Feb

Mai 2014
Cursul 2
Cursul 2
En
En
zimologiareplicriiADN
zimologiareplicriiADN
Etape Etape
Iniiere
Elongare
Terminare
Preiniiere
Preiniiere
RegiuneaundencepereplicareamoleculeideADN=origineareplicrii
OmoleculADNpoateavea:
1regiuneori Cromozombacterian
Plasmidebacteriene
ori

C
ori

V
Cromozomulbacterianesteunrepliconunic
maimulteregiuniori Cromozomidelaeucariote
Cromozomiidetipeucariotsuntstructurimultirepliconice
(dupWatson,2013,MolecularBiologyoftheGene,7thEdition)
SintezaADNestecatalizatdeoclasdeenzime=ADNpolimeraze
ADNpolimerazeleomn careprindejonciunea/regiuneamatri primer
Prinanalogie,cele3domeniipeptidice
degetmare(thumb thumb)
degete(fingers fingers)
palma/podulpalmei(palm palm)
coninesitulactiv,catalitic
leag2ionimetalicibivaleni
sau2Zn
2+
2Mg 2Mg
2+ 2+
Ordineaevenimentelor Ordineaevenimentelor nsintezaADN: nsintezaADN:
Nucleotidulnouse Nucleotidulnouse mperecheazcuurmtorulnucleotidliber mperecheazcuurmtorulnucleotidliber

depematri depematri
cucelliberdepe cucelliberdepe complementar complementar Numaiunnucleotidnou Numaiunnucleotidnou

matri matri sepoate sepoate mperechea mperechea
Domeniul Domeniuldegete degete

se se strnge strnge

njuruljonc njuruljonc iuniicatenveche iuniicatenveche

matri matri catennou catennou

Acumconforma Acumconforma iaenzimeipozi iaenzimeipozi ioneazcorectcei ioneazcorectcei2ionimetalici 2ionimetalici
Arelocreac Arelocreac iadeformarealegturiifosfodiesterice iadeformarealegturiifosfodiesterice iata iata area area

nucleotiduluinoulaprimer nucleotiduluinoulaprimer
Seredeschidedomeniuldegete Seredeschidedomeniuldegete
Regiunea/jonc Regiunea/jonc iuneamatri iuneamatri primer(+1dNTP) primer(+1dNTP)sedeplaseazcu sedeplaseazcu1perechedebaze 1perechedebaze
ADNpolimerazaestegataptrurmtorulciclu ADNpolimerazaestegataptrurmtorulciclu,p ,ptradugareaurmtoruluinucleotid tradugareaurmtoruluinucleotid
+
+
1Mg 1Mg
2+ 2+
5 5 P P primer primer 3 3 OH OH 5 5 P P primer primer 3 3 O O

5 5 P P primer primer 3 3 O O

dNTP dNTP



P P



P P



P P
dNTP dNTP

3 3 OH OH 5 5 P P primer primer


+


P P



P P
1Mg 1Mg
2+ 2+
l leg egturfosfodiesteric turfosfodiesteric
atacnucleofilicalgruprii
fosfataldNTPasupragruprii3O

Domeniulpalmasigurspaialcomplementaritateanucleotidului

nouinucleotidulliberdepematri
+
+
1Mg 1Mg
2+ 2+
5 5 P P primer primer 3 3 OH OH 5 5 P P primer primer 3 3 O O

5 5 P P primer primer 3 3 O O

dNTP dNTP



P P



P P



P P
dNTP dNTP

3 3 OH OH 5 5 P P primer primer


+


P P



P P
1Mg 1Mg
2+ 2+
l leg egturfosfodiesteric turfosfodiesteric
atacnucleofilicalgruprii
fosfataldNTPasupragruprii3O

Ordineaevenimentelor Ordineaevenimentelor nsintezaADN: nsintezaADN:

Nucleotidulnouse Nucleotidulnouse mperecheazcuurmtorulnucleotidliberdepematri mperecheazcuurmtorulnucleotidliberdepematri
Numaiunnucleotidnoucomplementarcucelliberdepematri Numaiunnucleotidnoucomplementarcucelliberdepematri sepoate sepoate mperechea mperechea
Domeniuldegetese Domeniuldegetese strnge strnge

njuruljonc njuruljonc iuniicatenvechematri iuniicatenvechematri catennou catennou
Acumconforma Acumconforma iaenzimeipozi iaenzimeipozi ioneazcorectcei ioneazcorectcei2ionimetalici 2ionimetalici
Arelocreac Arelocreac iadeformarealegturiifosfodiesterice iadeformarealegturiifosfodiesterice iata iata areanucleotiduluinoulaprimer areanucleotiduluinoulaprimer
Seredeschidedomeniuldegete Seredeschidedomeniuldegete
Regiunea/jonc Regiunea/jonc iuneamatri iuneamatri primer(+1dNTP) primer(+1dNTP)sedeplaseazcu sedeplaseazcu1perechedebaze 1perechedebaze
ADNpolimerazaestegataptrurmtorulciclu ADNpolimerazaestegataptrurmtorulciclu,p ,ptradugareaurmtoruluinucleotid tradugareaurmtoruluinucleotid
Laobifurcaiedereplicare,ambelecateneADNsuntsintetizatempreun


nacela nacela itimp itimp
IniiereauneinoicateneADNnecesitunprimer
ToateADNpolimerazeleaunevoiedeuncap3 ToateADNpolimerazeleaunevoiedeuncap3 OHliber,alunuinucleotid OHliber,alunuinucleotid
ADNpolimerazelenupotini ADNpolimerazelenupotini iasintezadeADN iasintezadeADN

nupotata nupotata aprimulnucleotid aprimulnucleotid
Potdoarprelungi,p Potdoarprelungi,prinformareauneiprimelegturifosfodiestericeporninddelau rinformareauneiprimelegturifosfodiestericeporninddelauncap3 ncap3 OHliber OHliber
= =fragmentoligonucleotidicm fragmentoligonucleotidicm.c. .c.ceoferADNpolimerazeiuncap ceoferADNpolimerazeiuncap3 3 OHliber OHliber
Primer
Primer
ncelule( ncelule(invivo invivo)primerii=fragmenteARN )primerii=fragmenteARN
nanumitetehnici( nanumitetehnici(invitro invitro)sepotutiliza )sepotutiliza iprimeriADN iprimeriADN
ncelule, ncelule,enzimacesintetizeazprimeri enzimacesintetizeazprimeri= =PRIMAZ PRIMAZ= =oARNpolimeraz oARNpolimeraz special special
Primerii=fragmenteARNm.c.,de5 Primerii=fragmenteARNm.c.,de5 10nucleotide 10nucleotide
Primazaac Primazaac ioneazattpecatenaconductoare ioneazattpecatenaconductoare,ct ,ct ipecea ipecea ntrziat ntrziat,dar: ,dar:
Catenaconductoarenecesitunsingurprimer Catenaconductoarenecesitunsingurprimer,delaelsintezaADNmergndcontinuu ,delaelsintezaADNmergndcontinuu
Catena Catena ntrziatnecesitmaimul ntrziatnecesitmaimul iprimeri,delafiecaresintetizndu iprimeri,delafiecaresintetizndu secteunfragmentOkazaki secteunfragmentOkazaki
Primeriitrebuieapoindeprtai
Pentruterminareareplicriiuneicatene Pentruterminareareplicriiuneicatene ntrziate, ntrziate,
primeriitrebuie primeriitrebuie ndeprta ndeprta idinstructurafragmentelorOkazaki, idinstructurafragmentelorOkazaki,
i i nlocui nlocui icuADN icuADN
ndeprtareaprimerilor ndeprtareaprimerilor

RNazaH RNazaH
Taielegturilefosfodiestericedintr Taielegturilefosfodiestericedintr ocatenARN ocatenARN, ,
ncadrulunuidubluhelixhibridADN:ARN ncadrulunuidubluhelixhibridADN:ARN
Umplereagolurilor Umplereagolurilor ADNpolimeraz ADNpolimeraz
Formareaultimeilegturifosfodiesterice Formareaultimeilegturifosfodiesterice

ADNligaz ADNligaz
Separareacelor2cateneparentale ADNhelicaze
Labifurca Labifurca iadereplicare,separareacelor2cateneparentaleprinruperea iadereplicare,separareacelor2cateneparentaleprinruperea

legturilordeH legturilordeH,e ,esterealizatde sterealizatdeADNhelicaze ADNhelicaze
Proteinehexamericecuformdeinel Proteinehexamericecuformdeinel


inelul inelul intrpeunadinceledoucateneparentale intrpeunadinceledoucateneparentale iavanseaz iavanseaz

peea, peea,rupndlegturiledeHdintrecele rupndlegturiledeHdintrecele2catene 2catene
Cateneneleparentaledesfcute Cateneneleparentaledesfcute(denumite (denumite imonocatene)suntstabilizateprinata imonocatene)suntstabilizateprinata arede arede

proteineSsb proteineSsb

Single Single strandedbinding strandedbinding
Monocateneleparentalesuntastfeldisponibileptrafiutilizat Monocateneleparentalesuntastfeldisponibileptrafiutilizatecamatri ecamatri nsintezadecateneADNnoi nsintezadecateneADNnoi
MonocateneleADNsuntstabilizate proteineSsb
Suprarsucirilesuntndeprtate

Topoizomeraze
Desfacereadubluluihelixparental Desfacereadubluluihelixparental iavansareabifurca iavansareabifurca ieidereplicareproducesuprarsuciri ieidereplicareproducesuprarsuciri nfa nfa abifurca abifurca iei. iei.
Acestesuprarsucirisunteliminateprintierialedubluluihel Acestesuprarsucirisunteliminateprintierialedubluluihelix,u ix,urmatededersucire rmatededersucire ire ire ligare ligare
Topoizomeraze Topoizomeraze Ac Ac ioneazpeADNdcnereplicat ioneazpeADNdcnereplicat, , nfa nfa abifurca abifurca ieidereplicare ieidereplicare
TaieunasauambelecateneADN TaieunasauambelecateneADN
topoizomerazedeclasII topoizomerazedeclasII
Rmnata Rmnata atelacapultiat atelacapultiat i i ldersucesc ldersucesc

fa fa decatennetiat decatennetiat
topoizomerazedeclasI topoizomerazedeclasI
Rmnata Rmnata atelacapeteletiate atelacapeteletiate itrec itrec
zonanetiatprin zonanetiatprin tietur tietur
ScadegraduldersucireamoleculeiADNparentale ScadegraduldersucireamoleculeiADNparentale i, i,astfel, astfel,
helicazapoatedesfacemaidepartelegturiledehidrogen helicazapoatedesfacemaidepartelegturiledehidrogen
dintrecateneleparentale dintrecateneleparentale
nambelecazuri, nambelecazuri,topoizomerazelerefaclegturilepecarele topoizomerazelerefaclegturilepecarele autiat autiat
SpecializareaADNpolimerazelor
nfiecarecelulexistmaimultetipuri nfiecarecelulexistmaimultetipuri(speciimoleculare)deADNpolimeraze,fiecareavndunroldist (speciimoleculare)deADNpolimeraze,fiecareavndunroldistinct inct
RolulcentralalADNpolimerazelor RolulcentralalADNpolimerazelor Replicareacorect Replicareacorect ieficientagenomului ieficientagenomului
Alteroluri Alteroluri Replicarea Replicarea golurilor golurilor lsatedeexcizareaprimerilorARN lsatedeexcizareaprimerilorARN
Replicarea Replicarea golurilor golurilor

formate formate nproceseledereparareADN nproceseledereparareADN
ReplicareaunormoleculeADNextracromozomale ReplicareaunormoleculeADNextracromozomale

plasmide,ADNmitocondrial,ADNplatidial plasmide,ADNmitocondrial,ADNplatidial
De De inumeleproteinelorestediferitdelaospecielaalta, inumeleproteinelorestediferitdelaospecielaalta,
activit activit ileenzimaticedesf ileenzimaticedesf uratepentrureplicareaADNcromozomal uratepentrureplicareaADNcromozomal
suntpracticacelea suntpracticacelea ilaorganismeextremde ilaorganismeextremde ndeprtatefilogenetic ndeprtatefilogenetic

bacterii,drojdii,om bacterii,drojdii,om
VitezaADNpolimerazeiestecrescutdeSLIDINGCLAMPS
ProcesivitateamareaADNpolimerazeilabifurca ProcesivitateamareaADNpolimerazeilabifurca iadereplicare iadereplicare Replicarearapidacromozomului Replicarearapidacromozomului
ADNpoladaugmilioanedenucleotidefrssedesprinddepe ADNpoladaugmilioanedenucleotidefrssedesprinddepe

ADN ADN
VitezafoartemareaADNpolimerazei VitezafoartemareaADNpolimerazei Oproteindenumit Oproteindenumit slidingclamp slidingclamp


SlidingclampssuntpoziionatedeCLAMPLOADERS
Proteinele Proteineleslidingclamps slidingclamps

sunt sunt deschise deschise
ionatepemoleculadeADNdectrealteproteine ionatepemoleculadeADNdectrealteproteine ipozi ipozi

clamploaders clamploaders
Au5 Au5subunit subunit i i ifolosescATP ifolosescATP
La LaE.coli E.coli,clamploader=complexulg( ,clamploader=complexulg( ) )
nceluleleEK,clamploader=factoruldereplicareC(RF nceluleleEK,clamploader=factoruldereplicareC(RF C) C)
ADNpolIIIholoenzima ADNpolIIIholoenzima
SintezaADNlabifurcaiadereplicare
Labifurca Labifurca iadereplicare, iadereplicare,cateneleconductoare cateneleconductoare i i ntrziat ntrziat( (leading leading

i ilagging lagging)suntsintetizatesimultan )suntsintetizatesimultan
Laoaceea Laoaceea ibifurfac ibifurfac iefunc iefunc ioneazmaimulteADNpol ioneazmaimulteADNpol
La LaE.coli E.coli,l ,laosingurbifurca aosingurbifurca iedereplicareseformeazuncomplexproteic iedereplicareseformeazuncomplexproteic= =ADNpolimerazaIIIholoenzim ADNpolimerazaIIIholoenzim
3copiiADNpolIIImiez 3copiiADNpolIIImiez
1slidingclamploader 1slidingclamploader
1sliingclamp 1sliingclamp
FIGURE924BindingoftheDNAhelicasetoDNAPolIIIholoenzymestimulatestherate
ofDNAstrandseparation.ThetsubunitoftheslidingclamploaderinteractswithboththeDNA
helicaseandtheDNApolymeraseatthereplicationfork.(a)Whenthisinteractionoccurs,theDNA
helicaseunwindstheDNAatapproximatelythesamerateastheDNApolymerasesreplicatethe
DNA.(b)IftheDNAhelicaseisnotassociatedwithDNAPolIIIholoenzyme,DNAunwinding
slowsby10fold.Undertheseconditions,theDNApolymerasescanreplicatefasterthanthe
DNAhelicasecanseparatethestrandsofunreplicatedDNA.ThisallowstheDNAPolIIIholoenzyme
tocatchup

totheDNAhelicaseandreformthereplisome.
Arthur

Kornberg
Aparat enzimatic care realizeaz replicarea ADN
Aparat enzimatic care realizeaz replicarea ADN

:
:
ADN polimeraz ADN polimeraz (III) (III)
= e = enzim complex nzim complex, f , format din mai multe subunit ormat din mai multe subunit i cu diverse func i cu diverse func ii; ii;
cea mai important func cea mai important func ie : ie : formarea legturilor fosfodiesterice dintre deoxiribonucleotide formarea legturilor fosfodiesterice dintre deoxiribonucleotide
Helicaz Helicaz

desface legturile de hidrogen dintre cele desface legturile de hidrogen dintre cele 2 catene parentale 2 catene parentale
Topoizomeraze Topoizomeraze

relaxeaz dublul helix relaxeaz dublul helix, s , scade numrul de spire cade numrul de spire / kpb / kpb
Proteine Proteine Ssb Ssb

(Single (Single- -Stranded Binding) Stranded Binding) se leag de monocatene ADN se leag de monocatene ADN i le stabilizeaz i le stabilizeaz
Primaz Primaz = = o ARN polimeraz o ARN polimeraz, s , sintetizeaz scurte catene de ARN numite primeri intetizeaz scurte catene de ARN numite primeri
Ligaza Ligaza

formeaz legturi fosfodiesterice formeaz legturi fosfodiesterice ntre nucleotide ntre nucleotide
Nu poate porni sinteza catenei noi Nu poate porni sinteza catenei noi de novo de novo, ci o poate doar prelungi , ci o poate doar prelungi
Are nevoie de o caten scurt pe care sa o prelungeasc Are nevoie de o caten scurt pe care sa o prelungeasc - -

PRIMER PRIMER
RNaz H RNaz H

scoate ribonucleotidele ce formeaz primerii scoate ribonucleotidele ce formeaz primerii
ADN pol I ADN pol I



umple golurile lsate de RNaza H umple golurile lsate de RNaza H
holoenzima holoenzima
3 ADN pol III 3 ADN pol III miez (palm, fingers, thumb) miez (palm, fingers, thumb)
1 sliding clamp 1 sliding clamp
1 clamp loader 1 clamp loader