Pentru acuratee, probele luate de pe mop i de pe suprafeele utilajelor trebuie utilizate i evaluate.

n recuperarea probellor de pe mopul de splare, un numr corespunztor de mopuri(minim trei) sunt puse n contact cu cantiti de analii n soluia rezidual echivalent cu cantitatea de analit care trebuie nlturat teoretic de la o arie cunoscut de suprafa. Analitul este lsat s se amestece cu substanele din mop, apoi urmeaz extracia ntr-un volum cunoscut de solvent de extracie. Studiile de recuperare trebuiesc desfurate pe cel puin trei niveluri nivelul limit, 50% din nivelul limit i 100% din nivelul limit. Recuperarea procentual este calculat prin folosirea unui standard extern preparat la concentraia nivelului limit. Recuperarea procentual obinut nu trebuie s fie mai mic de 80%. n recuperarea de pe suprafeele utilajului sunt folosite 316 sticle de ceas inerte. O arie cunoscut este presrat cu o cantitate cunoscut de analit prin distribuia uniform a analitului n soluia rezidual pe suprafaa cunoscut. Sticla de ceas este uscat n condiii normale. Timpul de uscare va depinde de solventul folosit. Totui, uscare peste noapte este preferenial. Reziduul analitului uscat este recoltat apoi folosind un recoltor umezit n prealabil peste suprafaa corespunztoare. Recoltarea poate fi fcut prin micri orizontale, verticale i n zig-zag a recoltorului. Pentru o recuperare optim poate fi nevoie de mai multe recoltoare pentru nlturarea analitului de pe suprafaa sticlei de ceas. Recoltoarele sunt apoi plasate ntr-un tub de 50ml i extrase cu solventul de extracie specificat n metoda respectiv. Calculele recuperrii sunt fcute mpotriva unui standard extern preparat la nivelul limit. Recuperrile pot fi efectuate la nivelul limit, 50% din nivelul limit i 100% din nivelul limit. Se scoate n eviden c n abordarea recuperrii de pe suprafee, valorile recuperate sunt de obicei ntre 70% i 80%. Pierderi n valorile de recuperare sunt atribuite solubilitii analitului, puterea de legare analit-metal, reactivitatea suprafeei cu analitul i tehnica de recoltare. Deasemenea, urmele lsate n urma procesului de recoltare sunt detrimentale i duc la pierderea substanei active.

Metoda de caracterizare fizico-chimic(dizolvarea)

Capitolul Generaliti din Farmacopeea Statelor Unite atribuie testarea dizolvrii n Categoria III. Parametrii de validare recomandai n Compendiu sunt studiile de precizie i nivelul de ncredere. Celelalte studii sunt lsate la discreia operatorului experimentat. n industria farmaceutic se practic verificarea metodei de dizolvare din Farmacopeea Statelor Unite prin desfurarea studiilor, precum liniaritatea soluiilor standard, interferea placebo, interferena nveliului capsulei (dac este o capsul) i reproductibilitatea rspunsului la momente specifice pentru eliberare. Totui, pentru o metod de dizolvare dezvoltate n compania productoare, studii corespunztoare de validare sunt necesare. Aceste studii vor include deasemenea i specificitatea(interferena placebo), precizia, liniaritatea, ncadrarea sistemului, adsorbia filtrului i stabilitatea standardului i a probei. Pentru sistemele automate de dizolvare, pe lng adsorbia filtrului, trebuie s fie fcut dovada nonadsorbiei tubulaturii active folosite pentru eliberarea prin sistem i a efectelor de transport. Este dificil s se exercite studii de recuperare pentru dizolvare, avnd n vedere c testarea pe medicamente placebo n vase nu este practic. Excipienii placebo au tendina de a pluti deasupra mediului de dizolvare. n plus, este dificil s se fac tablete individuale, dect dac se folosete o pres operat manual. Capsulele produse manual au o uniformitate slab, iar procedura este laborioas. n alt abordare, medicamentele placebo mpreun cu cantitatea declarat de substan activ sunt plasate ntr-un recipient de 900mL. Recipientul este umplut la volum cu mediu de dizolvare i se folosete agitarea magnetic pentru a amesteca aceast mixtur pe o sticl de ceas pentru perioada specificat de timp. Calculele de recuperare sunt fcute mpotriva standardelor externe preparate n mediul de dizolvare. Criteriile de acceptabilitate pentru precizie, specificitate, ncadrarea sistemului i liniaritate sunt similare validrii eseului.

Metode noncromatografice

Exist o varietate de norme valabile pentru validarea procedurilor cromatografice, dar relativ puine informaii sunt disponibile despre validarea metodelor noncromatografice. n general, se presupune c n Farmacopeea Statelor

Unite, capitolul Generaliti validarea analitic este aplicabil metodelor cromatografice. Aceast presupunere este incorect, avnd n vedere c seciunea Generaliti nu afirm c parametrii de validare specificai n acest capitol nu pot fi folosii pentru tehnici noncromatografice. Prin selectarea cu atenie a parametrilor, un protocol de validare poate fi proiectat pentru validarea metodelor noncromatografice. Brittain a pus n eviden problemele de validare i elementele datelor necesare pentru validarea metodelor noncromatografice.

Spectrofotometria UV

Pentru metodele spectrofotometrice UV, trebuie s se studieze parametrii precum precizia, acurateea, specificitatea i liniaritatea. Pentru precizie, un numr suficient de preparate ale probelor individuale trebuiesc testate pentru a permite calcularea deviaiei standard relative, valid din punct de vedere statistic. Acurateea poate fi determinat prin reacia cu un amestec de excipieni(placebo) cu cantiti cunoscute de substan medicamentoas activ la diferite niveluri de concentraie. Nivelurile adugate sunt, n general, similare intervalului de liniaritate. Probele adugate sunt preparate prin urmrirea procedurii preparrii probelor i reprezentarea funcie de standardele externe la concentraia dorit. Acurateea este calculat din rezultatele testelor ca procentajul recuperrii analitului de ctre test. Pentru studii de specificitate, diferenele intrinseci ale proprietilor fizice sau chimice sunt folosite pentru a asigura determinarea cu acuratee a analitului, chiar i n amestecuri de probe complexe. Scopul unui studiu de specificitate este de a demonstra c metoda va furniza rezultate de ncredere chiar i n prezena speciilor ce interfereaz. O abordare de a determina orice influen posibil, ntr-un eseu, se face prin comparaia rezultatelor valorii eseului obinute n prezena excipienilor placebo, cu rezultatele valoarii eseului fr excipienii placebo. Influena eseului este evaluat prin calcularea procentului ntre aceste dou rezultate prin formula Procentaj comun = TP / TA * 100

Unde TP = rezultatele testelor n prezena placeboului i TA = rezultatele testelor n absena placeboului. Un procent de 100% va demonstra absena influenelor datorate placebo-ului sau potenialelor specii inteferente. Valori de peste 100% indic o influen pozitiv, pe cnd valorile sub 100% indic o influen negativ n procedur de evaluare a eseului. Dac standardele pentru impuriti sau produi de degradare nu sunt disponibile, atunci specificitate poate fi determinat prin analizarea probelor ce conin impuritile sau compuii de degradare(din substana medicamentoas n vrac) i compararea rezultatelor cu cele obinute printr-o alt procedur independent sau eseu validat. Eseul independent este considerat eseul de referin, iar procentul ntre aceste dou rezultate va dicta specificitatea metodei dorite. Calculele sunt similare cu cele descrise mai sus. Un procent de 100% va fi necesar pentru absena oricrei influene n metoda dorit. Liniaritatea trebuie desfurat pentru cel puin cinci niveluri, ncluznd obiectivul nivelului care este de 100%. Celelalte concentraii ar trebui s fie 50%, 75%, 125% i 150%. Este important ca rspunsurile liniaritii s se conformeze legii Beer. Evaluarea statistic a liniaritii este similar cu aceea (dup cum a fost explicat la studiile de liniaritate) pentru validarea metodei cromatografice.

Spectroscopia absorbiei atomice

Absorbia atomic este folosit pentru a determina metalele grele prezente n substana medicamentoas. Metalele grele se ncadreaz n aceast categorie a unui test limit. Astfel, validarea riguroas nu poat fi necesar. Totui, pe msur ce aceste metale sunt prezente n urme, determinarea limitelor pentru detecie i cuantificare este de mare importan pentru validarea metodelor absorbiei atomice. Ali parametri de validare precum liniaritatea, precizia, specificitatea i acurateea pot fi evaluai conform instruciunilor din prezenta lucrare de licen. Limitele de detecie i cuantificarea sunt determinate prin analizarea unui numr de probe preparate la niveluri joase precum 2ppm, 5ppm i 10ppm. Pentru fiecare nivel de concentraie, analiza multipl este exercitat i este calculat

deviaia standard. Se face apoi media tuturor deviaiilor standard pentru a calcula deviaia standard simultan(MSD). Pentru a obine o estim a nivelului zgomotului, MSD-ul este mprit de panta curbei de calibrare. Pentru limita de detecie, nivelul zgomotului obinut este multiplicat printr-un factor de trei, pe cnd pentru limita de cuantificare, este folosit un factor de 10.

Spectroscopia n infrarou

Infrarou este folosit pentru identificarea compuilor. n Farmacopeea Statelor Unite, exist relativ puine monografii care descriu folosirea IR pentru cuantificarea analiilor. De exemplu, cuantificarea n IR este folosit pentru analiza simeticonei n vrac, comprimate, suspensii orale i capsule. Astfel, parametrii de validare necesari pot fi limitai studiilor de interferen. Aceast interferen se poate datora compusului nsui. De exemplu, dac un test de identificare prin spectrofotometria infrarou, polimorfismul poate produce interferen. Astfel, pentru compuii care manifest polimorfism, este critic ca probele i standardul de referin au o form cristalin similar. Devine apoi evident c pentru testul de indentificare n infrarou, trebuie demonstrat c metoda nu este sensibil oricrei forme polimorfice a materialului sau c efectele polimorfice au fost luate n considerare. Se scoate n eviden c fa de procedura cromatografic, nu exist norme oficiale disponibile asupra validrii unei tehnici n infrarou la momentul curent. Un articol publicat de Ciurcazk: Validarea metodelor spectroscopice n analiza farmaceutic d o imagine de ansamblu pe acest subiect.

Titrarea

Farmacopeea Statelor Unite are mai multe monografii care stipuleaz folosirea titrimetriei pentru eliberarea substanelor medicamentoase. Aceste proceduri sunt nespecifice i pot s nu duc la rezultate precise, n prezena impuritilor reactive sau produilor de degradare. Astfel, pentru validarea acestor

proceduri, este necesar o abordare inovativ este necesar. Parametrii pentru validarea metodei tritrimetrice include liniaritatea, acurateea, determinarea substanei martor i non-sensibilitatea metodei la cantitatea de indicator folosit. Pentru studiile de liniaritate, diferite greuti ale compusului trebuiesc titrate i rezultatele propriu-zise i teoretice trebuie s se potriveasc. n mod contrar, titrarea poate fi dus la capt folosind un interval ngust de greuti moleculare ale compuilor i trebuie precizat n metod c greutatea probei trebuie s fie n acest interval. Acurateea trebuie studiat prin demonstrarea c volumul de titrant pentru titrrile duplicate sunt foarte apropiate una de cealalt. Cu alte cuvinte, mici diferene n volumul de titrant necesare pentru a atinge un punct de sfrit sau de echivalen, nu induce nici o eroare semnificativ a rezultatelor. Dup cum am menionat mai devreme, procedurile titrimetrice sunt nespecifice i nu pot fi folosite pentru eseul simultan al substanelor active i impuritilor. n acest caz, impuritile trebuiesc monitorizate printr-o alt procedur validat independent. Pentru eseul substanelor active n vrac, comparaia rezultatelor obinute printr-o metod validat alternativ i cele obinute prin proceduri titrimetrice vor demonstra validitatea metodei titrimetrice.

Consideraii generale

Acurateea metodelor cromatografice se bazeaz puternic pe puritatea standardelor de referin. Astfel, un standard bine caracterizat i de puritate nalt este important. Administraia Alimentului i Medicamentului recunoate dou categorii de standarde de referin din Compendiu i din afara acestuia. Farmacopeea Statelor Unite este sursa acestor standarde. Standardele din afara Compendiului sunt deasemenea de o puritate nalt i pot fi obinute prin eforturi rezonabile i trebuiesc caracterizate puternic pentru a le lua evalua identitatea, puterea, calitatea i puritatea. Reglementrile testelor pentru standardele de referin sunt mai riguroase comparativ cu substanele activ n vrac. Factorii de corecie a puritii pentru standardele care nu sunt luate din Farmacopeea Statelor Unite trebuiesc incluse n calculele oricrei metode.

Cuantificarea substanelor active n metodele cromatografice este bazat fie pe standardele externe, fie pe cele interne. O metod standard extern este folosit atunci cnd standardul este analizat pe o cromatogram separat a probei. Cuantificarea n acest caz va fi funcie de proba i rspunsul de referin aria pick-ului sau nlimile pick-ului pentru HPLC sau cromatografia cu gaz sau intensitatea spotului n TLC pentru un anumit analit de interes. Metodele standard externe sunt utilizate n general pentru probele cu o singur concentraie i pentru intervale de concentraie nguste(teste de acceptabilitate i eliberare). Procedurile de preparare simple a probelor sau timpul de funcionare mai mare pentru detecia pick-urilor externe ca de exemplu testarea impuritilor, metodele HPLC pentru stabilitate i metodele TLC folosesc deasemenea standarde externe. Pentru metode ale standardelor interne, un compus de o puritate cunoscut este adugat direct n prob. Totui, trebuie s se asigure c acel compus care este folosit ca standard intern nu interfer cu nici un analit de interes sau produse de degradare din prob. Raportul de rspuns dintre standardul intern i analitul de interes din prob, este comparat cu raportul standarului intern i analitul din standard care este folosit n scopuri de cuantificare. Metodele standard interne sunt folosite pe scar larg pentru cuantificarea n probele biologice i pentru intervale de concentraie a probelor minime i maxime ca de exemplu n studiile farmacocineticii. Exist cteva puncte de baz care trebuiesc adresate n metoda de testare. 1. Proba i standardul trebuiesc preparate n faza mobil. Dac acest lucru nu este posibil, atunci nivelul solventului organic folosit n prepararea probei i standardului trebuiesc s fie mai sczute dect cel prezent n faza mobil. 2. Proba i concentraiile standard trebuie s fie aproape una de cealalt. 3. Preparatele probei necesit adesea filtrare naintea injectrii n sistem. Filtrarea nltur materia particulat care poate nfunda coloana. Totui, adsorbia analitului pe filtru poate avea loc. Acest efect al adsorbiei este important pentru impuritile n concentraii mici. Astfel, vor fi nevoie de date pentru a valida acest aspect.

n concluzie, validarea metodei este un proces dinamic i nu trebuie considerat o situaie unic. Designul i validarea metodei trebuie s fie

astfel nct i asigur nivelul de ncredere sau robusteea pe toat perioara vieii metodei. Acurateea datelor este afectat de variaiile n procesul de producie, prepararea probelor n laborator i performana instrumentarului. Cu o validare bine pus la punct i criterii de ncadrare a sistemului cromatografic eficiente, nivelul de ncredere al datelor poate fi considerabil mbuntit. Variaiile, nafar de cele din procesul de producie al substanelor medicamentoase, trebuiesc minimzate. Metodele validate, de ncredere vor genera date corecte.