DIAGNOSTIC DE LABORATOR

IMPORTANA METODEI PCR N DIAGNOSTICUL INFECIEI CONGENITALE CU CITOMEGALOVIRUS Aliona Chirca, Natalia Gheciu, Anatol Vinevschi Catedra Diagnostic de Laborator Clinic, USMF ,,Nicolae Testemianu Summary The importance of the PCR method in the diagnosis of the congenital infection CMV In this article we elucidated: studies on the prevalence of congenital CMV infection at newborns, prenatal diagnosis problems of infection with CMV, PCR method as procedure, advantages and disadvantages, we presented the results of studies wiht PCR method at newborns infected with CMV with PCR in developed countries, which is currently the gold standard for diagnosis of congenital CMV infection. Rezumat n acest articol am elucidat: studii privind prevalena infeciei congenitale cu CMV la nou-nscui, problemele de diagnostic prenatal al infeciei cu CMV, metoda PCR ca procedura de efectuare, avantaje i dezavantaje, am prezentat rezultatele studiilor efectuate la nou-nscuii infectai cu CMV n rile dezvoltate prin metoda PCR care actualmente este standartul de aur n diagnosticul infeciei congenitale cu CMV. Introducere Infecia cu virusul citomegalic (CMV) se caracterizeaz prin polimorfism clinic, condiionnd forme generalizate i localizate, frecvent asimptomatice i mai rar simptomatice prin variate tablouri clinice, n dependen de starea de imunocompeten a gazdei. Este cea mai comun infectie viral congenital n rile dezvoltate, foarte des evolund spre retard neuropsihic i deficit de dezvoltare somatic. Alturi de rubeola i toxoplasmoza este responsabil de malformaii ale nou-nscutului, cu sechele definitive sau, uneori cu sfrit letal. Agentul etiologic (CMV) are dimensiuni mari i este format din genom, nucleocapsid, tegument i anvelop lipidic [2]. SNC este considerat drept cea mai important int a CMV la ftul n dezvoltare, deoarece CMV are capacitatea de a infecta esutul endotelial, se consider c endarterita viral ar fi responsabil de dereglarea fluxului sanguin spre creierul n dezvoltare al ftului, cu rezultarea unui deficit neurologic marcat. Infecia congenital se realizeaz prin transmiterea materno-fetal a CMV de la gravide seronegative sau seropozitive. n majoritatea cazurilor ftul este infectat n timpul viremiilor, prin pasajul transplacentar al CMV sau prin continuitate, pe cale ascendent, prin secreiile vaginale. Transmiterea materno-fetal a CMV se poate produce pe parcursul ntregii perioade a graviditii, dar cea mai grav este n prima perioad a sarcinii [2]. Infecia fetal se poate manifesta prin anomalii multiple i nespecifice, care pot fi evdeniate n timpul sarcinii prin ecografie i/sau RMN fetal: retard al creterii, oligoamnios, anasacra, dilataia intraventricular, calcificri intracraniene sau hidrocefalee, microcefalee, hepatospleomegalie, calcificri intrahepatice, care pot duce la moartea in utero a ftului. Forma simptomatic la natere, cunoscut sub numele de boala cu incluziuni citomegalice, este rar (1:10000/1:20000 de nateri), dar i foarte sever manifestnde-se prin 212

prematuritate i hipotrofie, hepatosplenomegalie cu/sau fr icter, purpura trombocitopenic, semen de afectare a SNC microcefalie, hidrocefalie, convulsii, paralizii, chorioretinit ect [3]. La 80-100% din cei supravieuii se vor dezvolta sechele neurosenzoriale impotante : hipoacuzie neurosenzorial progresiv, retard mental, microcefalee, hepatit CMV cu/sau fr icter [2]. n 90-95% de cazuri, de nou-nscui infecia CMV este una asimptomatic la natere, care iniial prezint doar viremie, virurie, Ig M i Ig G anti-CMV crora se vor efectua examene complementare pentru evidenierea anemiilor, trombocitopeniilor, sindromului de citoliz hepatic, anomaliilor cerebrale i oculare. Pe parcurs, 10-15% din ei vor prezenta un risc major de handicap prin retard psihomotor, surditate, leziuni ocular [2]. Infectarea perinatal se realizeaz n timpul naterii prin secreii cervical sau postpartum prin intermediul laptelui matern i nu are consecine negative asupra dezvoltrii neuropsihice ulterioare a copiilor, deoarecee n laptele matern se conine Ig A specific, cu excepia prematurilor. La prematuri, de rnd cu riscul semnificativ de transmitere a infeciei, este posibil i dezvoltarea formelor severe, generalizate de boal cu rata decesului de circa 30% [3]. n cazul n care seroprevalena printre mame este nalt i alptarea la sn este practicat pe scar larg circa 30-70% din sugari dobndesc infecia CMV pe parcursul primului an de via, dar aceasta nu are efect negativ asupra dezvoltrii neuropsihice a copiilor [2]. Copii de vrst precolar pot achiziiona CMV unii de la alii, n special n colectivitile de copii, iar dup suportarea infeciei vor elimina virusul cu saliva i/sau urina timp de mai muli ani. Virusul este present n snge, saliv, lacrimi, sperm, secreii de col uterin, urin, laptele mamelor seropozitive. CMV se transmite prin contact direct cu fluidele corporale, n timpul contactelor intime, manoperelor de ngrijire a copiilor mici, transfuziilor de snge, transplantul de organe. Ponderea nou-nscuilor infectai cu CMV (0,5%5,4%) i a crescut odat cu seroprevalena preconcepional a femeilor [3]. n scopul aprecierii riscului infeciei congenital cu CMV la ft la gravide cu infecie primar cu CMV, se recomand a efectua diagnosticul prenatal la 21-23 de sptmni ale sarcinii, prin detectarea CMV n lichidul amniotic prin metoda virusologic clasic sau AND-ului CMV prin PCR. Standardul de aur pentru diagnosticul de infecie congenital cu CMV la nou-nscui rmne izolarea virusului din urin, saliv i/sau singe n primele 2-3 sptmni de via (termen necesar pentru diereniere infeciilor cu CMV perinatal i congenital) [2]. PCR. Reacia de polimerizare n lan Bazndu-se pe procesul natural al replicrii AND-ului, sa elaborat metoda cu ajutorul creia se pot obine copii ale anumitor poriuni ale genelor n cantiti nelimitate ntr-un tub (in vitro). Ea ofer posibilitatea de a determina rapid cu specificitate nalt a particularitilor construciei genetice a organismelor vii, identificarea AND-ului/ARN-ului i determinarea genotipului microorganismelor, aa deci genotiparea poate fi realizat cu ajutorul reaciei de polimerizare n lan. Reacia de polimerizare n lan este un proces ciclic de sintez a copiilor noi ale unui fagment de AND selectat care are loc sub form de alternare a parametrilor temperaturii mediului de reacie. Mediul de reacie trebuie s conin: AND-matri, dezoxinucleozidtrifosfai, AND-polimeraza, amorse, la fel adaosuri suplimentare care optimizeaz procesul de polimerizare, MgCl2, soluie tampon pentru Taq-polimeraz [10]. La baza metodei PCR este procesul de sintez in vitro a unui anumit segment-int din catena AND, sub influena enzimei AND dependent numit Taq-polimeraza care exercit consecutiv citirea i legarea nucleotidelor, complementare cu catena AND-matri i formarea catenei noi de AND-fiic. Sinteza catenei noi se iniiaz n anumute puncte stabilite n lungul AND-ului numite situsuri de iniire. Pentru iniierea sintezei alturi de AND-matri se mai folosesc dou poriuni polinucleotidice, monocatenare, de dimensiuni relativ mici complementare cu situsurile de iniiere PCR din AND-ul matri, numite amorse (praimeri). Cu ct sunt mai mari dimensiunile amorselor, cu att este mai nalt specificitatea metodei.

213

Ciclu PCR ncepe cu denaturarea catenelor de AND prezente n mediul de reacie, care are loc la temperatura de aproximativ 920-950C, legturile de hydrogen dintre catene se rup (etapa de denaturare), drept urmare se obin dou catene (monocatenare) liniare catenele matri [10]. n urmtoarea etap a ciclului temperatura se micoreaz pn la 450-700C, amorsele se cupleaz cu sectoarele ei complementare de pe catenele AND (etapa de hibridizare), iar AND-polimeraza ncepe sinteza catenei complementare, extinznd amorsa de la extremitatea 3. Apoi temperatura se mrete pn la optim pentru AND-polimeraz (720C, depinde de polimeraz), cu scopul realizrii maxime a activitii enzimei (etapa de sintez). Stoparea reacei de sintez are loc la mrirea temperaturii mai mult de 920C, AND-polimeraza finiseaz procesul de sintez. n urma unui ciclu PCR n mediu de reacie cantitatea de AND se dubleaz, pe lng aceasta se dubleaz i numrul sectoarelor recunoscute de amorse. Dup al doilea ciclu, n mediu de reacie sunt prezente segmente ale spiralei duble, care sunt limitate de pe o parte de prima amors, pe de alt parte de segmentul de cuplare a amorsei doi, mai deprte de aceast extremitate dubl polimeraza nu acioneaz. Dup 30-40 de cicluri cantitatea de fragmente AND sintetizate (ampliconi) atinge cteva milioane de copii i este uor de detectat cu ajutorul metodelor de electroforez n gel, n prezena colorantului fluorescent, care se cupleaz nespecific cu moleculele acizilor nucleici [10]. Modificrile metodei PCR: multiplex PCR, PCR n cuib, PCR n regimul timpului real. Pentru multiplicarea simultan a dou i mai multe secvene de AND-int, pe larg se utilizeaz multiplex PCR, care este un proces de coamplificare a ctorva matrie AND ntr-un mediu de reacie cu utilizarea diverselor perechi specifice de amorse, ce permit determinarea concomitent a prezenei factorilor de virulen i de rezisten la preparatele antibacteriene i antivirale [10]. ntr-un studiu efectuat n anul 2011 n statul Washington pe un lot de 55 de nou-nscui testai la dou centre concomitent au fost obinute 36 (66%) rezultate positive la cetrul 1, 40 (73%) au fost positive la centrul 2, n 9 cazuri au fost rezultate negative la ambele centre [7,8,6]. Una din cele mai rspndite variante ale PCR este PCR n cuib ce are drept scop creterea sensibilitii PCR prin reamplificarea direct a produsului primei reacii. n present sunt folosite dou tipuri de PCR n cuib: cu dou tuburi i cu un cuib, primul tip posed riscul de contaminare a mediului cu aerosoli n timpul transferului din primul n al doilea tub. Alt latur care complic reacia este faptul c produsul primei runde de amplificare nu poate fi inactivat i este disponibil pentru a doua etap [10]. Un studiu efectuat n Depertamentul de Microbiologie din Leiden n perioada dintre anii 2009-2011, prin genotiparea a 39 de probe de plasm a nou-nscuilor infectai cu CMV prin metoda PCR pentru glicoproteina B (GB) i glicoproteina H (GH) a demonstrat c genotipurile GB i GH au fost detectate n 33-36% din monsterele studiate cu rezultatul de 81% pentru GB i 73% pentru GH. Genotiparea a avut success 100% cu prevalena GB 1 i GB 3, i totui GB 3 ( M60934, M85228, M60933) fiind cel mai rspndit genotip [5]. Acelai Departament de Microbiologie din Leiden n perioada anilor 2009-2011 au studiat genotipul urinei a 21 de nounscui infectai congenital cu CMV de asemenea prin metoda PCR teste pentru GB i GH. Rezultatele obinute GB 1 (48%, 10/21), GB 3 (29%,6/21) i GH 2 (62%, 13/21), o prob de urin a unui nou-nscut cu CMV congenital a fost positiv att pentru GB 1 i GB 2 ce indic o infecie mixt [5]. Metoda PCR n regimul timpului real este o metod cantitativ a produselor PCR nemijlocit n timpul amplificrii devine una din cele mai populare metode att n diagnosticul clinic, ct i n cercetrile tiinifice. Din cauza omiterii electroforezei se exclude total contaminarea cu produsele reaciei, de asemenea aceast metod ofer posibilitatea determinrii cantitative a materialului iniial, i detectarea paralel a mai multor infecii ntr-o singur 214

monstr. Metoda se bazeaz pe msurarea semnalului fluorescent n fiecare ciclu de amplificare [10]. Studiu a 222 de copii n vrst de 4 ani cu hipoacuzie neurosenzorial din statul Washington prin testare sngelui prin metoda PCR n timp real a stabilit c la 35-65% din simptomatici, i la 7-15% din cei asimptomatici au dezvoltat n cele din urm hipoacuzie neurosenzorial. Sa stabilit c n statul Washington una din cele mai commune cause ale hipoacuziei neurosenzoriale n perioada copilriei este infecia congenital cu CMV [4,1]. Un lot de 177 de nou-nscui au fost testai pentru polimeraza salivar prin metoda PCR n timp real. Testul a avut o sensibilitate de 100% (95% I, 95,8 la 100), i o specificitate de 99,9% (95% CI, 99,9 la 100). Aceast metod poate fi folosit ca un test sceening pentru detectarea nfeciei citomegalice la nou-nscui n primele dou sptmni de via [9]. Pregtirea pacientului nu trebuie s primeasc preparate chimice 10 zile nainte de recoltarea materialului biologic, s nu efectueze proceduri medicale [10]. n calitate de materialul biologic pentru investigaiile PCR n infeciile cu CMV la nou-nscui se utilizeaz: sngele, saliva i urina nou-nscutului. Criteriile obligatorii att pentru recoltarea materialului biologic (de orice fel) pentru analizarea prin PCR: - utilizarea instrumentariului de unic folosin sau steril; - marcarea sau etichetarea corespunztoare a coninutului eprubetelor; - recoltarea sngelui pentru PCR se efectueaz n eprubete de plastic, de uz unic, ce conin soluie de EDTA; - urina se recolteaz dimineaa, ntr-un vas steril i chimic curat, dup centrifugare se nltur urina de deasupra iar sedimentul se transfer n eprobeta pentru PCR, care se nchide etan i se marcheaz; Pstrarea probelor: - probele se pstreaz la temperatura 40-80C timp de 24 ore; - la temperatura -180,-200C timp de 30 zile; - la temperatura -700C se pstreaz timp ndelungat (ani de zile); - probele destinate investigrii cantitative pot fi pstrate (40-80C) timp de 6 ore de la colectarea materialului biologic; Transportarea materialului biologic se efectueaz n containere cu elemente de rcire sau n termos cu ghe. Containerele trebuie s fie nchise etan, impermiabile pentru lichide, ele trebuie etichetate corespunztor coninutului. Containerele trebuie s fie produse din material rezistent la dezinfactani, s fie autoclavabile, i este necesar s fie decontaminate dup fiecare utilizare. Avantajele metodei PCR: 1. Sensibilitate nalt, deoarece metoda este bazat pe principiul exponenial de acumulare a produsului amplificat. 2. Specificitate nalt bazat pe identificarea secvenelor de material genetic unical pentru microorganism, ce detremin particularitile de clas, toxicitate,etc. 3. Timp scurt de efectuare 2-6 ore de la nceputul examinrii n cazul n care nu trebuie s fie transportate. 4. Procedur universal de executare este aplicabil practic pentru toi agenii patogeni. 5. Material biologic variat agentul patogen fiind identificat n orice lichid biologic al organismului, i nu este necesar creterea culturii pe medii sau izolarea culturii curate de agent patogen. 215

6. Diagnosticul diferitor procese patologice este posibil diagnosticul formelor acute, cronice, trenante, seronegative, diagnosticul microorganismelor cu posibiliti reduse de cultivare. 7. Perioada bolii este posibil identificarea agentului patogen nu numai n perioada de stare sau cronic, dar i n perioada de incubare a bolii ( fereastra imunologic) depistarea AND-ului. ARN-ul se depistez dup o sptmn sau dou de la infectare. 8. Este o metod direct de identificare a agentului patogen, bazat pe modalitatea universal de pstrare i transmitere a informaiei genetice la materia vie. Dezavantajele metodei PCR sunt legate mai mult de recoltarea, pstrarea i transportarea materialului biologic. Metoda PCR cu dou tuburi prezint dezavantaje de ordin tehnic: riscul contaminrii mediului cu aerozoli, reacia complicat de faptul c produsul primei runde de amplificare nu poate fi inactivat i este disponibil pentru a doua reacie [10]. Concluzii Infecia congenital cu CMV este cea mai comun infectie viral congenital n rile dezvoltate, foarte des evolund spre retard neuropsihic i deficit de dezvoltare somatic. Reprezint o problem actual imperioas a sntii publice, puin studiate, n Republica Moldova fa de rile nalt dezvoltate unde are loc testarea pe larg a nou -nscuilor n primele dou sptmni de via. Obiectivele ce in de viitorul apropiat sunt: perfectarea diagnosticului prenatal al infeciei cu CMV, optimizarea criteriilor de diagnostic al infeciei congenitale cu CMV la nou-nscui i sugari. Bibliografie 1. Aparecida Yulie Yamamoto, Marisa Marcia Mussi-Pinhata, Myriam de lima Isaac: Congenital Cytomegalovirus Infection as a Cause of Sensorineural Hearing Loss in a Highly Immune Population. Pediatr Infect Dis J. 2011 Dec;30(12):1043-6. 2. Gheorghe brn, Ion Ababii, Stanislav Groppa:Buletinul Academiei de tiine a Republicii Moldova. tiine Medicale. Nr 5,Chiinu 2010, 5-11p. 3. Gheorghe brn, Ion Ababii, Stanislav Groppa: Buletinul Academiei de tiine a Republicii Moldova. tiine Medicale. Nr 3,Chiinu 2007,179-184p. 4. Jannick Verbeeck, Erwin Van Kerschaver, Elke Wollants: Detection of Perinatal Cytomegalovirus Infection and Sensorineural Hearing Loss in Belgian Infants by Measurement of Automated Auditory Brainstem Response . J Clin Microbiol. 2008 Nov;46(11):3564-8. 5. Jutte J. C. de Vries, Els Wessels,a Anna M. H. Korver,b Annemiek A. van der Eijk: Rapid Genotyping of Cytomegalovirus in Dried Blood Spots by Multiplex Real-Time PCR Assays Targeting the Envelope Glycoprotein gB and gH Genes. J Clin Microbiol. 2012 Feb;50(2):232-7. 6. Nicholas Renzette, Bornali Bhattacharjee,Jeffrey D. Jensen, Laura Gibson: Extensive Genome-Wide Variability of Human Cytomegalovirus in Congenitally Infected Infants. PLoS Pathog. 2011 May;7(5):e1001344. 7. Oriane Soetens, Christelle Vauloup-Fellous, Ina Foulon, Pascal Dubreuil: Evaluation of Different Cytomegalovirus (CMV) DNA PCR Protocols for Analysis of Dried Blood Spots from Consecutive Cases of Neonates with Congenital CMV Infections . J Clin Microbiol. 2008 Mar;46(3):943-6. 8. Shekleton P, Walker SP, Palma-Dias R, Wood EM, Cytomegalovirus in pregnancy: to screen or not to screen. BMC Pregnancy Childbirth. 2013 Apr 18;13(1):96.. 9. Suresh B. Boppana, Shannon A. Ross, Masako Shimamura, April L. Palmer: Dr.P.H., for the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders CHIMES Study. Saliva 216

Polymerase-Chain-Reaction Assay for Cytomegalovirus Screening in Newborns. N Engl J Med. 2011 Jun 2;364(22):2111-8. 10. Vladimir Nahaba: Metodele molecular genetice de cercetare (PCR) n diagnosticul de laborator al infeciilor , Chiinu 2009 , 7-14 p. web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.

TESTUL HPV- DETECTAREA I GENOTIPAREA TULPINILOR CU RISC ONCOGEN NALT / SCZUT Natalia Gheciu, Aliona Chirca, Anatol Vinevschi Catedra Diagnostic de Laborator clinic USMF Nicolae Testemianu Summary HPV test - detection and genotyping of the strains with high / low oncogenic risk Human Papillomavirus (HPV) is the most common cause of cervical cancer. Cervical cancer represents the second most common cause of death after breast cancer, affecting women of different age groups; with a prevalence of over than about 20% in young sexually active women. Among different types of HPV, type HPV16-18 represents major strains causing this cancer and being sexually transmitted it had been unnoticed for decades. Elaboration and implementation of various diagnostic methods prove to be an effective way in eradicating the oncogenic potential of HPV. Rezumat Papilomavirus uman (HPV) este cea mai frecvent cauz a cancerului de col uterin. Cancerul cervical reprezint a doua cauz de deces la femei dupa cancerul mamar care afecteaz femeile de diferite vrste cu o prevalen mai inalt de aproximativ 20% la cele tinere active sexual. Printre diferite tipuri de HPV, tipul 16 -18 sunt tulpini majore care cauzeaz acest tip de cancer. Elaborarea i implimentarea diverselor procedee de diagnosticare se dovedesc a fi o modalitate eficienta n eradicarea potenialului oncogenic de HPV. Actualitatea Cancerul cervical este una din cauzele de baz a mortalitii femeilor, ndeosebi a celor tinere. Raportul variaz peste tot in lume, dar o rat semnificativ de mare a fost stabilit n rile occidentale [11]. n urma unor analize statistice i geografice s-a demonstrat ca nivelul HPV e mai mare la femeile americane dect la cele caucaziene.[8] Conform statisticilor a Organizaiei Mondiale a Sntii (OMS) sunt nregistrate aproximativ 500.000 de cazuri noi anual din care 250.000 cazuri sunt fatale. Conform celor mai recente rapoarte, femeile sunt predispuse la aceast infecie de dou ori mai mult dect brbaii [9]. Prevalena global a HPV n rndul femeilor indiferent de ras constituie o rat de 17,9% n timp ce barbaii au o rat de 8%. Persoanele cu multipli parteneri sexuali sunt predispui la un risc mai mare de infectare cu HPV de 20,1% fa de persoanele care au un singur partener sexual pe intreaga durat a vieii sexuale, la care riscul de infectare cu HPV e de 7% [8]. Virusul Papiloma Uman este un virus frecvent intlnit care cauzeaz leziuni celulare sau tumori la nivelul pielii; deasemenea poate determina modificri ale esuturilor de la nivelul membrelor superioare i inferioare, corzilor vocale, gurii i organelor genitale [13].

217

Tipurile HPV Actualmente sunt identificate mai mult de 100 tipuri de HPV, fiecare tip avnd tropism ctre anumite esuturi. Modificrile tisulare determinate de anumite tipuri de HPV pot servi ca substrat pentru dezvoltarea cancerelor organelor genitale feminine. n funcie de asocierea lor cu cancerul i gradul de patogenitate diferite genotipuri de HPV sunt clasificate n tipuri cu risc oncogen sczut i risc oncogen inalt. Genotipurile "cu risc sczut" sunt rareori asociate cu cancer n timp ce genotipurile "cu risc ridicat" sunt mult mai susceptibile de a conduce la dezvoltarea cancerului. Genotipuri cu risc crescut (oncogene sau cancer asociate) sunt: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 i 82 - Posibile genotipuri cu risc ridicat includ: 26, 30, 34, 53, 66, 67, 69, 70, 73, 82, 85 i 97. - HPV 16 este tipul predominant, provocnd mai mult de 50% din cazurile de cancer; urmeaz HPV 18 provocnd 14%; i HPV 45 cu 2,8% cazuri. Aceste genotipuri sunt foarte rspndite n toate regiunile din lume i sunt responsabile n aproximativ 70% de dezvoltarea cancerului de col uterin [11,15]. HPV tipurile 52 i 58 sunt rare n rile occidentale, cu toate acestea, ele sunt predominante n populaia din Asia n special n China (5, 14, 15, 28, 29). Genotipuri cu risc sczut (non-oncogene) sunt: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 73 i 81. - Genotipurile 6 i 11 determin aproximativ 90% dintre cazurile de negi anogenitali. Cu toate acestea, genotipurile care cauzeaz condiloame anogenitale, de obicei, nu produc cancer[11,15]. Cauzele si factorii de risc in dezvoltarea HPV n ceea ce privete cauzele dezvoltrii infeciei cu HPV sunt implicai o multitudine de factori. Comportamentul sexual este cel mai important factor pentru tulpinile cu risc oncogen nalt [9]. n ciuda comportamentului sexual ali factori ar putea fi, de asemenea implicai n dezvoltarea acestei infecii. Este important de menionat c nu toate infeciile cu HPV duc la o boal malign, cu toate acestea, cele dou tulpini de HPV care sunt HPV 16 si HPV 18 contribuie la dezvoltarea n principal al cancerului de col uterin [9]. Ali factori includ fumatul, utilizarea extinsa de contraceptive orale i prezena bolilor cu transmitere sexual. Factorii care deasemenea sporesc incidena cancerul de col uterin includ imunosupresia, persistena virusului, i administrarea de hormoni steroizi [8,9]. Proteinele structurale Exist dou proteine, L1 si L2, care formeaz structura icosaedric a virionului. L1 este protein major a capsidei, in timp ce L2 reprezint componena minor. L1 singur poate forma structura icosaedric n celulele eucariocite. Microscopia electronica a demonstrat c L1 formeaz particule aproximativ de mrimea unui virion complet, motiv pentru care sunt numite particule virus-like (VLPs). Proteina L2 poate i ea sa aib expresie la nivelul celulelor unde va forma o structur capsidica similar cu L1. Expresia comun a L1 i L2 determin creterea nivelului de VLPs, sugernd c L2 ajut astfel la stabilizarea capsidei. L2 poate funciona la nivelul virionilor pentru a lega genomul. Importana sistemului VLPs o reprezint faptul ca s-a artat pentru prima dat c exist diferene serologice ntre tipurile de HPV, chiar i ntre acelea foarte aprop iate. De exemplu, proteina L1 a tipurilor virale HPV16 i 31 care mpart 76% din identitate la nivelul aminoacizilor, are reactivitate serologic incruciat foarte sczut, iar tipurile HPV6 si 11 care au 92% omologie, prezint patru diferene n reactivitatea reciproc. Astfel, studiile serologice pentru depistarea infeciilor specifice HPV pot fi deosebite doar prin folosirea VLPs. O consecin a acestei descoperiri este aceea c dac s -ar produce un 218

vaccin, ar trebui incluse mai multe tipuri virale din moment ce un singur tip nu induce protecie incruciat. Infecia HPV la nivelul cervixului normal ADN-ul HPV poate fi depistat in celulele cervicale la femeile la care cervixul apare normal la colposcopie. Incidena depistrii variaz dramatic n funcie de metoda utilizat, de vrst i de grupul demografic studiat. Cea mai sensibil tehnic este PCR care a inregistrat niveluri de pozitivitate de 80% pentru HPV16 la femeile cu cervix normal [4,13]. Este dificil de comparat multe din rezultatele acestor studii la femeile normale pentru c subiecii aveau vrste diferite, metoda de depistare a fost diferit, femeile au avut niveluri socioeconomice diferite, iar definiia clinic a normalului a variat; unele studii s-au bazat numai pe rapoartele citologice, fr sa fie efectuat colposcopia. Incidena cea mai mare a depistrii se ntlneste la femeile tinere. ntr-un studiu efectuat la studentele din Berkeley s-au obinut 33% rezultate pozitive pentru HPV prin tehnica PCR. Rata prevalenei la nivelul cervixului si vulvei a fost de 46%. Este una dintre cele mai mari incidene raportate [4,13]. HPV tipurile 16 i 18 care sunt frecvent ntlnite n bolile maligne, reprezint aproximativ o treime din virusurile detectate, ceea ce nseamn c o mare parte din femeile tinere pot fi infectate cu aceste virusuri care determin cancerul [8]. Este evident c numai un numr mic vor dezvolta boala, dar recunoaterea celor cu risc nu este posibil n prezent. La grupele de vrst mai mari (>35 de ani) rata depistrii scade i, n timp ce la 20 de ani majoritatea femeilor sunt negative pentru boal, femeile peste 35 de ani infectate cu un tip oncogenic sunt mai predispuse la boal. Astfel, la grupa de vrst mai mare, infecia cu HPV este predictiv pentru boal i poate indica un grup la care testarea ADN are valoare diagnostic [2,8]. Este clar ca exist o inciden mai mare a infeciei la grupele de vrst mai tinere, cu valori de pan la 46% la femeile de 20 de ani, dar acestea scad la <10% la cele peste 40 de ani i < 5% la femeile peste 55 de ani [8]. Este posibil c dac toate femeile din grupul de vrst < 25 de ani ar fi testate prin screening ADN la intervale regulate pe o perioad de 5 ani, toate cele active sexual ar fi HPV pozitive la un moment dat, dei infecia i boala ar fi tranzitorii la majoritatea. Dei cervixul este descris ca fiind normal la aceste femei pe criteriul absenei de celule anormale la examenul citologic i pe aspectul normal la colposcopie, este aproape sigur c aria n care are loc replicarea viral este anormal din punct de vedere histopatologic. Pn acum nimeni nu a artat replicare a HPV n esuturile normale. Exist probabil microleziuni prezente la nivelul cervixului cnd o femeie prezint infecie subclinic cu HPV. Studiile serologice au artat rezultate pozitive la grupele de vrst care nu sunt n mod normal asociate cu bolile cu transmitere sexual [5]. Folosind n special proteine bacteriene fuzionate care conin proteine HPV, s-au obinut rezultate pozitive pentru HPV genital la diferite grupe de vrst, inclusiv la copii. Datorit faptului ca proteinele fuzionate nu conin epitopi nu este clar n prezent dac rezultatele reprezint infecii cu diferite tipuri de herpes genital cum ar fi HPV6 sau 16 sau reactivitate incruciat cu tipurile cutanate de HPV, din moment ce multe proteine au niveluri crescute de conservare. HPV si cervixul anormal Cea mai frecvent leziune genital produs de infecia cu HPV este veruca genital benign condyloma acuminatum, determinat predominant de HPV6 i 11. Cu toate acestea, cum s-a discutat nainte, anumite papilomavirusuri determina de asemenea boli premaligne i maligne la nivelul cervixului. Verucile sunt distribuite la nivelul cervixului, pe pereii vaginului, vulv i n regiunea perianal. La brbai leziunile apar pe penis, in regiunea perianal, in special la homosexuali, i mai puin frecvent pe scrot. 219

Leziunile premaligne asociate cu HPV pot s apar pe aceleai zone ca i verucile, dei cervixul reprezint zon n care transformarea malign apare cel mai frecvent. Leziunile premaligne de la nivelul cervixului, neoplazia intraepitelial cervical (CIN), sunt gradate de la I la III n ordinea cresctoare a severitaii cu CIN III care include carcinomul n situ, care precede cancerul invaziv. De la introducerea noului sistem Bethesda, clasificarea s-a schimbat : leziuni scuamoase intraepiteliale (LSI) cu grad sczut ( LSI grad sczut, atipii si CIN I ) i LSI cu grad crescut ( CIN II si CIN III) [11]. HPV6 i 11 i noile izolate 42, 43 i 44 au LSI cu grad sczut, n timp ce tipurile oncogenice HPV 16 i 18 i cele mai puin frecvente HPV 31, 33, 45 i 56 au toate gradele de LSI. Exist un numr de tipuri HPV adiionale, dar genomul ntreg nu a fost clonat. Asa cum s-a menionat, leziunile intraepiteliale de la nivelul cervixului apar in totalitate la nivelul zonei de transformare, care este reprezentat de o arie de epiteliu metaplastic ntre exocervixul matur i epiteliul columnar al canalului endocervical [11]. Cancerul invaziv apare n aceste arii de LSI i celule maligne, apoi migreaz la nivelul stromei uterine i n ganglionii limfatici locali. HPV 16 este cel mai frecvent virus la nivelul LSI i a fost depistat n 70% din cazurile de CIN III n Germania i UK, fiind izolat n 80% din cazurile de cancer invaziv de cervix [11]. n SUA, HPV 16 i 18 reprezint 55% din LSI cu grad nalt i peste 70% din bolile maligne ale cervixului. Studiile epidemiologice au artat c depistarea HPV este asociat cu un risc de 10 ori mai mare al CIN [8,11]. n timp ce HPV6 i 11 nu s-au intlnit n bolile maligne ale cervixului, ele au fost izolate de la nivelul leziunilor locale invadate ale vulvei, cum ar fi carcinomul verucos i tumorile Buschke-Lowenstein . Genomurile de la nivelul acestor leziuni au fost secvenializate, gsinduse deleii i duplicaii n regiunea reglatoare, ceea ce a sugerat c aceste rearanjamente genetice au alterat patogenitatea. Boala maligna a penisului, rar n rile industrializate, este mult mai frecvent n zonele srace ale lumii cum ar fi America de Sud i Africa. Virusurile asociate n mod frecvent cu cancerul cervical, ca HPV16 i 18 sunt depistate n peste 50% din cazurile de cancer penian [8]. Att n cancerul cervical, ct i n cel penian, ADN-ul HPV este integrat n genomul celulei gazd, n timp ce n leziunile premaligne ADN-ul viral este liber i capabil s produc particule virale infecioase. Faptul c cele mai multe cancere invazive (90%) conin secvene integrate, acestea se pare c sunt premaligne [12]. Aceast stare particular se pare c selecteaz celulele pentru conversia maligna, din moment ce numai acele celule cu ADN integrat in E1 i E2 se gsesc la nivelul esutului canceros. Exist dovezi c integrarea n regiunile E1 i E2 ale genomului determin un reglaj al E6 i E7 rezultnd astfel o mai mare stabilitate n codul ARNm pentru aceste proteine cnd se folosete o alt celul dect cea viral. S-a stabilit c integrarea poate avea loc n cteva celule n faza premalign a bolii i este probabil c acestea s capete potenial invadant. Cu toate acestea, exist modificri moleculare care nu sunt nc cunoscute [10]. Transmiterea Se cunoate de la nceputul anilor 1950 c verucile genitale sunt transmise prin contact sexual. Aceste rezultate au fost confirmate de studiile ulterioare, cnd s-a demonstrat c transmiterea sexual a virusurilor determin malignizarea. n plus, studiile efectuate la partenerii femeilor cu CIN (neoplazia intraepitelial cervical) au artat ca ei au inciden crescut a infeciei care determin boli benigne sau premaligne, n funcie de tipul virusului [11]. Astfel, calea sexual de transmitere este bine stabilit la aduli. Transmiterea la nou nscui n timpul naterii vaginale se crede c reprezint cauza papiloamelor laringiene i poate s contribuie la unele din cazurile de infecie genital ntlnite la copiii mai mari. Dei copiii pot s fie bine n ultima parte din prima decad de viaa cnd apar pentru prima dat semnele clinice 220

de infecie HPV, la nivelul laringelui sau zonei genitale, transmiterea la natere reprezint o posibilitate din moment ce se stie ce ADN-ul viral poate persista. Astfel, pentru apariia infeciei este necesar contactul intim i frecvent. Cu toate acestea, se cunoate foarte puin despre ci alternative de transmitere, cum ar fi infecia transmis prin obiecte. Persistena HPV Peste 90% din infeciile cu HPV par a se vindeca pe cont propriu n termen de 2 ani. Timpul necesar pentru curare pare s varieze cu diferite genotipuri HPV, variind de la cinci ase luni pentru genotipurile cu risc sczut i opt la 14 luni pentru genotipurilor cu risc ridicat. Eliminarea virusului de HPV a fost determinat de incapacitatea de prelevare de probe pentru a detecta infecia cu HPV. Nu este clar dac virusul este complet eliminat sau dac aceasta rmne latent n celulele bazale i poate reactiva n condiii imunocompromise [6,7]. Detectarea i genotiparea tulpinilor cu HPV A fost creat o metod rapid, sensibil, de calitate, colorimetric de amplificare izoterm a buclei (LAMP) cu colorant albastru (HNB) de hydroxynaphthol pentru a detecta papilomavirus uman deosebit de riscant (HPV) a genotipurilor 16, 18, 45, 52, i 58 [4]. Toate studiile de validare iniiale cu ADN-ul de control s-au dovedit a fi de tip specific. Testul colorimetric LAMP specifice acestui tip ar putea realiza o sensibilitate de la 10 pn la 100 de exemplare, la 63 C timp de 65 min, comparabil cu cea a PCR n timp real. n scopul de a evalua fiabilitatea HPV de tip specifice, testul LAMP a fost evaluat n continuare cu ADN HPV de la un grup de 294 de specimene clinice ale cror statutul HPV a fost anterior determinat cu o metod nou de dactilografiere cu o singur etap cu PCR multiplex [13]. Astfel, screening-ul de col uterin ar putea fi mbuntit prin testarea pentru ADN al tipurilor cu risc ridicat de HPV ca un instrument de screening primar. Tehnologiile disponibile pentru genotiparea HPV variaz n funcie de metod i platform i poate oferi caracterizri specifice de tip pentru o multitudine de diferite tipuri de HPV cu risc oncogen nalt si sczut. De exemplu, testul Qiagen Hybrid Capture 2 HPV ADN (HC2) i testul Roche Amplicor HPV (Amplicor) detecta ADN a 13 tipuri de HPV cu risc ridicat. Testul de genotipare n linie a HPV permite discriminarea a 37 de genotipuri de HPV. Testul de screening PapilloCheck HPV (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania) este un sistem de detectare i identificare a 24 de genotipuri de HPV pe baza de microaranjare n linie a ADN PCR. Totui, aceste metode nu ar putea fi adecvate n situaii clinice primare n rile n curs de dezvoltare sau pentru utilizare pe teren, din cauza instrumentelor sofisticate necesare, elaborare i procedurile complicate de testare i reactivi scumpi [6]. Prin urmare, exist o cerere tot mai mare pentru teste moleculare simple i economice. Amplificarea izotermic a buclei (LAMP) este o amplificare a acidului nucleic, metod dezvoltat de Notomi i a aprut ca un instrument puternic de amplificare a genei datorit simpliti sale, vitezei, specificitii, i costurilor eficiente [4]. Aceast tehnic este utilizat din ce n ce mai mult pentru rapiditate i detectare vizual i tipizarea de virui n curs de dezvoltare. Una dintre caracteristicile cele mai atractive ale acestui test este c rezultatele LAMP pot fi observate si determinate de colorant mediat HNB i vizualizate cu ochiul liber i fr a deschide tuburile dup amplificare. Concluzii Identificarea precoce a HPV cu risc nalt de dezvoltare a cancerului este important deoarece prezena acestui virus poate servi ca indicator a infeciei i ca marker tumoral. n 221

plus, tehnicile de identificare viral pot servi ca baz pentru stabilirea strategiei terapeutice individuale i dezvoltarea noilor principii terapeutice axate spre eradicarea infeciei HPV. Bibliografie 1. Asato T, Maehama T, Nagai Y, Kanazawa K, Uezato H, Kariya K: A large case-control study of cervical cancer risk associated with human papillomavirus infection in Japan, by nucleotide sequencing-based genotyping. J Infect Dis 2004, 189:1829-32. 2. Baay MF, Quint WG, Koudstaal J, Hollema H, Duk JM, Burger MP, Stolz E, Herbrink P: Comprehensive study of several general and type specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 1996, 34:745-747. 3. Canadian Consensus Guidelines on Human Papillomavirus, Journal of Obstetrics and Gynecology Canada 2007:29 (8, supplement 3):S1-S56. 4. Castle, P. E., et al. 2008. A comparison of two PCR-based human papillomavirus genotyping methods. J. Clin. Microbiol. 46:34373445. 5. Cobo F, Concha A, Ortiz M: Human papillomavirus (HPV) type distribution in females with abnormal cervical cytology. A correlation with histological study. Open Virol J 2009, 3:6066. 6. Dalstein, V., et al. 2009. Analytical evaluation of the PapilloCheck test, a new commercial DNA chip for detection and genotyping of human papillomavirus. J. Virol. Methods 156:7783. 7. Dobec, M., F. Bannwart, F. Kaeppeli, and P. Cassinotti. 2009. Automation of the linear array HPV genotyping test and its application for routine typing of human papillomaviruses in cervical specimens of women without cytological abnormalities in Switzerland. J. Clin. Virol. 45:2327. 8. Dunne, E.F., Unger, E.R., Sternberg, M., McQuillan, G., Swan, D.C., Patel, S.S. & Markowitz, L.E. (2007). Prevalence of HPV infection among females in the Unisted States. JAMA, 297(8):813-819. 9. Faridi et al.: Oncogenic potential of Human Papillomavirus (HPV) and its relation with cervical cancer. Virology Journal 2011 8:269. 10. Gao P, Zheng J: High-risk HPV E5- induced cell fusion a critical initiating event in the early stage of HPV-associated cervical cancer. J Virol 2010, 7:238. 11. Garca-Espinosa et al.: Genotype distribution of human papillomavirus (HPV) in histological sections of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical carcinoma in Madrid, Spain. BMC Cancer 2012 12:533. 12. Herbert J, Coffin J: Reducing patient risk for human papillomavirus infection and cervical cancer. J Am Osteopathic Assoc 2008, 108:65-70. 13. Nishiwaki, M., et al. 2008. Genotyping of human papillomaviruses by a novel one-step typing method with multiplex PCR and clinical applications. J. Clin. Microbiol. 46:1161 1168. 14. Travasso, C., M. Anand, M. Samarth, A. Deshpande, and C. Kumar-Sinha. 2008. Human papillomavirus genotyping by multiplex pyrosequencing in cervical cancer patients from India. J. Biosci. 33:7380. 15. Venuti A, Badaracco G, Sedati A, Carbini R, Marcante ML: Determinants of HPV types 16,18 infections in the lower female genital tract in an Italian population. Eur J Gynaecol Oncol 2004, 15:205-10.

222

ESUTUL ADIPOS - ORGAN MULTIFUNCIONAL Antonina Rotaru, Vasile Turea, Anatol Vinevschi Catedra Diagnostic de Laborator Clinic, USMF Nicolae Testemianu Summary Adipose tissue - a multifunctional organ Central obesity provides a major cardiometabolic risk versus peripheral obesity. Although the reasons which that determine this risk are not fully elucidated, the profiles of gene expressions and the products secreted by visceral adipose tissue prove to be more proatherogenic than those of peripheral adipose tissue. Actually, the adipose tissue is not considered a simple energy storage, but an endocrine and secretory organ, which beyond fatty acids and other lipid products, issues a wide range of signals and protein factors, called adipokines, these factors of adipocitar derivation and non adipocitar derivation include proteins, metabolites and hormones. Rezumat Obezitatea central ofer un risc cardiometabolic major comparativ cu obezitatea periferic. Cu toate c motivele care determin acest risc nu snt nc complet elucidate, profilurile expresiilor genetice i produii secretai de esutul adipos visceral se dovedesc a fi mai proaterogeni ca cei din esutul adipos periferic. esutul adipos de fapt nu este deja demult considerat un simplu depozit energetic, dar un organ endocrin i secretor, care dincolo de acizi grai i ali produi lipidici, elibereaz o ampl gam de semnale i factori proteici, numii adipochine, aceti factori de derivare adipocitar i non adipocitar includ proteine, metabolii i hormoni. Introducere Depozitele adipoase ale mamiferelor sunt compuse din dou citotipuri fundamentale, adipocitele albe i brune; cantitatea lor depinde de specie, gen, vrsta, de condiiile ambientale i nutriionale. Adipocitele albe mature, cu un subtil strat citoplasmatic i nucleu zdrobit la periferie din colectarea central a trigliceridelor, pentru mult timp au fost considerarate doar depozite de molecule cu energie nalta, capabile sa furnizeze ,,combustibil altor celule ale organismului n timpul foamei. Adipocitele brune au nucleu aproape central, mitocondrii mari i rotunde, cu mici picturi de trigliceride dispuse n citoplasm; au un rol divers fa de adipocitele albe, avnd rol n termogenez. n aceste, acizii grai n loc sa fie inclui n circulaie pentru furnizare de energie ctre alte esuturi, sunt ndepartai de pe suprafaa picaturilor lipidice i oxidai de ctre mitocondrii. Comparativ cu alte celule, mitocondriile esutului adipos brun se caracterizeaz prin prezena unei proteine specializate numit proteina I de decuplare care induce termogeneza n esutul adipos brun decuplnd fosforilarea oxidativa; descris n termeni mai simpli, acest mecanism permite eliberarea energiei sub form de caldur n loc de producerea de ATP. E cunoscut faptul c aproximativ ntreg organul adipos al adultului e compus din depozite subcutane i viscerale de esut adipos alb. esutul adipos subcutan include ntreaga suprafa corporal; la femei este n particular este dezvoltat n regiunea gluteo-femural i mamar, la barbai n zona abdominal. O parte semnificativ a esutului adipos (circa 10% din total), e depozitat n jurul fasciilor musculare. O mare parte din depozitele viscerale e constituit din esut adipos mezenteric i omental; depozite minore, cu seminificaie similar a esutului adipos visceral al abdomenului se gsec n regiunea epicardic i mediastin. Mai discutate sunt prezena i rolul esutului adipos brun n organismul omului adult. Exist opinia precum c acesta, comparativ cu organismul nou-nscutului, este absent, i c la adult termogeneza nu este determinat de activitatea muscular sau c este susinut de alte mecanisme. Aceasta convingere a fost dezminit de dovezi cazuale din ce n ce mai frecvente odat cu rspndirea tomografiei cu emisie de pozitroni cu fluorodezoxiglucoza a ariilor 223

hipercaptante ce nu pot fi atribuite esutului patologic dar datorate hiperactivitaii metabolice ale depozitelor de esut adipos brun. S-a observat de asemenea c pretratamentul cu beta-blocante reduce captarea trasorului ( izotopului) metabolic n aceste arii i c odat cu expunerea la frig, la voluntarii sntoi crete rapid sinteza esutului adipos brun; acesta tinde s se adune n regiunea supraclavicular, laterocervical, paravertebral i mediastinal [17]. Cum s-a menionat mai sus o perioad ndelungat de timp esutul adipos a fost considerat un organ cu un rol de activitate minim n ntreaga homeostazie energetic, se afirma c funcia sa n afara de a oferi o izolare termic i mecanic, a fost doar cea de nmagazinare a exesului de energie sub form de trigliceride cu densitatea caloric nalt ca mai apoi s o distribuie innd cont de necesitai sub form de acizi grai liberi. De puin mai mult de un deceniu e n curs o revoluie a modului de a nelege funciile biologice ale esutului adipos. La ora actual este vzut ca un organ dinamic implicat ntr-o gama ampl de procese metabolice i biologice. Aceast perspectiv a fost impus de descoperirea precum c esutul adipos este un organ endocrin. Adipocitele secret, de fapt, o serie de hormoni, factori i semnale proteice, numite adipochine care se asociaz rolului esutului adipos n homeostazia energetic i contribuind la determinarea complicaiilor majore care nsoesc obezitatea [1,7], Fig.1[14]

Fig.1. Efectele clinice i metabolice ale activitatii adipocitelor. Caracteristici celulare ale esutului adipos. Volumul esutului adipos este dominat de multiple procese ce regleaz volumul i numrul adipocitelor. esutul adipos alb conine, n afar de adipocite mature pline de acizi grai, un amplu pool de celule mezenchimale multipotente i de preadipocite, gata de maturare sub influena celui mai apropriat stimul. Bilanul energetic pozitiv determin o cretere a greutaii corporale, inial din cauza hiperplaziei adipocitelor mature prezente n esutul adipos; odata ce aceste celule ajung un volum critic, cu mecanisme nc neidentificate, este stimulat diferenierea precursorilor adipocitelor mature. Volumul pare s aib un rol cheie n funcionarea celular: astfel adipocitele hipertrofiate care se elibereaz mai frecvent n adipozitatea visceral au o expresie genic divers, sunt mai puin sensibile la efectele metabolice ale insulinei i au o activitate lipolitic nalt comparativ cu celule mai mici. n afar de adipocitele mature i ale precursorilor lor, esutul adipos conine celule endoteliale, celule nervoase i celule imune; acestea din urma i asum un interes particular de cnd a fost atribuit activrii inflamaiei un rol nonsecundar n dezvoltarea dereglrilor corelate cu obezitatea. Deja n 1993 a fost semnalat producerea factorului de necroz tumoral (TNF-) de ctre esutul adipos alb [2]. Mai recent a fost demonstrat c obezitatea se asociaz cu acumularea de macrofage n 224

esutul adipos i c acestea particip la secreia de citochine proinflamatoare, contribuind la statutul de insulinorezisten proprie a obezitii [3]. Adipochinele: un numeros grup de proteine cu diverse funcii Numrul total de adipochine, multe documentate, altele nc presupuse, depaesc cifra de 50. Enzima lipoproteinlipaza cu rol n hidroliza trigliceridelor circulante cu acizii grai liberi, a fost prima identificat. n anii 80 a fost identificat adipsina luat-n considerare, iniial ca molecula cu rol n reglarea cantitii esutului adipos n organism; ulterior, relevarea analogilor structurali ai adipsinei cu sistemul complementului D9 a permis ipotizarea acelor relaii dintre esutul adipos, sistemul imun i inflamaie recunoscute totalmente la ora actual. n 1994 descoperirea leptinei, un hormon similar cu citochinele, cu o gama ampla de funcii biologice, a oferit adipocitelor statutul de celule endocrine. Adipochinele snt foarte diverse ntre ele, fie dup structura proteic, fie dup funcie. Ele includ citochinele clasice, factori de cretere i factori angiogenici, proteinele fazei acute i a rspunsului la stres, proteinele cii alternative a sistemului complementului, proteinele hemostazei, a coagulrii i a tonusului vascular. Multe adipochine intervin n bilanul energetic, n metabolismul lipidic i cel glucidic [4]. Aceast gam ampl de factori i sistemele proteice ne las s nelegem complexitatea esutului adipos ca organ nalt integrat n fiziologia i metabolismul mamiferelor, capabil s stabileasc ci de comunicare cu alte esuturi i organe, nu n ultimul rnd cu sistemul nervos central, ficatul, musculatura scheletal i cortexul suprarenal. Leptina Identificarea genei leptinei i a receptorului su a pus nceputul erei endocrine a esutului adipos. oriceii cu mutaia genei pentru leptin (ob/ob) sau pentru receptorul su (db/db) au demonstrat o obezitate masiv [5,6]. La fel ca i la animale, la om deficitul congenital de leptin determin o obezitate grav cu o termogenez alterat i insulino-rezisten sensibil la tratamentul cu leptin recombinat [7]. n afar de intervenia n coordonarea masei corporale, leptina regleaz pubertatea i reproducerea, funciile placentare i fetale, raspunsul imun i sensibilitatea la insulina muscular i hepatic [8]. La pacienii cu lipoatrofie, lipsa esutului adipos determin o hipoleptinemie, care se asociaz cu o grav insulinorezisten, steatoz hepatic i dislipidemie. La aceiai pacieni tratamentul cu leptin determin o mbuntire net a metabolismului glucidic, a dislipidemiei i a hepatosteatozei. Pe de alt parte, aceeai hiperleptinemie caracteristic majoritii obezilor, pare a avea un rol proaterogen contibuind la insulinorezisten, alternd funcia endotelial, favoriznd agregarea trombocitelor i tromboza arterial [9]. Adiponectina Adiponectina este produs de adipocitele mature i este secretat n torentul sanguin, unde e dozabil n concentraii de 2-20mg/l. Structural aparine suprafamiliei colagenelor i se prezint n 3 forme oligomerice majore: un trimer cu greutate molecular mic, un hexamer cu greutate molecular medie i un 12-18mer cu mas molecular mare. Au fost identificai 2 receptori pentru adiponectin: unul (Adipo R1) se afl n muchi, altul (Adipo R2) este expresat prevalent n ficat; cu toate c efectele biologice ale adiponectinei nu depind doar de concentraia sa n circuit, dar i de activitatea i expresia receptorilor tisulari specifici. Cum deja s-a menionat, adiponectina este expresat abundent n adipocit, dar comparativ cu alte adipochine, nivelurile sale plasmatice sunt reduse n adipozitate abdominal; e probabil c esutul adipos visceral produce un efect inhibitor sintezei de adiponectin, pe care unii autori l identific n TNF-. n afar de obezitate, nivele plasmatice reduse de adiponectin se nregistreaz la brbai, la femeile n postmenopauz, n HTA, n hipertrigliceridemie, n DZ II i n cardiopatia ischemic. Adiponectina mbuntaete sensibilitatea la insulin n esutul adipos, n muchi, n ficat favorizeaz oxidarea lipidelor; mbuntete vasodilataia endotelio-dependent, reduce 225

expresia proteinelor de adeziune, contrasteaz efectele negative ale TNF- i a lipoproteinelor oxidate cu densitate joas asupra funciei endoteliale, inhib diferenierea monocitelor i formarea celulelor spumoase, inhib activitatea metaloproteinelor din matrice, are la fel aciune antitrombotic reducnd agregarea trombocitelor i formarea trombusului. Cu toate c o mare parte din aceste efecte sunt bazate pe studii in vitro sau pe animale, adiponectina demonstreaz c posed proprieti importante antiaterogene, antidiabetice i antiinflamatorii chiar i la om. Subiecii cu nivele plasmatice de adiponectin crescute au un risc semnificativ redus de accidente cardiovasculare severe, chiar i dup ajustarea pentru colesterolul legat cu lipoproteine cu densitate joas i nalt, mas corporal, diabet zaharat i HTA. [10,11]. Conform datelor prezentate de unii autori, hipoadiponectinemia ce caracterizeaz subiecii cu obezitate abdominal i sindrom metabolic ar fi elementul cheie pentru justificarea riscului cardiometabolic n aceast situaie. Visfatina Visfatina, identic cu pre-B cell colony-enhancing factor produs de maduva osoas, ficat i muchi, s-a adugat recent n lista factorilor de derivaie adipocitar [12]. Pare a fi specific depozitelor adipoase abdominale, dar concentraia sa plasmatic coreleaz cu gradul de obezitate abdominal. Visfatina are efecte similare cu cele ale insulinei; pare s acioneze receptorul insulinei legindu-l ntr-un punct diferit celui de insulin. Pentru c nivelurile visfatinei circulante sunt semnificativ minore afinitaii sale pentru receptorul insulinei, este probabil c visfatina poate aciona mai curnd pe cale paracrin sau autocrin, dect pe cale endocrin. Expresia genei pentru visfatin este modulat de inflamaie i sepsis, aceast adipochin inhib deasemenea apoptoza neutrofilelor, ceea ce implic aciuni diferite efectului insulinomimetic. Proteina transportatoare de retinol (RB4). RB4 este o protein specific pentru trasnportul i circulaia retinolului (vit.A) i nregistreaz nivele crescute la diverse tipuri de obezitate animalier i insulinorezisten. Recent s-a demonstrat c RB4 reprezint un semnal adipocitar ce poate contribui la patogeneza DZ II al obezului; cretera concentraiei sale plasmatice pare c induc, de fapt, expresia hepatic a enzimelor neoglucogenetice i contribuie la insulino-rezisten n muchii scheletici [13]. Observrile ce ar confirma raporturile sale definitive n obezitate sunt nc controversate. Angiotensinogenul/Angiotensina II esutul adipos este un important sediu de producere a angiotensinogenului i angiotensinei II. Nivelurile cele mai nalte de ARNm pentru angiotensinogen sunt relevabile n esutul adipos la subiecii obezi comparativ cu cele ale subiecilor normoponderali i la fel s-a constat o corelaie pozitiv ntre nivele plasmatice de angiotensinogen i gradul de adipozitate[14]. Deci, s-a demonstrat c creterea sintezei angiotensinogenului i angiotensinei II poate contribui la apariia hipertensiunii care foarte frecvent se asociaz cu obezitatea. De asemenea, angiotensina II pare s exercite efecte proinflamatorii n adipocit, s stimuleze stresul oxidativ; aceste efecte sunt inhibate de blocarea receptorului I al angiotensinei. Relevrile clinice ale acestor observaii nu sunt ntru totul elucidate. Totui, efectele proinflamatorii ne ajut s nelegem c declinul produciei de angiotensina II, cauzat de tratamentul cu inhibitori enzimei de conversie a angiotenzinei sau blocarea receptorului AT1, determin reducerea tonusului inflamator care se observ n practica medical. 11-hidroxisteroid-dehidrogenaza 11-HSD este o enzim ce amplific aciunea local a glucocorticoizilor facilitnd conversia cortizolului inactiv n cortizol. Enzima este bine exprimat n esutul adipos uman, cu activitate major n esutul omental comparativ cu cel subcutan [15]. Hiperactivitatea a 11HSD care se nregistraz n obezitatea uman, se asociaz cu expansiunea esutul adipos visceral datorit hipertrofiei adipocitare. Acesta ar putea fi unul din mecanismele de recrutare a noilor adipocite; aceast enzima, de fapt, stimuleaz diferenierea adipocitelor prin activitatea paracrin a cortizolului. Nivelurile crescute de 11-HSD determin o augmentare a concentraiei locale de 226

cortizol, care stimuleaz lipaza lipoproteic i lipaza hormono-sensibil a esutului adipos cu eliberarea de acizi grai liberi contribuind separat la profilul metabolic alterat i la insulinorezisten . Factorii protrombotici Inhibitorul activatorului plasminogenului (PAI-1) inhib producia de plasmin i mpiedic unele procese mediate de ea ca: fibrinoliza i degradarea matricei extracelulare; nivelurile crescute de PAI-I sunt considerate ca un factor de risc trombotic. Dei PAI-I este sintetizat de diverse subtipuri celulare, la obezi esutul adipos este sursa major de PAI-I i nivelurile circulante de PAI-I coreleaz cu gradul obezitii abdominale[16]. La rndul su PAII pare a avea rol n dezvoltarea esutului adipos; animalul de laboator cu defict de PAI-I are o pierdere energetic crescut, este rezistent la obezitatea indus de excesul caloric, demonstreaz prezena adipocitelor mai mici, niveluri tisulare joase de trigliceride i o sensibilitate mai bun comparativ cu animalul de control. Mediatorii inflamaiei i factorii fazei acute O ntorstur esenial n ntelegerea rolului adipocitii viscerale a fost determinat de constatarea c esutul adipos visceral este sediul patogenetic a multor tulburri corelate cu obezitatea i c excesul de adipozitate visceral se asociaz cu un statut inflamator de grad nalt. n 1993, Hotamisligil s.a. au demonstrat o expresie crescut a TNF n esutul adipos al animalului obez genetic. Ideea c un factor produs de esutul adipos ar fi implicat n geneza insulino-rezistenei, n acea perioad era revoluionar. De atunci au fost individualizai muli ali factori secretai de esutul adipos ca interleuchine (IL-1,IL-6,IL-8,IL-10), interferon , factori de cretere ca transforming growth factor i factorul de cretere endotelial vascular proteine chemiotactice (factor chemiotactic pentru monocite-1) i factori ai cascadei complementului. Nivelurile circulante ale acestor factori cresc odat cu masa adipoas, n special cea abdominal. Muli din aceti factori ai inflamaiei snt produi, n afar de adipocite, de macrofagii activai rezideni n esutul adipos; prezena acestor celule inflamatorii este foarte probabil determinat de recrutarea monocitelor circulante sub influena factorilor chemotactici produi de adipocite transformate n hipertrofice de excesul caloric i prin urmare suferinde. Infiltraia monocitar a esutului adipos amplific procesul inflamator. Diferena dintre esutul adipos visceral i subcutan. Din cele relatate se conclude c obezitatea central sau visceral, cu depozite de grsimi pe abdomen i trunchi, confer un risc cardiovascular net majorat comparativ cu obezitatea periferic. Obezitatea visceral exprimat de un raport crescut ntre circumferina abdomenului i circumferina oldurilor, este una din determinantele majore de risc cardiovascular i e independent de ali factori de risc majori. Bazele diversului risc cardiovascular indus de obezitate visceral pare a merge dincolo de aa zisa ,,ipotez portal, care identific n fluxul portal mare de acizi grai liberi, proprietate a adipozitii abdominale, cauza insulino- rezistenei i a alterrilor metabolice responsabile de daunele vasculare. Modelul de expresie genetic divers ntre esutul subcutan periferic i visceral par a fi de fapt consecvente cu o major influen proaterogen al celui din urm. Conform culturilor de esut adipos subcutan, mostrele de grsime visceral produc mai multe interleuchine proinflamatoare (IL-6, IL-8), angiotensinogen, PAI-1 ,TNF i factori de cretere, n special factorul de cretere endotelial vascular, muli din aceti factori snt produi de fracia stromovascular a esutului adipos i de macrofagi care infiltreaz esutul adipos al obezilor n numr net majorat comparativ cu subiecii normoponderali. n afara determinrii unui mediu proinflamator, produsele adipocitelor viscerale, diferit de cele subcutane, au acces direct n ficat, determinnd astfel consecinele negative datorate excesului de grsime visceral. 227

Concluzii n esutul adipos au fost individualizai i caracterizai un numr mare de produi; muli dintre acetia snt determinani pentru ntelegerea raporturilor existente ntre obezitatea central, patologia cardiovascular, dislipidemia, diabetul zaharat tip 2 i inflamaia sistemic. La fel s-a definit rolul fundamental al esutului adipos n producerea semnalelor complexe care regleaz raporturile ntre organele care sunt incluse n homeostazia energetic, sensibilitatea la insulin, metabolismul lipidic i sistemul imun. Alterarea expresiei i secreiei de adipochine care se verific n obezitate, n special cea abdominal, determin importante dereglri circulatorii i metabolice; urmeaz s determinm care dintre multitudinea de produi i efectele lor, sunt fiziologic mai importante i care se pot modula farmacologic. Bibliografie 1. Ana -Maria Fusaru, USMF Craiova, Studiu histologic al dezvotrii fetale a organului adipos i al rolului su n patogenia inflamaiei din obezitate ,Tez de doctorat, pag.8-10. 2. Anisie Nslean, Camelia Gliga. Corelaia dintre leptin i obezotate n perioada menopauzei. Rev Romana Med Lab. 2008;10(1):39-46 3. Bergmann and Sypniewska: Diabetes as a complication of adipose tissue dysfunction. Clin Chem Lab Med 2013; 51(1): 177185. 4. Cinti S. The adipose organ. Milano: Kurtis, 1999. 5. Claudia Gherman, Aurel Mironiuc, Laura Palcau, Anca Cristea, Adriana Muresan, Adriana Filip, et al. Adipocytokines and their relationship with symptomatic atherosclerotic peripheral arterial disease. Rev Romana Med Lab. 2010;18(1):23-32 6. Corina Bua, Carmen Vulpoi, Didona Ungureanu, Voichia Mogo, Dumitru D. Brniteanu. Masa slab i leptina, ns nu i masa de esut adipos, sunt factori predictivi independeni ai masei osoase la femeile aflate n perioada postmenopauzal. Rev Romana Med Lab. 2012;20(3):215-223. 7. Ferder l, Inserra F, Martinez-Maldonado M. Inflammationand the metabolic syndrome: role of angiotensin II and oxidative stress. Curr Hypertens Rep 2006; 8: 191-8. 8. G Bittolo Bon - Il tessuto adiposo come organo multifunzionale. G Ital Cardiol Vol 9 Suppl 1-4 2008. 9. Gligor I.Ramona . Biomolecule adipocitare legtura ntre diabet zaharat, obezitate i boli cardiovasculare.Tez de doctorat.pag.10. 10. http://diabetta.wordpress.com/2009/08/04/tesutul-adipos-ca-organ-secretor%E2%80%93-rolul-adipokinelor/ 11. http://www.cardiab.com/content/7/1/30/figure/F2?highres=y 12. http://www.nutritie-cluj.ro/tesutul-adipos-organ-endocrin/ 13. Jernas M, Palming J, Sjoholm K, et al. Separation of humanadipocytes by size: hypertrophic fat cells display distinctgene expression. FASEB J 2006; 20: 1540-2. 14. Journal Viaa Medical, Nr.20, (12.10.2011); http://www.viatamedicala.ro/*articleID_6931-dArt.html 15. Margetic S, Gazzola C, Pegg GG, Hill RA. Leptin: a reviewof its peripheral actions and interactions. Jnt J Obes Relat Metab Disord 2002; 26: 1407-33. 16. Nedergaard J, Bengtsson T, Cannon B. Unexpected evidencefor active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007; 293: 444-52. 17. Oh DK, Ciaraldi T, Hnry RR. Adiponectin in health and disease. Diabetes Obes Metab 2007; 9: 282-9.

228

IMPORTANA DIAGNOSTIC A GLUTATION-S-TRANSFERAZEI CLASA Pi (GSTP1) N CANCERUL DE PROSTAT Olga Melnic , Iacob Locoman, Anatol Vinevschi Catedra Diagnostic de Laborator clinic ,USMF Nicolae Testemianu Summary The importance of the Glutathione-S-transferase Pi class (GSTP1) in prostate cancer diagnosis Prostate cancer represents one of the most frequent localizations of the cancer in male patients over 50 years old. The most important risk factors are age, family history and race. Glutathione S-transferase (GST) enzymes may prevent carcinogenesis through inactivation of the organic compounds electrophiles by conjugation to reduced glutathione. Recently, it was reported that most prostate cancers fail to express GST-pi despite an abundant presence in benign prostate tissue, suggesting a common genetic alteration. Rezumat Cancerul prostatei reprezint una dintre cele mai frecvente localizri ale cancerului la brbaii de vrsta mai mare de 50 de ani. Cei mai importani factori de risc fiind vrsta, istoricul familial i factorul rasial. Glutation S-transferaza (GST ) poate mpiedica carcinogeneza prin inactivarea compuilor organici electrofili prin conjugare cu glutation redus. Recent, s-a raportat c cele mai multe forme de cancer de prostat nu reuesc s-i exprime GSTP1 n ciuda prezenei abundente n esuturile benigne de prostat, sugernd o modificare genetica comun. Actualitatea Cancerul de prostat (CP) este n prezent una din principalele probleme de sntate ale brbailor. Conform datelor furnizate de Centrul de Statistic i de Cancer Registru a Institutului Oncologic din Republica Moldova (IOM) pentru anii 2000-2009 numrul de cancere de prostat, diagnosticate n Republica Moldova ,,de novo atest o continu cretere, de la 85 cazuri n anul 2000 pn la 249 n anul 2009. Respectiv la capitolul mortalitate se determin o cretere n rndul populaiei masculine prin aceast boal de la 4,1 n 2000, pn la 8,1 n anul 2009. Acelai tablou cu indicii ce sunt ntr-o continu cretere este propriu i pentru alte ri. Cancerul de prostat constituie 11% din cancerele sexului masculin n Europa i este responsabil de 9% din decesele prin cancer ale brbailor din Uniunea European. n SUA este cel mai frecvent tip de cancer la brbai, estimndu-se ca mai mult de 218. 000 de brbai diagnosticai cu cancer de prostat n 2007, i aproximativ 27. 050 de brbai decedai din aceast cauz n acelai an. [27] Mecanismele epigenetice pot fi principala for motrice pentru schimbrile semnificative n expresia genelor care sunt responsabile de progresia cancerului de prostat. Cele trei mecanisme mai larg caracteristice pentru reglarea epigenetic a genelor snt: schimbarea modelelor de metilare a ADN-ului; acetilarea / deacetilarea histonelor i alterri n buclele feedback-ului de reglementare pentru factorii de cretere.[43] Glutation S-transferazele (GST) reprezint un grup important de enzime de detoxifiere. Toate speciile eucariote posed multiple izoenzime GST citozolice i legate de membran, fiecare afieaz proprieti catalitice precum i de legare necatalitice distincte: enzimele citozolice sunt codificate de cel puin cinci familii de gene (desemnate clasa alfa, mu, pi, sigma i teta), n timp ce enzimele legate de membran (GST microzomale i leucotrien-C4 sintetaza) sunt codificate de gene unice. Dovezile sugereaz c nivelul de exprimare a GST este un factor esenial n determinarea sensibilitii celulelor la un spectru larg de substane chimice toxice. Muli inductori, dar nu toi, au efectul de activare a transcripiei genelor GST fie prin elementul antioxidant-receptiv, elementul xenobiotic-receptiv, GST P1 amplificator (GPE), sau elementul glucocorticoid-receptiv (GRE ). 229

n celule inducia GST de ctre speciile reactive de oxigen ar prea s reprezinte un rspuns adaptativ ca aceste enzime s detoxifice unele toxice carbonil-, peroxid-, i metaboliii epoxid care se conin n celule ca produse de stres oxidativ. Majoritatea tumorilor umane i linii celulare tumorale umane exprim cantiti semnificative de GST clasa pi [18]. Glutation-S-transferaza clasa Pi (GSTP1), situat pe cromozomul 11q13 codific enzime metabolice a fazei II, care detoxific produii intermediari sau radicalii liberi. GSTP1 joac un rol important n protejarea celulelor de ageni citotoxici i cancerigeni i se exprim n esuturile normale n diferite tipuri de celule. Modificarea activitii i exprimrii GSTP1 au fost raportate n mai multe tumori i acest lucru se datoreaz n mare parte hipermetilrii ADN -ul din regiunea CpG n promotor-5' a GSTP1. Cartografierea precis a modelelor de metilare ADN-ului n insulele CpG a devenit esenial pentru nelegerea diverselor procese biologice, cum ar fi reglarea genelor imprimate, inactivarea cromozomului X i inactivarea genelor supresoare de cancer uman. [26] Progresele n caracterizarea epigenetic a cancerelor a permis dezvoltarea testelor de metilare a ADN care vor putea fi utilizate n curnd ca teste serologice i tisulare de cancer. Inhibarea metilrii promotoarelor aberante ar putea preveni teoretic carcinogeneza. Speciile reactive de oxigen, care sunt generate n procesele fiziologice, cum ar fi respiraia celular, expunerea la ageni chimici, sau expunerea la radiaii ionizante pot depi aprarea celular antioxidant i provoca leziuni ale ADN-ului. [5] Astfel de afeciuni pot duce la mutaii i modificarea oncogenelor sau genelor supresoare tumorale. Izoenzima citozolic glutation Stransferaza pi (GSTP1) este o enzim detoxifiant important din familia enzimelor glutation S transferaze (GST), care inactiveaz cancerigenele prin conjugarea cu glutationul.[29] Secvena reglatoare din apropierea genei GST este frecvent afectat de hipermetilare n etapele timpurii ale carcinogenezei.[35,6,30,21] Comparativ cu esutul benign, n cancerul de sn, de colon, de stomac, de pancreas, pulmonar, a capului i gtului, de ovar, i de col uterin, precum i sarcomul esuturilor moi, carcinomul embrionar testicular , meningiom i gliom, este crescut expresia GST clasa Pi.[39,42,7,31,16,25,4,45,1] Cu toate acestea, hipermetilarea promotorului GSTP1 a fost asociat cu inhibiia genei n cancerul de prostat i a cancerului de rinichi.[36,6,30,13] Recent, un studiu a artat o tendin de cretere a frecvenei de metilare a GSTP1 cu creterea gradului de tumori mamare piloide. Autorii au raportat c hipermetilarea promotorului a fost asociat cu pierderea exprimrii GSTP1. Aceste rezultate sugereaz c tumorile piloide segreg n doar dou grupe, pe baza profilurilor metilare: grupa benign i grupa combinat:grani / malign.[26] Ali cercettori au studiat rolul hipermetilrii genei GSTP1 n carcinomul endometrial i s-a constatat c reducerea exprimarii GSTP1 a fost asociat cu potenialul de invazie miometrial.[10] Modificri epigenetice: markeri moleculari n curs de dezvoltare pentru detectarea cancerului. Cancerul este un proces alimentat att de modificri genetice ct i de mecanisme epigenetice.La mecanismele epigenetice se refer schimbrile n expresia genelor, care pot fi motenite mitotic, dar nu sunt asociate cu schimbri n secvena de codificare a genelor afectate. Cu alte cuvinte, la mecanismele epigenetice se refer motenirea de informaii pe baza nivelului de expresie genic, n contrast cu genetica care se refer la transmiterea de informaii pe baza secvenei genei. Metilarea ADN-ului, cel mai bun mecanism neles n epigenetic, este o modificare chimic enzimo-mediat care adaug grupuri metil (-CH3) pe locuri selecte din ADN. La om i majoritatea mamiferelor, metilarea ADN afecteaz numai bazele citozinice (C), atunci cnd aceastea snt urmate de guanozine (G). Metilarea reziduului nucleotidelor citozina situate n dinucleotida 5'-CPG-3 este cea mai frecvent modificare epigenetic la om. Aceste dinucleotide CpG nu sunt distribuite n mod aleatoriu n genom. ntr-adevr, exist regiuni CpG bogate numite "insule CpG" asociate frecvent cu 5 'regiuni regulatoare de gene, inclusiv 230

promotor. Metilarea ADN-ului n regiunile promotor este un mecanism puternic pentru suprimarea activitii genei.[26] Analiza de metilare a ADN-ului, metode disponibile n prezent. Metilarea insulei CpG prezint interes din motive diagnostice i prognostice. Metilarea unei sau ambelor alele ale unei regiuni poate servi ca un biomarker de cancer sau de inhibiie a expresiei genelor atunci cnd acestea sunt ntr-o regiune promotor. Testele pentru metilare sunt atrgtoare pentru cercetarea translaional, deoarece acestea pot utiliza tehnici de amplificare, cum ar fi metilare-PCR specific, i s utilizeze astfel cantiti mici de probe. Datorit simplitii sale relative, de siguran i sensibilitate, metilare-PCR specific este metoda cea mai frecvent utilizat pentru analiza de metilare.[23] Metilare-PCR specific (CMSP) -test convenional utilizeaz dou seturi de primeri speciali concepui pentru a amplifica secvena metilat sau nemetilat, iar produsele PCR sunt conduse ntr-un gel.[23] Rezultatele CMSP la o anumit regiune de ADN sunt pur i simplu raportate ca metilat sau nemetilat, nu permite cuantificarea sau identificarea metilarii pariale. Testul CMSP este folosit n principal pentru detectarea GSTP1 metilat n fluide. De exemplu:GSTP1 metilat n ser la brbaii cu cancer de prostat localizat, nainte de tratament implic un risc 4,4 ori mai mare de reapariie biochimic dup o intervenie chirurgical.[3] Utilizarea metilrii-PCR specific cantitative fluorescent-bazate (QMSP) a mbuntit sensibilitatea detectrii tumorii. Monitorizarea continu a semnalelor fluorescente n timpul procesului PCR a permis cuantificarea alelelor metilate a unei singure regiuni, din ADN nemetilat, deoarece emisia de fluorescen reporter reprezint numrul de fragmente ADN generate.[19] GSTP1 hipermetilat: semnificaia i incidena legat de cancerul de prostat. Inhibarea exprimrii genei GSTP1 este recunoscut ca fiind un semn distinctiv molecular a cancerului de prostat. Metilarea insulei CpG n promotorul clasei pi de glutation S-transferaza apare n neoplazia intraepitelial de prostat (PIN) i a cancerului.[15] Alte regiuni hipermetilate relevante pentru cancer de prostat includ receptorii beta-2 ai acidului retinoic.[3] Aceste constatri n cancerul de prostat sugereaz c metilarea ADN-ului anticipeaz tumorigeneza, dar rmne de vzut dac metilarea ADN-ului este un eveniment necesar sau permisiv n tumorigenez. Metilarea extins de nucleotide deoxicitidin distribuite n regiunea 5 a insulei CpG nu este detectat n epiteliul benign al prostatei, dar a fost detectat n neoplazie intraepitelial, adenocarcinom de prostat, n fluide (plasma, ser, ejaculat i urin) de la pacienii cu cancer de prostat cu metilare-PCR specific i poate fi util ca un biomarker molecular de cancer.[36,7,21,12,41,24,8] Metilarea-PCR specific cantitativ (QMSP) arat c pierderea de exprimare a genei GSTP1 este, de fapt, cea mai ordinar alterare genetic n cancerul de prostat (> 90%) i n neoplazia intraepitelial de prostat (PIN) (70 %) [36,6,7,17,21] i aceast inactivare somatic a GSTP1 este direct asociat cu metilarea de promotor.[7,22,21] Niveluri mai ridicate de GSTP1 cu promotor metilat este asociat cu trecerea de la neoplazie intraepitelial de prostat (PIN) la carcinom.[22] n timpul dezvoltrii cancerului, GSTP1 nu pare s funcioneze ca o oncogen sau ca o gen supresoare tumoral, deoarece inducerea exprimrii GSTP1 n linii celulare de cancer de prostat nu suprim creterea celulei. n schimb, GSTP1 a fost propus pentru a aciona ca o gen "ngrijitoare". Cnd GSTP1 este inactivat, celule de prostat par s devin mai vulnerabile la modificrile somatice la expunerea dauntoare cronic a genomului la oxidani i electrolii, la care contribuie mediul i stilul de via.[34,7] Semnificaia GSTP1 inactive n PIN-ul de grad nalt i carcinom este neclar. Acesta poate fi un epifenomen, reflectnd simpla ntrerupere a stratului celular bazal cu progresie neoplazic.C u toate acestea, Lee i colab. consider probabilitatea unui rol mai fundamental.[36] Dou studii au descoperit c un procent mic (3,5-5%) din cazuri, rein o modest GSTP1 expresie n carcinom. 231

[11,38] Cookson i colaboratorii au obinut pozitivitate, de asemenea, n 1 din 17 cazuri de PIN-ul de grad nalt.[10]Spre deosebire de modificrile genetice permanente i definitive a modificrii secvenei ADN-ului, a metilrii promotorului este o modificare potenial reversibil. Prin urmare, metilarea promotorului poate fi supus la intervenia terapeutic care vizeaz reactivarea genei de cancer inhibate. Acest lucru are implicaii importante pentru chemoprevenie, deoarece, dup cum s-a menionat mai sus, pn la 70% din PIN cu grad nalt, arat metilarea promotorului GSTP1.[6,7,30] Recent, unii cercettori au investigat efectele polifenolilor din ceaiul verde (GTPs) pe re-expresia GSTP1. Ei au demonstrat c demetilarea promotorului de ctre polifenolii din ceaiul verde duce la re-expresia GSTP1 din celulele cancerului de prostat, prin urmare,polifenolii din ceaiul verde se fac candidai exceleni pentru chemoprevenia de cancer de prostat.[40] Unii savani au evaluat impactul terapiei de privare de androgeni pentru detectarea GSTP1 hipermetilat n cancerul de prostat.[35] La 87% (13/15) din pacieni, nu a existat nici o modificare n detectarea GSTP1 hipermetilate [35] i autorii au sugerat c schimbarea de la GSTP1 hipermetilat pozitiv la negativ, la doi pacieni pot indica dependen parial de androgeni. [35] n plus fa de presupusa interaciune hormonal, ar putea specula alte explicaii posibile pentru a explica de ce cancerul de prostat pierde GSTP1 hipermetilat dup o prelungit terapie hormonal neoadjuvant. n primul rnd, lipsa de GSTP1 hipermetilat poate fi atribuit unor probleme tehnice -rezultate fals negative. n plus, ar putea fi crescut posibilitatea c n ambele tumori primordial a lipsit GSTP1 hipermetilat. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua frecvena i gradul de interaciune hormonal cu GSTP1 hipermetilat. Efecte anti-cancer de GSTP1 i perspectivele de viitor. Nivelurile crescute de GSTP1 pot proteja celulele canceroase umane mpotriva preparatelor citotoxice, medicamente antineoplazice, agenii alchilani electroliii deosebit de reactivi, formele conjugate cu glutation spontan i n reaciile catalizate.[2] Expresia anumitor subclase de GST protejeaz celulele de citotoxicitatea acestor medicamente cancerigene i excesul GST a fost implicate n rezistena la medicamentele antineoplazice.[37] Inducia enzimatic este ca un rspuns adaptativ la stres i poate fi declanat de agenii chimici exogeni i de asemenea, de metaboliii reactivi de oxigen.[18] Enzimele GST au o specificitate de substrat larg, care includ substane cu proprieti mutagene cunoscute. Creterea n ser a GSTP1 a fost exploatat ca un marker tumoral n ser pentru cancerul gastrointestinal [39] i limfom non Hodgkin [32] ca o metod de a prezice sensibilitatea la chimioterapie. Inactivarea GSTP1 n cancerul de prostat apare timpuriu n carcinogenez, lasnd celulele prostatice cu aprare inadecvat mpotriva oxidanilor i electrofililor cancerigeni. Mecanismele epigenetice sunt puternic implicate n progresia cancerului.[43] Spre deosebire de modificrile genetice, modificrile metilrii ADN-ului sunt potenial reversibile. Astfel, interveniile terapeutice care implic inversarea procesului de metilare a mai multor gene-cheie n carcinogeneza de prostat ar putea mbunti opiunile terapeutice actuale, sporind astfel efectul anti-cancer a genelor GSTP1 la pacienii cu risc sporit, cu PIN-ul de grad nalt sau la brbaii cu cancer de prostat stabilit. Inhibitorii nucleozidelor analogice ale metiltrasferazelor ADN, cum ar fi 5-aza-2'-deoxicitidin, sunt capabili s demetileze ADN-ul i restabili expresia genelor inhibate. Din pcate, utilitatea clinic a acestor compui nu a fost nc pe deplin realizat, n principal din cauza efectelor secundare ale acestora. Procainamida,un medicament anti-aritmic, un inhibitor non-nucleosidic al ADN metil-transferazelor (categorie de enzime care catalizeaz metilare ADN-ului n timpul replicrii celulelor), inverseaz ADN-ul GSTP1 hipermetilate i restabilete exprimarea GSTP1 n LNCaP celulelor cancerului de prostat propagat in vitro sau in vivo ca tumori xenograft n oareci atimici.[7] Utilizarea MCF-7, linie de celule din cancerul mamar, au constatat c procaina a produs o reducere cu 40% a coninutului de 5-metilcitozinei din ADN determinat prin electroforez capilar de nalt performan i 232

digestia enzimatic total a ADN. Procaina poate demetil, de asemenea, insulele CpG dens hipermetilate, cum ar fi cele situate n regiunea promotor al beta -2 gena RAR, restabilind expresia genelor inhibate. Aceast proprietate poate fi explicat prin legarea procainei la CpG ADN-ului mbogit. n cele din urm, procaina are, de asemenea, efecte de inhibare a creterii, n aceste celule canceroase provocnd inhibiia mitotic.[26] Astfel, procaina i procainamida sunt ageni promitori pentru terapia viitoare a cancerului,bazat pe epigenetic. Lee i colaboratorii au raportat c GSTP1 a fost stimulat n compartimentul stromal de cancer de prostat hormono-independent, care pot contribui la chemorezistena de cancer avansat de prostat.[37] Dovezile epidemiologice au artat un risc redus de cancer de prostat la brbaii seleniu consumatori, ceea ce sugereaz c are un rol de antioxidant n protecia mpotriva cancerului de prostat. O analiz sistematic i meta-analiza literaturii de specialitate confirm faptul c aportul de seleniu poate reduce riscul de cancer de prostat.[14] De asemenea, vitamina E poate reduce deteriorarea ADN-ului i inhib transformarea prin intermediul funciei sale antioxidante. Suplimentarea pe termen lung cu alfa-tocoferol a redus substanial incidena cancerului de prostat i a mortalitii n cazul fumtorilor de sex masculin.[26] Concluzii Progresele realizate n cunoaterea mecanismelor implicate n progresia cancerului prostatic au identificat multiple inte poteniale pentru terapia moleculara. Aceasta ar putea mbunti att supravieuirea ct i calitatea vieii pacienilor diagnosticai cu aceast afeciune. GSTP1 are un rol protector ca un agent antioxidant n transformarea i progresia cancerului de prostat. Interaciunea dintre modificarea expresiei sau afectarea de GST pare sa joace un rol important n carcinogeneza n prostat. Inhibarea metilrii promotorului aberant ar putea fi o metod eficient de chemoprevenie. Bibliografie Arai T, Miyoshi Y, Kim SJ, :Association of GSTP1 CpG islands hypermethylation with poor prognosis in human breast cancers, Breast Cancer Res Treat. 2006 nov;100(2):16976. Epub 2006 Jun 22. Awasthi S, Bajpai KK, Piper JT.: Interactions of melphalan with glutathione and the role of glutathione S-transferase, Drug Metab Dispos. 1996 Mar;24(3):371-4. Bastian PJ, Ellinger J, Heukamp LC.: Prognostic value of CpG island hypermethylation at PTGS2, RAR-beta, EDNRB, and other gene loci in patients undergoing radical prostatectomy, Eur Urol. 2007 Mar;51(3):665-74; discussion 674. Epub 2006 Aug 23. Bentz BG, Haines GK 3rd, Radosevich JA.: Glutathione S-transferase pi in squamous cell carcinoma of the head and neck, Laryngoscope. 2000 Oct;110(10 Pt 1):1642-7. Bostwick DG, Alexander EE, Singh R.: Antioxidant enzyme expression and reactive oxygen species damage in prostatic intraepithelial neoplasia and cancer, Cancer. 2000 Jul 1;89(1):123-34. Brooks JD, Weinstein M, Lin X.: CG island methylation changes near the GSTP1 gene in prostatic intraepithelial neoplasia,Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1998 Jun;7(6):5316 Cairns P, Esteller M, Herman JG, Schoenberg M, Jeronimo C.: Molecular detection of prostate cancer in urine by GSTP1 hypermethylation.; Clin Cancer Res. 2001 Sep;7(9):2727-30. Cao DL, Yao XD.: Advances in biomarkers for the early diagnosis of prostate cancer, Chin J Cancer. 2010 Feb;29(2):229-33. Carmen Jernimo, Henning Usadel,Rui Henrique: Quantitation of GSTP1 Methylation in Non-neoplastic Prostatic Tissue and Organ-Confined Prostate Adenocarcinoma 233

1.

2. 3.

4. 5.

6.

7.

8. 9.

10. Chan QK, Khoo US, Chan KY, Ngan HY.: Promoter methylation and differential expression of pi-class glutathione S-transferase in endometrial carcinoma,J Mol Diagn. 2005 Feb;7(1):8-16. 11. Cookson MS, Reuter VE, Linkov I, Fair WR:Glutathione S-transferase PI (GST-pi) class expression by immunohistochemistry in benign and malignant prostate tissue., J Urol. 1997 Feb;157(2):673-6 12. Crocitto LE, Korns D, Kretzner L, Shevchuk T.: Prostate cancer molecular markers GSTP1 and hTERT in expressed prostatic secretions as predictors of biopsy results.,Urology. 2004 Oct;64(4):821-5 13. Dulaimi E, Ibanez de Caceres I, Uzzo RG.:Promoter hypermethylation profile of kidney cancer., Clin Cancer Res. 2004 Jun 15;10(12 Pt 1):3972-9. 14. Etminan M, FitzGerald JM, Gleave M, Chambers K.: Intake of selenium in the prevention of prostate cancer: a systematic review and meta-analysis., Cancer Causes Control. 2005 Nov;16(9):1125-31. 15. Gonzalgo ML, Nakayama M, Lee SM.: Detection of GSTP1 methylation in prostatic secretions using combinatorial MSP analysis., Urology. 2004 Feb;63(2):414-8. 16. Green JA, Robertson LJ, Clark AH.: Glutathione S-transferase expression in benign and malignant ovarian tumours.,Br J Cancer. 1993 Aug;68(2):235-9. 17. Harden SV, Guo Z, Epstein JI, Sidransky D.: Quantitative GSTP1 methylation clearly distinguishes benign prostatic tissue and limited prostate adenocarcinoma., J Urol. 2003 Mar;169(3):1138-42. 18. Hayes JD, Pulford DJ.: The glutathione S-transferase supergene family: regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance.,Crit Rev Biochem Mol Biol. 1995;30(6):445-600. (REVIEW) 19. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM.: Real time quantitative PCR., Genome Res. 1996 Oct;6(10):986-94. 20. Heinonen OP, Albanes D, Virtamo J, Taylor PR: Prostate cancer and supplementation with alpha-tocopherol and beta-carotene: incidence and mortality in a controlled trial., J Natl Cancer Inst. 1998 Mar 18;90(6):440-6. 21. Henrique R, Jeronimo C.: Molecular detection of prostate cancer: a role for GSTP1 hypermethylation., Eur Urol. 2004 Nov;46(5):660-9; discussion 669. (REVIEW) 22. Henrique R, Jeronimo C, Teixeira MR.:Epigenetic heterogeneity of high-grade prostatic intraepithelial neoplasia: clues for clonal progression in prostate carcinogenesis., Mol Cancer Res. 2006 Jan;4(1):1-8. 23. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands., Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6. 24. Hopkins TG, Burns PA, Routledge MN.: DNA methylation of GSTP1 as biomarker in diagnosis of prostate cancer., Urology. 2007 Jan;69(1):11-6. (REVIEW) 25. Inoue T, Ishida T, Sugio K, Maehara Y, Sugimachi K.: Glutathione S transferase Pi is a powerful indicator in chemotherapy of human lung squamous-cell carcinoma., Respiration. 1995;62(4):223-7. 26. Isabelle Meiers M.D.:Gluthatione S-Transferase pi (GSTP1) 27. Iurcu Corneliu: Managementul diagnosticului precoce i optimizarea screeningului multilateral n cancerul de prostat 28. Jenny Z Song,Clare Stirzaker,Janet Harrison: Hypermethylation trigger of the glutathione-S-transferase gene (GSTP1)in prostate cancer cells 29. Jeronimo C, Usadel H, Henrique R, Oliveira J, Lopes C, Nelson WG, Sidransky D.: Quantitation of GSTP1 methylation in non-neoplastic prostatic tissue and organconfined prostate adenocarcinoma., J Natl Cancer Inst. 2001 Nov 21;93(22):1747-52. 234

30. Jeronimo C, Usadel H, Henrique R, Silva C, Oliveira J, Lopes C, Sidransky D.: Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer., Urology. 2002 Dec;60(6):1131-5. 31. Kantor RR, Giardina SL, Bartolazzi A.: Monoclonal antibodies to glutathione Stransferase pi-immunohistochemical analysis of human tissues and cancers., Int J Cancer. 1991 Jan 21;47(2):193-201. 32. Katahira T, Takayama T, Miyanishi K.: Plasma glutathione S-Transferase P1-1 as a prognostic factor in patients with advanced non-Hodgkin's lymphoma (stages III and IV)., Clin Cancer Res. 2004 Dec 1;10(23):7934-40. 33. Kim JH, Choi YD, Lee JS, Lee JH, Nam JH, Choi C, Park MH, Yoon JH.: Borderline and malignant phyllodes tumors display similar promoter methylation profiles., Virchows Arch. 2009 Dec;455(6):469-75. Epub 2009 Nov 19. 34. Kinzler KW, Vogelstein B.: Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers., Nature. 1997 Apr 24;386(6627):761, 763. 35. Kollermann J, Kempkensteffen C, Helpap B, Schrader M, Krause H, Muller M, Miller K, Schostak M.: Impact of hormonal therapy on the detection of promoter hypermethylation of the detoxifying glutathione-S-transferase P1 gene (GSTP1) in prostate cancer., BMC Urol. 2006 Jun 27;6:15. 36. Lee WH, Morton RA, Epstein JI, Brooks JD:Cytidine methylation of regulatory sequences near the pi-class glutathione S-transferase gene accompanies human prostatic carcinogenesis., Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Nov 22;91(24):11733-7. 37. Morrow CS, Smitherman PK, Diah SK, Schneider E, Townsend AJ.: Coordinated action of glutathione S-transferases (GSTs) and multidrug resistance protein 1 (MRP1) in antineoplastic drug detoxification. Mechanism of GST A1-1- and MRP1-associated resistance to chlorambucil in MCF7 breast carcinoma cells., J Biol Chem. 1998 Aug 7;273(32):20114-20. 38. Moskaluk CA, Duray PH, Cowan KH, Linehan M, Merino MJ.: Immunohistochemical expression of pi-class glutathione S-transferase is down-regulated in adenocarcinoma of the prostate., Cancer. 1997 Apr 15;79(8):1595-9. 39. Niitsu Y, Takahashi Y, Saito T, Hirata Y, Arisato N, Maruyama H, Kohgo Y, Listowsky I.: Serum glutathione-S-transferase-pi as a tumor marker for gastrointestinal malignancies., Cancer. 1989 Jan 15;63(2):317-23. 40. Pandey M, Shukla S, Gupta S.: Promoter demethylation and chromatin remodeling by green tea polyphenols leads to re-expression of GSTP1 in human prostate cancer cells., Int J Cancer. 2010 Jun 1;126(11):2520-33. 41. Perry AS, Foley R, Woodson K, Lawler M.: The emerging roles of DNA methylation in the clinical management of prostate cancer., Endocr Relat Cancer. 2006 Jun;13(2):35777. (REVIEW) 42. Randall BJ, Angus B, Akiba R.: Glutathione S-transferase (placental) as a marker of transformation in the human cervix uteri: an immunohistochemical study., Br J Cancer. 1990 Oct;62(4):614-8. 43. Rennie PS, Nelson CC.: Epigenetic mechanisms for progression of prostate cancer., Cancer Metastasis Rev. 1998-1999;17(4):401-9. (REVIEW) 44. Satta T, Isobe K, Yamauchi M, Nakashima I, Takagi H.: Expression of MDR1 and glutathione S transferase-pi genes and chemosensitivities in human gastrointestinal cancer., Cancer. 1992 Feb 15;69(4):941-6. 45. Simic T, Mimic-Oka J, Savic-Radojevic A.: Glutathione S-transferase T1-1 activity upregulated in transitional cell carcinoma of urinary bladder., Urology. 2005 May;65(5):1035-40. 235