz și apoi incolor.
 Mod de lucru:
Proba reductazei cu albastru de metilen
-eprubetă: 20 de ml de lapte +1 ml de soluție de albastru de
metilen
-eprubeta se introduce în baia de apă termostatată la
temperatura prestabilită de 38-40ºC
-se analizează schimbarea culorii probei la intervalele de 20,
60, 120, 180, 330 de minute.
Pentru a scurta timpul de analiză a probei se utilizează 10 ml
de lapte și 1 ml de soluție de albastru de metilen la diluția
de 1/10.
Proba reductazei cu resazurină
-eprubetă:10 ml de lapte +1 ml de soluție de resazurină 0,05%
-se termostatează proba la temperatura de 38-40ºC
-se urmărește modificarea culorii probei la intervalele de 20 și
60 de minute.
 2.Metode bazate pe utilizarea petrifilmelor

Petrifilmele au fost concepute în vederea satisfacerii conceptelor

sistemului HACCP, care prevăd aplicarea unor măsuri corective, pe tot
parcursul procesului de producție, fără ca acesta să stagneze, ceea ce
impune analiza unui număr mare de probe, cu obținerea unor rezultate
prompte și în scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea
metodelor clasice de control microbiologic.
Utilizarea unor sisteme comerciale, denumite Petrifilme
(eng.Petrifilms) simplifică foarte mult metodele culturale. Mediul de
cultură specific (selectiv in general), deshidratat, ușor rehidratabil este
fixat sub forma unui film pe suport de carton plastifiat, acoperit cu folie de
plastic. Lichidiul rezultat din inocularea suspensiei de celule hidratează
mediul iar termostatarea oferă posibilitatea de dezvoltare a
microorganismelor.
 Folosirea petrifilmelor a constituit în prezent
sisteme eficiente de analiză, aplicate pentru aprecierea
calității materiilor prime și controlul în punctele critice
în cadrul procesării.
Avantaje: reducerea timpului, a costurilor per
probă, creșterea numărului de probe luate în analiză,
asigurarea inocuității alimentelor, îmbunătățirea
considerabilă a productivității.

Se utilizează pentru alimente precum:

• lapte și produse derivate,
• carne și produse din carne,
• pește și alte produse acvatice,
• ouă,
• legume și fructe,
• cereale și produse cerealiere,
• Condimente.
 Tehnica de lucru:
-proba se diluează prin tehnica diluțiilor
decimale până la concetrația de
celule de aproximativ 10⁴ celule per
ml;
- se ridică filmul superior;
-se inoculează 1 ml suspensie dintr-o
diluție corespunzătoare în centrul
petrifilmului așezat pe un suport
special;
-se presează ușor deasupra zonei
inoculate cu ajutorul dispozitivului
de răspândire, celulele de suspensie
pe toată suprafața circulară a
mediului de cultură;
- se îndepărtează sistemul de răspândire
și se așteaptă un minut pentru ca
mediul să se solidifice;
- se termostatează în condiții optime
pachete de până la 20 de petrifilme,
specifice pentriu microorganismele
analizate.
 S-au realizat evaluările
cantitative, pentru 4 indicatori
microbiologici: drojdii,
mucegaiuri, bacterii aerobe
mezofile, bacterii coliforme și
E. coli, realizată pe tipuri
diferite de produse
alimentare prin utilizarea
petrifilmelor, în paralel cu
tehnicile culturale clasice care
folosesc medii selective de
cultură. Evaluările privind
numărul total de drojdii și
mucegaiuri au condus la
rezultate inferioare, în
variantele analizelor realizate
cu petrifilme, comparativ cu
cele convenționale.
 Avantaje:
Ușor de exploatat, trei etape: etapa de inoculare, termostatare
și evaluare cantitativă și calitativă.
Ușor de utilizat, interpretare a rezultatelor cu acuratețe
(condiții selective de creștere și evaluare a microorg.)
Evaluările cantitative sunt facilitate.
Se reduce semnificativ costul manoperei, timpul este redus la
jumătate, au impact pozitiv asupra controlului punctelor critice.
Optimizarea strategiilor de control, crește numărul de analize
efectuate, îmbunătățește calitatea și asigură inocuitatea produselor
finite prin eficientizarea procesării.
Datorită eliminării operațiilor de pregătire și sterlizare a
mediilor de cultură, a ustensilelor. Organizarea laboratorului de
microbiologie aconstituie un avantaj.
Volumul rezidual este în cantități reduse la finalul analizei și
pot fi eliminate ușor prin incinerare, astfel se reduce riscul pentru
mediul înconjurător.
Din punct de vedere economic, prezintă avantaje, petrifinele
au o perioadă de valabilitate prelungită, dacă sunt păstrate
corespunzător la temperaturi de 4ºC, termenul de valabilitate a
acestora este de mai mult de un an.
 INDICARORI DE CALITATE ȘI SIGURANȚĂ
MICROBIOLOGICĂ ALIMENTARĂ

Sunt reprezentați de microorganisme și/sau produsele

lor metabolice a căror prezență în alimente și la anumite
niveluri pot fi folosiți pentru reflectarea valabilității
produsului respectiv.
Microorganismele indicatoare trebuie să îndeplinească
mai multe condiții și anume: să fie prezente și decelabile în
alimentele luate în analiză; creșterea și numărul lor trebuie
să fie în corelație negativă directă cu calitatea produslui; să
fie ușor detectabile și numărabile, net diferențiabile de alte
microorganisme; trebuie să fie numărate într-o perioadă de
timp relativ scurtă; alte componente ale microbiotei din
aliment nu trebuie să influențeze creșterea în mod negativ.
 Aceste produse au o biotă restrânsă, alterarea fiind produsă de un singur
microorganism. În acest caz, numărul de germeni este monitorizat prin cultivare
selectivă sau prin metoda care se bazează pe un mediu selectiv adecvat. Acești
indicatori de calitate microbiologică sunt de fapt microorganisme de alterare, prin
creșterea numărului acestora determină pierderea calității produsului. Produsele
metabolice pot fi folosite pentru evaluarea și prognosticarea calității microbiologice a
unor alimente.
 Indicatorii de siguranță alimentară

Indicatorii microbieni sunt folosiți frecvent pentru evaluarea siguranței și

igienei alimentare. Un indicator de siguranță alimentară trebuie să fie:
 Decelabil ușor și rapid;
 Să prezinte un istoric de asociere constanta cu agentul patogen, a cărui prezență
trebuie indicată;
 Să fie ușor de diferențiat de alți membri ai biotei alimentare;
 Să fie prezent întodeauna când este prezent și agentul patogen;
 Să fie un organism al cărui număr să se coreleze cu numărul agenților patogeni
respectivi;
 Să aibă condiții și o rată de creștere egală sau mai mare decît agentul patogen;
 Să aibă o rată de dispariție, cel puțin paralelă cu cea a agentului patogen și care în
mod ideal să persiste puțin mai mult decât agentul patogen respectiv.
Criteriile acestea sunt aplicate la majoritatea produselor ce pot fi vehiculate
de transport ai agenților patogeni din alimente.
Pe parcursul timpului, s-a considerat că agenții patogeni responsabili de
intoxicații alimentare, de origine intestinală, rezultă direct sau indirect din
consumul alimentelor contaminate cu fecale. Astfel de indicatori sanitari au fost
utilizați pentru determinarea contaminării apelor cu fecale.
Primul indicator pentru contaminarea fecală a fost Escherichia coli.