STRUCTURA MACROMOLECULELOR PROTEICE

Metode fizice de determinare a structurii macromoleculelor

Proteine - generalitati, definitie

Proteinele sunt substane organice macromoleculare formate din lanuri simple sau complexe de aminoacizi; ele sunt prezente n celulele tuturor organismelor vii n proporie de peste 50% din greutatea uscat. Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, n care secvena acestora este codificat de ctre o gen. Fiecare protein are secvena ei unic de aminoacizi, determinat de secvena nucleotidic a genei.

Generalitati

Biosinteza proteinelor este un proces prin care fiecare celul i sintetizeaz proteinele proprii, prin intermediul unui proces care include multe etape, sinteza ncepnd cu procesul de transcripie i terminnd cu procesul de translaie. Procesul dei similar, este diferit n funcie de celul: eucariot sau procariot.

Tipuri de proteine
n funcie de compoziia lor chimic ele pot fi clasificate n: 1. Holoproteine care cuprind: Proteine globulare (sferoproteine) sunt de regul substane solubile n ap sau n soluii saline:protaminele, histonele, prolaminele, glutelinele, globulinele, albuminele. Proteinele fibrilare (scleroproteinele) caracteristice regnului animal, cu rol de susinere, protecie i rezisten mecanic:colagenul, cheratina i elastina. 2. Heteroproteinele sunt proteine complexe care sunt constituite din o parte proteic i o parte prostetic; ele cuprind: Glicoproteine, lipoproteine si nucleoproteine.

Proteinele au masa moleculara foarte mare M> 10.000 u.a.m.

Denumire Lactalbumin Gliadina Insulina Hordeina

Sursa(izolata din) lapte gru pancreas orz

Masa moleculara (u.a.m). 17000 27.500 12,000 27.500

Hemoglobina
Hemocianina Miozina Pepsin Peroxidaza Virusul tutunului

globule roii
molute(snge) , artropode(snge) muchi stomac rinichi tutun

68.000
28 000 85.000 36.000 44.000 17.000.

Aminoacizii standard

Din punct de vedere chimic, proteinele sunt heteropolimeri constituii din 20 de aminoacizi (aa numiii aminoacizi standard vezi tabelul), n care gruprile carboxil se pot combina cu gruprile amino formnd legturi peptidice. Aminoacizii standard au proprieti variate, proprieti care sunt direct responsabile de structura tridimensional a proteinei, dar i de proprietile acesteia.

Denumirea (Residue)
Alanin

cod 3-litere
ALA

cod 1 liter code A

Abunden />(%) E.C.

13.0

Arginin
Asparagin Aspartat Cistein Acid glutamic Glutamin Glicin Histidin Isoleucin Leucin Lizin Metionin Fenilalanin

ARG
ASN ASP CYS GLU GLN GLY HIS ILE LEU LYS MET PHE

R
N D C E Q G H I L K M F

5.3
9.9 9.9 1.8 10.8 10.8 7.8 0.7 4.4 7.8 7.0 3.8 3.3

Prolin
Serin Treonin Triptofan Tirosin Valin

PRO
SER THR TRP TYR VAL

P
S T W Y V

4.6
6.0 4.6 1.0 2.2 6.0

Lantul polipeptidic

n lanul polipeptidic aminoacizii formeaz legturile peptidice prin cuplarea grupei carboxil cu o grup amino; odat legat n lanul proteic aminoacidul se "transform" n aminoacid "rezidual" iar atomii de carbon , azot, hidrogen i oxigen implicai n legturi formeaz "scheletul" proteinei. Atunci cnd lanul proteic se tremin cu o grup carboxil poart denumirea de carboxi terminus sau( C -terminus), n timp ce, dac se termin cu gruparea amino, devine amino-terminus (Nterminus).

Structura primara a proteinelor si acizilor nucleici

Structura primar este dat de aminoacizii care intr n lantul proteic prin formarea legturilor pepetidice. Legtura peptidic -CO-NH- se gsete n acelai plan, iar carbonul -CH- se poate roti, putnd s apar n planuri diferite. Datorit lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte i de alta a lanului proteic, astfel c lanul proteic nu este ramificat.

Structura primara a proteinelor si acizilor nucleici

n proteinele naturale legtura peptidic se stabilete ntre gruparea carboxilic de la C1 i gruparea aminic de la C2, nct lanul peptidic va fi format dintr-o succesiune de uniti CO-NH-CH, legate cap-cap.

Structura secundara

Structura secundar se refer la forma i la lungimea lanurilor polipeptidice,ulata a structurii locale stabilizata prin legturile de hidrogen. Cele mai ntlnite tipuri de structura secundar sunt alpha helixul i lanurile beta.

Elicea alpha se formeaz prin rotaia unui lan polipeptidic n jurul propriei axe

Imaginea alfa helixurilor mioglobinei, a crei structur a fost determinat de ctre Max Perutz i Sir John Cowdery Kendrew n 1958 folosind cristalografia cu raze X

Structura secundara
Aminoacizii au un comportament diferit vis-a-vis de posibilitatea formrii structurii secundare. Prolina i glicina sunt cunoscui ca aa numiii " helix breakers"(sprgtori de helix), deoarece afecteaz configuraia scheletului proteic; ambii aminoacizi au abiliti conformaionale neobinuite i de regul se gsesc n colurile scheletului proteic. Aminoacizii care prefer s adopte conformaia helixului proteic fac parte din aa numita serie MALEK ( codurile formate din 1 liter a aminoacizilor): metionin, alanin, leucin, acid glutamic i lizina); Prin contrast aminoacizii aromatici (triptofanul, tirosina i fenilalanina, dar i aminoacizii cu legare prin carbonul beta (izoleucina, valina i treonina, adopt configuraia .

Structura tertiara

Prin intermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul c macromoleculele proteice au o conformaie tridrimensional , realizat de obicei prin intermediul cuplrii mai multor lanuri polipeptidice scurte ntre ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice; legturile intercatenare pot fi principale sau secundare.

Structura tertiara: legaturi intercatenare

Legturi de hidrogen - sunt legturi coordinativ heteropolare care se stabilesc cu uurin ntre gruparea carbonil C=O (electronegativ) i gruparea NH- (electropozitiv), din 2 lanuri polipeptidice alturate, sau ntre gruparea -OH i azotul iminic =NH. Legturile de hidrogen se pot stabili i ntre catenele laterale care au grupri carboxil, hidroxil, amino sau tiolice. Din punct de vedere energetic legtura de hidrogen nu este puternic dar datorit rspndirii relativ uniforme de-a lungul scheletului proteic ofer proteinei stabilitatea necesar.

Legturile de hidrogen au lungimea cuprins ntre 2,7-3,1A i energia de 3-7 Kcal/mol .

Structura tertiara: legaturi intercatenare

Legturi disulfidice- foarte puternice,50-100kcal/mol i au un rol foarte important n stabilizarea arhitecturii spaiale a moleculei proteice. Legtura este rezistent la hidroliz, ns se poate desface iar prin reducere formeaz tioli (SH), iar prin oxidare formeaz acizi.n general legtura sulfidic se ntlnete la proteinele transformate, care au o rezisten mecanic mare.

Structura tertiara: legaturi intercatenare

n afar de aceste legturi se mai pot stabili : legturi ionice (stabilite de obicei ntre gruprile aminice i cele carboxilice ionizate), legturi de tip van der Waals (legturi electrostatice slabe care se stabilesc ntre radicalii hidrofobi), legturi fosfodiesterice (ntre 2 resturi de serin i acid fosforic) legturi eterice (stabilite la nivelul aminoacizilor cu grupri hidroxilice.

Structura cuaternara

Se refer la modul in care se unesc subunitile proteice.Enzimele care catalizeaz asamblarea acestor subuniti poart denumirea de holoenzime. Proteine care au structura cuaternar :hemoglobina, ADN polimeraza i canalele ionice, dar i nucleozomi i nanotubuli, care sunt complexe multiproteice. Fragmentele proteice pot suferi transformri n structura cuaternar, transformri care se reflect fie n structurile individuale fie n reorientrile fiecrei subuniti proteice. Numrul subunitilor oligomerice sunt denumite prin adugarea sufix-ului -mer (grecescul pentru subunitate), precedat de numele subunitii. 1 = monomer 2 = dimer 3 = trimer 4 = tetramer

Structura cuaternara
Vedere 3 D a hemoglobinei cu cele 4 subuniti (2rou i 2galben), iar unitatea hemic verde. Numele de hemoglobin este format din hem i globin, denumire ce denot faptul c hemoglobina are la baz proteine globulare cuplate cu o grupare hem

Cristalografia cu raze X- metoda de determinare a structurii proteinelor si acizilor nucleici

Generalitati

Cristalografia cu raze X

Este o metoda de determinare a structurii si ordinii atomilor dintr-un cristal utilizand un fascicol de raze X care care dupa ce loveste cristalul este imprastiat in diferite directii. Masurand unghiul de difractie si intensitatea fascicollor rezultante, poate fi obtinuta o imagine tridimensionala a densitatii electronice a cristalului. Cu ajutorul acestei imagini se pote determina pozitia fiecarui atom in cristal si a legaturilor chimice dintre atomi. Fenomenul de difractie poate fi explicat cu ajutorul principiului lui Hygens din optica ondulatorie.

Difractia undelor- definitie

Difractia undelor consta in ocolirea de catre unda a obstacolelor, atunci cand dimensiunile acestora sunt comparabile ca ordin de marime cu lungimea de unda a radiatiilor (a undei). Schimbarea directiei de propagare a undei se numeste in acest caz difractie.

Cristalele

Cristalele sunt structuri regulate care se repeta pe cele trei directii in spatiu.Atomii au pozitii fixe in aceste structuri.

Prin difractie cu raze X sa demonstrat ca simetria hexagonala a unui cristal de gheata rezulta din aranjamentul tetraedric al legaturilor de hidrogen dintre moleculele de apa.

Principiul fizic al difractiei

Atomii cristalului sunt aranjati regulat in plane paralele situate la distanta d unul de celalalt. d= constanta retelei. Razele X pot fi utilizate in experiente de difractie pentru ca lungimea lor de unda este de acelasi ordin de marime cu distanta dintre planele unui cristal (1-100 )

2d sin n

Relatia lui Bragg: Difractia are loc in conditii optime si prezinta maxime de intensitate daca diferenta de drum optic este un multiplu al lungimii de unda a radiatiei X utilizata.

Exemplu- grafitul si diamantul

Chiar daca diamantul si grafititul au aceeasi compozitie chimica, fiind ambele carbon pur, cristalografia cu raze X a evidentiat o aranjare diferita a atomilor in spatiu, ceea ce le ofera proprietati diferite. In diamant, atomii de carbon sunt dispusi tetraedral si legati prin legaturi covalente simple, facandu-l foarte rezistent in toate directiile. In contrast, grafitul este alcatuit din foi (paturi) suprapuse in care atomii de carbon sunt dispusi hexagonal prin legaturi delocalizate in raport 4/3. Nu exista legaturi covalente intre paturi, deci grafitul este usor de separat in bucati plate.

Realizari importante in domeniul biologiei si farmaciei

Cristalografia cu raze X a fost utilizata cu succes in cazul moleculelor biologice incepand cu dr. Dorothy Crowfoot Hodgkin, care a elucidat structura colesterolului (1937), vitaminei B12 (1945), penicillinei (1954), pentru care a primit premiul Nobel in Chimie in anul 1964. Apoi, in 1969, ea a descoperit structura insulinei, pentru care a lucrat peste 30 de ani.

Structura penicilinei: galben-carbon, verdehidrogen, alb-oxigen, rosusulf, albastru-azot.

Diagrama tip panglici pentru mioglobina- sunt colorate lanturile alpha helix. In acesta structura intra mii de atomi, dar diagrama prezinta doar lantul polimeric incepand cu capatul N-terminus (albastru) pana la C-terminus (rosu).

Procedee experimentale
In difractia cu raze X se utilizeaza trei procedee experimentale: 1. Metoda Laue: asupra unui monocristal este trimis un fascicol de raze X cu spectru continuu, iar maximele de iterferenta obtinute in urma difractiei se formeaza numai pentru unghiuri de incidenta si lungimi de unda care satisfac relatia lui Bragg si sunt inregistrate pe o placa fotografica sau pe computer. Din distributia spatiala a maximelor de de interferenta se poate deduce tipul cristalografic caruia ii apartine substanta studiata.

Procedee experimentale
2. Metoda cristalului rotitor: cristalul asupra caruia se proiecteaza un fascicol de raze X este rotit in jurul unei axe, difractia se produce numai pentru pozitii care satisfac relatia Bragg.

Procedee experimentale
3. Metoda Debye-Scherrer (a pulberilor): proba continand substanta sub forma de pulbere policristalina este de forma cilindrica si asezata pe axul unei camere cilindrice, iar asupra ei este proiectat fascicolul monocromatic de raze X. In pulberea supusa analizei se vor gasi si cristale care satisfac relatia Bragg. In urma difractiei, pe o placa fotografica fixata pe peretii camerei cilindrice, se vor obtine maxime de difractie sub forma de linii, iar din distributia lor se poate determina constanta de difractie a retelei cristaline.

Dispozitivul practic se numeste goniometru.