Aspecte moleculare i biochimice ale interaciei gazd - parazit n cadrul procesului tumorigen la plante

LIGIA GHEEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA Institutul de Genetic al Universitii din Bucureti

1. Introducere
In cadrul procesului patologic, interaciunea dintre parazit i planta gazd induce modificri att n expresia anumitor gene, ct i n conformaia anumitor enzime (modificri epigenetice). In consecin, are loc o modificare a cilor metabolice n sensul sintezei unor metabolii care aparin aparatului defensiv al plantei, pe de o parte, iar pe de alt parte, este indus, de ctre parazit, sinteza unor produi care i asigur stabilizarea relaiei sale cu planta gazd. O analiz direct a expresiei genice, utiliznd tehnici moleculare specifice, precum izolarea de molecule de ARN mesager, reverstranscrierea, secvenierea moleculelor de ADN complementar corespunztoare, analiza Northern i Southern, traducerea ARN mesager in vitro, dar i investigaiile biochimice asupra produilor genici i asupra cilor metabolice activate, analizele de structur i ultrastructur a celulelor i esuturilor vegetale afectate, ofer informaii valoroase asupra dinamicii acestui proces complex i totui nc puin neles, care este patogeneza la plante. Lucrarea de fa reprezint o sintez de date, cu privire la modificrile biochimice i genetice care caracterizeaz, pe de o parte, procesul de formare a nodozitilor la diferite specii de leguminoase, prin aciunea bacteriilor din genul Rhizobium iar pe de alt parte, cecidogeneza (formarea tumorilor de tip gal) indus de nematodul Meloidogyne incognita. S-a urmrit evidenierea elementelor comune celor dou procese, n special n privina mecanismelor defensive declanaten planta gazd, prin aciunea parazitului.

2. Mecanisme genetice i biochimice implicate n rspunsul defensiv, la plante

Plantele au dezvoltat un spectru deosebit de larg de mecanisme de aprare, dei mult mai puin specifice n comparaie cu cele elaborate de animale. Baron & Zambryski (1995) distribuie diferitele gene induse n cadrul rspunsului defensiv, n cteva grupe funcionale. Intr-una dintre aceste grupe, autorii includ genele codificatoare ale enzimelor metabolismului fenilpropanoizilor, precum fenilalanin amonia-liaza (PAL), chalcon-sintetaza (CHS) i chalcon-izomeraza (CHI). Aceste gene reprezint markerii clasici ai rspunsului plantei la infecie i rnire. Produii fenilpropanoidici joac diverse roluri n rspunsul plantei la diferii stimuli abiotici i biotici (figura 1).
81

LIGIA GHEEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA

O alt grup conine genele care codific pentru sinteza glicoproteinelor bogate n hidroxiprolin (HRGP) i pentru peroxidaze. Aceti produi genici pot contribui la formarea unei bariere structurale care s opreasc invazia patogenului sau a produilor elaborai de acesta. In cea de a treia grup sunt cuprinse genele care codific sinteza enzimelor chitinaz, pectinaz i -1,3-glucanaz. Aceste enzime pot produce degradarea pereilor celulari ai fungilor invadatori sau eliberarea elicitorilor endogeni din pereii celulei vegetale, acetia din urm stimulnd mai departe, rspunsul defensiv al plantei. In fine, ntr-un alt grup, cei doi autori includ genele care codific pentru lipoxigenaz (LOX), a crei activitate crete n cteva sisteme plant patogen. Produii LOX, cum ar fi acidul jasmonic, sunt frecvent ntlnii n cadrul rspunsului plantelor la atacul patogenilor i la rniri. Acidul jasmonic i esterul su metil-jasmonatul sunt reglatori hormonali naturali care controleaz senescena la plante, precum i inductori ai inhibitorilor de proteinaz, n rspunsul la rnire i atacul patogenilor (Gundlach H. et al., 1992). Acidul jasmonic i derivaii lui sunt considerai elemente semnal cheie care conduc la transcrierea de novo, traducerea i biosinteza metaboliilor secundari n culturile de celule vegetale. Eliberarea acidului -linolenic un precursor al acidului jasmonic i al metiljasmonatului este mediat de un receptor specific pentru elicitor. Adiia metil-jasmonatului n culturile de celule vegetale iniiaz transcrierea de novo a unor gene precum cea pentru fenilalanin amonia-liaz.

Figura 1. Produi ai fenilalaninei, sintetizai pe calea fenilpropanoidic : sgeata simpl o etap enzimatic ; sgeata dubl mai multe etape enzimatice. PAL fenilalanin amonia-liaza; CHS chalcon sintetaza; CHI chalcon izomeraza; IFR izoflavon reductaza.

Franceschi i Grimes (citai de Gundlach et al.) au raportat inducerea, de ctre jasmonat, a acumulrii de antocianin, ca rspuns la tratamentul plntuelor de soia cu metiljasmonat, demonstrnd, prin aceasta, c acest mecanism este operant i in vivo. Acidul jasmonic a fost comparat cu prostaglandinele substane asemntoare hormonilor, la mamifere.
2

Aspecte moleculare i biochimice ale interaciei gazd parazit n cadrul procesului tumorigen la plante

Dup cum se observ i n figura 1, o categorie de produi rezultai n urma activrii cii fenilpropanoidice este reprezentat de fitoalexine. Fitoalexinele sunt fenoli ca pisatina, faseolina, acidul clorogenic, acidul cofeinic etc. Ele sunt analoge anticorpilor din organismele animale, dar, spre deosebire de acetia, sinteza lor are loc nu n tot organismul, ci numai n celula infectat, fitoalexinele putndu-se identifica numai la distan mic fa de celulele care le-au sintetizat. De asemenea, o deosebire a fitoalexinelor fa de anticorpi este lipsa lor de specificitate. Astfel, n timp ce anticorpii animalelor au proprietatea de a precipita numai antigenii care le-au indus formarea, fitoalexinele au aciune nespecific, manifestndu-se chiar i asupra esuturilor plantelor care le produc. Aceast aciune se manifest prin producerea unor necroze ale esuturilor vegetale, n timpul reaciilor de hipersensibilitate ale acestor esuturi. Reacia de hipersensibilitate este reacia de aprare a plantelor, prin care acestea, n urma infeciei produs de ageni patogeni, i omoar propriile celule atacate, localiznd efectul infeciei. Astfel, o reacie de aprare sporit, cauzat de o sensibilitate crescut fa de agentul patogen, poate conferi plantelor un avantaj fa de plantele aa-zis rezistente. Nu numai mecanismul, dar i efectul reaciilor de hipersensibilitate este altul dect al celorlalte mecanisme de rezisten. In timp ce, n alte situaii, este tolerat existena cuplului gazdparazit, reacia de hipersensibilitate este un indiciu de incompatibilitate ntre un agent patogen i o anumit gazd. Reacia de hipersensibilitate este mediat de un set de gene R (de rezisten) care sunt capabile s detecteze tipul de patogen prin recunoaterea proteinelor desemnate Avr (de avirulen), codificate i sintetizate de parazit. Rezistena mediat de genele R este numit si rezistena gen-pentru-gen, fiind, n mod obinuit, dar nu obligatoriu, asociat cu necroza rapid a celulelor plantei, la locul invaziei (Feys & Parker, 2000). In afar de fitoalexine, sintezele proteice sunt procesele cel mai profund implicate n reaciile de aprare ale organismelor vegetale. Un aspect deosebit de interesant, din acest punct de vedere, este capacitatea plantelor de a produce interferoni, n urma infeciei cu virusuri. Considerat, iniial, un atribut exclusiv al celulei animale, sinteza interferonilor la plante a fost demonstrat nc din 1964, de ctre Loebenstein i colab. (citat de Dumitrescu i Vldescu, 1973). Cercettorii au indus sintezade interferoni n plantele de Datura stramonium, prin infecii virale sistemice sau locale, izolndu-i apoi, cu ajutorul unor metode folosite curent n cazul organismelor animale. Cele mai interesante enzime din punct de vedere al implicaiilor lor n rezistena plantelor la atacul diferiilor ageni patogeni, sunt enzimele oxidative. Rolul enzimelor oxidative este complex i const n formarea chinonelor care oxideaz sau precipit proteine ale diferiilor parazii. Se declaneaz astfel, un adevrat rzboi enzimatic ntre agentul patogen i plant. Anihilarea aciunii agenilor patogeni de ctre oxidazele vegetale este, uneori, urmat de un contra-atac al parazitului, prin secretarea unor catalaze care, prin competiia pentru substrat (H2O2), inhib catalazele sau peroxidazele plantei. Schimbarea spectrelor izoenzimelor oxidative ale plantelor sub influena atacului unor ageni patogeni, a fost frecvent semnalat. Deosebit de interesant este problema rolului peroxidazelor plantelor, suplimentar sintetizate sub aciunea agenilor patogeni, n reaciile de hipersensibilitate. Efectul dublu pe de o parte, al creterii intensitii activitii enzimelor oxidative, al apariiei unor fracii izoenzimatice noi i al necrozelor pe de alt parte, a pus problema existenei sau a inexistenei unor relaii cauzale ntre aceste fenomene. A fost emis ipoteza potrivit creia procesele de necrozare pot s apar ca urmare a aciunii enzimelor oxidative. Ulterior ns, s-a demonstrat c, dei reacia de hipersensibilitate este nsoit de creterea concentraiei substanelor fenolice (substraturi ale unor enzime oxidative), acestea conduc la necroze de hipersensibilitate i c sinteza fenolilor nu ar fi dect un efect secundar al procesului infecios.
3

LIGIA GHEEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA

De asemenea, s-a artat c schimbrile activitilor enzimatice i apariia unor enzime oxidative noi n reaciile de hipersensibilitate ale plantelor, sunt o consecin i nu un factor determinant al morii celulelor.

3. Aspecte moleculare i biochimice ale simbiozei dintre plantele leguminoase i bacterii din genul Rhizobium
3.1 Mecanismul interaciunii dintre plant i bacterie Simbioza dintre plantele leguminoase i Rhizobium, n condiiile existenei unei surse limitate de azot n sol, conduce la dezvoltarea unor formaiuni noi la nivelul plantei nodozitile fixatoare de azot atmosferic. Nodozitile se formeaz, de obicei, pe rdcini, dar, n cazul anumitor specii, i la nivelul tulpinilor, fiind un rezultat al unei creteri tisulare anormale dar limitate, cu organizare armonioas i difereniat (Mihescu i Gavril, 1989). In interiorul nodozitii, bacteroizii fixeaz azotul molecular care este apoi utilizat de ctre planta-gazd. Formarea nodozitilor radiculare implic succesiunea unor mecanisme celulare i moleculare: dediferenierea celulelor corticale i stimularea lor mitotic, iniierea formrii nodozitii prin organizarea unui esut meristematic, diferenierea structural a esuturilor nodozitii, creterea i maturarea structurii nou formate. Interaciunea simbiotic debuteaz odat cu colonizarea, de ctre bacterie, a suprafeei rdcinii i inducerea rsucirii vrfului prului radicular. Urmeaz invaginarea pereilor celulari i formarea unui cordon de infecie n interiorul prului radicular. Cordonul de infecie traverseaz straturile celulare superficiale, ajungnd n zona n care va fi iniiat formarea nodozitii, aceasta presupunnd activarea procesului mitotic (Gavril i Mihescu, 1989). Celulele poliploide ncrcate cu bacteriozi se afl n zona central a nodozitii. Endopoliploidia care caracterizeaz nodozitile leguminoaselor, apare doar n zona de infecie cu celulele de Rhizobium i manifest un gradient distalo-proximal crescnd, n raport cu vrful cordonului de infecie, aa nct nodozitatea matur posed o zon central poliploid, n care celulele sunt ncrcate cu bacteroizi. Aceast zon este nconjurat de un esut alctuit din celule diploide neinfectate. Celulele ncrcate cu bacteroizi au o cantitate de ADN de 4 8 ori mai mare n comparaie cu celulele diploide. Numrul nucleolilor corespunde gradului de ploidie. Celulele zonei meristematice au de 2 4 ori mai mult ADN n comparaie cu celulele cortexului nodozitii, care sunt diploide i lipsite de bacteroizi (Mihescu i Gavril, 1989). Dezvoltarea celulelor vegetale i bacteriene trebuie s se desfoare coordonat. Procesul nodulrii se desfoar n cteva faze, succesiunea acestor faze presupunnd comunicarea dintre cei doi parteneri. In fiecare etap a dezvoltrii nodozitii, are loc inducerea, att n plant, ct i n parazitul bacterian, a unor programe genetice specifice (Schultze & Kondorosi, 1998). Unii compui ai plantelor, cum este i flavonoidul luteolina, induce activarea genelor pentru nodulare, n organismul bacterian. Aceast activare este exprimat prin producerea de semnale nod reprezentate de cteva lipo-chito-polizaharide. Pentru planta gazd, aceste semnale reprezint factori externi de cretere care declaneaz programul endogen de nodulare. In timpul invaziei, bacteriile din genul Rhizobium produc exopolizaharide (EPS), lipopolizaharide (LPS) i polizaharide capsulare (KPS). Aceste polizaharide au cteva funcii printre care i cea de comunicare intracelular i de protecie a bacteroizilor fa de reacia defensiv a plantei.
4

Aspecte moleculare i biochimice ale interaciei gazd parazit n cadrul procesului tumorigen la plante

La nivelul ADN-ului bacterian, genele nod sunt organizate n civa operoni localizai fie pe cromozom, fie n plasmide de dimensiuni mari. Expresia genelor nod este reglat pozitiv de proteina NodD. Interaciunea proteinei NodD cu flavonoizi specifici ai plantei gazd reprezint primul nivel de recunoatere specific a gazdei Multe specii de Rhizobium conin cteva gene nod cu grad nalt de omologie, care conduc la producerea de proteine Nod capabile s interacioneze cu un spectru mai larg de molecule (flavonoizi) inductoare. Factorii Nod sunt derivai din chitin-oligozaharide n care gruparea N-carbonil a zahrului nonreductor este nlocuit de un lan de acizi grai. Structura lipo-chitooligozaharidic de baz (LCO) este comun tuturor bacteriilor genului Rhizobium, fiind determinat de genele nod comune nodABC. Rspunsurile fenotipice majore ale plantei gazd la semnalele Nod sunt deformarea perilor radiculari, formarea cordonului de preinfecie i diviziuni celulare corticale. Aceste rspunsuri sunt nsoite de inducerea genelor exprimate timpuriu n dezvoltarea nodozitii (gene timpurii ale nodulrii). Zonele de diviziune celular pot cuprinde primordiul nodozitii sau ntreaga nodozitate, depinznd de specia gazd. Att diviziunile celulare corticale, ct i formarea cordonului de preinfecie par s aib la origine procese similare de activare celular. Acest proces este similar cu reiniierea ciclului celular n celule difereniate (Gorenflot, 1990). Cu toate acestea, celulele corticale, n funcie de poziia lor n straturile interne sau externe, prezint potenialiti diferite pentru a intra n diviziune. Astfel, exist o categorie de celule care parcurg un ciclu celular complet, iar n cazul celulelor care formeaz punile citoplasmice, ciclul celular se oprete n G2. Modificrile n morfologia prului celular ca rspuns la factorii Nod, prezint anumite specificiti. Deformarea prului este indus de reiniierea diviziunii celulare n acei peri radiculari care i-au ncetat elongarea (creterea). Este posibil ca sistemele de percepere a semnalelor Nod s fie diferite n diferitele straturi celulare. Perii radiculari rspund la factorii Nod (care acioneaz ca nite elicitori) printr-o depolarizare rapid a membranei plasmatice consecina influxului de ioni de Ca 2+ i a efluxului de ioni de Cl--. Mai mult, a fost observat o alcalinizare extracelular tranzitorie, dublat de o alcalinizare intracelular persistent. Primul eveniment care este semnalat la cteva secunde dup aciunea factorilor Nod, este un influx de ioni de Ca 2+, urmat de un eflux de ioni de Cl-, ceea ce produce o depolarizare membranar. Acest proces este contrabalansat de un eflux de K+. Influxul de Ca2+ are un efect profund asupra creterii vrfului prului radicular. Procesul este nsoit de schimbri ale dinamicii citoscheletului. Filamentele de actin sufer un proces de fragmentare sub incidena factorilor Nod (n urma infeciei cu Rhizobium). Procese similare au loc n tuburile polinice, unde influxul de Ca 2+ induce fragmentarea filamentelor de actin. Modificrile n concentraia ionilor de Ca2+ intracelular declaneaz o cascad de semnale intracelulare care se finalizeaz cu exprimarea genelor specifice implicate n programul simbiotic care conduce la dezvoltarea nodozitii. Diferitele gene timpurii ale nodulrii sunt induse de factorii Nod. Multe gene identificate pe baza inducerii sau amplificrii exprimrii lor n timpul dezvoltrii nodozitii (genele nodulinice) par s codifice, printre altele, proteine ale pereilor celulari. Aceasta subliniaz importana alterrilor biochimice induse la nivelul pereilor celulari n timpul formrii nodozitii. Astfel de gene codific pentru proteine bogate n prolin (PRP): Enod2, Enod5, Enod10, Enod11, Enod12, PRP4, pentru extensine, pentru proteine bogate n glicin (GRP) si pentru o peroxidaz (gena rip1). Printre markerii genici ai etapei foarte timpurii a nodulrii, se numr enod12 i rip1. Ambele gene sunt asociate cu stadiul de preinfecie, avnd rol n modificrile pereilor celulari, modificri observate n urma infeciei cu Rhizobium sau n urma interaciunii cu
5

LIGIA GHEEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA

factorii Nod. Faptul c factorii Nod induc modificri ale pereilor celulari este susinut i de descoperirea i caracterizarea unei hidrolaze a crei sintez se declaneaz n urma tratamentului cu factori Nod. Aceast hidrolaz prezint omologie de secven cu o clas de glicozil-hidrolaze care acioneaz n condiii normale, asupra componentelor pereilor celulari. Competena pentru inducerea nodozitii este determinat de condiii fiziologice i de activitatea fitohormonilor. Genele cii sintetice a fenilpropanoizilor, ca de exemplu, gena pentru chalconsintetaz, sunt induse n timpul simbiozei, iar factorii Nod mresc producia de flavonoizi. Deoarece s-a descoperit c factorii Nod acioneaz i ca inhibitori ai transportului de auxin, concluzia a fost c diviziunea celular indus de acetia poate fi cauzat de o perturbare a fluxului de auxin. Se cunoate faptul c Rhizobium are capacitatea de a converti triptofanul la acid indol acetic; cultivate in vitro, bacteriile din acest gen produc auxin i citochinin (Gavril i Mihescu, 1989). Mutantele de Rhizobium defective n sinteza de factori Nod pot fi parial recuperate, n privina capacitii de nodulare, la Medicago sativa, prin introducerea n ADN bacterian, a unei gene care codific pentru sinteza de citochinin. In plus, s-a constatat c factorii Nod i citochininele induc, n mod similar, exprimarea genei enod12A, produsul acesteia stimulnd diviziunea celular la nivelul celulelor corticale. Etilena afecteaz negativ formarea nodozitii. Unele mutante de mazre, incapabile de nodulare, rectig aceast capacitate n urma aciunii unor inhibitori ai etilenei. Dimpotriv, la specia Medicago truncata, exist mutanta sickle defectiv n sensibilitatea la etilen, ceea ce conduce la o cretere drastic a numrului de infecii persistente cu Rhizobium. Acidul 1-aminociclopropan carboxilic (ACC) precursorul biosintetic al etilenei, supreseaz dezvoltarea nodozitii la plantele normale, dar nu i n cazul mutantei sickle. Rezultatele cercetrilor sugereaz c etilena joac un rol n controlul local al infeciei, prin blocarea procesului infecios. 3.2 Simbioza o relaie armonioas ? In contrast cu lupta dintre plante i patogeni, interacia simbiotic este mai puin agresiv, conducnd la o asociere a celor dou organisme participante. Cu toate acestea, o privire mai atent asupra rspunsului plantei demonstreaz faptul c interacia nu este chiar att de armonioas cum pare la prima vedere, putnd apare, n orice stadiu al infeciei, o respingere a bacteriilor invadatoare (Baron & Zambryski). In ciuda abilitii demonstrate de Rhizobium, de a supresa, parial, rspunsul gazdei, doar un procent mic al infeciilor se finalizeaza cu succes, conducnd la formarea nodozitilor pline cu bacteroizi. Inducerea expresiei genelor pentru fenilalanin amonia-liaz (PAL) i chalcon-sintetaz (CHS) constituie markeri pentru iniierea cii fenilpropanoidice ca o component a rspunsului plantei la atacul patogenilor. Inducerea acestei enzime a fost detectat n primele stadii ale interaciei lui Bradyrhizobium japonicum cu soia. Printre familiile genice ce codific pentru izoenzimele din categoriile PAL si CHS, diferite subseturi sunt induse att de ctre bacterii din genul Rhizobium, ct i de patogeni propriu-zii (bacterii, nematode, acarieni, insecte). Un alt aspect interesant a fost descoperirea c gena pentru izoenzima CHS5 de la trifoi poate fi indus att prin infecia cu Rhizobium leguminosarum biovar trifolii, ct i n urma rnirii. Poate Rhizobium s supreseze rspunsul defensiv al gazdei ? Ipoteza potrivit creia o nodulare reuit depinde de supresarea rspunsului gazdei este susinut puternic de analiza infeciilor respinse, ale tipului slbatic de Rhizobium i a mutantelor defective n polizaharide
6

Aspecte moleculare i biochimice ale interaciei gazd parazit n cadrul procesului tumorigen la plante

de suprafa celular. Mutantele ExoB de Bradyrhizobium japonicum au o exopolizaharid cu structur alterat i produc nodoziti la soia, dup o oarecare ntrziere i cu eficien redus. In acest caz, n faza timpurie a infeciei, n exudatele rdcinii au fost depistate nivele drastic crescute ale fitoalexinei gliceolina (absent la tipul slbatic). In final, nodularea apare, dar nodozitile prezint caracteristici morfologice i biochimice specifice, precum expresia crescut a chitinazei, sugernd un rspuns defensiv. Mutantele de Rhizobium meliloti care au absent o exopolizaharid nu pot infecta rdcinile de alfalfa (lucern) la primul contact, dar secret factori Nod i induc, pe aceast cale, pseudonoduli care nu conin bacteroizi. Dup o infecie secundar a rdcinilor, bacteriile mutante sunt nconjurate de perei ngroai ai celulelor radiculare, indicnd un proces de lignificare a pereilor celulari. Pereii celulelor care intr n constituia pseudonodozitilor prezint aspecte biochimice i citologice caracteristice pentru o reacie defensiv a gazdei, de exemplu, schimbri n coninutul depozitelor de fenoli i caloz.

4. Tumorigeneza indus de nematodul Meloidogyne incognita

Primele etape ale ciclului de via al nematodului, din momentul ecloziunii, se desfoar n sol. Dup ecloziune, nematozii tineri se deplaseaz prin pelicula de ap care nvelete particulele de sol, ctre rdcinile tinere ale viitoarelor gazde. Larvele de stadiul 2 perforeaz pereii celulari cu stomatostiletul, ptrund n rdcin i se deplaseaz ctre cilindrul central unde ptrund i se localizeaz. Prin aciunea unei enzime care este eliberat de ctre parazit, celulele vegetale care nconjoar nematodul sufer hipertrofie, devenind gigantice i servind, mai apoi, ca surs de hrnire pentru parazit. Rezultatul este formarea unei gale caracteristice care nvelete, n scurt timp, complet parazitul, blocnd circulaia n vasele conductoare. Rnirea vrfurilor rdcinilor tinere constituie, n acest caz, primul pas n procesul de infecie. Rnirea mecanic induce frecvent dediferenierea urmat de rediferenierea celulelor parenchimatice n elemente traheidale, n jurul locului rnit . Aceste elemente traheidale apar ca o consecin a ntreruperii legturilor vasculare i a perturbrii transportului hormonal (Fukuda, 1996). In general, rspunsul plantei la rnire include inducerea unor gene implicate n rspunsul defensiv, codificatoare pentru peroxidaz i lipoxigenaz. Unele dintre enzimele induse n urma rnirii funcioneaz n sinteza ligninei care contribuie la consolidarea pereilor celulari afectai (Baron & Zambryski, 1995). Inducerea chalcon-sintetazei i a chalconizomerazei indic producerea de fitoalexine (flavonoizi). Rnirea stimuleaz i producerea de polifenoloxidaz, care conduce la acumularea unor produi toxici de oxidare a fenolului (de exemplu, a taninurilor). De asemenea, la unele specii de plante, apare sinteza de inhibitori ai proteinazelor, ei contribuind la aprarea plantei mpotriva atacului larvelor de insecte, prin blocarea cilor de metabolizare a proteinelor de ctre parazit. Studiile noastre asupra galelor induse de nematodul Meloidogyne incognita care prezint un spectru foarte larg de gazde (peste 700 de specii aparinnd dicotiledonatelor) au condus la concluzia potrivit creia parazitul modific profund organizarea intracelular i cursul proceselor metabolice la nivelul esutului infectat (Gheea i colab. - material n curs de publicare). Astfel, n celulele din vecintatea cilindrului central, unde, dealtfel, se gsete localizat parazitul, ciclul eumitotic devine unul endomitotic. Consecina acestui fapt este c aceste celule devin poliploide, iar prin mrirea proporional a volumului lor citoplasmic, ele devin celule gigantice. Nivelele nalte de endopoliploidie reprezint, dealtfel, o caracteristic foarte
7

LIGIA GHEEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA

comun a esutului galar, dat fiind frecvena cu care apar astfel de nuclei endopoliploizi n gale produse pe multe specii de plante. Pereii celulari sufer importante modificri biochimice i structurale. Structurile multinucleare care se remarc n urma analizei esutului galar, sunt rezultatul unei profunde degradri a proceselor celulare generale, degradare care conduce la diviziunea amitotic a nucleilor nalt endopoliploizi, urmat, uneori, de liza pereilor celulari i de fuziuni celulare. In stadiile finale ale tumorigenezei, la nivelul nucleilor de dimensiuni variabile, rezultai prin diviziune amitotic, apare fenomenul de inactivare prin hipercondensarea cromatinei. Aspectul acestor nuclei este picnotic. Complementul organelar apare, de asemenea, alterat, att n privina numrului, ct i n cea a structurii organitelor. Biosinteza auxinei i transportul hormonului de-a lungul rdcinilor tinere sunt perturbate prin prezena parazitului n esutul plantei, acesta, prin activitatea sa, inducnd i modulnd un model nou de difereniere celular la nivelul rdcinilor. Se cunoate faptul c, n galele tinere, concentraia auxinei este semnificativ crescut comparativ cu esutul normal difereniat. Stadiul final al tumorigenezei este caracterizat de ngroarea prin lignificare, a pereilor celulari i de vacuolizarea celulelor transformate. Galele btrne apar lignificate i cu arii necrotice extinse, mimnd un rspuns de hipersensibilitate. Care ar putea fi explicaia ? Lupta care se d ntre nematod i planta gazd, pe tot parcursul procesului de formare a tumorii, este intens. Ca i n cazul lui Rhizobium, n galele n cretere, parazitul reuete s diminueze rspunsul defensiv al plantei gazd. Dei diminuate de ctre parazit, mecanismele defensive ale plantei sunt active (sau activate dup primele stadii ale infeciei). Ca i n cazul formrii nodozitilor (Schultze & Kondorosi, 1998), n tumorigeneza indus de nematod, schimbrile n concentraia ionului Ca 2+ intracelular se constituie ntr-un semnal care declaneaz exprimarea genelor implicate n mecanismele defensive ale plantei. Interaciunea prelungit a nematodului i a metaboliilor si (cu rol de elicitori) cu esuturile radiculare conduce la o alcalinizare extracelular. Unul dintre efectele acestei alcalinizri este favorizarea reaciilor oxidative n urma crora sunt generate enzimatic specii active de oxigen, prin aciunea unor peroxidaze extracelulare sau enzime oxidative legate de membran (Bolwell, 1995). Producerea tranzitorie de ap oxigenat la suprafaa celulei poate fi considerat analog reaciei oxidative din timpul activrii macrofagice, la nivelul sistemului imunitar. Producerea de ap oxigenat cauzeaz formarea rapid de legturi ncruciate (crosslinking) ntre proteinele din pereii celulari, la fel ca i n cazul rnirii esuturilor vegetale. Efectul este acela de localizare a parazitului n interiorul esutului (Baron & Zambryski, 1995). Lignificarea pereilor celulari, care apare i n cazul tumorigenezei produs de nematod, reprezint o consecin a inducerii enzimelor cii fenilpropanoidice, ca o component a rspunsului defensiv al plantei la invazia nematozilor. Cercetrile pe care le-am efectuat asupra activitii peroxidazice din esutul normal i tumoral (Gheea i colab. material n curs de publicare), au fost remarcate schimbri n activitatea izoperoxidazelor, n cursul procesului tumorigen. Astfel, s-a observat faptul c esutul galar prezint, n etape succesive de formare a galei, similariti ale activitii izoperoxidazelor cu diferite esuturi ale plantei, n funcie de stadiul de difereniere a galei. Astfel, galele tinere prezint activiti ale izoperoxidazelor similare cu cele ale frunzei, n timp ce galele btrne prezint activiti izoenzimatice comparabile cu cele ale rdcinii sntoase. In stadiile timpurii ale dezvoltrii galei, parazitul reuete s reduc drastic activitatea majoritii izoperoxidazelor, pe cnd, n galele btrne, se poate constata o revenire a activitii peroxidazice, aproape de parametrii iniiali, caracteristici esutului sntos.
8

Aspecte moleculare i biochimice ale interaciei gazd parazit n cadrul procesului tumorigen la plante

Potrivit datelor din literatur, modificarea spectrului izoperoxidazic n procesul de formare a galelor, reprezint, mai curnd, o reflectare a plasticitii mecanismelor genetice (de inducere / represare a expresiei genelor pentru diferitele izoperoxidaze), modificrile epigenetice, n msura n care se realizeaz, avnd un rol secundar.

Concluzii
Tumorile la plante constituie rezultatul unor mecanisme deosebit de complexe, care antreneaz modificri ale expresiei genice n esutul vegetal afectat, inducerea exprimrii unor gene care aparin arsenalului de aprare al plantei, producerea unor metabolii care, fie au efect toxic asupra parazitului, fie consolideaz structurile celulare, pentru a limita efectele nocive ale agentului agresor. Sub influena metaboliilor produi i eliberai n esutul atacat, de ctre parazit, are loc o reorganizare celular i tisular, care presupune o serie de procese : dedifereniere/redifereniere celular, hiperplazie/hipertrofie celular, endoreduplicri la nivelul nucleilor celulelor care sufer hipertrofiere. Aceast reorganizare celular i tisular conduce, n final, la edificarea unei neoformaiuni cu caracteristici morfo-anatomice i funcionale diferite de cele ale esutului sntos, netransformat. Edificarea tumorii vegetale este, n egal msur, un efect al aciunii parazitului i al strategiei de aprare a plantei. In acest sens, este impresionant arsenalul de mecanisme de care dispune planta i pe care le activeaz, n mod direct sau indirect, parazitul, n momentul atacului. Este o reacie n cascad care, uneori, conduce la respingerea categoric a parazitului (reacia de hipersensibilitate), alteori finalizndu-se cu formarea unor excrescene (fie c ele se numesc nodoziti, fie c se numesc gale, n fapt, ambele sunt neoformaiuni proliferative localizate), care realizeaz o izolare a parazitului i o localizare a efectelor aciunii sale la nivelul plantei. La ora actual, se fac corelaii funcionale ntre componente ale aparatului de aprare la plante i la animale. Astfel, acidul jasmonic este comparat cu prostaglandinele (substane asemntoare hormonilor de la mamifere), fitoalexinele sunt considerate analogi ai anticorpilor din organismele animale (ns spre deosebire de acetia din urm, ele nu prezint specificitate); din plante infectate cu virusuri, au fost izolai interferoni, cu acelai rol n celula vegetal ca i n cea animal. Cercetrile legate de mecanismele de aprare la plante sunt n plin desfurare, nefiind exclus ca, n viitor, s se descopere noi elemente de asemnare ntre mecanismele defensive dezvoltate de plante i cele elaborate de animale. Chiar dac asemnrile nu merg pn la detaliu, important este semnificaia funcional, care este aceeai la ambele regnuri.

Bibliografie
1. Baron C., Zambryski The Plant Response in Pathogenesis, Symbiosis and Wounding : Variations on a Common Theme ? Annual Review of Genetics 29 : 107 129, 1995. Bolwell G.P. Cyclic AMP, the reluctant messenger in plants TIBS 2, 492494, 1995 Clarke H.R.G., Leigh J.A., Douglas C.J. Molecular signals in the interaction between plants and microbes Cell, Vol.71, 1992, pp.191 199
9

2. 3.

LIGIA GHEEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA

4. 5. 6. 7. 8. 9.

DAmato F. Chromosome Endoreduplication in Plant Tissue Development and Function John Wiley & sons, 1998, pp. 153-166. Dumitrescu M., Vldescu Izoenzimele plantelor Editura Ceres, Bucureti, 1973, pag.105 123. Feys B.J., Parker J.E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance Trends in Genetics Vol.16, No.10, Oct.2000, pp.449 455. Fukuda Hiroo Xylogenesis: Initiation, progression and cell death Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol., 1996, 47 : 299 325 Gavril L., Mihescu Gr., - Biologia microorganismelor fixatoare de azot Ed. Ceres, 1989 Gorenflot R. Biologie vgtale , 1990, Vol.1, pp.110 114

10. Gundlach H., Mller M.J., Kutchan T.M., Zenk M.H. Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992, Vol.89, pp. 2389 2393. 11. Klee H. Molecular genetic approaches to plant hormone biology Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol., 1991, 42 : 529 551 12. Long.R.S., Staskawicz B.J. Prokaryotic Plant Parasites Cell, Vol.73, 1993, pp.921 935. 13. Morris R.O. Genes specifying auxin and cytokinin biosynthesis in phytopathogens Ann. Rev. Plant Physiol., 1986, 37 : 509 538. 14. Nagl W. Endopoliploidy and Polyteny in Differentiation and Evolution 1978, Kaizerslautern University, Germania 15. Schultze M., Kondorosi A. Regulation of symbiotic root nodule development Annu. Rev. Genet. 1998. 32 : 33 57.

10