PROTEINE

Proteinele

compui naturali macromoleculari, formai prin
policondensarea aminoacizilor

una sau mai multe catene polipeptidice:
o singur caten polipeptidic- protein monomer
mai multe catene polipeptidice -protein multimer
homomultimer: un singur tip de caten polipeptidic
heteromultimer: dou sau mai multe tipuri de catene


CLASIFICARE
HOLOPROTEINE
alctuite exclusiv din catene polipeptidice
HETEROPROTEINE (proteine conjugate)
alctuite din:
catene polipeptidice
grupri neproteice
dac partea neproteic este important pentru funcia
proteinei, se numete grupare prostetic
Ex. prot conjugate: glicoproteine, lipoproteine, nucleoproteine,
fosfoproteine, metaloproteine, hemoproteine, flavoproteine


Hemoglobina-protein conjugat
heteromultimer

Hemoglobina (Hb) este
un heterotetramer o
2
|
2

Hemul, gruparea prostetic a hemoglobinei
RNaza- ribonucleaza A bovin
enzim, 124 aminoacizi;
nu conine Trp
ADH-alcool dehidrogenaza din ficatul de cal
enzim dimer
dou catene identice de cte 374
aminoacizi.
compoziia n aminoacizi reprezentativ
pentru proteinele solubile n ap
Mb-mioglobina de caalot
protein care leag oxigenul
format din 158 aminoacizi
nu conine Cys
Compoziia n aminoacizi a unor proteine
(% de reprezentare)
Proteina
Aminoacid RNaza ADH Mb
Ala 6.9 7.5 9.8
Arg 3.7 3.2 1.7
Asn 7.6 2.1 2.0
Asp 4.1 4.5 5.0
Cys 6.7 3.7 0
Gln 6.5 2.1 3.5
Glu 4.2 5.6 8.7
Gly 3.7 10.2 9.0
His 3.7 1.9 7.0
Ile 3.1 6.4 5.1
Leu 1.7 6.7 11.6
Lys 7.7 8.0 13.0
Met 3.7 2.4 1.5
Phe 2.4 4.8 4.6
Pro 4.5 5.3 2.5
Ser 12.2 7.0 3.9
Thr 6.7 6.4 3.5
Trp 0 0.5 1.3
Tyr 4.0 1.1 1.3
Val 7.1 10.4 4.8
Aminoacizi RNaza ADH Mb
Acizi 8.4 10.2 13.7
Bazici 15.0 13.1 21.8
Aromatici 6.4 6.4 7.2
Hidrofobi 18.0 30.7 27.6
Histona H3
protein cromozomal care leag ADN;
135 resturi aminoacizi,
puternic bazic: abundena Arg i Lys
nu conine Trp
Colagenul
protein structural extracelular
1052 aminoacizi
compoziie atipic: 1/3 Gly i Pro.
lipsit de Cys i Trp
srac n aminoacizi aromatici
Compoziia n aminoacizi a unor proteine
(% de reprezentare)
Proteina
Aminoacid Histona H3 Colagen
Ala 13.3 11.7
Arg 13.3 4.9
Asn 0.7 1.0
Asp 3.0 3.0
Cys 1.5 0
Gln 5.9 2.6
Glu 5.2 4.5
Gly 5.2 32.7
His 1.5 0.3
Ile 5.2 0.8
Leu 8.9 2.1
Lys 9.6 3.6
Met 1.5 0.7
Phe 3.0 1.2
Pro 4.4 22.5
Ser 3.7 3.8
Thr 7.4 1.5
Trp 0 0
Tyr 2.2 0.5
Val 4.4 1.7
Aminoacizi Histona H3 Colagen
Acizi 8.1 7.5
Bazici 24.4 8.8
Aromatici 5.2 1.7
Hidrofobi 23.0 6.5



Diagrama Venn
n funcie de proprietile lor,
aminoacizii se vor gsi
prefernial n anumite poziii
din structura proteinelor
Dimensiunile proteinelor
-variaz n limite largi
Dimensiunile proteinelor
Proteina
Mr (kDa) Nr resturi
aminoacid per
caten
Organizarea
subunitilor
Insulina (bovin)
5,733 21 (o)
30 (|)
o|
Citocrom c (ecvin)


12,5 104 o1
Ribonucleaza A (pancreas bovin)
12,64 124 o1
Lizozim (albu de ou)


13,93 129 o1
Mioglobin (cal)


16,98 153 o1
Dimensiunile proteinelor
Proteina Mr (kDa) Nr resturi
aminoacid
per
caten
Organizarea
subunitilor
Hemoglobin (uman)




64,5 141 (a)
146 (b)
a
2
b
2

Glutamin
sintetaza (E. coli)
600,0 468 a
12


Arhitectura proteinelor

Form: fibroas sau globular
Nivelurile structurii proteice
Primar: secvena/succesiunea aminoacizilor n catena
polipeptidic
Secundar: structuri locale formate prin legturi de
hidrogen ntre atomii legturilor peptidice
Teriar: forma tridimensional de ansamblu a catenei
polipeptidice
Cuaternar: organizarea subunitilor
NIVELURILE STRUCTURII PROTEICE
1. Structura primar 2. Structura secundar
3. Structura teriar
4. Structura cuaternar
o-helixul |-structura bucl conectoare
monomer
tetramer
o - | - o
Regulile structurii proteice
1. Funcia unei proteine este determinat de forma
sa tridimensional
2. Forma 3D a unei catene polipeptidice este
determinat de secvena sa de aminoacizi
3. Secvena aminoacizilor dintr-o caten
polipeptidic este determinat de succesiunea
nucleotidelor n gena care o codific
Corelaii structur 3D-funcie
Proteinele structurale:
fibroase
insolubile n ap
Ex. colagenul
alctuit din trei catene
polipeptidice rsucite helical
n compoziia sa predomin
Pro, Hyp, Gly

Corelaii structur 3D-funcie
Proteinele solubile
ndeplinesc roluri metabolice
sunt molecule globulare, pliate
compact
Ex. mioglobina
hem-protein
transport O
2
i CO
2
la/de la muchi
modelul de pliere:
aminoacizii hidrofili la exterior
aminoacizii hidrofobi n interior
proteina este solubil n ap

Corelaii structur 3D-funcie
Proteinele membranare
catenele laterale hidrofobe sunt
expuse n regiunile transmembranare
prile expuse mediului apos au
caracter hidrofil, similar proteinelor
solubile
Ex: bacteriorodopsina
leag pigmentul cis-retinal
implicat n absorbia luminii, la
bacterii

Structura primar: secvena de aminoacizi a
proteinelor
unic i caracteristic fiecrei proteine
codificat de secvena de nucleotide a ADN
este o form de expresie a informaiei genetice
se citete de la captul N-terminal spre cel C-terminal

Secvena
ribonucleazei A
(Structura primar)

Structura secundar a proteinelor
rearanjarea catenei polipeptidic n segmente:
helicale
pliate
prin legturi de hidrogen ntre resturile adiacente de aminoacizi
segmentele cu structur regulat se extind pe o singur dimensiune

Structura teriar
catena polipeptidic a moleculei proteice se repliaz structur
compact
conformaia globular:
confer raportul cel mai mic suprafa/volum
micoreaz interaciunile proteinei cu mediul nconjurtor

Structura cuaternar
la proteinele alctuite din dou sau mai multe
catene polipeptidice care interacioneaz reciproc
fiecare caten=subunitate proteic
organizarea subunitilor =structur cuaternar
aspectele definitorii:
felul i tipul subunitilor constituente
organizarea spaial
interaciunile dintre subuniti

HEMOGLOBINA
alctuit din dou catene polipeptidice o i dou |, hemoglobina
reprezint un exemplu pentru structura cuaternar a proteinelor
n aceast reprezentare, catenele | se afl n partea superioar a
moleculei iar o n partea inferioar
gruprile hem ale celor patru catene de globin sunt reprezentate prin
ptrate
ionii de fier sunt reprezentai prin sfere
aranjamentul subunitilor este simetric.

Structura primar
reprezint succesiunea (secvena) aminoacizilor n catena polipeptidic
conine ntreaga informaie necesar realizrii structurilor superioare
ierarhic ale proteinei
secvena repetitiv de-a lungul catenei polipeptidice se numete
schelet polipeptidic
la acesta sunt ataate prile din aminoacizi care nu particip la
formarea legturilor peptidice:
un atom de hidrogen
gruparea R=caten lateral
asigur distinctivitatea aminoacizilor proteici

Polaritatea (sensul) catenelor polipeptidice

extremitile lor sunt distincte chimic:
una are o grupare amino liber (N-terminus)
cealalt are o grupare carboxil liber (C-terminus)
direcia unei catene polipeptidice poate fi exprimat ca NC
sau CN
prin convenie, cnd sensul unei catene polipeptidice nu este
indicat explicit, se consider NC
acesta este sensul sintezei ei pe ribozomi, de la aminoacidul
N-terminal spre aminoacidul C-terminal.

Diversitatea aminoacizilor proteici
proteinele sunt alctuite dintr-un repertoriu de 20 de aminoacizi
gruparea R (caten lateral) = partea variabil de la un aminoacid la altul
R poate fi:
de dimensiuni mici, cu structur simpl
Ex. un atom de hidrogen (Gly); un radical metil (Ala).
aromatice (Phe, Tyr, Trp).
majoritatea catenelor laterale nu prezint sarcini electrice, dar:
dou ns sunt ncrcate negativ (Asp, Glu)
trei sunt ncrcate pozitiv (Arg, His, Lys)
unii aminoacizi sunt polari (Gly, Ser, Thr)
alii sunt nepolari (Ala, Leu, Val)
cei 20 de aminoacizi proteici standard:
sunt specificai de codul genetic
particip la sinteza catenelor polipeptidice (translaie)
Alte cauze ale diversitii structurale
a proteinelor
diversitatea chimic a proteinelor nu se limiteaz ns la cei 20
de aminoacizi standard
aminoacidul selenocisteina (Se-Cys)
similar Cys dar are Se n loc de S
poate fi inserat ntr-o caten polipeptidic n timpul sintezei proteinelor,
printr-o modificare a modului de citire a informaiei genetice.
n timpul prelucrrii proteinelor, unii aminoacizi sunt modificai chimic
prin:
adugarea unor grupri chimice noi (acetilare, fosforilare)
ataarea unor catene oligoglucidice voluminoase
proteinele prezint un grad nalt de variabilitate chimic:
specificat de genom
rezultat din prelucrarea post-translaional.


n structura primar:

aminoacizii sunt legai ntre ei prin legturi peptidice
se formeaz prin reacia de condensare dintre:
gruparea carboxil a unui aminoacid
gruparea amino a altui aminoacid




Legtura peptidic
este mijlocul de legare a aminoacizilor ntre ei, pentru a
forma catene polipeptidice
reprezentarea -CO-NH- sugereaz posibilitatea rotaiei
n jurul legturii C-N, ceea ce nu concord cu realitatea
energia de activare a acestei rotaii este de 80 kJ.mol
-1

mai potrivit este reprezentarea legturii amidice ca fiind
planar
delocalizarea extins a perechii de electroni neparticipani ai N
confer legturii peptidice caracter parial de legtur dubl

Legtura peptidic este planar

Cei 6 atomi ai gruprii peptidice sunt n acelai plan:

Caracteristici geometrice ale legturii peptidice
Legtura peptidic

aprox. 0,133 nm lungime
mai scurt dect o legtur simpl tipic ( 0,154 nm)
mai lung dect o legtur dubl ( 0,121nm)
are caracter parial (40%) de dubl legtur
N parial polarizat pozitiv
O parial polarizat negativ
datorit caracterului de legtur dubl, cei ase
atomi implicai n legtura peptidic sunt totdeauna
planari
de obicei, configuraie trans


n legtura peptidic:
atomii C
o
se gsesc n poziie trans unul fa de cellalt
form mai stabil cu circa 12 kJ.mol
-1
dect cis
n cis apar repulsii electrostatice ntre catenele laterale ale
aminoacizilor.
cnd Pro este implicat n legtura peptidic:
diferena de energie dintre formele cis i trans este mai mic
forma cis apare uneori n proteine
rotaia este permis n jurul legturilor simple dintre
C

C carbonilic
C

N aminic.


Structura unitii dipeptidice

sunt evideniate unghuirile de rotaie
n jurul legturilor atomului central Co
|==180 corespunde unei catene
polipeptidice extinse complet.

poate fi descris n termeni ai
unghiurilor diedre | i
prin rotaia n jurul acestor
legturi:
se modific unghiurile | i
se schimb distana dintre atomii
nelegai direct unul de altul
variaz energia unitii dipeptidice
cnd atomii nelegai ntre ei sunt
adui n imediat vecintate:
norii lor electronici se suprapun
apar repulsii electrostatice
destabilizare

Configuraie vs. conformaie
configuraiile D- i L-ale gliceraldehidei nu pot fi interconvertite fr
a scinda i reface legturi covalente.
cele dou configuraii se gsesc n relaie de reflectare (obiect-
imagine n oglind, nesuperpozabile prin translaie sau rotaie n
plan).
Configuraie vs. conformaie
chiar i pentru moleculele simple, rotaia liber n jurul
legturii covalente simple creaz o varietate de conformaii
tridimensionale.
n cazul1, 2-dicloretanului, predomin trei orientri rotaionale
principale.
repulsiile sterice dintre conformaiile eclipsate i parial
eclipsate menin numrul posibilitilor n limite rezonabile

Conformaiile catenelor polipeptidice
2 din 3 legturi covalente din scheletul
polipeptidic sunt simple i permit rotaia
liber
proteinele au posibiliti conformaionale
teoretic nelimitate
doar un numr mic sunt favorizate
energetic n condiii fiziologice
regulile care direcioneaz plierea
catenelor polipeptidice nu au fost elucidate
complet
DETERMINAREA STRUCTURII
PRIMARE (SECVENEI)
proteinelor

Determinarea secvenei proteinelor

1953: Frederick Sanger a secvenializat cele dou
catene ale insulinei
premiul Nobel, 1958
toate moleculele unei anumite proteine au aceeai
secven (succesiune a aminoacizilor)
proteinele pot fi secvenializate n dou moduri:
determinarea secvenei aminoacizilor n catena polipeptidic
determinarea secvenei ADN n gena care codific proteina


O strategie n 8 etape:

1. Dac exist mai multe catene polipeptidice, se separ
2. Se scindeaz punile disulfurice
3. Se determin compoziia n aminoacizi a fiecrei catene
4. Se determin resturile N- i C-terminale
5. Se scindeaz fiecare caten n fragmente mai scurte
se determin secvena fiecrui fragment
6. Repetarea pasului 5, utiliznd un procedeu diferit de
fragmentare
un set diferit de fragmente
7. Reconstituirea secvenei proteinei din secvenele
fragmentelor care se suprapun
8. Determinarea poziiei punilor disulfurice

Etapa I: Separarea catenelor
o subunitile interacioneaz prin fore slabe
o separarea lor se realizeaz prin:
o valori de pH extreme

o uree 8 M

o guanidin HCl 6M
o concentraii saline mari (de obicei, sulfat de amoniu)

http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/0072943696/student_view0/chapter2/animation__protein_denaturation.htm
l

Etapa 2: Scindarea punilor disulfurice


oxidare cu acid performic
tratament cu ageni reductori:
mercaptoetanol
ditiotreitol



pentu a mpiedica reformarea lor, se trateaz apoi cu un agent
alchilant, ca iodacetat
Desfacerea punilor disulfurice
a) Acid performic
b) 2-mercaptoetanol
Alchilarea gruprilor -SH
1) Acid iodacetic
2) 3-brompropilamin

Etapa 3: Determinarea compoziiei n
aminoacizi


digestia proteinei cu HCl 6N
are loc hidroliza legturilor peptidiceamestec de aminoacizi
separarea amestecului rezultat n amonoacizii componeni,
prin:
cromatografie de schimb ionic
HPLC (high-performance liquid chromatography sau high-pressure
liquid chromatography)
http://www.studyhplc.com/chromatographyanimation.php

rezultatele ofer adesea sugestii privind modul n care ar
trebui fragmentat proteina

Cromatografia de schimb ionic
Principiu:
adsorbia reversibil a moleculelor de solvat ncrcate electric
pe gruprile cu sarcini opuse ale schimbtorului de ioni
imobilizat pe coloana cromatografic
moleculele adsorbite sunt apoi eluate treptat, utiliznd soluii
cu trie ionic cresctoare
http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/4a0f132842ea4d354a25685d0011fa04/4a
555d526b88731ac1256e92003e865c/$FILE/GE_Ion%20Exchange.swf

Tipuri de schimbtori de ioni
i gruprile lor ionizate
Tipul
Exemple Gruparea
ionizat
Schimbtori
de cationi

Dowex-50
rin polistirenic puternic acid

Carboximetil (CM) celuloz; slab acid


Chelex -100
Rin polistirecic slab acid, chelatoare

Schimbtori
de anioni

Dowex-1
rin polistirenic puternic bazic


Dimetilaminoetil (DEAE) celuloz
Slab bazic

Modul de operare al unui schimbtor de cationi
(a) iniial, schimbtorul de cationic se afl n forma Na
+

(b) pe coloana coninnd rina este adugat un amestec de Asp, Ser i Lys
gruprile ionizate/polare ale aminoacizilor se vor ataa la schimbtorul de ioni
(c) pe coloan se adaug apoiun gradient de sare (ex. NaCl).
ionii srii vor substitui/deplasa treptat componentele amestecului de aminoacizi
Asp, ncrcat negativ, este eluat primul
(d) pe msur ce concentraia srii crete, este eluat i Ser;
(e) concentraia srii continund s creasc, este eluat i Lys, aminoacidul cel mai
pozitiv din amestec
Separarea aminoacizilor pe o coloan
schimbtoare de cationi
Cromatograme ale unui amestec de aminoacizi
separat prin schimb ionic
Fracionarea cromatografic a unui amestec sintetic de aminoacizi pe o coloan, utiliznd ca
schimbtor de ioni Amberlite IR-120, o rin din polistiren sulfonat similar Dowex-50.
Aminoacizii sunt aplicai pe coloan la pH sczut (4,25) condiii n care:
Asp i Glu (aminoacizi acizi) sunt slab legai
aminoacizii bazici Arg, Lys) sunt legai puternic.
Soluii de citrat de sodiu la dou concentraii diferite i trei valori diferite de pH sunt utilizate
pentru eluia gradat a aminoacizilor de pe coloan.
O a doua coloan, cu condiii de tamponare diferite, va fi folosit pentru a elua aminoacizii bazici
HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)
Utilizeaz:
diferite tipuri de faze staionare
o pomp care acioneaz faza mobil i analiii prin coloan presiune nalt
un detector pentru a msura timpul de retenie (i alte informaii) caracteristice
fiecrui analit
timpul de retenie variaz n funcie de:
tria interaciunilor cu faza staionar
solvenii utilizai
viteza de curgere a fazei mobile

Avantajele metodelor HPLC
rezoluie foarte nalt
sensibilitate excelent
vitez foarte mare

Cromatogram HPLC
Reprezentare schematic a unei uniti
HPLC
(1) Rezervoare pentru solveni, (2) Degazor, (3) Valv pt. reglarea gradientului, (4) Vas de amestecare
pentru faza mobil, (5) Pomp de nalt presiune, (6) Comutarea valvei n "poziia injecie", (6') Comutarea
valvei n "poziia ncrcare", (7) Bucla de injecie a probei, (8) Pre-coloan (guard column), (9) Coloan
analitic, (10) Detector (i.e. IR, UV), (11) Achiyiia datelor, (12) Colector de resturi sau fracii

Etapa 4: Identificarea resturilor
N- i C-terminale


Analiza N-terminal:
reactiv Edman (fenilizotiocianat)
Analiza C-terminal
metode enzimatice

Identificarea N-terminal: Metoda Edman
n soluii slab bazice
fenilizotiocianatul (C
6
H
5
-N=C=S; reactiv Edman) reacioneaz cu
aminoacidul N-terminal al proteinei, care este:
excizat de la captul catenei polipeptidice
recuperat sub form de derivat feniltiohidantoin (PTH)
identificat cromatografic
Secvenierea prin metoda Edman
reacia Edman poate da informaii privind secvena de aminoacizi
restul catenei polipeptidice rmne intact
poate fi supus unei noi runde de degradare Edman
succesiunea aminoacizilor n caten
C-terminal al polipeptidului analizat poate fi cuplat la o matrice insolubil
recuperarea uoar a polipeptidului prin filtrare, dup fiecare rund de reacie
secveniatoare Edman-realizeaz automat ciclul de reacii
pot fi realizate 50 de cicluri de reacie
50 pmoli polipeptid din 100-200 resturi de aminoacizi
secvena primelor 50 de resturi de aminoacizi din protein
eficiena scade n cazul proteinelor mai mari
o protein tipic, de 2000 de aminoacizi, particip doar la 20 de cicluri de
reacie
necesitatea fragmentrii n peptide mai mici

Analiza C-terminal
metod enzimatic
analiza cu carboxipeptidaze: enzime care scindeaz succesiv resturi
de aminoacizi de le C-terminal al unui polipeptid
sunt utilizaze de obicei 4 carboxipeptidaze: A, B, C i Y.
carboxipeptidaza A (din pancreas bovin) hidrolizeaz eficient legtura
peptidic C-terminal la care particip orice rest de aminoacid cu
excepia Pro, Arg i Lys
carboxipeptidaza B (din pancreas de porc) este eficient doar cnd
resturile terminale sunt Arg sau Lys.
un amestec de carboxipeptidaze A i B eliberereaz orice aminoacid C-terminal, cu
excepia Pro
carboxipeptidaza C din frunzele de lmi
carboxipeptidaza Y din drojdie
acioneaz asupra oricrui rest C-terminal.
viteza hidrolizei depinde de aminoacid
Y-utilizat pentru secveniere automat

Etapele 5 i 6:
Fragmentarea catenei polipeptidice

scop: a produce fragmente utile n analiza de secven
metode de scindare:
enzimatice
chimice, specifice sau nespecifice
ex. hidroliza acid parial
Enzimele proteolitice
pot hidroliza doar anumite legturi peptidice
Specificitatea furnizeaz informaii imediate despre produsul
peptidic
fragmentele produse prin scindare trebuie s fie:
sufucient de mici pentru a fi secvenializate prin metoda Edman
nu foarte mici, pentru a rezulta foarte multe.




Tripsina

scindeaz specific legturile peptidice la care Arg sau Lys particip prin
gruparea carboxil (X-NH-CO-Lys/Arg)
produii de reacie sunt:
un amestec de fragmente peptidice avnd la C-terminal Arg sau Lys
un singur peptid derivat de la C-terminal al peptidului.
numrul peptidelor mai mici rezultate prin aciunea tripsinei:
nr. total de resturi Arg i Lys din protein + 1 (fragmentul C-terminal al peptidului iniial)

Chimotripsina
manifest preferin pentru hidroliza legturilor preptidice formate de
gruparea carboxil a aminoacizilor aromatici: Phe, Tyr i Trp.
n timp ns, chimotrisina hidrolizeaz i alte legturi peptidice, fiind
susceptibile mai ales cele la care particip Leu.
specificitatea chimotripsinei este relativ.
chimotripsina produce un set de peptide foarte diferit de tripsin
tratamentul unor probe separate din aceeai protein cu aceste dou
enzime va genera seturi de fragmente a cror secven se suprapune.
rezolvarea ordinii resturilor de aminoacizi n fiecare fragment conduce
la secvena proteinei originale.
Alte endopeptidaze
i alte endopeptidaze (proteaze care scindeaz legturile peptidice din
interiorul unei catene polipeptidice) sunt, utilizate n investigarea
secvenei
acestea includ:
clostripaina, care acioneaz doar la resturile Arg
endopeptidaza Lys-C, care scindeaz doar la restul Lys
proteaza stafilococal, carew acioneaz la resturile acide Asp i
Glu.
alte endopeptidaze, relativ nespecifice, sunt utile pentru a digera
fragmente triptice sau chimotriptice de dimensiuni mari.
din aceast categorie fac parte :
pepsina, papaina, subtilizina, termolizina i elastaza.


Bromcianul
acioneaz specific asupra resturilor Met
atomul de sulf, nucleofil, al Met reacioneaz cu CNBr
se formeaz un ion sulfoniu
prin rearanjare intramolecular rapid intermediar ciclic, iminolacton.
apa hidrolizeaz rapid iminolactona, scindnd polipeptidul
fragmente care au la C-terminal resturi homoserin lacton n locul Met.
Specificitatea unor procedee reprezentative de scindare a
catenelor polipeptidice utilizate n analiza de secven

Metoda
Scindarea are loc de partea
N- sau C- a restului
susceptibil
Restul de aminoacid
susceptibil
Enzime proteolitice

Tripsina
Chimotripsina
Clostripaina
Proteaza stafilococal

Metode chimice
Bromcian
NH
2
OH
pH 2.5, 40C


C
C
C
C


C
legturi Asn-Gly
legturi Asp-Pro
Arg sau Lys
Phe, Trp, sau Tyr; Leu
Arg
Asp sau Glu


Met

Etapa 7
Reconstrucia secvenei de ansamblu

Secvenele obinute de la seturile de
fragmente rezultate prin dou sau mai multe
procedee de scindare sunt comparate, pentru:
identificarea suprapunerilor
stabilirea continuitii secvenei de aminoacizi

Exemplu
Se compar rezultatul scindrii cu tripsin i proteaz stafilococal a
unei peptide:

tripsin:
A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K
proteaz stafilococal:
F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E
alinierea fragmentelor:
L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K
secvena corect:
L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K


Importana studiilor de secven
a proteinelor

proteine omoloage
provin la organisme diferite
ndeplinesc aceeai funcie
au secvene de aminoacizi omoloage
proteinele corelate structural au origine evolutiv comun
proteine aparent diferite pot avea un strmo comun
proteine mutante
variante ale secvenei de aminoacizi
determinate de mutaii genetice (nlocuirea bazelor ADN)

elucidarea unor aspecte privind: