I.

1 IMPORTANA ENZIMELOR PENTRU PRACTICA MEDICAL

Realizrile teoretice i practice ale enzimologiei sunt utilizate n practica medical n dou moduri distincte:determinarea activitii enzimelor tisulare i din lichidele biologice n scop de diagnostic; - utilizarea enzimelor native i/sau imobilizate n tratamentul unor enzimopatii.

I.1.1 Determinarea activitii enzimelor n diagnostic i tratament constituie principala metod

de evaluare a perturbrilor metabolice respective i implicit un element important de care se ine seama n stabilirea diagnosticului i urmrirea evoluiei bolii n perioada tratamentului medical.Pe de alt parte se cunoate un mare numr de maladii ce reprezint consecina unor de!ecte enzimatice. "n asemenea situaii activitatea sczut sau chiar absena unor enzime reprezent cauza maladiilor respective spre deosebire de situaia descris mai sus c#nd bolile respective au o alt etiologie iar modi!icarea activitii unor enzime reprezint efectul acestora. "n consecin e$ist dou situaii:- bolile con enitale de metabolism ce corespund unui de!icit enzimatic;- bloca!ul acti"it#$ii catalitice a enzimelor sub aciunea unor inhibitori speci!ici ce apar n organism din di!erite motive.%are pot !i repercusiunile unui bloca& metabolic ' ( presupunem secvena metabolic de tipul:

) * % + , - n care este blocat etapa % +. "n aceste condiii va avea loc o diminuare sau chiar anularea !ormrii metabolitului intermediar +:) * % +
.n e$emplu concret l reprezint diminuarea !ormrii glucozei n glicogenoza de tip I n absena glucozo-/-!os!atazei. *oala poate !i cauzat !ie de un bloca& complet !ie de unul parial. %onsecinele unor ast!el de situaii careniale determin perturbarea mecanismului de reglare prin retroinhibiie. )lte anomalii metabolice prin de!icit enzimatic se nt#lnesc n cazul cilor metabolice rami!icate: )

*%+ ,Pentru schema general de mai sus blocarea reaciei % + determin !uncionarea la nivel ma$im a secvenei % , - care n condiii normale ndeplinete un rol secundar. )a se nt#mpl de e$emplu n oligofrenia fenilpiruvic unde se observ nu numai o acumulare de !enilalanin 0%1 ci i !ormarea e$cesiv de corpi cetonici. +e!icienele enzimatice se mani!est n toate celulele indi!erent dac ele sunt de natur genetic sau nu. Pe de alt parte de!icienele enzimatice provoac de obicei mani!estri patologice la nivelul mai multor sisteme acestea put#nd prezenta la r#ndul lor interes clinic i/sau diagnostic. +e e$emplu galactozemia este o boal cauzat de o de!icien enzimatic cu repercusiuni asupra mai multor organe. 2a aceti bolnavi este absent galactozo-1-fosfat-uridil-transferaza i ast!el are loc o acumulare de galactoz i galactozo-3-!os!at. +in punct de vedere clinic aceast anomalie se mani!est prin hepatosplenomegalie ce evolueaz spre ciroz cu retardare psihic. Pot s apar i leziuni renale care determin hiperalbuminurie i respectiv hiperaminoacidurie. 4abloul clinic este agravat dac acestei anomalii i se suprapune avitaminoza. 4ratamentele clasice constau n general n administrarea acelor substane care ar trebui s se !ormeze n mod normal n aval de etapa blocat aceast terapie d#nd rezultate relativ satis!ctoare. 4ratamentul respectiv este nsoit i de o diet adecvat: regim !r galactoz n galactozemie !r !enilalanin n oligo!renia . 5 metod de diagnostic e!icient trebuie s !ie !iabil sensibil speci!ic i ino!ensiv pentru pacient. %iabilitatea unei metode depinde n primul r#nd de e$actitatea sa. ,$actitatea rezultatelor nu poate !i apreciat dec#t pentru analizele e!ectuate n condiii identice din toate punctele de vedere: timpul puritatea i concentraia reactivilor p6-ul temperatura aparatura electronic de laborator etc. &en'ibilitatea metodelor enzimatice de analiz este n str#ns interdependen cu sensibilitatea e$trem de crescut a !enomenelor !iziopatologice. &(ecificitatea marii ma&oriti a dozrilor enzimatice este net superioar celorlalte metode de analiz utilizate n clinic. (peci!icitatea de diagnostic depinde n mare msur de alegerea pattern-ului enzimatic.

I.1.2. Enzimoterapia. ,$istena deficienelor enzimatice congenitale i secundare ca urmare a unor

leziuni i/sau anomalii la nivelul organelor unde se sintetizeaz enzimele respective a determinat declanarea

unor cercetri privind posibilitatea utilizrii enzimelor n scop terapeutic. ) devenit ast!el posibil distrugerea pe cale enzimatic a unor substane patologice sau metaboliilor eseniali ai unor procese patologice 7mensa ma&oritate a enzimelor 8medicament9 aparin clasei hidrolazelor i sunt utilizate n prezent n principal n afeciuni digestive afeciuni ale sistemului de coagulare sanguin i fibrinoliz. a1 !ratamentul enzimatic al afeciunilor digestive . :a&oritatea substanelor nutritive nu poate !i utilizat sub !orma n care acestea se a!l n alimente. )ceti nutrieni sunt supui procesului de digestie prin care sunt scindai hidrolitic sub aciunea enzimelor tractului digestiv n compui solubili ce pot !i absorbii la nivel intestinal. "n urma aciunii acestor hidrolaze se !ormeaz monozaharide aminoacizi acizi grai i glicerol care dup traversarea peretelui intestinal sunt vehiculai pe cale sanguin n !icat.;ilnic se !ormeaz n organism apro$imativ 3< litri de sucuri digestive 0saliv suc gastric secreii intestinale i pancreatice bil etc.1 care sunt deversate n tractul digestiv. )cestea conin apro$imativ 3< grame de protein-enzime utilizate zilnic pentru digestia substanelor nutritive. "n general cantitatea de enzime sintetizate zilnic este superioar necesitilor cotidiene. 2a persoanele crora li s-a e!ectuat pancreatectomie dintr-un motiv sau altul activitatea enzimatic digestiv se situeaz la un nivel e$trem de sczut !iind asigurat at#t de enzimele gastrice c#t i cele microbiene produse de !lora intestinal. =umeroase studii e!ectuate pe asemenea subieci au demonstrat c enzimoterapia substitutiv d rezultate notabile. Preparatele enzimatice utilizate n acest scop conin proteinaze) lipaze i amilaze de origine animal vegetal i/sau microbian.+at !iind !aptul c ma&oritatea a!eciunilor digestive sunt localizate la nivel intestinal deseori se !olosesc preparate enzimatice sub !orm de pancreatin b) "oagularea sanguin i fibrinoliza. "n esen coagularea sanguin const n trans!ormarea !ibrinogenului solubil n !ibrin insolubil nalt polimerizat. -ibrinoliza este procesul invers de degradare proteolitic a !ibrinei cu !ormare de polipeptide solubile. %ib*ina se !ormeaz constant n cantiti minime la nivelul peretelui vascular intact ntr-un proces lent de coagulare i se scindeaz de asemenea continuu ntr-o !ibrinoliz lent. +in punct de vedere enzimatic coagularea sanguin i !ibrinoliza sunt de !apt dou etape de degradare proteolitic a !ibrinogenului. )tunci c#nd echilibrul !iziologic stabilit ntre coagulare i !ibrinoliz se deplaseaz ntr-un sens sau n altul apar hemoragii respectiv tromboze. "n asemenea cazuri este pe deplin &usti!icat o enzimoterapie substitutiv n sensul activrii sau al inhibiiei dup caz. !rombina 0!actorul 77a1 este o proteinaz nalt speci!ic ce poate !i aplicat local n stoparea hemoragiilor 0de e$emplu la nivelul plgilor postoperatorii1 sub !orma unui preparat e$tras din s#ngele de bou. )ceast aplicaie local este posibil i n hemoragia gastric. 4rombina nu poate !i ns in&ectat intravenos sau intramuscular put#nd genera tromboze i embolie deoarece nu este neutralizat dec#t !oarte lent de ctre inhibitorii plasmatici endogeni. "n asemenea situaii se !olosete accele*in+con"e*tina care este un amestec ce conine !actorii >77a 0convertina1 > 0accelerina1 7? 0!actorul Christmas1 i ? 0!actorul Stuart-Prower1 acest preparat activ#nd protrombina 0!actorul 71. "n #emofilia $ o maladie congenital sanguin destul de !recvent este absent !actorul >777 - globulina antihemo!ilic ) o @-globulin cu mas molecular mare. .n tratament de substituie este posibil prin per!uzarea de plasm sanguin uman.)nticoagulanii utilizai n tratamentul dereglrilor de coagulare acioneaz !ie direct asupra !actorilor coagulrii 0cum acioneaz heparina1 !ie indirect c#nd intervin n biosinteza acestor !actori .5 alt enzim utilizat n acest scop este streptoAinaza produs de streptococul hemolitic. I.1.% Enzimele n pediatrie. :ulte a!eciuni unele din ele letale pot !i astzi decelate i tratate n consecin. )st!el n hepatita acut activitatea celor dou transaminaze este crescut chiar n !aza prodromal atinge ma$imum n !aza icteric i se normalizeaz progresiv n timpul convalescenei. +ozrile enzimatice sunt la !el de importante i n cazul a!eciunilor pancreasului. (e mai !ac dozri enzimatice i n icterul hemolitic 0glucozo-/-!os!at-dehidrogenaza i piruvat-Ainaza eritrocitar1 distro!ia muscular 0aldolaza i creatin-Ainaza1 rahitismul !lorid 0!os!ataza alcalin1 boala Baucher 0!os!ataza acid1 etc. I.1.& Enzimele n oncologie 4erapeutica anticanceroas a cunoscut un impuls important c#nd s-a observat c serul de cobai posed activitate antitumoral. )cest !enomen const n degradarea 2-asparaginei sub aciunea asparaginazei din ser cu e!ecte letale asupra celulelor tumorale n special leucemice. ,nzimoterapia leucozelor nu este realizabil actualmente dec#t cu a&utorul asparaginazei e$tras din Escherichia coli. )u !ost puri!icate dou asparaginaze ) i * identice imunologic dar distincte prin punctul lor izoelectric. II ENZIME IMOBILIZATE . =oiunea de enzi,# i,obilizat# desemneaz catalizatorul heterogen obinut prin !i$area uneia sau mai multor enzime sau a organitelor subcelulare i a celulelor ntregi pe suporturi insolubile cu pstrarea capacitii catalitice. Procedeele biocatalitice industriale se pot clasi!ica n !uncie de tipul i starea biocatalizatorului ast!el:

a1 biocatalize enzi,atice:- cu enzime n sistem liber;- cu enzime imobilizate; b1 biocatalize *ealizate -e celule :- cu celule n sistem liber;- cu celule imobilizate.

II.2 'E!(DE DE I'()I*I+$,E se pot clasi!ica n !uncie de natura interaciunilor ce au loc ntre
enzim i suport n procesul de imobilizare. 5 prim clasi!icare a !ost !cut de Durand G. et al. care consider c e$ist dou categorii de metode de imobilizare:- prin includere 0entrapare - ,=4 i microencapsulare - :,%1;- prin legare 0adsorbie- )+( i covalent - %>*1. :ai t#rziu s-a !cut o alt clasi!icare raional a metodelor de imobilizare. %on!orm acestei clasi!icri metodele de imobilizare se mpart n dou mari grupe !iecare conin#nd alte subgrupe de metode :- grupa ): ,eto-e fizice -e i,obiliza*e 0metode de imobilizare prin adsorbie metode de includere mecanic a moleculelor enzimatice n suport prin reticulare microncapsulare includere n membrane de ultra!iltrare etc.1;- grupa *: ,eto-e c.i,ice -e i,obiliza*e 0imobilizarea prin legare covalent i imobilizarea cu a&utorul liganzilor1. II.2.1 'etode fizice de imobilizare a enzimelor prin care enzima se leag de suport !r !ormare de legturi covalente. )cestea la r#ndul lor se mpart n dou subgrupe: imobilizarea prin adsorbie i respectiv includerea mecanic a moleculelor enzimatice n suport 0includere n geluri microncapsulare etc.1. 1 Imobilizarea enzimelor prin adsorbie ,nzimele sunt !i$ate la supra!aa suportului datorit urmtoarelor tipuri de legturi ce intervin n adsorbie:- interaciuni van der -aals - interaciuni electrostatice ntre atomi sau molecule cu moment de dipol;- puni de #idrogen ce se !ormeaz n cazul gruprilor -56 -%556 -=6@;- transfer de sarcin - adic toate interaciunile ntre substane electro!ile i nucleo!ile;- sc#imb de ioni.%antitatea de enzim legat de suport n cazul adsorbiei depinde de urmtorii parametri: a1 concentraia proteic b1 timpul de contact c1 temperatura de reacie d1 influena p.-ului: 2 Imobilizarea enzimelor prin includere n geluri. 7ncluderea mecanic n suport presupune utilizarea unor geluri reticulate microcapsule !ibre membrane de ultra!iltrare etc."n ultimul timp s-au propus noi tehnici de includere n geluri i noi tipuri de geluri. +e e$emplu polimerizarea n emulsie const#nd dintr-o !az apoas i o !az hidro!ob permite obinerea unui hidrogel sub !orm de particule s!erice a cror dimensiune poate !i controlat prin schimbarea condiiilor de polimerizare. "n cazul n care emulsia este ngheat naintea polimerizrii se obin particule poroase cu o supra!a speci!ic mare."n prezent pentru imobilizarea enzimelor cel mai adesea se !olosesc gelurile de poliacrilamid 0!ig. 31. %alitile acestor geluri pot !i mbuntite utiliz#nd metoda radiopolimerizrii. Belurile ast!el obinute au o structur poroas cu supra!a activ mare iar elasticitatea crete considerabil dac polimerizarea are loc n prezena amidonului C D cresc#nd totodat i termostabilitatea enzimei imobilizate.
CH 2 CH C = O NH n CH 2 = CH CONH 2 + n CH 2 NH C = O CH 2 CH Acrilamid BIS + Enzim K2S2O8 sau DMAPN

Fig. 1. Reaciile de copolimeri are ce au loc !n timpul imo"ili #rii en imelor prin includere !n gel de poliacrilamid#

% Imobilizarea enzimelor prin microncapsulare

:icroncapsularea este o metod !izic de imobilizare ce se realizeaz prin includerea enzimelor ntr-o microcapsul !ormat dintr-o membran semipermeabil. )ceasta este impermeabil pentru protein-enzima din interior i compuii macromoleculari e$terni ns permite di!uzia liber a compuilor cu mas molecular mic cum ar !i unele substrate i produii lor de reacie 0!ig. @1. +rept suport de imobilizare se !olosesc at#t polimerii naturali c#t i cei sintetici. 5binerea microcapsulelor sintetice se realizeaz prin policondensare i coacervare inter!azic sau prin emulsionare dubl. "n cazul policondensrii inter!azice !ormarea membranei semipermeabile se !ace prin reacii chimice ce au loc la supra!aa de separare dintre cele dou !aze 0ap-solvent organic1 iar n cazul coacervrii aceasta se !ormeaz datorit scderii solubilitii polimerului la limita dintre !aze. Fig. $. Schema de %uncionare a en imelor micro!ncapsulate& 1 - microcapsul#' $ - en im# imo"ili at#' ( - su"strat cu mas# molecular# mic#' ) - produs cu mas# molecular# mic#' *- su"stan# macromolecular#

:etoda emulsionrii duble reprezint o modi!icare a primelor dou metode de microncapsulare. (oluia apoas de enzim se emulsioneaz mpreun cu soluia monomerului ntr-un solvent organic apoi suspensia obinut se emulsioneaz n !aza apoas cu !ormare de s!ere solide conin#nd micropicturi din soluia enzimatic. Prin aceste metode se obin microcapsule cu diametrul de zecimi p#n la sutimi de micron. .tilizarea microcapsulelor naturale permite obinerea unor preparate de enzime imobilizate de uz medical. Printre suporturile naturale !olosite des la microncapsularea enzimelor se numr liposomii i !antomele eritrocitare. )vanta&ul acestora const n !aptul c odat introduse n organism nu prezint !enomenul de respingere i sunt vehiculate de !lu$ul sanguin la toate organele i esuturile. II.2.2 'etode c#imice de imobilizarea enzimelor. Pentru o mai bun !i$are a enzimelor pe suport muli cercettori au recurs la metode chimice de imobilizare care constau n !ormarea de legturi covalente !ie direct ntre enzim i suport !ie prin intermediul liganzilor. "n cazul legrii directe legturile covalente iau natere ntre gruprile !uncionale ale suportului i cele ale protein-enzimei grupri a!late de regul n a!ara situsului activ enzimatic.7mobilizarea chimic a enzimelor pe suporturi solide poate !i e$ecutat i prin intermediul liganzilor care sunt n general compui chimici bi!uncionali sau nesaturai. Ei n acest caz se asigur o !i$are puternic a enzimei pe suport. 1 Imobilizarea enzimelor prin legare covalent se poate utiliza orice tip de suport anorganic sau organic natural semisintetic sau sintetic care prezint grupe !uncionale adecvate !ormrii de legturi covalente. "n cazul legturilor covalente ce sunt legturi chimice puternice este nlturat practic posibilitatea eluiei pariale a enzimei de pe suport n timpul e$ploatrii. +in aceast cauz numeroi cercettori utilizeaz aceast metod pentru imobilizarea enzimelor de importan practic. 2 Imobilizarea enzimelor cu a/utorul liganzilor. 5 alt metod de imobilizare covalent a enzimelor o reprezint !i$area acestora cu a&utorul liganzilor. )cetia sunt substane bi- sau multi!uncionale sau substane nesaturate. "n procesul de imobilizare se !ormeaz c#te dou legturi covalente pentru !iecare molecul proteic: ligandul se !i$eaz de suport prin intermediul uneia din gruprile sale !uncionale cealalt rm#n#nd disponibil pentru !i$area enzimei. )vanta&ul acestei metode const n !aptul c se poate realiza o imobilizare optim aleg#nd ligandul speci!ic n !uncie de natura gruprilor !uncionale ale suportului i respectiv enzimei ce urmeaz a se imobiliza.
=6 @ 'u(o*t F , G =6 @ F 6@= G

A G =6 @
=6 @

56% G 0%6 @1H G %65

(uport inert

,nzimI

)lbuminI

BlutaraldehidI

Fig. (. Repre entarea schematic# a imo"ili #rii en imelor pe %i"re de celulo # prin reticulare cu aldehid# glutaric#

II.% !E.0I"I DE I'()I*I+$,E $ E0+I'E*(, 1I "E*2*E*(,

4ehnicile de imobilizare a enzimelor i celulelor ntregi se mpart n urmtoarele dou grupe: a1 tehnici de imobilizare n sistemul 8 coloan9 care constau n trecerea soluiei enzimatice sau a suspensiei celulare printr-o coloan umplut cu suportul de imobilizare ce a !ost n prealabil activat i echilibrat; singurele probleme mai di!icile care se pun sunt cele legate de crearea condiiilor optime de !i$are 0p6 temperatur etc.1 condiii care s nu duc la inactivarea enzimelor. )ceast tehnic este similar cromatogra!iei pe coloan e$ecut#ndu-se n condiii identice. b1 tehnici de imobilizare n sistemul 8 baie9 c#nd imobilizarea se !ace sub agitare continu n vase speciale apoi dup splare preparatul obinut se trece n coloana de reacie n vederea e$ploatrii. 9 sunt ceva mai comple$e din cauza condiiilor aspre n care au loc reaciile chimice. "n general aceste tehnici se aseamn cu cele din sinteza chimic organic cu deosebirea c se !ac anumite modi!icri n scopul crerii unor condiii mai bl#nde de reacie care s nu denatureze proteinele.

II. &. "$,$"!E,I3!I"I*E "I0E!I"E 1I 420"5I(0$*E $*E E0+I'E*(, I'()I*I+$!E "n general la imobilizarea oricrei enzime se urmresc urmtoarele aspecte:
a1 alegerea condiiilor optime de imobilizare/ + ale e*ea 'u(o*tului o(ti, 0se !ace n aa !el nc#t procesul de cuplare s inactiveze c#t mai puin enzima.1;

- ale e*ea ,eto-ei o(ti,e -e i,obiliza*e0 n !uncie de procesul de trans!ormare n care va !i !olosit viitorul preparat1 de numrul i natura grupelor !uncionale ale suportului precum i n !uncie de scopul !inal urmrit; - ale e*ea te.nicii -e i,obiliza*e0poate !i utilizat at#t imobilizarea n sistemul coloan c#t i n sistemul baie cu condiia s se realizeze un contact c#t mai intim ntre enzim i suport.1; - ale e*ea con-i$iilo* o(ti,e -e (1) te,(e*atu*# etc. n care s se realizeze imobilizarea 0 deoarece e$ist pericolul inactivrii termice a enzimelor cuplarea se realizeaz de obicei la rece -J < FKo%1 b1 determinarea principalilor parametri cinetici i !uncionali ai imobilizatelor enzimatice obinute: - -ete*,ina*ea ca(acit#$ii -e i,obiliza*e 0Prin capacitate de imobilizare se nelege cantitatea de enzim e$primat n miligrame !i$at pe unitatea de mas 0gram1 sau volum 0mililitru1 de suport.1; - 'tu-iul influen$ei (1+ului 2i te,(e*atu*ii ,e-iului a'u(*a "itezei *eac$iei catalizate -e enzi,a i,obilizat# *e'(ecti"# 0determin activitatea catalitic n condiii standard dar la valori di!erite de p6. Bra!icul dependenei vitezei reaciilor enzimatice de p6-ul mediului de incubare are acelai aspect gaussian dar cu o deschidere mai mare34 + 'tu-iul influen$ei concent*a$iei 'ub't*atului a'u(*a "itezei -e *eac$ie 2i -ete*,ina*ea con'tantei 5 M 0"n unele situaii constanta L: nu se modi!ic n !oarte puine cazuri aceasta se micoreaz iar pentru marea ma&oritate a enzimelor se observ o cretere a valorii constantei L: prin imobilizare ceea ce presupune o scdere a a!initii enzimei pentru substrat34 + -ete*,ina*ea ti,(ului -e 'toca*e o(e*a$ional# 0se nelege intervalul de timp n care un preparat enzimatic imobilizat poate realiza cicluri de trans!ormare !r ca activitatea enzimatic s scad semni!icativ.1; - -ete*,ina*ea ti,(ului -e 6n!u,#t#$i*e a acti"it#$ii catalitice0 se nelege intervalul de timp n care prin utilizare continu sau discontinu preparatul enzimatic respectiv i diminueaz activitatea cu C< D !a de capacitatea sa catalitic iniial.1. III. No$iuni ene*ale a'u(*a ,eto-elo* i,unoenzi,atice -e analiz# :etodele imunologice sunt n special cantitative i se bazeaz pe reaciile antigen-anticorp. )ctualmente ma&oritatea metodelor de imuno-analiz utilizeaz i un al treilea element aa-numitul trasor. )cesta rezult prin asocierea antigenului sau anticorpului cu un marAer. .tilizarea marAerilor radioactivi prezint ns i unele inconveniente principalul dezavanta& const#nd n posibilitatea !olosirii limitate a elementelor radioactive n condiiile laboratoarelor obinuite de enzimologie.. No$iuni ene*ale (*i"in- 't*uctu*a c.i,ic# 2i *olul biolo ic al antico*(ilo*. atunci c#nd unui animal de e$perien i este in&ectat un antigen rspunsul imunitar determin printre altele secreia de anticorpi. )nticorpii 0imunoglobulinele1 sunt glicoproteine sintetizate n lim!ocitele * 0activate sub !orm de plasmocite1 i e$portai n plasma sanguin i lichidul interstiial. 7munoglobulinele conin situsuri speciale numite epitopi capabile s recunoasc speci!ic antigenele. 7munoglobulinele conin n molecul aa-numitele catene grele 6 0hea+,1 i respectiv catene uoare 2 0light1 0!ig. C1.%atenele 6 sunt unite ntre ele prin intermediul a minimum dou puni disul!idice intercatenare n timp ce !iecare caten de tip 2 se leag de c#te o caten 6 printr-o punte disul!idic. (e cunosc mai multe catene de tip 6 notate convenional , , , i care stau la baza clasi!icrii imunoglobulinelor - 7gB 7g) 7g: 7g+ i 7g,. %atenele 2 sunt de dou tipuri 0 i 1 n !uncie de capacitatea lor antigenic
H 2N H2 N ca !n " ca !n H

COOH COOH

H2 N H 2N

Fig. *. Repre entarea schematic# a structurii imunoglo"ulinelor

$ " C " C H% C H2 C H&

$ H Si usuri d! l!#ar! a an i#!nului

Fig. -. Structura de "a # a .gG /0isono%%1 2. et al. 3 14-5) 7munoglobulinele cunoscute n prezent au !ost mprite n cinci clase n !uncie de structura catenelor lor de tip 6: 7gB 7g) 7g: 7g+ i 7g,. I,uno lobulinele 7 07gB1 reprezint apro$imativ MCD din totalul imunoglobulinelor din sistemul circulator au o mas molecular de 3C< A+a i o constant de sedimentare de M C (. 7gB se mpart n patru subclase n !uncie de natura i ponderea componentei glucidice a catenelor 6: 7gB 3 7gB@ 7gBH 7gBK. Pentru organismul uman toate imunoglobulinele B cu e$cepia 7gB H au capacitatea de a !orma compleci insolubili cu proteina ) din peretele celular al Staph,lococcus aureus. I,uno lobulinele M 07g:1 au masa molecular de N<< A+a i sunt alctuite din cinci subuniti. ,le conin n molecul zece situsuri de legare a antigenelor dei din motive sterice nu toate sunt !uncionale. I,uno lobuliele A 07g)1 au masa molecular de HO< A+a i constanta de sedimentare de 33 ( !iind prezente preponderent n saliv lapte secreiile genito-urinare etc. I,uno lobulinele D 07g+1 au o mas molecular de 3MC A+a i se gsesc n cantitate mare n membranele lim!ocitelor * sin s#nge. I,uno lobulinele E 07g,1 au masa molecular de 3N< A+a i sunt responsabile de reaciile ana!ilactice ce determin eliberarea de histamin. :ecanismul biosintezei anticorpilor este urmtorul: un antigen dat interacioneaz speci!ic cu lim!ocitele * capabile s-l recunoasc. "n urma acestei interaciuni este indus proli!erarea i trans!ormarea lim!ocitelor * urmat de biosinteza intens i eliberarea anticorpilor speci!ici Tit*ul antiserului se de!inete ca !iind diluia la care se realizeaz legarea a C<D dintr-un antigen marcat i are drept unitate de msur inversul !actorului de diluie. Afinitatea unui imunoser se evalueaz prin determinarea constantei de asociere L a la echilibru i se e$prim n mol-3. &(ecificitatea unui imunoser !a de un anumit antigen se de!inete ca !iind capacitatea sa de a recunoate numai antigenul respectiv. Antico*(i (oliclonali. anticorpi care mani!est speci!icitate !a de di!erii epitopi ai aceluiai antigen adic sunt seruri policlonale. Antico*(i ,onoclonali. !iecare antigen va interaciona numai cu celulele capabile s-l recunoasc. )ceast interaciune determin proli!erarea i maturarea lim!ocitelor respective !apt ce conduce la apariia celulelor cu 8memorie9 de lung durat anticorpii secretai !iind denumii anticorpi monoclonali. Ob$ine*ea i,uno'e*u*ilo*. se ine cont de mai muli !actori: specia animalului de e$perien natura antigenului necesitatea asocierii mai multor antigene utilizarea unor ad&uvani calea de administrare i doza necesar succesiunea administrrii etc. "n !uncie de rspunsul imun antigenele pot !i de dou tipuri: antigene cu capacitate imunogen imediat i respectiv #aptene. 6aptenele sunt specii moleculare 0cu mas molecular mic1 ce nu prezint capacitate imunogen dec#t dup cuplarea cu un 8purttor9 cu mas molecular mai mare de 3<<< +a. 'etodele imunometrice 6sand7ic#8 se deosebesc de cele prin competiie prin utilizarea anticorpilor n e$ces precum i prin utilizarea unui alt anticorp marcat n calitate de indicator al reaciei dintre antigene i primul tip de anticorpi .Primul anticorp se !i$eaz pe un suport solid insolubil ntr-o cantitate bine determinat n aa !el nc#t numrul total de situsuri de legare s !ie mai mare dec#t numrul de molecule de antigene din soluia etalon i respectiv din lichidul biologic de analizat. "n mediul de incubare antigenele vor interaciona n mod speci!ic la nivelul situsurilor de legare. "n momentul n care n mediul de incubare se adaug anticorpi marcai are loc interaciunea acestora cu antigenele !i$ate de&a pe moleculele primului anticorp ceea ce nseamn c antigenele sunt blocate ntre cei doi anticorpi 0de unde i denumirea de 8sandPich9 atribuit acestor metode1 0!ig. 331.

' ' ' '

)nticorp imobilizat )ntigenI )nticorp marcat

' ' '

-ig. 33. Principiile generale ale metodelor imunometrice de tip sandPich +up !ormarea interaciunilor anticorp imo"ili at3antigen#3anticorp marcat aceti compleci se separ relativ uor prin splare. )lturi de anticorpii imobilizai i cei marcai mai pot !i utilizai at#t anticorpii monovaleni c#t i anticorpii cu speci!iciti di!erite acest lucru mrind interesul cercettorilor !a de anticorpii monoclonali speci!ici !a de un singur epitop. 4rasarea curbei de etalonare se !ace trec#nd pe abscis concentraia antigenelor iar pe a$a ordonatelor intensitatea semnalului complecilor marcai )c G )g G )cQ curba obinut !iind di!erit de cea utilizat la metodele prin competiie a9 'etode n faz omogen)cestea reprezint ma&oritatea metodelor prin competiie i se aplic n special n cazul haptenelor. :etodele n !az omogen se bazeaz pe principiul EMIT 0Enz:me 'ultiplied Immuno$ssa: !est9 utilizat !oarte des la dozarea medicamentelor i a hormonilor cu mas molecular mic 0tiro$in cortizol etc.1 0!ig. N1. "n cazul acestor metode legtura dintre con&ugat i anticorp mascheaz centrul activ al enzimei care n !elul acesta nu poate ataca substratul. %antitatea de enzim activ deci implicit semnalul msurat crete o dat cu creterea concentraiei antigenului dozat.

Fig. 4. Repre entarea schematic# a principiului metodei E6.7 !n %a # omogen# /8ar"ier1 9. - 14:4)