Sunteți pe pagina 1din 31

CURSUL I

IMUNOLOGIA TBC
CARACTERE GENERALE ALE TUBERCULOZEI T 1. infecie bacterian specific termenul de T este rezervat de obicei mbolnvirii care se produce n urma infeciei cu M. tuberculosis (bacilul T de tip uman, R. Koch, 1882). Complexul M. tuberculosis, ageni patogeni ai T umane, pe lng M. tuberculosis include i M. bovis i M. africanum. mbolnvirile cu alte micobacterii (ex: M. kansasii, M. avium-intracellulare) sunt definite ca micobacterioze. 2.transmisibiltransmiterea inf. T se face interuman, de la B eliminatori de bK la contacii lor sntoi: contaminarea se produce pe cale aerian, prin inhalarea unor particule microscopice de secreii respiratorii care conin bacili. Dei sunt cunoscute i
alte ci de transmitere, acestea se materializeaz numai rarisim i nu au semnificaie patologic.
2

3. larg, dar neuniform rspndit T a fost i este nc larg rspndit pe ntreaga suprafa a globului. Studiile arheologice i mrturiile istorice sugereaz c, iniial sporadic, apoi epidemic i n final endemic, tuberculoza afecteaz specia uman de cel puin 6000 de ani. A fost considerat secole de-a rndul drept un redutabil pericol social pt care nu existau remedii eficiente. n ultimii 50 de ani, dei au devenit disponibile mijloace i strategii eficace de combatere a bolii, ea continu s reprezinte la scar mondial o problem grav de sntate comunitar. Date recente OMS arat c n prezent aprox. o treime din populaia lumii este infectat cu M. tuberculosis i c anual se nregistreaz cca 9 milioane de cazuri noi de mbolnvire.
3

T este neuniform rspndit geografic. Exist o discrepan flagrant ntre situaia epidemiologic a bolii din multe ri avansate ale emisferei nordice (n special din Europa i America de Nord) i cea din rile n curs de dezvoltare (din Africa, Asia, America Latin). n primele, T a nregistrat dup al doilea rzboi mondial un declin evident, considerat de muli drept un preambul al eradicrii ei, n timp ce n ultimele boala nu a ncetat s reprezinte un adevrat flagel social. n plus, n ultimii 10-15 ani s-a nregistrat n ntreaga lume o tendin la recrudescen a T , care afecteaz grav rile srace, dar se resimte i n multe dintre rile mai favorizate economic.
4

4. endemic caracterul endemic are ca substrat capacitatea de autoperpetuare a infeciei i bolii. La specia uman B contagioi difuzeaz larg inf. n jurul lor,
dar aceasta rmne de regul latent, neafectnd cu nimic starea de sntate a celor infectai. Dintre infectai o proporie redus (n jur de 10%) fac mbolnviri patente devenind surse de contaminare. Se creaz cercul vicios infecie-mbolnvire-noi infecii, care poate ntreine endemia virtual indefinit.

5. disjuncia infecie/boal din tuberculoz infecia cu M. tuberculosis (curent infecia tuberculoas) nu este sinonim cu mbolnvirea tuberculoas (tuberculoza boal, curent tuberculoz). Procesul tuberculos se

desfoar n 2 faze: a) constituirea strii de inf, caracterizat de instalarea hipersensibilitii ntrziate cu suport celular (IDR la PPD pozitiv); b) producerea ulterioar a mbolnvirii tuberculoase, caracterizat de alterri tisulare care au ca substrat necroza cazeoas; amploarea i intensitatea acesteia determin suferina clinic propriu-zis.
5

Dintre subiecii infectai, cea mai mare parte, 8090%, nu se vor mbolnvi niciodat de T; dintre persoanele infectate numai 10-20% vor face boala, i anume cei la care mecanismele lor de aprare antiinfecioas sunt serios compromise. 6. afecteaz toate vrstele, prioritar pe cele socioprofesional active, 15-50 ani;

susceptibil de a fi contagioas; T extrapulmonar afecteaz cel mai frecv pleura, ganglionii limfatici, coloana vertebral, articulaiile, cile genitourinare, sistemul nervos sau abdomenul. 8. cronicitate, cu letalitate ridicat n condiiile unei endemii neinfluenate de msuri profilactice i curative eficiente; pe glob cca 3 milioane de decese anual.
6

7. localizri multiple: T pulmonar este forma cea mai frecv a bolii (cca. 80% din cazuri) i practic singura form

9. polimorfism lezional (lez. infiltrative, exudative, necroz de cazeificare) i clinic (mergnd de la forme asimptomatice sau torpide, pn la forme acute sau supraacute).

Aceste caracteristici, alturi de condiionarea socio-economic, fac din T o boal extrem de original, care trebuie studiat din 2 pdv la fel de importante. Pe de o parte, din pdv general, trebuie cunoscut extensia bolii i a inf. ntr-o populaie dat; epidemiologia tuberculozei, mai mult dect n orice alt afeciune este de interes primordial. Pe de alt parte, din pdv al individului mbolnvit, trebuiesc cunoscute interrelaiile gazd-bacil pe plan histo-patologic i imunologic.
7

TUBERC. EXPERIMENTAL. FENOMENUL KOCH La cobai,specia cea mai sensibil la infectia T (mortalitate 100% dup contaminrile virulente), inocularea subcutanat sc a unei doze suficiente de bacili umani viruleni (0,1mg) determin, dup scurgerea unei perioade de laten de cca 2 sptmni apariia unui nodul care evolueaz spre ulcerare i care nu se mai nchide pn la moartea animalului. De la locul inoculrii inf invadeaz cile limfatice regionale provocnd apariia unei adenopatii locale (adenopatie inghinal n cazul inoculrii sub pielea coapsei). n continuare inf se generalizeaz n toate viscerele pe cale limfatic i hematogen. Animalul prezint simptome de boal ac progresiv (apatie, refuzul hranei, slbire, febr, tahipnee, caexie) care duc la moarte n 6-8 sptmni. Necropsia evideniaz leziuni tbc ale tuturor viscerelor
(plmni, splin, ganglioni, peritoneu, ganglioni abdominali, etc.).
8

Fenomenul Koch, descris de Koch n 1891, cuprinde secvena de reacii care apar la reinocularea s.c. de bacili viruleni efectuat n alt punct al organismului (coapsa opus) dup constituirea leziunilor locale la locul inoculrii iniiale. Aceste reacii difer de cele nregistrate dup prima inoculare prin urmtoarele caractere: 1) apar rapid, fr interval de laten, n 24-48 de ore constituindu-se un nodul local necrotic care se elimin (escar); 2) ulceraia local se vindec spontan; 3) nu sunt urmate de propagarea inf dincolo de locul reinoculrii, bacilii fiind distrui i eliminai pe loc. Dei animalul moare ntr-un interval de timp similar celui constatat la cobaii care au suferit numai prima inoculare i prezint aceleai leziuni diseminate la autopsie, dac la a 2 inoculare s-au folosit germeni diferii (marcai), din leziuni nu se identific dect germenii utilizai la prima inoculare.

Diferena de rspuns dovedete faptul c organismul uman infectat a dobndit concomitent o stare de hipersensibilitate (alergie) i o rezisten crescut (imunitate) fa de bacilii tuberculoi. Starea de hipersensibilitate face ca: rspunsul la noile contacte cu agentul patogen s fie rapid (fr interval de laten) i brutal (necroz tisular acut) iar rezistena crescut este ilustrat de: vindecarea spontan, rapid i complet a leziunilor celei de-a doua inoculri, lipsa afectrii ganglionului satelit, lipsa generalizrii limfo-hematogene.

10

REACIA LA TUBERCULIN Antigen 1. PPD-RT23 (1958) lot standard internaional este un lot f mare de tuberculin purificat produs de Statens Serum Institute din Copenhaga n 1958 pt a asigura omogenitatea produsului antigenic folosit n studii epidemiologice n lumea ntreag. O unitate din aceast soluie conine 0,0002 mg de tuberculin purificat;un mg de PPD este echivalent cu 500 mg de tuberculin brut. 2. n Romnia: PPD-IC65 (2 i 10 UI) de la 01.01.1973 a fost generalizat folosirea unei diluii de 2u PPD IC65 la 0,1 ml, etalonat n raport cu o diluie corespunztoare de PPD RT23.
11

Administrare
1) intradermoreacie (IDR, Mantoux); 2) cu sering i ace speciale pt injecii intradermice id: se utilizeaz numai seringi cu volum de maximum 1 ml i cu diviziuni clar marcate, cel puin pentru fiecare 1/10 ml i ace pentru injecii id de unic ntrebuinare; 3) pe faa anterioar a antebraului stg., la unirea treimii medii cu cea superioar, dup o prealabil dezinfecie a tegumentului cu alcool sau alcool-eter; 4) 0,1 ml coninnd 2 uniti, strict intradermic. Dovada injectrii corecte este fcut de apariia imediat, la locul de inoculare, a unei papule albicioase (ischemice) de 5-6 mm diametru cu aspect de coaj de portocal. Citire - la 72 ore; test negativ sau t. pozitiv

12

Test negativ - absena induraiei locale sau cnd diametrul transversal al acesteia este de maxim 9 mm; Test pozitiv 1) papul dermic, dur, n relief fa de tegumentele N din jur, deseori delimitat de acestea printr-un burelet destul de net, eventual flictene i necroz; reacia eritematoas de la 24-48 de ore, ce traduce o reacie histaminic local, nu se ia n consideraie; 2) se msoar diametrul maxim transversal (n mm) delimitat preferabil prin palpare; cnd diametrul este de 10 mm sau mai mare, reacia este considerat pozitiv; 3) Tipuri Palmer tip I: induraie ferm sau cu flictene, tip II: induraie elastic, tip III: infiltraie depresibil, tip IV: fr infiltraie aparent.
13

Interpretare
NEGATIV = absena infeciei. Reacia negativ exprim urmtoarele posibiliti: 1) individul nu a fost infectat cu bacili Koch i nici nu a fost vaccinat BCG; 2) individul a fost infectat sau vaccinat f recent i se gsete n perioada antealergic (n care nu s-a instalat nc
alergia)

a crei durat poate fi de 4-8 sptmni;

3) dei individul a devenit alergic, n momentul testrii poate prezenta o eclips a reaciei, datorit unei multitudini de factori specifici sau nespecifici:
maligne avansate, viroze recente, inclusiv gripa, hepatita, SIDA, unele infecii bacteriene, .a.),

- boli cu efect imunodepresor (sarcoidoz, limfoame maligne, leucemii, neoplazii - terapie antitub. sau citostatic, corticoterapie, raze X sau UV, - menstruaie, graviditate,

un grad de anergie cutanat.

- oc, caexie, malnutriie, vrst avansat, - Tuberculoze avansate (pulmonare distructive extinse, miliare) traducnd
14

vaccin necorespunztor prin scderea activitii antigenice a PPD, lectur i interpretare incorect. POZITIV = infecie prezent. Reacia pozitiv exprim starea de inf tuberculoas (natural sau artificial, pe cale vaccinal). Testul tuberculinic nu informeaz asupra vechimii infeciei i a gradului de activitate a leziunilor.
mic, injectare prea profund),

4) defecte de tehnic: administrare incorect (dozare prea

Exist ns cteva situaii n care o reacie la tuberculin poate preciza data infectrii i stadiul de activitate al bolii, impunnd o atitudine terapeutic:
1) Viraj tuberculinic sau test pozitiv la copiii de 0-4 ani nevaccinai BCG = primoinfecie recent (= activ!). Virajul tuberculinic se numete succesiunea de 2 testri, prima cu rezultat negativ iar a doua pozitiv. 2) Salt tuberculinic (creterea intensitii alergiei ntre 2 testri succesive cu cel puin 10 mm)= (supra)infecie recent (activ!). Dac aceast cretere este

mare i se produce ntr-un interval scurt, de 6-12 luni, ea atrage atenia asupra pericolului de transformare a infeciei tuberculoase n tuberculoz boal.
15

Pt aprecierea corect a celor 2 situaii de mai sus trebuie fcut distincia ntre alergia post-vaccinal i cea din infecia natural. Alergia post-vaccinal este de regul mai puin intens dect cea prin infecie natural i de durat mai scurt. n timp ce, dup infecia natural alergia se instaleaz n proporie de peste 95% i este bine exprimat i durabil, dup vaccinarea intradermic cu BCG alergia depete rareori diametrul de 20 mm i dup civa ani are tendina de stingere (reversie tuberculinic). 3) efect booster = Apare prin repetarea testrilor la intervale prea scurte i poate fi interpretat eronat ca un salt tuberculinic. nseamn creterea dimensiunilor reaciei cu 3-8 mm ntre 2 testri practicate la 12 luni interval, n cursul unei alergii post-vaccinale care se terge n decursul timpului sau al unei primoinfecii naturale petrecute cu mult nainte (la persoanele n vrst). Nu are semnificaie patologic ci doar de rememorare imunitar.

16

CARACTERE GENERALE ALE RSPUNSULUI IMUN N TUBERCULOZ mediat celular celule efectoare: macrofage si limfocite T Componente: hipersensibilitate ntrziat (ALERGIE) si rezisten relativ (IMUNITATE) Macrofagele pulmonare sunt celule funcionale ale sistemului fagocitar mononuclear. Formele tinere, provenite din promonocite i progenitorii lor din mduv, circul aproximativ 30-72 de ore n snge ca monocite, migrnd ulterior n esuturi, unde se regsesc cu aspecte morfologice, comportamente funcionale i denumiri variate (microglia-SNC, celule Kupffer-ficat, osteoclast-os, condroplast-cartilagiu, etc.). Aceste forme mature nu se recircul i au o durat de via de la 75 de zile pn la ani de zile.
17

Macrofagele alveolare sunt stocate n reeaua capilar pulmonar, unde se difereniaz nainte de a depi bariera alveolo-capilar i de a ptrunde n spaiile aeriene distale unde i vor ndeplini multiplele funcii. Sunt celule de talie mare, mononucleate, bogate n mitocondrii i n lizozomi, suportul unor activiti enzimatice multiple. Prin fuziune, ele genereaz celule gigante multinucleate i celule epitelioide. Macrofagele intervin: 1) n etapa iniial a rspunsului imun ca celule prezentatoare de Ag : - capteaz sau fagociteaz nespecific Ag nativ

(germeni, celule mbtrnite, celule tumorale, celule distruse prin diverse procese patologice);

- prelucreaz acest antigen cu eliberarea unui epitop (E); E are determinai antigenici foarte accesibili i foarte uor expozabili diverilor receptori, fiind astfel mult mai imunogenic dect antigenul nsui;
18

- elibereaz o serie de fact. imunoreglatori nespecifici


(monokine, metabolii activi ai oxigenului, lipide bioactive generate att pe calea

cu rol n amplificarea sau supresia rspunsului imunologic; 2) n etapa final ca celule efectorii (citotoxicitatea).
ciclooxigenazei ct i pe calea lipooxigenazei -PGA, LT, proteaze inhibitorii, etc.)

Limfocitele

Limfocitele T. Scopul final al activrii celulelor T este de a induce generarea unor seturi diferite de subpopulaii celulare T cu specificitate antigenic (helper, supresor, contrasupresor, supresor-inductor). Efectorul limfocitar T particip la exprimarea reaciilor de hipersensibilitate ntrziat, crete rezistena la microorganismele cu multiplicare intracelular (mycobacterii, brucele, listerii), lizeaz celulele neoplazice sau infectate viral, particip la generarea granuloamelor imune.
19

Studii detailate asupra subseturilor de limfocite T efectoare la nivel pulmonar au demonstrat c marea majoritate a limfocitelor CD4 exprim fenotipul caracteristic pt o activitate de tip helper (CD4+/CD29+/CD45RO). Aceste celule stimuleaz sinteza Ig in vitro dar nu pot media i supresia, hipersensibilitatea de tip ntrziat sau citoliza. Spre deosebire de acestea, celulele care exprim fenotipul CD4+/CD45RA+ (supresor-inductor) pot s activeze celulele CD8 supresoare, s medieze mecanismele hipersensibilitii de tip ntrziat i activitatea citotoxic mediat celular. Ambele subseturi de celule CD4, helper i supresorinductor, sunt implicate n tolerana imun la unele microorganisme i antigene.
20

Celulele supresoare exercit un efect supresor asupra cel B. n termeni de fenotip, se difereniaz greu cel CD8 supresoare de cel CD8 citotoxice, cu att mai mult cu ct ele au markeri de suprafa similari. Cel CD8 citotoxice, prezente n nr mic n plmnul persoanelor sntoase, joac un rol central n imunitatea antiviral, i sunt direct implicate i n protecia mpotriva unor bacterii i a protozoarelor. Inhib creterea intracelular a M. tuberculosis i lizeaz macrofagele alveolare infectatea cu M. tuberculosis. Ele sunt eseniale i pt protecia antitumoral; sunt implicate n patogenia unor boli pulmonare autoimune, deoarece n anumite circumstane pot s medieze liza constituenilor N ai parenchimului pulmonar. n plus, cel citotoxice particip la mecanismele ce conduc la reacia gazdei de rejecie a transplantului pulmonar alogenic.
21

Din

punct de vedere al secreiei de citokine, celulele T se mpart n 2 grupe: Th1 i Th2. Celule de tip Th1 produc IFN-, celule de tip Th2 produc IL-4, IL-5 iar ambele tipuri de celule produc IL-2, IL-6, IL-10 i IL-13. Activitatea de tip Th1 este suportul imunitii de tip celular prin sprijinirea activitii microbicide a macrofagelor precum i prin iniierea i amplificarea rspunsurilor de tip hipersensibilitate ntrziat. Activitatea de tip Th2 este la baza imunitii de tip umoral prin iniierea i stimularea creterii i diferenierii limfoc. de tip B.
22

IMUNITATEA PROTECTOARE Hipersensibilitate (H), imunitatea (I) sunt induse concomitent i ntreinute de persistena germenilor n organismul infectat ("imunitatea de infecie"). Dar contrar hipersensibilitii ntrziate, care poate fi indus i prin injectarea de extracte proteice bacteriene (de ex. tuberculina),
instalarea unei imuniti antibacteriene necesit contactul cu bacterii vii i persistena lor n organism.

H explic: - reacia local din cadrul fenomenului Koch, - particularitile morfologice caracteristice T - reacia la tuberculin.
I are un caracter relativ deoarece: - nu exclude mbolnvirea sau rembolnvirea, - poate fi depit de contaminrile masive i repetate, - poate suferi fluctuaii importante sub influena condiiilor nespecifice de teren sau de mediu, - prezena ei este condiionat de persistena inf n organism.
23

H i I au o dinamic deseori neparalalel. Astfel, reactorii la tuberculin pot fi purttori de infecii oculte
sau B cu T severe (cu I deficitar), iar anergia sau hipoergia tuberculinic (depresie a H) din unele boli sau condiii fiziologice nu antreneaz n mod obligatoriu mbolnvirea T
(cu I eficient) (depresie a I).

RI al speciei umane la inf micobacteriene este global f. eficace.Mecanism. imunitii protectoare antimicobacteriene, ca i factorii care determin rezistena/susceptibilitate sunt n T probleme nc neelucidate. Expunere iniial: fr infecie, aprox. 70% - aprare nativ (neimunologic) eficient cu infecie, aprox 30% - aprare nativ (neimunologic) ineficient laten, aprox. 20% - aprare imun eficient mbolnvire precoce, aprox. 5% - aprare imun ineficient mbolnvire tardiv, aprox. 5% - aprare imun ineficient

Total mbolnviri: aprox. 10% din infectai


24

Rezistena natural (nativ) este o caracteristic de specie, determinat genetic. Astfel M. tuberculosis este patogen pt om, cobai i maimu i nepatogen pt cal, capr i psrile domestice; mai mult chiar, n interiorul aceleiai specii exist indivizi cu grade diferite de rezisten.
TIPURI ELEMENTARE DE LEZIUNI TUBERCULOASE Exista un bimorfism tisular i imunologic cu:

1. Leziuni exudative - alterative (hipersensibilitate)


- arii nodulare mici, bronhopneumonice

sau pneumonice (subsegmentare, segmentare sau mai mari), care au ca substrat - alveolita fibrino-celular aglomerarea de macrofage (nsoite de un nr oarecare de PMN) i limfocite n spaiile alveolare umplute de un exudat mai mult sau mai puin bogat n fibrin. n aceste zone se gsesc bacili n nr mare cu multiplicare activ - n cazeumul lichefiat bacilii gsesc un mediu favorabil i se multiplic extracelular; rezult o expunere antigenic extins care duce la distrugerea esutului astfel impregnat cu - tendin marcat la extensie i necroz de cazeificare cu posibila lichefiere i eliminarea cazeumului (ulcerare/ cavern).
(lobulare)
25

2. Leziuni nodular-proliferative (rezisten) a) Tipuri de leziuni : a foliculi Koester - aspect "n cocard": - centru cazeos, - celule gigante Langhans sunt celule epitelioide multinucleate care au fuzionat una cu alta (cel mai frecvent n jurul unui mic fragment de esut necrozat cazeos). Nucleii lor sunt dispui ca o coroan la periferia celulei. - coroan de macrofage / epitelioide. Celulele epitelioide sunt macrofage activate, uneori organizate ntr-o structur asemntoare celei epiteliale. Nucleii lor traduc o transcripie ADN foarte activ i implicit o activitate foarte susinut de sintez; aceasta explic rolul lor n inhibarea sau distrugerea micobacteriilor fagocitate (bacteriostaz sau bactericidie) i n limitarea progresiunii bolii. - coroan de limfocite, plasmocite i fibroblati.
26

a esutul de granulaie tuberculos esut reacional activ format prin proliferarea difuz a celulelor mezenchimale din jurul ariilor necrotice sau sever modificate; structura sa este de esut conjunctiv vascular. Rolurile esutului de granulaie sunt n funcie de rezistena imunitar a gazdei: la gazda imunocompetent poate opri prin ncapsulare progresia leziunilor, la gazda imunodeficient, dimpotriv, poate favoriza extensia acestora prin necroza stratului intern granulativ i nlocuirea lui proliferativ la periferie. b) Caracteristici - multiplicare bacilar minim n cazeumul solid. Cazeumul reprezint zone de necroz specific leziunii T, relativ omogene, de culoare alb-glbuie, bogate n lipide i proteine provenind din bacilii i celulele (predominent macrofage) distruse. Cazeumul este avascular iar vasele adiacente sunt trombozate. Are un pH acid, concentraii foarte joase de oxigen i, probabil, conine produi de metabolism toxici, ceea ce explic de ce n cazeum nr de bacili este f redus i mutiplicarea lor este aproape abolit. Focarele de necroz cazeoas se pot calcifica sau chiar osifica. - tendin la extensie lent.
27

3. Leziuni mixte: exudativ proliferative: se ntlnesc frecvent concomitent, localizate n diferite zone ale plmnului sau constituind mozaicuri n cadrul unei aceleiai leziuni, cu preponderena unuia sau a altuia din cele 2 tipuri de modificri i cu posibila transformare dintr-un tip n cellalt, n funcie de echilibrul delicat dintre bacil i organismul gazd.

Evoluia leziunilor progresiv prin extensie contigu, bronic, limfogen, hematogen: - lichefierea cazeumului caverne, - extensie lezional "in situ" sau la distan. regresiv: - rezorbie, - reparaie (esut de granulaie, fibroz, calcificare sau osificare).
28

1. Clasificri ale tuberculozei T T poate fi clasificat n funcie de variate criterii: - n raport cu organul afectat: pulmonar, extrapulmonar, mixt; - n raport cu momentul infeciei: tuberculoza primar, tuberculoza secundar; - n raport cu manifestrile clinice, radiologice, cu situaia bacteriologic, cu tratamentul administrat.

Toate clasificrile care se fac n raport cu momentul infeciei respect principiul evoluiei ciclice a TBC (n parte analoag celei a sifilisului). Clasificrile ciclice uzuale sunt bistadiale i au un caracter explicativ (patogenic) urmnd s stabileasc legtura dintre formele bolii i mecanismul apariiei lor.
29

1. Clasificarea tristadial (Ranke 1916-1926) TBC primar - viraj tuberculinic - complex primar TBC secundar - alergie intens - extensie local - extensie limfohematogen TBC teriar - ftizie izolat de organ - cronic-progresiv - leziuni cavitare
30

2. Clasificarea bistadial TBC primar (= TBC primar + secundar Ranke) TBC secundar (= TBC teriar Ranke) 3. Alte clasificri TBC primar, TBC postprimar TBC de tip infantil, TBC de tip adult Clasificri pragmatice, utilitare, care orienteaz deciziile cu caracter practic: - OMS are la baz standardizarea i codificarea raportrii cauzelor de mbolnvire i deces pt a face posibil compararea datelor statistice pe plan internaional; - Clasificarea American Thoracic Society are obiective cu caracter epidemiologic-profilactic, opernd cu conceptele de expunere, infecie i boal patent.
31