8. Importana biomedical a enzimelor este dat de utilizarea lor n diagnosticarea unor boli, precum i de folosirea lor n scop terapeutic.

8.1. Utilizarea enzimelor n stabilirea unui diagnostic Majoritatea proceselor enzimatice se petrec la nivel celular, n timp ce determinarea enzimelor se face n general n lichide biologice (snge total, plasm, ser, urin, lichid cefalorahidian etc.). Enzimele prezente n plasm pot fi clasificate n dou grupe: 1) Enzime care acioneaz asupra unor substrate prezente n mod constant n plasm n concentraii semnificative. Astfel de enzime se numesc enzime plasmatice funcionale i au rol funcional la acest nivel deoarece catalizeaz reacii chimice n plasm. Ele sunt secretate n diferite organe (de ex. ficat) i scderea activitii acestor enzime n plasm indic lezarea organului care le produce. Astfel de enzime sunt enzimele coagulrii si fibrinolizei. 2) prezente Enzime n care acioneaz de asupra se unor substrate enzime celule. Astfel enzime numesc

plasmatice nefuncionale deoarece substratele pe care ele acioneaz nu sunt prezente n plasm, ci n celule. Aceste enzime sunt totui prezente n plasm (n concentraii constante, mici), prezenta lor datorndu-se distruciei celulare, normale. Enzimele plasmatice nefuncionale pot proveni: a) de la organe secretoare (ex. pancreas) sau b) din compartimente celulare. a) n cazul enzimelor provenite de la organe secretoare, concentraia lor plasmatic poate varia att n sensul creterii ct i al scderii cantitii de enzim: scderea concentraiei lor

indic o atrofiere a organului secretor, n timp ce creterea acesteia indic o obstrucie a cii de secreie sau o modificare a permeabilitii membranelor celulare (ex.creterea amilazemiei). b) n cazul enzimelor exclusiv intracelulare, prezena lor n plasm poate varia doar n sensul creterii concentraiei lor, fapt ce indic o liz sau o modificare a permeabilitii membranare ca urmare a aciunii unor factor infecioi, toxici sau ca o consecin a traumatismelor tisulare. Fiecare organ are un profil enzimatic propriu n funcie de particularitile metabolice legate de funcia sa. O bun parte din enzime se gsesc n toate organele, doar proportia dintre ele difer de la organ la organ. De exemplu, ficatul este bogat n glutamic-piruvic transaminaza (GTP), glutamat dehidrogenaza (GLDH) i succinat dehidrogenaza (SDH) fiind sarac in creatin kinaza (CPK). Miocardul, musculatura, sunt bogate, in schimb, in CPK. Aceasta face ca leziunile hepatice sa fie caracterizate prin creteri ale GPT, GLDH i SDH, iar cele musculare i miocardice prin creteri ale CPK. Determinarea acestui profil enzimatic permite confirmarea unui diagnostic cat si urmarirea evolutiei bolii prin determinarea concentratiei izoenzimelor specifice acestuia. Un exemplu este infarctul de miocard in care profilul enzimatic este cel prezentat in figura 22.

Fig 22 Nivelele CPK2 si ale LDH in plasma in infarctul de miocard. CPK2 atinge concentratii serice maxime in 24 ore ( 1 zi) de la instalarea infarctului. LDH total creste mai incet atingand nivele maxime intr- un interval de 48 ore (2 zile).

Muschiul cardiac este singurul tesut ce contine izoenzima CPK2 (CKMB). Aparitia in sange a acestei enzime la trei ore dupa instalarea durerii in piept, este specifica infarctului de miocard, si ea prezinta activitate maxima la aproximativ 24 ore de la instalarea acestuia. Lactat dehidrogenaza (LDH), creste si ea in infarct dar activitatea maxima se observa la aproximativ 30-48 ore de instalarea infarctului. Astfel determinarea LDH este utila in diagnostic pentru pacientii investigati dupa 48 de la infarct (timp la care CK2 poate prezenta valori neconcludente) cat si pentru a urmari evolutia bolii, scaderea activitatii LDH fiind un indiciu clar de depasire a infarctului. O alta modalitatea de investigare a unei afectiuni este cea a determinarii izoenzimelor specifice unui anumit tesut. Un

exemplu il constitue tot infarctul de miocard in care poate fi determinata o izoforma a enzimei LDH, specifica doar muschiului cardiac. Izoenzima LDH1 este specifica cordului; concentratia ei atinge valoarea maxima in 24-48 ore de la instalarea infarctului (fig. 23). De pus a, b, c, d

Fig.23 Profilul seric al izoenzimelor lactat dehidrohenazei (LDH) la in serul unui pacient sanatos si in infarct. In serul normal LDH 1 este prezenta in concentratii mai mici decat LDH2 (a). In infarct, nivelul total al LDH creste progresiv (b), cu cresterea in special a concentratiilor LDH1 care depasesc nivelele LDH2 intre 12- 24 ore (c). Cresteri secundare ale concentratiilor LDH5 pot apare ca urmare a congestiei hepatice (d). Asfel pot fi monitorizate si complicatiile secundare ale infarctului [11].

n cazul enzimelor intracelulare diferenierea localizrii lor permite aprecierea gradului de lezare a celulei/esutului. Astfel unele enzime sunt localizate doar intr-un singur compartiment celular (enzime uniloculare) cum ar fi: glutamat dehidrogenaza (GlDH) prezent doar n mitocondrii, sau LDH i glutamic piruvic transaminaza (GPT) prezente numai n citoplasm. Alte enzime sunt prezente atat in citozol cat si in mitocondrii ca de exemplu glutamic oxalacetic transaminaza (GOT) (enzima biloculara). Creterea LDH i GPT ntr-o afeciune hepatic sugereaz leziuni limitate la spaiul citoplasmatic. Creterea concomitent si a GOT indic o posibila leziune mai avansat care intereseaz inclusiv membranele mitocondriale. Confirmarea mitocondriala. O modalitatea de diagnosticare moderna a aparut prin asocierea enzimelor cu imunoglubulinele in asa numitele teste ELISA (enzime liked immunoabsorbent assay). Metoda consta in generarea unor anticorpi specifici, prin inocularea la un animal de experienta (soarece, iepure) a unui antigen uman, cum ar fi virusul hepatitei (VH). Acest anticorp este fixat pe o suprafata solida intr-o capsula de polistiren numita godeu. Pentru a evidentia prezenta virusului hepatitei la un este data de dozarea GlDH, enzima strict

pacient, serul acestuia este pus in godeuri. Aici are loc o prima incubare prin care antigenul din sangele pacientului (in cazul de fata virusul hepatititei) se combina cu anticorpul specific fixat pe godeu. Se indeparteaza apoi componentele nereactionate, se fac o serie de spalari cu solutii tampon adecvate, astfel incat pe suprafata solida sa ramana doar complexul antigen-anticorp. Se realizeaza o a doua incubare prin adaugarea unei solutii ce contine acelasi anticorp specific, marcat insa cu o enzima, adica la care s-a legat covalent o enzima, de regula o peroxidaza. In aceasta etapa anticorpul marcat cu enzima se va fixa doar acolo unde anterior s-a fixat antigenul. Dupa o procedura de spalare in care se indeparteaza excesul de anticorp marcat se face o ultima incubare prin adaugarea substratului specific enzimei. Enzima va actiona asupra substratului generand de regula un compus colorat. Reactia enzimatica este apoi stopata adaugand de regula un acid puternic (ex. HCl). Cu cat culoarea generata va fi mai intensa cu atat cantitatea de enzima fixata va fi mai mare deci si cantitatea de antigen din ser mai mare. Altfel spus intensitatea culorii generate este proportionala cu cantitatea de antigen din ser figura 24.

Fig 24 - Principiul tehnicii ELISA. Intr-o prima etapa se fixeaza antigenul specific pe suportul solid (a). Se aplica apoi serul testat. Antigenul din ser se va fixa pe anticorpul specific (b), dupa care se va adauga anticorpul marcat cu enzima (c). In ultima etapa se adauga substratul specific enzimei (d), care in urma actiunii acesteia va genera un compus colorat, a carui intensitatea este proportionala cu cantitatea de antigemn din serul testat [12].

8.2. Utilizarea enzimelor n scop terapeutic Cele mai ntlnite enzime utilizate ca ageni terapeutici sunt streptokinaza i asparaginaza. Streptokinaza este utilizat n infarctul de miocard pentru dizolvarea cheagului. Ea activeaz plasminogenul la plasmin, enzim foarte activ n liza cheagului la elemente componente solubile.

Asparaginaza este utilizat n terapia anticanceroas. Celulele tumorale au nevoie de cantiti crescute de asparagina pe care o fur din snge, lipsind astfel celulele normale de acest amino acid. Administrare de asparaginaza scade nivelul acestui aminoacid i implicit viabilitatea celulelor tumorale. Utilitatea terapeutica a multor enzime este limitata, deoarece, fiind proteine, ele pot avea rol antigenic.