Curs 2. Genetica bacteriana.

Chimioterapie antibacterian

Universitatea de Vest Vasile Goldis Facultatea de Medicina, Farmacie Medicina Dentara Dr. Biol Sergiu Fendrihan

Bazele geneticii

Ereditatea: nsuirea tuturor vieuitoarelor de a transmite caracterele specifice speciei la urmai Variabilitatea: apariia unor caractere diferite de cele ale genitorilor ADN. Structura i replicarea acestuia este similiar cu cea de la celulele eucariote. Proporia de baze complementare este constant n cadrul unei specii. Raportul adenin-timin/guanin-citozin (AT/GC) servete drept criteriu taxonomic de baz n clasificarea modern a bacteriilor

Organizarea materialului genetic la bacterii

Repliconi = formaiuni genetice ce se replic independent cromozomul bacterian elementele genetice extracromozomiale Plasmidele Structura genelor la bacterii genomul bacteriofagilor elementele genetice transpozabile fragmentele de inserie transpozonii.

Genetica bacteriilor
Materialul genetic bacterian este in principal format dintr-un -cromozom din ADN dublucatenar circular superinfasurat pentru a incapea in celula bacteriana -una sau mai multe plasmide care sunt elemente genetice cu replicare independenta, asemenatoare ca structura cu cromozomul bacterian dar mai mici ca dimensiune.

Cromozomul bacterian este asa cum am aratat o molecula circulara de ADNcu o lunginme aproximtiva de 1000um si cu o greutate moleculara de 1,5-2 109 D, continand circa 2000-3000 de gene, fiind superinfasurat in stare normala si codifica toate informatiile necesare supravietuirii speciei. Mai exact, cromozomul circular este impartit in domenii de superfinfasurare ca niste bucle

Plasmidele

determinanii genetici eseniali ai plasmidelor codific informaiile legate de replicarea lor autonom determinanii accesori codific caractere fenotipice neeseniale supravieuirii celulei bacteriene n condiii naturale gene de transfer (tra), gene de rezisten la antibiotice (factorul R), gene de secreie a unor toxine etc. 1.Plasmidele de virulen poart determinanii genetici ai unor factori de virulen secreia de enterotoxina (termolabil i termostabil) factorul de colonizare la Escherichia coli, hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis i E.coli exfoliantina la S. aureus gena de invazivitate la Shigella

Plasmidele

0 1 Tn

genele FTR care confer Tn 8 plasmidului capacitatea de a se transfera

R determinant

Tn 21

Tn 8 Tn 9

B. Plasmidele R -de rezisten (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau n esen din dou regiuni genetice genele care codific rezistena la antibiotice R, unice sau multiple (prin aglomerarea mai multor gene de rezisten R, pe acelai plasmid, prin fenomenul transpoziiei repetate de material genetic)

RTF

Plasmidele

Peste 90% din tulpinile de spital prezint o rezisten de tip plasmidic: familia Enterobacteriaceae, genurile:Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, i Corynebacterium. Plasmidele prezente la bacilii gram-negativi sunt mai mari dect cele evideniate la bacteriile gram-pozitive.

Plasmidele

C. Plasmidul F plasmid de de sex factor de fertilitate i conine genele de transfertra -se pot transmite prin conjugare-mediaz transferul de gene de la o celul donor la una receptor -n funcie de prezena factorului bacterii F- lipsite de factorul F, denumite celule femele i care sunt receptoare de material genetic, bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca plasmid n citoplasm i care sunt celule donoare, bacterii Hfr care au factorul F+ integrat n cromozom, de asemenea masculine, bacterii F care au factorul F+ ca plasmid autonom, dup ce acesta a fost integrat n cromozom i l-a prsit rupnd un fragment ADN din cromozom.

2.3 Elemente genetice transpozabile

Barbara Mc Clintock, 1931, 1952, 1983(gene sltree) Fragmentele de inserie (IS)

fragmente mici de ADN (fac parte in mod normal din plasmid/cromozom) cu limite structurale bine precizate se pot integra repetat n mai multe situsuri dintr-un genom. Transpozoni (Tn) Constau in 2 IS GFEDCBA ABCDEFG Transpozaz conin i alte gene dect cele ce codifica transpoziia

IS IS

Gene de rezisten Gene de rezisten

IS IS

Operon

Structura operonului Genele care afecteaz aceeai cale biochimice n bacterii (de exemplu, genele care codifica proteinele implicate in metabolizarea lactoz zahr) vor fi toate exprimate n aceleai condiii (cum ar fi atunci cnd lactoza este prezent). Prin urmare, este economic s aib toate aceste gene grupate sub controlul sistemului de reglementare acelai. Astfel de un grup de gene similar-reglementat n bacterii se numete un operon

Operon exemplu

Un operon inducibil este operonul lactoz (LAC operon pentru scurt), care conine gene care codifica enzimele responsabile pentru metabolizarea lactoz. -lac Z, care codifica enzima beta-galactozidaz (care descompune lactoza in glucoza si galactosewhich codifica un permease (care transport lactoza in celula), i -Un lac, care codifica o transacetylase (a cror funcie nu vom lua n considerare aici). -promotor este n cazul n care se leag de ARN-polimerazei ADN-ul i se pregtete pentru a iniia transcriere. -operatorul (desemnate O). -este lac gena I, care codifica o proteina numita represor lac represor lac are dou domenii funcionale sau regiuni: una care se leag de ADN-ul din regiune operatorului, i una care se leag de lactoz. n cazul n care se leaga de represor operatorului, acesta previne ARNpolimerazei avanseaz de-a lungul operon, transcrierea i nu se produce

Reglarea expresiei genetice

1. In lipsa de lactoz , gena Lac I se transcrie (amintii-v, acesta este exprimat constitutiv), i mRNA este tradus, productoare de represor lac.Represor se leag de operator, i ARN-polimerazei blocuri. Cu ARN-polimerazei blocat, nu exist nici o transcriere, i enzime pentru metabolizarea lactozei nu sunt sintetizate. Acest lucru este bun, deoarece nu exist lactoz a metaboliza. 2.Lactoza este prezenta. Represor Lac este nc sintetizat. Dup cum sa menionat anterior, acest represor se poate lega la lactoz. Atunci cnd face acest lucru, represorul sufer o schimbare conformationala (schimbare de forma). Moleculele care schimba forma atunci cnd acestea se leaga de o alta molecula se numesc molecule allosterice. Atunci cnd sufer o modificare conformationala, represorul Lac este n imposibilitatea de a se lega n regiune operatorului. Ca urmare ARN polimeraza nu este blocata, i este capabila s transcrie genele din operon.

Variabilitatea la bacterii

Este o latur a geneticii -important n medicina practic Mutaia Transfer de material genetic Transformare Transducie Conjugare Transpoziie

Mutatia

Modificri spontane ale genomului (modificri ale secvenei de nucleotide din gen)produse de : raze X, UV, ageni alchilani, etc. Punctiform afecteaz 1 nucleotid Inseria (adugare a sute de nucleotide) Deleia (pierdere ) Asigur: rezistena la chimioterapice, structur antigenic modificat, pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi, pierderea capacitii de sintez a unui metabolit Dpdv medical: one-step:rezistena brusc la AB multi-step:bacteria devine rezistent prin mutaii succesive

Transferul de material genetic

2.1. Transformarea Reprezint transferul de material genetic de la o celul donor la una receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracie chimic Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella se petrece nu numai ntre tulpinile aceleiai specii, ci i ntre specii diferite stare de competen - se modific structura peretelui celular, care devine mai poros, ncrcat electropozitiv, favoriznd legarea ADN-lui strin are loc n medii unde triesc mai multe specii bacteriene(colon) i sunt puse n libertate cantiti mai mari de de ADN Se practic azi n tehnici de inginerie genetic

Transductia

2.2.Transductia este un transfer de gene cromozomiale de la o celul bacterian la alta, mediat de bacteriofagi Transducia generalizat este mediat de fagii viruleni, litici, care dup ptrunderea n celula bacterian se multiplic i determin liza celulei gazd. n timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmenteaz ocazional: un fragment cu o dimensiune apropiat de cea a genomului fagic se integreaz n capsida bacteriofagului, n locul genomului fagic. aceti fagi pot ptrunde n alte celule bacteriene injectndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va integra n cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi: rezistena la chimioterapice, proprieti ce in de patogenitatea bacteriei etc

Conjugarea

2.3 Conjugarea transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare printr-un proces de mperechere, ce se realizeaz prin contactul direct dintre cele dou celule. Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum i gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+) La bacteriile Gram negative Factorul F+ poate fi situat pe: -plasmid transfer conditionat de existenta genelor tra, responsabile de sinteza sex-pilului si transferul plasmidului -pe cromozom-transfer de gene cromozomale. Aceste celule , care au factorul F integrat in cromozom, numite Hfr (frecenta mare a recombinarii genelor de la celula donoare cu cele de la celula receptoare).

Conjugarea

F+

F+

Hfr

Plasmide conjugative

Dpdv medical importante sunt plasmidele conjugative de rezisten R. Proprieti: spectrul de gazde: circul ntre specii diferite. Acest transfer are loc i n laborator i n macroorganism. (s-a descris transferul de plasmide de la bacilul coli nepatogen la salmonele sau shigelle. Nu s-a observat ns transferul plasmidelor de la bacterii gram-negative la cele grampozitive); determinanii de rezisten R: caracteristici pentru plasmidele conjugative sunt determinanii de rezisten multipli. S-au evideniat astfel la tulpinile izolate din spital plasmide ce au factori de rezisten fa de toate chimioterapicele uzuale (ampicilina, cefalosporine, streptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamycina, gentamicina, sulfonamide).

Transpozitia

2.4. Transpoziia integrarea ntr-un genom al unui elemente genetic transpozabil din aceeai molecul de ADN sau din alta prezent n aceeai celul . Clasa I-transpoziia se face pe baza translocrii conservative(secvena se mut de la donor la receptor fr reduplicarea Tn)IS au n jur de 1000 baze i fac parte n mod normal din cromozom sau plasmidesunt prezente n mai multe copii i flancate la cele 2 capete ale aceleiai baze, dar n ordine invers. Nu confer caracter nou celulei-pot produce modificri n expresia genelor Tn compui = 2 Is i delimiteaz determinani de rezisten sau alte caractereInseria oricrei gene ntre dou elemente transpozabile face posibil transferul ei prin recombinare neomolog, n aceeai celul pe o molecul de ADN nenrudit structural. Astfel, prin transpoziie se pot produce deleii, inversii, transpuneri de determinani genetici de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabil a unor repliconi complei, de pild a dou plasmide.Evoluia rezistenei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi conceput astzi fr fenomenul de transpoziie. Mecanismele transpoziiei sunt responsabile de formarea plasmidelor cu multirezisten, prin inserarea succesiv pe un plasmid a determinanilor genetici de rezisten situai ntre dou elemente transpozabile de pe alte plasmide

Antibioticele

Definitie
Antibioticele sunt substante de origine naturala sau sintetica care au activitate de suprimare sau de incetinire a activitatii biologice a organismelor sau microorganismelor Aciunea antibacterian a antibioticelor poate fi bactricida cu moartea celulelor microbiene (n cazul de penicilinei) sau bacteriostatice, de divizare ncetinire a dezvoltarii bacteriene. n cazul de antibiotice antimicotice (antifungice) este numit fungicid i fungistatica. n cazurile de boli grave, este cu siguran prescrie antibiotice moarte microbiene. Exista si alte antibiotice si anume antiparazitice, antimalarice, antituberculoase etc. In cazul de fata, aceste antibiotice se inteleg bacteriocidele celelalte urmand sa fie discutate la diferite sectiuni ale cursului.

Clasificarea antibioticelor
In functie de originea lor, antibioticele naturale sunt produse de bacterii (Gramicidina, Bacitracina, Polimixinele etc.) de bacterii din actinomicete( Streptomicina, Neomicina, Kanamicina etc.)sau de ciuperci filamentoase ( Penicilina, Grizeofulvina etc.) Din punct de vedere a structurii chimice sunt compusi alifatici, aromatici heterociclici. Ele pot sa fie derivate din aminoacizi (peniciline), din glucide (streptomicina), etc.

Conform clasificarilor acceptate, sunt mai multe tipuri de antibiotice si anume (Anghelescu, 2006). 1.Betalactamice din care fac parte 1.1.penicilinele - meticiline (meticilina),fenoximetilpeniciline (penicilina V), penicline naturale (penicilina G), peniciline retard (benzilpenicilina) peniciline antispeudomonas (azlocilina),peniciline reziatente la penicilinaze (nafcilina), izoxazolil penicilina (cloxacilina),aminopeniciline (amoxicilina, ampicilina), carboxipeniciline (carbenicilina),acilpeniciline (piperacilina)

d1.2. peniciline si inhibitori de betalactamaze (amoxicilina clavulanat), 1.3.cefalosporine-cefalosporine orale (cefalexin), cefalosporine generatia I a (cefalexina), cefalosporine de generatia aII a (cefaclor),cefalosporine de generatia a III a (ceftibuten), cefalosporine de generatia a IV a (cefepima), cefalosporine diferite (ceftizoxima), 1.4.carbapeneme (imipenem), 1.5.monobactame (cefoperazona-sulbactam,, F.ampicilina-sulbactam)

imipenem

cefalexin

II. macrolide 1.eritromicina,.roxitromicina III.aminoglicozide streptomicina, spectinomicina, kanamicina,.neomicina IV.glicopeptide/licopeptide (vancomicina, teicoplanina, oritavancina, dlabavancina, daptomicina) V.(fluoro)chinolone (acid nalidixic, norfloxacina, lomefloxacina, ciprofloxacina VI.(tetra)cicline (teraciclina, doxiciclina) VII.fenicoli (cloramfenicol, tiamfenicol)

streptomicina

cloramfenicol

rimfapicina

VIII.sulfamide (sulfasalazina,sulfadiazina,sulfamet oxazol-triametoprimum (cotrimoxazol) IX.rifamicine (rifampicina, rifabutina,, rifaximina, X.azoli (metronidazol, rnidazol,.tinidazol,.albendazol,.flub endazol,tiabendazol, mebendazol) XI.oxazolidinone (.linezolid) XII.polipeptide ciclice (.polimixina E,.polimixina A, polimixina B.bacitracina) XIII.nitrofurani (.furazolidon, nitrofurantoina) XIV.alte antibacteriene (acid fusidic, fosfomicina)

Polimixin B sulfat

n funcie de mecanismul de aciune, exist cinci grupe de antibiotice: Antibiotice ce duc la blocarea sintezei peretelui celular bacterian. Acestea sunt lactamine -(peniciline) ce provoaca blocarea sintezei principalei componente a peretelui celular -peptidoglicanilor. Antibiotice ce distrug structura membranei plasmatice celulare Dintre acestea sunt antibiticele de sinteza ca polimixinele(polimoxina B si colistinul cu structura polipeptidica) si polienele. Antibioticele ce inhiba sinteza proteica Actioneaza la nivelul ribozomilor in translatie, inhiband etapele de elongatie a peptidelor ca de pilda tetraciclinele, eritromicina, iar sintomicina si cloramfenicolul blocheaza formarea legaturii peptidice in reactia catalizata de peptidiltrasferaza. Diferite tipuri de inhibitori ai sintezei proteice sunt aminoglicosidele obtinute prin semisinteza (gentamicina, streptomicina), macrolidele (eritromicina, azitromicina, claritomicina) tetraciclinele (doxtretraciclina, oxitetraciclina),cloramfenicolul, acidul fusidic.

Antibiotice ce interfera cu acizii nucleici avand efect inhibitor asupra sintezei acestora. Inhibitori ai sintezei precursorilor ca sulfonamidele (clotrimoxazol,dapsona) si trimetroprimul ce suprima insasi sinteza nucleotidelor. iar chinolonele (ciprofloxacinul, norfloxacin), blocheaza sinteza ADN si anume replicarea acestuia inhibitoarele sintezei ARN si anume ai ARN polimerazei sunt rimfapicinele, iar metronidazolul oxideaza acidul dezoxiribonucleic.

Reactii adverse la antibiotice

Iata ce fel de reactii pot sa produca 1) reacii toxice la nivelul ficatului (aciunea tetraciclinei), reactii la nivelul rinichilor (aciunea aminoglicozidelor), efect negativ asupra organelor ce produc hematii (efect asupra hematopoezei, ca levomicetina). 2) Reactiile alergice determinate de unele antibiotice au fost puse la diferite persoane aflate sub tratament. De aceea se recomanda inlocuirea acestora cu altele, ca de pilda inlocuirea penicilinei la persoanele alergice cu cefalosporinele (Niculescu si Iordache, 2007). 3) o alta reactie negativa este asa numita disbioza sau disbacterioza, adica determinarea unei schimbari in componenta comunitatilor de microorganisme din microflora normal umana prin aplicarea unui antibiotic cu spectru larg de aciune. Acestea actioneaza atata asupra agentului infecios care provoaca boala, dar si asupra microflorei normale. 4) Alt efect nedorit este inhibarea sistemului imun ca de pilda levomicetina care inhiba formarea de anticorpi de catre limfocitele B , iar tetraciclina inhiba fagocitoza .