REACŢIA DE AMPLIFICARE POLIMERAZICĂ

Reacţia de amplificare polimerazică sau reacţia polimerazică înlănţuită (polymerase chain reaction — PCR)
este definită ca o metodă de sinteză şi amplificare enzimatică in vitro a unor secvenţe de ADN aplicând
fenomenul de hibridare ADN-ADN şi proprietatea de replicare semiconservativă. Hibridarea se produce după
recunoaşterea specifică a unor fragmente nucleotidice de pe o catenă a ADN-ului de interes, de către nişte
secvenţe scurte de ADN, numite primeri. Primerii iniţiază sinteza catenelor complementare de ADN care se
realizează cu o ADN-polimerază termorezistentă (Taq-polimeraza).
Determinarea secvenţei acizilor nucleici sau identificarea unor secvenţe nucleotidice din structura acestor
macromolecule prin hibridizare reclamă o anumită cantitate de material de analizat, de ordinul ng (10 -9g) sau
pg (10-12g), care — de cele mai multe ori — se obţine prin tehnici curente de donare. Însă uneori trebuie
evidenţiată doar o singură moleculă de ADN/celulă sau se pune problema identificării unei gene aflată într-o
singură copie/genom. Acesta este cazul „amprentei“ individului, când se lucrează doar pe un fir de păr sau pe
o picătură de lichid biologic, probe deja utilizate în medicina legală şi admise în criminalistică şi în justiţie.
Procedeul care a permis depăşirea acestor dificultăţi este cunoscut sub sigla PCR, care permite — pornind de
la cantităţi foarte mici de material iniţial — posibilitatea multiplicării practic nelimitate a acestuia in vitro.
Tehnologia PCR este rezultatul unor descoperiri majore în ştiinţele fundamentale, începând cu identificarea
de către Kornberg (1955) a primei enzime direct implicate în replicarea ADN in vivo şi anume a ADN
polimerazei I. În perioada 1955-1970 cercetătorii au analizat şi descris termodinamica amorsării replicării
ADN şi a extensiei primerului pe direcţia 5’→3', iar ideea sintezei amplificate a ADN a fost elaborată pentru
prima oară teoretic de către grupul lui Khorana. Primele experimente în domeniu au fost realizate de Kleppe
şi Molineux, aparţinând de grupul respectiv, dar ei au realizat doar un număr mic de cicluri de amplificare (2-
4) pe un duplex scurt de ADN (20-30 pb), folosind primeri de 9—10 baze.

Procedeul nu a fost extins de colaboratorii lui Khorana din mai multe considerente:
scopul ştiinţific al celor implicaţi fusese atins prin evidenţierea posibilităţii sintezei in vitro a ADN, ulterior
interesul fiind concentrat pe alte domenii;
la vremea respectivă nu erau cunoscute ADN polimeraze termostabile, necesare pentru eficientizarea
procedeului;
dificultatea sintetizării primerilor era în epocă un impediment major.
Рисунок 1. История развития метода ПЦР. 
 Metodologia modernă a PCR a fost dezvoltată iniţial de către Mullis (1983). În 1985, tehnica a fost prezentată
public, iar în 1988 numai subiectul consacrat superconductorilor a fost citat mai des în literatură decît cel legat de
PCR.

• Principiul metodei de PCR a fost formulat de Gobind Khorana in 1971

• In 1983 Karry Mullis a efectuat reactia de PCR
• In 1993 Karry Mullis a fost decernat cu premiul Nobel in chimie pentru inventia reactiei PCR
PCR „exploatează“ anumite etape ale replicării ADN. Se
ştie că ADN polimeraza utilizează drept matriţă (template)
pentru sinteza unei noi catene complementare un ADN
monocatenar. Ţinta este flancată de doi primeri, asemănători
amorselor necesare replicării ADN in vivo. După fiecare
ciclu de reacţie (care se repetă de 25-35 ori), numărul
copiilor moleculelor iniţiale se dublează (produsele din
ciclul anterior servesc ca matriţe pentru sinteza noilor
catene), astfel încât, la sfârşitul I ciclu dintr-o moleculă de
ADN de interes se obţin 2 molecule, în ciclul II – 4
molecule, în ciclul 3 – 8 molecule etc., după 30 de cicluri,
numărul de molecule amplificate este de peste 1 mlrd
30
Amplificarea ADN in vitro (eficacitatea reala a unor cicluri de amplificare constitue in progresia
geometrica~ 78-97%).

А = М(2ⁿ-n-1) ~ 2ⁿ
n-numarul ciclurilor; M – cantitatea initiala ADN tinta , A – cantitatea produsului specific amplificat .
 Reacţia de amplificare polimerazică constă în repetarea ciclică a unui modul de trei etape (în aceeaşi ordine
pentru fiecare ciclu) (fig. 18):
 denaturarea ADN matriţă prin încălzire la o temperatură ~960C;
 amorsarea cu primeri care hibridizează cu ADN ţintă (annealing) ~500C;
 extensia primerilor sub acţiunea ADN polimerazei la temperatura 720C.
Singurul parametru variabil pe parcursul ciclurilor este temperatura.

Fig. 18 — Reacţia PCR în modul.

 Practic, în primul ciclu de reacţie există o moleculă-ţintă bicatenară care este denaturată termic, dând naştere la două
monocatene; la acestea se ordonează adică se ataşează pe baza complementarităţii de baze azotate (anneal) prin hibridizare
în zona 3’ amorsele (primerii) complementare corespunzătoare. De aici începe extensia prin polimerizare a catenelor
complementare-fiice, pe direcţia 5’→3’. Produşii de elongare au o lungime determinată de cea a secvenţei iniţiale flancate
de primeri; deoarece ei sunt de asemenea complementari, vor lega aceiaşi primeri, ciclul de evenimente repetându-se de un
anumit număr de ori. Prin PCR se realizează exclusiv amplificarea ADN de interes, cu condiţia cunoaşterii (măcar parţiale) a
secvenţei, condiţie necesară pentru designul şi sinteza unor primeri specifici, discriminatori (fig. 19).

Fig. 19 — Schema generală a reacţiei PCR.

 PARAMETRII REACŢIEI DE AMPLIFICARE. AMESTECUL STANDARD DE PCR REACŢIE.
 ADN matriţă (105-106 molecule) (reprezentat de 1 μg ADN genomic uman sau 10 ng ADN de drojdie sau
1 ng ADN cromozomal de E. coli sau 1% dintr-o plajă fagică, de exemplu de fag M13);
 gelatină autoclavată sau albumină serică bovină 100 μg /ml, fără nucleaze;
 Concentraţia enzimei şi tipul ei. Iniţial, s-a folosit ADN polimerază de E. coli (fragmentul Klenow), astfel
că fiecare rundă necesita o nouă cantitate de enzimă, pentru compensarea celei denaturate termic. Introducerea
unor polimeraze termorezistente, izolate din bacterii termofile cum ar fi Thermus flavus, Thermococcus
litoralis, Thermophilus aquaticus, Pyrococcus furiosus etc., a constituit un prim pas spre automatizarea
procesului. La ora actuală, cea mai utilizată polimerazâ este cea din Thermus aquaticus (Taq), pentru care s-
au realizat majoritatea protocoalelor de lucru. Viteza optimă de polimerizare este de 35-100 nucleotide/s la
70-80°C. Enzimele au o activitate 5’-3’ exonucleazică care permite înlăturarea nucleotidelor situate in faţa
lanţului de creştere. Alta varianta de ADN polimeraza termostabila ce se utilizeaza deseori este AmpliTaq
polimeraza, care are aceleaşi proprietăţi cu Taq polimeraza dar este produsă in E.coli prin recombinare
genetică. Reproductibilitatea şi puritatea acesteia este mult mai mare decât a Taq polimerazei simple. Dar in
ultimul timp se preconizează înlocuirea ei cu enzima din P. furiosus (Pfu) cu o termostabilitate superioară şi
cu proprietăţi de corectare (proof-reading) mai bune decît ale altor polimeraze similare. Experimentele au
arătat că ADN polimeraza Pfu are o fidelitate de 12 ori mai mare decât Taq polimeraza. În plus, Taq
polimeraza este lipsită de activitate 3’,5’-exonucleazică de corectură, astfel încât uneori se înregistrează rate
relativ mari de încorporare greşită. Prin contrast, Pfu nu ridică acest tip de probleme, ceea ce va determina ca
ea să devină enzima de elecţie pentru PCR, mai ales acolo unde se cere o înaltă fidelitate în copierea ADN,
cum ar fi donarea pentru exprimarea unor proteine. În plus, la temperatura camerei, Pfu are o activitate pe
jumătate faţă de Taq, ceea ce are drept efect reducerea extensiei nespecifice a primerilor de start la rece. În
cazul Pfu s-a calculat o rată de eroare de 1-2x10 -6 faţă de 1,5-2,5x10-5 pentru Taq, ceea ce corespunde la o
frecvenţă de mutaţie de 0,35—0,60% la Pfu comparativ cu 4,3-7,3% la Taq. Aceasta înseamnă că amplificând
o secvenţă de 1 kb în cursul a 20 de cicluri efective cu Taq, pot apărea 40% mutaţii, pe când lucrând cu Pfu
incidenţa este doar de 3%. In general, se recomandă adăugarea a 1-2,5 unităţi enzimatice/reacţie, o
concentraţie prea mare putând produce un fond ridicat de produse nespecifice, iar una prea mică ar avea ca
efect obţinerea unei cantităţi insuficiente de produs de interes.
Deoxiribonucleozidtrifosfaţii (dNTP), câte 50 μmoli din fiecare, sunt livrate fie sub forma a patru
soluţii stoc individuale, fie sub forma unui amestec al celor patru nucleotide. Soluţiile sunt ajustate la o
valoare optimă de pH. Concentraţia optimă de dNTP depinde de: concentraţia de MgCl2, conc. primerilor,
lungimea fragmentului ce urmează să fie amplificat şi numărul de cicluri de reacţie. Aceştia trebuie să
prezinte suficientă stabilitate individuală, aşa încât să rămână activi cel puţin în proporţie de 50% după 50 de
cicluri de lucru. În domeniul 20 - 200μM se asigură un bun echilibru între
randamentul/specificitatea/fidelitatea reacţiei. Se preferă lucrul cu cantităţi echivalente, pentru evitarea
încorporării eronate. În domeniul concentraţiilor mai mici, cresc specificitatea şi fidelitatea de replicare.
 Primerii. Primerii sunt secvenţe oligonucleotidice cu o lungime de 18—20 de baze, cu un conţinut de 50-
60% G+C şi având Tm=550-80°C, cîte 2 μmoli din fiecare, in desemnarea primarilor trebuie respectate câteva
reguli generale:
-lungimea primarilor trebuie să fie cuprinsă intre 20 şi 35 de nucleotide. acest lucru permiţând selectarea unei
temperaturi de hibridizare ridicate;
- primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru baze azotate, evitându-se pe cât posibil
regiunile cu repetiţii de nucleotide (evitare structuri hairpin);
- parechile de primeri trebuie alese astfel încât să nu prezinte complementaritate la nivel intra- şi
interindividual (evitarea dimerilor de primeri), îndeosebi la capetele 3’, ceea ce se poate realiza uneori prin
înlocuirea dGTP cu 7deaza-2’deoxiguanozintrifosfat, pe care Taq polimeraza o încorporează după o cinetică
similară, fără afectarea fidelităţii globale a PCR, produsul final putând fi donat în E. coli sau secvenţializat.
Mai mult chiar, niciunul dintre primeri nu ar trebui să aibă 3’T, acesta fiind nucleotidul cel mai puţin
discriminatoriu (primerii de acest tip au o mare toleranţă la împerecheri greşite), în mod general protocoalele
de lucru recomandând ca în tripleta 3’ consecutiv cu G sau С să existe cel puţin o A sau T. In structura
secvenţelor de primeri pot fi introduse situsuri pentru enzimele de restricţie, codoni ATG de start sau
nucleotide din secvenţe promotor, polilinkeri pentru donare sau situsuri pentru mutaţii.
- distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5-10 kpb, dar s-a observat o eficienţă
foarte scăzută a reacţiei in cazul in care lungimea produsului de amplificare depăşeşte 3 kpb;
- determinarea cu exactitate a temperaturii optime de hibridizare (annelare) prin realizarea unei reacţii PCR în
Concentraţia Mg2+. Una dintre variabilele-cheie ale PCR este concentraţia ionilor Mg 2+; ea este un factor
esenţial al specificităţii şi al cantităţii de produs de amplificare obţinut. Concentraţia prea mare de ioni Mg 2+
stabilizează ADNdc, prevenind totodată denaturarea produsului iniţial, reducând nivelul produsului
amplificat. De asemenea, excesul de Mg 2+ poate stabiliza ordonarea (annealing) aleatorie a primerilor la ţinte
incorecte, determinând obţinerea de nivele crescute de produse nedorite şi, deci, specificitate mică.
Pe de altă parte, concentraţia scăzută de Mg 2+ (sub 0,2 μM) — cu rol de cofactor enzimatic al celor mai
multe ADN polimeraze şi sigur al celor termostabiie — nu permite extensia primerilor. Parţial, ionii de Mg 2+
vor fi chelataţi de către dNTP din amestecul de reacţie, de aceea va exista mereu o concentraţie optimă de
Mg2+ care va mări specificitatea reacţiei, atunci când toate celelalte condiţii vor rămâne constante. Pentru aşa-
numitele „regiuni recalcitrante“ (cu conţinut ridicat G+C), amplificarea eficientă este înlesnită de o
concentraţie relativ mică de ioni Mg2+.
Prezenţa ionilor bivalenţi influenţează ordonarea primerilor, precum şi temperatura de disociere a catenelor
complementare (denaturarea). O concentraţie anumită de Mg 2+ împiedică formarea unor dimeri de primeri,
influenţând favorabil activitatea şi fidelitatea ADN polimerazei. Prezenţa EDTA sau a altor chelatori
afectează reacţia PCR.
 tampon pentru PCR (10x: KCl 500 mM,Tris-HCl 100 mM, MgCl2 15 mM) furnizează pH optim al
polimerazei utilizate şi concentraţia optimă a ionilor Mg +2, activatorii ADN polimerazei (cantităţile
insuficiente de Mg+2 duc la amplificări slabe, iar cantităţile crescute conduc la cumularea de produşi de
amplificare nespecifici). Regiunile bogate în G+C se amplifică bine prin PCR atunci când mediul este bazat
pe NaCl, probabil prin favorizarea denaturării. Tampoanele cu (NH 4)2SO4 au fost utilizate printre primele în
studiile de PCR, acum fiind reluate mai ales pentru lucrul cu noile enzime termostabile recomandate, de
exemplu pentru Pfu. Prezenţa sărurilor de amoniu înlătură artefactele (decelate în electroforeză ca benzi de
masă moleculară mică) produse de Taq polimerază prin extensia incompletă a produselor de amplificare. In
plus, aceste tampoane conţin substanţe de tipul Triton X-100 sau gelatină, cu rol în stabilizarea proteinei
enzimatice de-a lungul ciclurilor de reacţie. Cel mai comun tampon pH8,3 folosit conţine: Tris-HCl şi
gelatină.
apă distilată, la un volum final de 50-100 μl, se utilizează exclusiv apă ultrapurificata nuclease-free, livrată
 Aşa după cum s-a menţionat anterior, parametrul variabil în PCR este temperatura. Condiţiile clasice de denaturare sunt de
95°C/30 sec sau 97°C/15 sec, dar în cazul ţintelor cu conţinut ridicat de G+C se recomandă utilizarea unor valori mai mari
de temperatură. Denaturarea incompletă reduce cantitatea de produs de amplificare, în timp ce prelungirea acesteia duce la
pierderea activităţii enzimatice.
Temperatura şi timpul necesar amorsării depind de compoziţia în baze azotate, de lungimea şi de concentraţia primerilor
utilizaţi. De obicei se foloseşte o temperatură cu 5°C mai mică decât Tm corespunzător primerilor, dar cele mai bune rezultate
s-au obţinut la valori cuprinse în intervalul 55°-72°C. Creşterea temperaturii la amorsare măreşte gradul de discriminare faţă
de alinierea incorectă a primerilor şi reduce extensia greşită a nucleotidelor incorect adăugate la capătul 5’. Se poate spune
astfel că temperaturile stringente de annealing măresc specificitatea reacţiei. Există protocoale care, în acelaşi scop,
recomandă adăugarea Taq polimerazei (termostabilă) abia la sfârşitul primei runde de denaturare.
Td — temperatura la care jumătate din primeri (oligonycleotide lungi de 20 de baze) se aliniază la secvenţa-ţintă specifică
se calculează după ecuaţia:
Td = 4(G+C) + 2(A+T) - p/u primeri, care contin pana la 20-25 nucleotide, unde A, T, C, G - numărul bazelor
respective din oligonucleotid;
unde l-lungimea primerului, p/u primeri, care contin >20 nucleotide sau
Tm = 22+1.46([2(G+C)] + (A+T)) - p/u primeri, care contin pana la 20-35 nucleotide;
-p/u primeri, pana la 15-70n., I-concentratia cationilor monovalente, N-lungimea
primerului.
Tradiţional, extensia primerilor se face la 72°C, aceasta fiind temperatura optima pentru modelul experimental în care ţinta
este acidul nucleic al fagului M13. Rata de incorporare la această temperatură variază între 35-100 nucleotide/sec şi este in
funcţie de natura, pH şi tăria ionică a tamponului, de natura ţintei etc.
Temperaturile scăzute de extensie, ca şi concentraţiile crescute de dNTP favorizează extensia greşită a primerilor
(missextension), ca şi pe cea a nucleotidelor greşit încorporate (missmatched). Din aceste considerente, unii autori consideră
că PCR trebuie realizat cu primeri lungi şi numai la două valori de temperatură: 55°-72°C pentru annealing şi extensie şi
94°-97°C pentru denaturare.
Specificitatea PCR este afectată şi de alţi factori, în afară de temperatura de annealing, concentraţiile dNTP şi a primerilor,
a Mg2+ şi a ADN polimerazei pot varia şi ele pe parcursul reacţiei. De obicei, se supun amplificării secvenţe ADN cu
dimensiuni până la 4 (10) kb.
Aşa numitul long range PCR permite amplificarea unor acizi nucleici cu dimensiuni mai mari (de 10—20, eventual până la 27 kb).
Metoda foloseşte,un amestec de Taq pol de înaltă procesivitate (având activitate polimerazică 5’→3’) cu o polimerază cu înaltă
capacitate de proofreading 3’→5’ (Pwo sau Tth pol). Aceste enzime asigură o extensie susţinută a primerilor, pe parcursul a circa 40 de
Dependenţa cantităţii de produse amplificate
de concentraţia ADN genomic utilizată în
PCR. S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 – 0,5
μg, 2 – 0,25 μg, 3 – 0,1 μg, 4 – 0,02 μg
VARIANTE DE REACŢII DE AMPLIFICARE
Invers-PCR este o variantă care permite amplificarea unor regiuni ADN de secvenţă necunoscută, flancate de zone cu
secvenţă cunoscută. Prima etapă presupune restricţia enzimatică în interiorul regiunilor cu secvenţe necunoscute in scopul
obţinerii a două capete de acid nucleic compatibile. Regiunea astfel delimitată se circularizează prin ligare, iar primerii se
sintetizează pentru secvenţele ADN cunoscute (fig. 20).
Deci PCR permite amplificarea ADN, ceea ce îi asigură succesul comercial.
SR (self sustained sequence replication) sau NASBA este o
varianta in vitro de transcriptie retrovirale naturale. Este o tehnică
oarecum înrudită cu PCR, în condiţii izoterme (37°-42°C), deci
fără cicluri termice, cu timpi de reacţie mai scurţi decât PCR (105
copii/15 min de 3SR faţă de 85 min în PCR, pentru acelaşi număr
de copii); în acest caz, se porneşte de la ARN, care se degradează
pe parcurs (fig. 21):

Fig. 21 — Schema 3SR.

Fig. 20 — Schema invers-PCR.

LCR (ligase chain reaction). Tehnica se bazează pe următoarele, prin comparaţie cu amplificarea obişnuită: PCR
generează noi molecule de ADN din nucleotidele individuale, pe când LCR utilizează enzima termostabilă pentru ligarea
unor oligonucleotide adiacente. Este tot o reacţie ciclică — denaturare/ordonare/ligare — oligonucleotidele cuplate
complementar devenind matriţă în etapele ulterioare. In LCR este necesară cunoaşterea integrală a secvenţei ADN-ţintă,
deoarece o împerechere greşită poate împiedica ligarea (fig. 22):

Fig. 22 — Schema LCR.

 
RT-PCR (PCR precedat de reverstranscriere). Seeburg şi colab. (1986) au fost primii care au descris PCR aplicat direct la
ARNm, cu obţinerea ADNc. Protocolul este asemănător cu cel standard pentru ADN, doar că în plus se adaugă
reverstranscriptazâ (adică virusul Moloney al leucemiei murine sau virusul mieloblastozei aviare AMV sau o enzimă
„sintetică“) şi RNasin (adică inhibitori de RNază). Pentru reverstranscriere şi pentru PCR se foloseşte acelaşi tampon sau
tampoane diferite, în funcţie de protocol. În general, 1 μg ARN citoplasmatic este suficient pentru amplificarea unor secvenţe
rare de ARNm, aflate în 1—10 copii/celulă. O celulă de mamifere conţine circa 10 pg ARN citoplasmatic, deci 1 μg
reprezintă ARN din 105 celule. Cînd se analizează o populaţie celulară omogenă nu este nevoie de separat poliA-ARN. Ca
amorsă de reverstranscriere se pot utiliza fie hexaprimeri aleatori (care asigură amplificarea nespecifică a ARN), fie
primerul antisens — utilizat apoi în reacţia propriu-zisă de PCR.
Când se studiază ARNm eucariot se recomandă ca primerii să fie derivaţi din exoni distincţi, ceea ce va inhiba
amplificarea şi contaminarea cu produse nedorite provenite din ADN respectiv. Dacă nu se cunoaste structura genomului se
folosesc primeri separaţi prin 300-400 de baze, din zona 5’ a regiunii codificatoare. Întrucât la vertebrate exonii mai mari de
300 de baze sunt rari, există şanse ca primerii să aparţină cu adevărat unor exoni diferiţi. Dacă gena nu are introni sau se
studiază ARNm bacterian, ARN viral sau transcripţi virali, este nevoie de tratarea ARN cu DNază pentru obţinerea unor
rezultate bune în PCR, evitându-se contaminarea.
Obţinerea unor ADNc cu lungime completă faţă de ARNm transcrişi ridică probleme legate de realizarea capetelor 5’ ale
mesajelor, iar factorul limitant este chiar reverstranscrierea, fie din punct de vedere al reverstranscriptazei, fie al
pretratamentelor la care este supus ARNm pentru anularea structurii sale secundare. In plus, pentru analiza unei singure
biblioteci de ADNc este necesar un timp îndelungat, în condiţii standard, cel puţin de ordinul săptămânilor!
Tehnicile moderne permit sinteza unui ADNc monocatenar-matriţă direct pe bile magnetice, deci un revers-PCR (RT-
PCR) în fază solidă. ADNc legat la bile poate fi utilizat pentru a sintetiza copii multiple ale fragmentelor respective.
Beneficiile PCR prin reverstranscriere în fază solidă includ înalta specificitate şi sensibilitate, ca urmare a izolării şi detecţiei
unor transcripte ARNm rare. Separarea magnetică rapidă asigură îndepărtarea secvenţelor ARNm/ADNc nespecifice şi
reduce nivelul degradării enzimatice. Proprietâţile fizice şi chimice ale bilelor magnetice permit desfăşurarea normală a
reacţiilor enzimatice în cursul RT-PCR direct pe bile, cu o cinetică optimă.
Datorită marii sale sensibilităţi, RT-PCR în fază solidă asigură izolarea ARNm pornind de la minim 2 celule/probă.
Reverstranscrierea este apoi efectuată pe primerii oligo(dT) legaţi covalent la bile printr-un procedeu standard (fig. 23).
După izolarea magnetică a ARNm, se adaugă un primer 5’-specific şi se sintetizează prima catenă de ADNc, monocatenar,
necesară sintezei ulterioare a ADNc dublu catenar, utilizat în PCR standard.
Fig. 23 — Schema RT-PCR.
RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Este o variantă îmbunătăţită, care permite ca analiza produşilor de
reverstranscriere să se facă în 1—2 zile de la obţinere. Protocolul RACE cuprinde inclusiv separarea speciilor de ADNc,
produse pe diferite transcripte anterior donării. În esenţă, RACE dă naştere la ADNc prin PCR, amplificând copierea
regiunilor cuprinse între locul de ataşare a primerilor şi capetele 3’ şi 5’. Metoda impune cunoaşterea măcar a unei secvenţe
scurte dintr-un exon, în funcţie de care se vor alege primerii orientaţi 3’ sau 5’, care vor da naştere secvenţelor suprapuse de
ADNc, la extensia maximă. Primerii sunt cei care dau specificitate etapei de amplificare şi de aceea se aleg astfel încît să se
ordoneze faţă de capătul 3’-poliA natural sau 5’-poliA adăugat sintetic. În final, produsele RACE pentru capatele 3’ şi 5’ vor
forma un ADNc intact, de lungime completă. Pentru capătul 3’, ARNm se reverstranscrie utilizând un primer hibrid cu
oligo(dT)17 legat de un adaptor oligonucleotidic cu 17 resturi. Amplificarea se face cu primerul adaptor legat la capătul 3’ şi
cu primer specific pentru gena de interes. Pentru capătul 5’ reverstranscrierea are loc doar cu un primer specific pentru gena
de interes. La produsul de reacţie monocatenar se ataşează cu ajutorul transferazei terminale o coadă poliA. Amplificarea are
loc între primerul hibrid amintit şi primerul specific genei, situat în aval de primul (fig. 24).
Ca dezavantaje ale RACE se pot cita amplificarea unor ADNc fără omologie semnificativă cu gena de interes (ca urmare
a alegerii unor primeri neadecvaţi) sau apariţia unor ADNc 3’truncaţi (din cauza ordonării primerului adaptor la o zonă
bogată în A, dar diferită de capătul 3’poiiA). În ceea ce priveşte capătul 5’, utilizarea unor primeri scurţi de 12-16
nucleotide, bogaţi în A+T şi a unor temperaturi mai mari pentru reverstranscriere (52°C) micşorează pericolul obţinerii unor
produşi nespecifici.
Primerul adaptor oligo(dT)17 folosit pentru reacţia de amplificare 3’ poate fi utilizat şi ca primer pentru sinteza celei de a
doua catene a ADNc corespunzător capătului 5’. De multe ori este economic şi de dorit folosirea unor primeri degeneraţi
(amestecuri de oligonucleotide cu acelaşi număr de baze, dar cu secvenţă variabilă), mai ales atunci cînd nu se cunoaşte
integral secvenţa genei sau structura primară a proteinei corespunzătoare. Din acest punct de vedere, designul primerilor se
face ţinînd cont de degenerarea codonilor, fiind preferaţi codoni care prezintă degenerare minimă (tabelul 7).
Fig. 24 — Schema RACE.
MOPAC (Mixed Oligonucleotide Primed Amplification of cDNA). Trebuie ținut cont că un primer are 15-20
nucleotide, adică mesajul pentru 5-7 aminoacizi care trebuie bine precizaţi în proteina a cărei genă se studiază. Pentru a
înlesni unele studii, eventual primerul poate include un situs de restricţie. Acest gen de primeri se utilizează în cadrul
variantei MOPAC. Primerii cei mai adecvaţi urmează să se ordoneze selectiv la matriţă, în competiţie cu cei mai puţin
specifici. S-a constatat cu surprindere că pentru o bună reuşită a PCR în MOPAC nu este nevoie de o împerechere perfectă,
ci există o toleranţă de circa 20% între ţinta-matriţă si amorse. MOPAC funcţionează nu numai cu ARNm-poliA izolat, ci şi
cu ARN total, iar denaturarea hibrizilor ADN:ARN formaţi pe parcurs se realizează termic, fără a mai fi nevoie de mediul
alcalin pentru hidroliza ARN. În desfăşurarea MOPAC se recomandă ca ARNm să provină de la aceeaşi specie de la care
derivă şi proteina pe baza căreia s-a făcut designul primerilor.
PCR asimetric. Uneori se urmăreşte ca după PCR să se facă direct determinarea secvenţei, fără donarea prealabilă a
produsului obţinut, ceea ce a determinat punerea la punct a unor variante modificate de PCR în care să rezulte doar ADN
complementar monocatenar corespunzător catenei alese. In acest scop, se utilizează cantităţi inegale din cei doi primeri (fig.
25).
În cursul primelor 15-20 cicluri-cea mai mare parte a produsului sintetizat este bicatenară şi se acumulează exponenţial. În
continuare, primerul în exces duce doar la amplificarea unei singure catene, iar acest ADNmc se acumulează liniar, în
funcţie de concentraţia primerului excedentar. Matriţa monocatenară poate fi apoi secvenţializată cu acelaşi primer folosit la
obţinere sau cu un al treilea primer intern, care conferă un grad sporit de specificitate. Oricum, PCR asimetric este mai puţin
productiv decât PCR standard, fiind necesare mai multe cicluri pentru atingerea unui randament convenabil. Lungimea
optimă a ADN ţintă de amplificat prin PCR asimetric este de 1 kb, iar concentraţia dNTP este mai mică decât la procedeul
standard.
Pentru obţinerea fragmentelor PCR utilizate în donare, la capetele 5’ ale primerilor se adaugă situsuri pentru enzimele de
restricţie, manevra fiind posibilă pe seama câtorva nucleotide necomplementare cu ADN-ţintă (un primer tipic are 15-30
nucleotide complementare integral cu ţinta, iar în cazul dat, primerii sunt precedaţi de 4-8 nucleotide reprezentând situsul de
recunoaştere şi tăiere al unei anumite restrictaze). Adiţia de extranucleotide la capetele 5’ ale primerilor nu interfera cu
eficienţa PCR, ADN polimeraza Taq adăugând ea însăşi extranucleotide la capetele matriţei, pe parcursul sintezei. Prin
aceeaşi tehnică se pot adapta fragmentele de amplificare în scopul donării, prin adăugarea de polilinkeri.
Fig. 25 — Schema PCR asimetric.
Anchor PCR. Este o altă variantă a tehnicii PCR, în cadrul căreia pot fi amplificate secvenţele ADN sau ARN cu capete
variabile. La capetele 3’ ale ADNc obţinut prin RT se ataşează, cu ajutorul deoxinucleotidiltransferazei, o coadă poli(dG)
care hibridizează cu capătul 5’-poli(dC) al primerului ancorat. În continuare, se desfăşoară reacţia PCR standard, care
amplifică acest ADN (fig. 26):

Fig. 26 — Schema anchor-PCR.

Nested PCR realizează o dublă amplificare prin utilizarea a două perechi de primeri diferiţi. Prima rundă de amplificare
foloseşte două amorse situate la distanţă mai mare una de cealaltă, eventual din regiunea înalt conservată a genomului de
investigat, iar în cea de a doua etapă, primerii sunt situaţi în regiuni apropiate sau în cele care pot duce la discriminarea
genotipurilor înrudite (fig. 27).

Fig. 27 — Schema nested PCR.

PCR in situ. Izolarea ţintei ADN sau ARN, anterior amplificării prin PCR, este una dintre limitele acestei tehnici.
Posibilitatea de a efectua PCR in situ elimină acest dezavantaj şi, mai mult, furnizează date asupra localizării celulare a
secvenţei nucleotidice urmărite, cu conservarea caracteristicilor citologice şi histologice ale preparatelor biologice studiate.
Tehnica este aplicată ţesuturilor îngheţate sau parafinate, prelucrate recent sau chiar mai vechi (se trateaza cu proteaza si se
adauga direct solutia tampon PCR pentru amplificarea ulterioara). Evidenţierea rezultatelor pozitive se face prin
incorporarea în amestecul de reacţie a unor sonde moleculare. Sondele moleculare sunt fragmente de ADN sau ARN
marcate sau nu (radioactiv), care prin fenomenul de hibridare pot recunoaşte în mod complementar fragmente “de interes”,
pe o moleculă de acid nucleic “destinat cercetării”. Din punct de vedere aplicativ, sondele nucleare reprezintă căile de acces
direct la nivelul ADN, acestea putând detecta unele gene mutante, chiar în stadiul prenatal.
Tipuri de sonde moleculare:
1.sonde “calde” – marcate radioactiv cu izotopi de 32P sau 35S care sunt foarte sensibile, dar au o durată scurtă de viaţă şi
sunt periculoase pentru cei ce le manipulează; se vizualizează prin autoradiografie (impresie pe filmul fotografic);
2. sondele “reci” – fragmente de acid nucleic, marcate cu un produs chimic neutru: direct, cu enzime sau fluorocromi sau
indirect, cu biotină. Se vizualizează în funcţie de tipul de marcaj. Deşi sunt mai puţin sensibile, au avantajul de a fi
inofensive pentru cercetător.
PCR cantitativ. În afară de aspectele calitative, tehnica PCR a permis şi stabilirea unor aspecte cantitative, privind
cuantificarea anumitor secvenţe nucleotidice. Pentru cuantificare este necesar un standard intern (lucrat concomitent cu
proba de analizat), care constă în existenţa unui număr precizat de copii ale unei secvenţe omoloage cu cea de cercetat.
 RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA
(ADN Polimorfic Amplificat Randomizat )
Tehnica RAPD a fost pentru prima dată descrisă de către WILLIAMS şi colab. (1990) si este cea mai simplă
variantă a metodei PCR cu primeri arbitrari. Ea se bazează pe polimorfismul formelor parentale la nivel alelic în
ceea ce priveşte prezenta sau absenta unor produşi de amplificare, în urma folosirii unui singur primer decamer
oligonucleotidic ce se leagă în mod randomizat în genom, acolo unde găseşte omologie.
Avantaje: automatizat, rapid, relativ ieftin, cu variabilitate
mare
Dezavantaje:
markerii sunt dominanti (fragmentul apare atât în cazul
homozigoţilor dominanţi (AA) cât şi în cazul heterozigoţilor (Aa), dar
lipseşte în cazul homozigoţilor recesivi (aa) pentru secventa respectiva.
Analiza datelor este mai complicata.
Sensibilitatea mărită a tehnicii - in privinţa reproductibilităţii,
RAPD necesită menţinerea constantă a condiţiilor de reacţie.

RAPD analysis of somatic

hybrid plants (sf1-sf3)
M.sativa + M.falcata with the
random primer RP7.(S. Arcioni
Schema RAPD (Williams et al., 1990) et al.)
 ISSR – Inter Simple Sequence Repeat
(Amplificarea Regiunilor dintre Secvenţele Simple Repetate )
Tehnica ISSR a fost pentru prima dată descrisă de către Zietkiewicz şi colab. (1994). Ea se bazează pe
polimorfismul unor secvenţe foarte scurte de 1-10 perechi de baze cu o distribuţie dispersată în genom,
în urma folosirii unui singur sau câțiva primeri cu lungimea de 15-24pb.
Microsatelit ADN – ADN constituit din motive simple, de obicei de 1 sau 6 pb repetate în tandem.
Marcherii ISSR specifici sunt înalt polimorfi în regiunile intermicrosatelitice şi se moştenesc dominant
conform legilor mendeliene. Datorită eficienţei înalte, metoda este aplicată cu succes în determinarea
gradului de rudenie (paternitate), in apartenența la o anumită populație (variabilitate
intrapopulationala), studiul asupra hibridizării. Microsateliții sunt caracterizați printr-o rată ridicată de
schimbare a secvențelor datorită "alunecării" în procesul de replicare a ADN-ului și a mutațiilor
punctiforme.
Primer:
5’ – CA CA CA CA CA CA CA CA CA
G
Avantaje: variabilitate foarte mare, reproductibilitate
si precizie inalta in comparatie cu RAPD, evolueaza
rapid, rapida si relativ ieftina

Dezavantaje: markeri dominanti, locarizarea si

functia in genom a produselor de amplificare raman ne
cunoscute

Schema ISSR (Zietkiewicz et al., 1994; Gupta et al., 1994; Bornet, Branchard, 2001)
 AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism
(Polimorfismul Lungimilor de Fragmente Amplificate )
AFLP este o metoda destul de complexa, care consta din cateva etape:
Digestia ADN cu doua enzime
Legarea adaptorilor la capetele fragmentelor
Primeri complementari cu adaptorii si cu capatul 3’ a unor fragmente

AFLP in gel de poliacrilamida

cu sonda moleculara
Avantaje: rapid, relativ ieftin cu variabilitate mare
decat ISSR si RAPD
Dezavantaje: markerii sunt dominanti, costuri mari

Schema AFLP (Zabeau, Vos, 1993) Capete “lipicoase” Sticky ends

Alte aplicaţii. Una dintre cele mai importante aplicaţii PCR este identificarea şi analiza mutaţiilor în ADN eucariot (fig.
28).
Inserţiile (fig. 29) şi deleţiile (fig. 30) pot fi decelate prin modificarea dimensiunilor produşilor PCR sau, în absenţa
produsului de amplificare, dacă în aria deleţiilor este cuprins şi primerul.
Mutaţiile pot fi identificate prin hibridizarea ampliconilor ADN cu sonde ARN şi digestia duplexului cu RNazâ A
(digestia va apare în condiţiile prezenţei mismatch-urilor în duplex). Peste 23 de mutaţii ale genelor umane şi defecţiuni ale
alelelor lincate au fost diagnosticate prin PCR (uneori diagnosticul efectuându-se prenatal) şi peste 30 de organisme
patogene au fost identificate în probe clinice).

Fig. 28 — PCR pentru studii de mutageneza.

Fig. 29- PCR pentru studii de mutageneză prin inserţie.

Fig. 30 — PCR pentru studii de mutageneză prin deleţie.

Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea mutaţiilor
punctiforme cu primeri specifici pentru gena normală
Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea deleţiilor
DECELAREA PRODUŞILOR DE AMPLIFICARE
După terminarea etapelor propriu-zise de amplificare urmează evidenţierea produselor obţinute. Aceasta se poate executa
electroforetic (în gel de agaroză sau poliacrilamidă, a căror concentraţie depinde de rezoluţia pe care trebuie să o confere),
faţă de un marker de masă moleculară, atunci când se cunoaşte masa ampliconului, prin hibridizare Southern sau dot-blot
sau prin reacţii tip ELISA (pe plăci special pregătite). În anumite cazuri, pentru analiza completă a fragmentului amplificat
(în special atunci când s-a efectuat la invers-PCR), se poate recurge la secvenţializare.
Tehnica de amplificare polimerazică a avut un impact major în dezvoltarea cercetărilor biologice: acizii nucleici ai unor
celule care cresc greu (fungi) au putut fi astfel evidenţiaţi sau s-a realizat analiza expresiei factorilor de creştere ai exprimării
genice în cursul embriogenezei şi a examinării recombinărilor omoloage în celulelele embrionare, ca şi la decelarea
schimbărilor nucleotidice rezultate din evenimentele de procesare a ADN, precum şi studiul interacţiunii ADN-proteine,
toate aceste cercetări având un impact major, inclusiv în proiectul „Genomul uman“.
 Avantajele tehnicii PCR sunt următoarele:
necesitatea cantităţilor mici de ADN,
rapiditatea ei (în câteva ore se obţin milioane copii de ADN),
Metoda ieftina,
Nu necesita izotopi radioactivi,
Interpretarea usoara a rezultatelor,
iar specificitatea primerilor permite amplificarea selectivă a ADN,
produsele de amplificare pot fi utilizate în calitate de sonde pentru hibridări în
alte tehnici.

Dezavantajele PCR
Necesitatea cunoasterii secventei nucleotidice amplificate,
Necesitatea primerilor sintetici, specifici secventei analizate.
Aplicaţiile practice ale tehnicii PCR:
- detectarea mutaţiilor cunoscute la bolnavi şi purtători, în diagnosticul prenatal şi presimptomatic al bolilor ereditare
(insertiile, deletiile, mutatiile punctiforme);
- determinarea genelor de predispoziţie la bolile comune (coronaropatii, boala hipertonică, tulburări psihice etc.);
- diagnosticul precoce şi evaluarea pronosticului bolilor canceroase;
- determinarea prenatală a sexului;
- identificarea agenţilor patogeni (viruşi, bacterii) si gradului de infectie (quantitative PCR);
-dactiloscopia genomică în identificarea persoanelor, analiza filiaţiei (paternitate, maternitate);
-Identificarae expresiei genice (RT-PCR);
- tipizarea HLA (antigena leucocitei umane) - teste de histo-compatibilitate.