Universitatea din Bucureti

Facultatea de Biologie
TEZ DE DOCTORAT
STUDIUL DINAMICII TEMORALE A BIOFILMELOR
MICROBIENE DEZ!OLTATE E SUBSTRATURI INERTE "I
A INFLUEN#EI IN$IBITORII A UNOR E%TRACTE
!E&ETALE TOTALE "I FRAC#IONATE
CONDUCTOR TIIN#IFIC'
ROF( UNI!( DR( !ERONICA LAZR
DOCTORAND'
)AMERZAN *SA!IUC+ CRINA,MARIA
Bucure-ti. /01/
CURINS
Introducere
1
ARTEA TEORETICA
3
I( Bio2il3ele 3icro4iene i i35licaiile 3edicale ale 2or36rii lor 5e dis5o7itivele
5rotetice
3
I(1( Bio3ateriale utili7ate la 2a4ricarea dis5o7itivelor 5rotetice
3
I(1(1( Bio3ateriale 3etalice 6
I(1(/( Bio3ateriale cera3ice 7
I(1(8( Bio3ateriale 5oli3erice 8
I(/( Aderena 3icro4ian6 la su4strat inert
10
I(/(1( As5ecte 9enerale i 5articulare ale aderen:ei la su4strat inert 10
I(/(/( Structuri 4acteriene i35licate ;n aderen:a la su4strat inert 11
I(/(8( Bio3olecule -i a5endice 2ila3entoase i35licate ;n aderena la su4strat inert 13
I(/(<( Interaciuni 2i7ico,c=i3ice i cinetica 2eno3enului de aderen6 3icro4ian6 la su4strat inert 17
I(8( Mecanis3ele 5ato9ene7ei in2ec:iilor asociate i35lant6rii dis5o7itivelor
3edicale
22
I(<(Tolerana la su4stane anti3icro4iene a 3icroor9anis3elor incluse ;n
4io2il3e
31
I(>( In2ec:ii consecutive te=nicilor de i35lantare?inserare a dis5o7itivelor
3edicale
40
II( rinci5ii active din 5lante cu activitate anti3icro4ian6
53
II(1( Date 9enerale
53
II(/( Modalit6i de e@tracie i controlul calit6ii uleiurilor volatile
55
II(/(1( Metode industriale 56
II(/(1(1( resarea la rece
56
II(/(1(/( Distilarea cu va5ori de a56
56
II(/(1(8( Antrenarea cu va5ori de a56
56
II(/(1(<( E@tracia cu solveni
56
II(/(1(<(1( E@tracia cu solveni a5olari
56
II(/(1(<(/( E@tracia cu solveni nevolatili
57
II(/(1(<(8 E@tracia cu 2luide su5ercritice
57
II(/(/( Metode de la4orator
58
II(/(/(1 Distilarea cu va5ori de a56
58
II(/(/(/( E@tracia continu6 cu e@tractorul So@=let
58
II(/(/(8( E@tracia cu 3icrounde
59
II(/(8( rocedee 3icroe@tractive
59
II(/(8(1 Microdistilarea
59
II(/(8(/ Recoltarea i anali7a direct6 din structurile secretorii
59
II(/(< Controlul calit6ii uleiurilor volatile
60
II(8( Activitatea anti3icro4ian6 a uleiurilor volatile
62
II(8(1( Date 9enerale
62
II(8(/( Clase de co35ui cu activitate anti3icro4ian6 constitueni ai uleiurilor
volatile
66
II(8(8( Activitatea anti,5ato9enic6 a e@tractelor ve9etale
73
II(8(<( rocedee de sta4ili7are a uleiurilor volatile
76
II(8(<(1( Te=nicile u7uale de ;nca5sulare
78
II(8(>( I35ortanta nanote=nolo9iei ;n 2or3ularea 2ar3aceutic6
80
ARTEA E%ERIMENTAL
DEZ!OLTAREA UNOR METODE ALTERNATI!E ECOLO&ICE BAZATE
E COMU"I FITOTERAEUTICI , ULEIURI !OLATILE. ENTRU
RE!ENIREA I ERADICAREA INFECIILOR CU MICROOR&ANISME
INCLUSE AN BIOFILME
84
III( Sco5ul -i o4iectivele lucr6rii
84
III(1( MATERIALE "I METODE
85
III(1(1( O4inerea. caracteri7area 2i7ico,c=i3ic6 i de3onstrarea activit6ii
anti3icro4iene i anti4io2il3 a unor uleiuri volatile asu5ra tul5inilor 3icro4iene
virulente i 3ultire7istente
85
III(1(1(1( Caracteri7area 2enoti5ic6 i 9enoti5ic6 a unor tul5ini 3icro4iene virulente i 3ultire7istente i7olate din 5ro4e clinice
85
III(1(1(1(1( Identi2icarea 4ioc=i3ic6 5e 4a7a siste3elor 3ultitest a unor tul5ini 3icro4iene virulente i 3ultire7istente i7olate din 5ro4e
clinice
85
III(1(1(1(/( Deter3inarea ca5acit6ii de aderen6 la su4strat inert a tul5inilor 4acteriene 5ato9ene
88
III(1(1(1(8( Metoda Brun,Buisson 5entru deter3inarea cantitativ6 a ca5acit6ii de aderen6 la su4strat inert 5entru tul5inile 2un9ice
5ato9ene
88
III(1(1(1(<( Caracteri7area 2enoti5ic6 a 2actorilor de virulen:6 solu4ili ai tul5inilor 2un9ice i7olate
89
III(1(1(1(>( Caracteri7area 9enoti5ic6 a 2actorilor de virulen6 utili7Bnd 3etodele si35le@ i 3ulti5le@ CR
89
III(1(1(/( O4inerea i caracteri7area 2i7ico,c=i3ic6 a e@tractelor ve9etale
97
III(1(1(/(1( Materialul ve9etal C recoltare -i 5re96tirea 5entru e@trac:ie
97
III(1(1(/(/( O4inerea uleiurilor volatile 5rin =idrodistilare
99
III(1(1(/(8( O4inerea uleiurilor volatile 5rin =idrodistilare asistat6 de 3icrounde
99
III(1(1(/(<( O4inerea 3aceratului din Forsythia s55(
99
III(1(1(/(>( O4inerea 5rin 5resare la rece a e@tractului din Aronia melanocarpa
99
III(1(1(/(D( Caracteri7area 2i7ico,c=i3ic6 a e@tractelor ve9etale
100
III(1(1(/(D(1( M6surarea densit6ii uleiurilor volatile
100
III(1(1(/(D(/( M6surarea indicelui de re2racie al uleiurilor volatile
100
III(1(1(/(D(8( Anali7a &C,MS a uleiurilor volatile
101
III(1(1(/(D(<( Deter3inarea con:inutului de acid ascor4ic
102
III(1(1(/(D(>( Deter3inarea con:inutului total de antociani
102
III(1(1(/(D(D( E@trac:ia -i deter3inarea cantitativa a carotenoi7ilor
102
III(1(1(/(D(E( Deter3inarea con:inutului ;n 5oli2enoli totali e@5ri3a:i ;n acid ca2eic al e@tractelor din Forsythia s55(
102
III(1(1(8( Evaluarea calitativ6 i cantitativ6 a activit6ii anti3icro4iene -i anti4io2il3. ca -i a ac:iunilor siner9ice -i a 3ecanis3elor de
ac:iune ale uleiurilor volatile asu5ra celulelor 3icro4iene ;n sus5ensie -i a celor aderate la un su4strat
104
III(1(1(8(1( Deter3inarea calitativ6 a s5ectrului anti3icro4ian al e@tractelor ve9etale
104
III(1(1(8(1(1( Metoda di2u7i3etric6 standard
104
III(1(1(8(1(/( Cur4a dina3icii te35orale a e2ectului 3icro4iostatic?3icro4icid
104
III(1(1(8(1(8( Evaluarea activit6:ii anti2un9ice a uleiului volatil 5rin te=nica cito3etriei ;n 2lu@
105
III(1(1(8(/( Deter3inarea cantitativ6 a activit6:ii anti3icro4iene -i sta4ilirea concentra:iei 3ini3e in=i4itorii
105
III(1(1(8(8( Studiul in2luen:ei uleiurilor volatile asu5ra ca5acit6:ii de aderen:6 la su4strat inert a unor tul5ini 4acteriene 5rin testul
5roducerii de slime
105
III(1(1(8(<( Studiul in2luen:ei asu5ra sesnsi4ilit6:ii la anti4iotice a tul5inilor studiate
105
III(1(1(8(<(1( Metoda di2u7i3etric6 ada5tat6
105
III(1(1(8(<(/( Metoda 3icrodilu:iilor seriale 7eci3ale 5entru deter3inarea co35arativ6 a concentra:iei 3ini3e in=i4itorii 5entru solu:ii de
anti4iotice res5ectiv solu:ii de anti4iotice cu ulei volatil din Eugenia caryophyllata
106
III(1(1(8(>( In2luen:a uleiurilor volatile totale -i 2rac:ionate asu5ra sinte7ei 2actorilor de virulen:6 solu4ili *to@ine 2or3atoare de 5ori.
e@oen7i3e+
106
III(1(1(8(D( Evaluarea activit6:ii uleiurilor volatile -i a unor 2rac:ii ale acestora asu5ra 4io2il3elor 3icro4iene e@5eri3entale 3onos5eci2ice
de7voltate 5e su4straturi inerte
105
III(1(1(8(D(1( Deter3inarea in2luen:ei in=i4itorii a uleiurilor volatile asu5ra 4io2il3elor 3icro4iene e@5eri3entale de7voltate 5e su4strat
inert su43ersat
110
III(1(1(8(D(/( Deter3inarea in2luen:ei in=i4itorii a uleiului volatil din Eugenia carryophyllata asu5ra 4io2il3elor e@5eri3entale de Candida
sp. de7voltate 5e su4strat inert te@til
110
III(1(1(8(D(8( Deter3inarea 5rin cito3etrie ;n 2lu@ a in2luen:ei in=i4itorii a uleiurilor volatile -i a unor 2rac:ii ale acestora asu5ra 4io2il3elor
e@5eri3entale de Candida albicans ATCC 10/81 de7voltate 5e su4strat inert
111
III(1(1(8(E( Eviden:ierea in2luen:ei uleiurilor volatile -i a unor 2rac:ii ale acestora asu5ra e@5resiei unor 9ene codi2icatoare ale unor 2actori
de virulen:6 -i 3olecule i35licate ;n se3nali7area intercelular6
111
III(1(/( Deter3inarea aciunii e@tractelor ve9etale selectate asu5ra celulelor
eucariote i o5ti3i7area activitatii anti3icro4iene 5rin o4:inerea unor
nanosiste3e =i4ride 2unctionali7ate
115
III(1(/(1( Testarea citoto@icitatii e@tractelor ve9etale asu5ra celulelor eucariote 5rin 3etoda coloraiei cu tri5an 4lue
115
III(1(/(/( O4:inerea unor 3ateriale nanostructurate =i4ride anor9ano,or9anice cu 5ro5riet6i antiaderente i anti3icro4iene
115
III(1(/(/(1( Sinte7a 3a9netitei 2uncionali7ate cu acid oleic
115
III(1(/(/(/( Sinte7a nanotu4urilor de car4on 3ultistrat *MFCNT+
117
III(1(/(/(8( Asa34larea nano2luidului 5e 4a7a de 3a9netit6 -i uleiuri esen:iale 5entru o4:inerea de su5ra2e:e antiaderente
117
III(1(/(/(<( Asa34larea MFCNT,urilor 5e 4a76 de car4on,2ier -i 2itoco35onen:i ai a5elor de co=o4a:ie 5entru o4:inerea 3aterialelor
antiaderente
118
III(1(/(/(>( O4:inerea su5ra2e:elor antiaderente
119
III(1(/(/(>(1( Modi2icarea su5ra2e:elor 5rin i3ersare ;n nano2luid aliniat ;n cB35 3a9netic
119
III(1(/(/(>(/( Modi2icarea su5ra2e:ei dis5o7itivelor 3edicale 5rin de5unere asistat6 laser utili7Bnd te=nica MALE *Matrix Assisted Pulsed
Laser Evaporation+
121
III(1(/(/(D( Caracteri7area 3aterialelor nanostructurate 5rin DR%. FT,IR. AFM. AT& i TEM
121
III(1(/(/(D(1( Di2rac:ia de Ra7e % *DR%+
121
III(1(/(/(D(/( S5ectrosco5ia ;n In2raro-u *FT,IR+
121
III(1(/(/(D(8( Microsco5ia Electronic6 5rin Trans3isie *TEM+
121
III(1(/(/(D(<( Microsco5ie cu For:6 Ato3ic6 *AFM+
122
III(1(/(/(D(>( Anali7a Ter3o,&ravi3etric6 *AT&,TD+
122
III(1(/(8( Deter3inarea activit6:ii anti3icro4iene? anti,4io2il3 a nanosiste3elor 5e 4a76 de uleiuri volatile
122
III(1(/(8(1( Evaluarea calitativ6 a activit6:ii anti,4io2il3 5rin 3icrosco5ie con2ocal6 *CLSM+
122
III(1(/(8(/( Deter3inarea concentra:iei 3ini3e in=i4itorii 5entru MFCNT,uri ;nca5sulate ;n 2itoco35oneni din a5a de co=o4a:ie din
Eugenia caryophyllata
123
III(1(/(8(8( Deter3inarea cantitativ6 a ca5acit6:ii de aderen:6 la su4strat inert 5entru tul5inile 2un9ice 5ato9ene
124
III(1(/(8(<( Deter3inarea activit6:ii anti5ato9enice a nano2luidului 5e 4a76 de 3a9netit6 -i ulei volatil din 3u9uri de Eugenia
caryophyllata
124
III(/( REZULTATE "I DISCU#II
125
III( /(1( Caracteri7area 2enoti5ic6 i 9enoti5ic6 a unor tul5ini 3icro4iene i7olate
din in2ecii consecutive de7volt6rii 4io2il3elor 5e dis5o7itive 4io3edicale
125
III(/(1(1( Deter3inarea ca5acit6:ii de aderen:6 la su4strat inert -i 2or3area consecutiv6 a 4io2il3elor 3onos5eci2ice 5entru tul5ini
3icro4iene a5ar:inBnd s5eciilor Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans
128
III(/(1(/( Studiul 5lasticit6:ii 3or2olo9ice la tul5ini 2un9ice din s5ecii di2erite
133
III(/(1(8( Caracteri7area 2enoti5ic6 a 2actorilor de virulen:6 solu4ili 5entru tul5ini 3icro4iene a5ar:inBnd s5eciilor Staphylococcus
aureus, Pseudomona. aeruginosa i Candida albicans
134
III(/(1(<( Caracteri7area 9enoti5ic6 a tul5inilor selec:ionate 5entru 5re7en:a unor 9ene de virulen:6
137
III(/(1(<(1( Distri4u:ia 9enelor de virulen:6 la tul5inile de Staphylococcus aureus
137
III(/(1(<(/( Distri4u:ia 9enelor de virulen:6 la tul5inile de Pseudomonas aeruginosa
139
III(/(1(>( Conclu7ii
143
III(/(/( O4:inerea -i caracteri7area 2i7ico,c=i3ic6 a e@tractelor ve9etale
145
III(/(/(1( E@trac:ia -i caracteri7area 2i7ic6 a uleiurilor volatile
145
III(/(/(1( Caracteri7area c=i3ic6 a uleiurilor volatile
146
III(/(/(8( Caracteri7area sucului o4:inut din 2ructe de Aronia melanocarpa
168
III(/(/(<( Caracteri7area e@tractelor din Forsithya s55(
168
III(/(/(>( Conclu7ii
170
III(/(8( Evaluarea calitativ6 -i cantitativ6 a activit6:ii anti3icro4iene? anti5ato9enice -i a 3ecanis3elor de ac:iune ale uleiurilor volatile
asu5ra celulelor 3icro4iene ;n sus5ensie -i a celor aderate la un su4strat
171
III(/(8(1( Evaluarea calitativ6 -i cantitativ6 a activit6:ii anti3icro4iene
171
III(/(8(/( Evaluarea activit6:ii anti5ato9enice -i a 3ecanis3elor de ac:iune ale uleiurilor volatile asu5ra celulelor 3icro4iene ;n sus5ensie -i
a celor aderate la un su4strat
180
III(/(8(/(1 Studiul dina3icii te35orale a e2ectului 3icro4icid al uleiurilor volatile
180
III(/(8(/(/( Studiul in2luen:ei in=i4itorii a e@tractelor ve9etale asu5ra sinte7ei 2actorilor de virulen:6 solu4ili 4acterieni eviden:ia:i 2enoti5ic
182
III(/(8(/(/( Activitatea anti4io2il3 a e@tractelor ve9etale
185
III(/(8(/(/(1( In=i4area ca5acit6:ii de aderen:6 3icro4ian6 la su4straturi inerte
185
III(/(8(/(/(/( Eradicarea 4io2il3elor 3onos5eci2ice e@5eri3entale de7voltate 5e su4straturi inerte
187
III(/(8(/(/(8( E2ectul 3odulator asu5ra e@5resiei 9enelor de GS la tul5ini de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa
192
III(/(8(/(8( E2ectul 5otenator al uleiurilor volatile asu5ra activit6:ii anti3icro4iene a anti4ioticelor
195
III(/(8(/(<( Conclu7ii
199
III(/(<( Studiul 4ioco35ati4ilit6:ii -i o5ti3i7area activit6:ii anti3icro4iene a
e@tractelor ve9etale selectate 5rin o4:inerea unor nanosiste3e =i4ride
2unc:ionali7ate
202
III(/(<(1( Deter3inarea ac:iunii e@tractelor ve9etale selectate asu5ra celulelor eucariote
202
III(/(<(/( Caracteri7area siste3elor nanostructurate anor9ano,or9anice
204
III(/(<(8( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Candida sp. 5e su5ra2a:a dis5o7ivitelor 3edicale re5re7entate de sec:iuni de cateter
*ne+5eliculi7ate cu 2ito,nanosiste3 *3a9netit6 2unc:ionali7at6 -i ulei volatil din !osmarinus. o""icinalis+
211
III(/(<(<( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Candida 5e su5ra2a:a la3elelor de sticl6 *ne+5eliculi7ate cu 2ito,nanosiste3 5e 4a76 de
Salvia o""icinalis
213
III(/(<(>( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Candida 5e su5ra2a:a la3elelor de sticl6 *ne+5eliculi7ate cu 2ito,nanosiste3 5e 4a76
3a9netit6 2unc:ionali7ata ne5olar -i ulei volatil de Anethum graveolens
214
III(/(<(D( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Staphylococcus aureus 5e su5ra2a:a la3elelor de sticl6 *ne+5eliculi7ate cu 2ito,
nanosiste3 *3a9netit6 2unc:ionali7at6 -i acid usnic+
216
III(/(<(E( Studiul in vitro al activit6:ii anti3icro4iene a 2ito,nanosiste3ului *Fe8O<?acid oleic dro5,cast vs 2il3 su4ire+ 5e 4a76 de Eugenia
caryophyllata asu5ra unor tul5ini de Staphylococcus aureus
216
III(/(<(H( Studiul in vitro al activit6:ii anti3icro4iene a 2ito,nanosiste3ului 5e 4a76 de MFCNTs -i 2itoco35onente din a5a aro3atic6 de E.
carriophyllata asu5ra unor tul5ini de Staphylococcus aureus
217
III(/(<(I( De3onstrarea in vivo a activit6:ii anti3icro4iene a nanosiste3elor 5e 4a76 de ulei volatil din 3u9uri de Eugenia caryophyllata
219
III(/(>( Conclu7ii 220
III(8( CONCLUZII &ENERALE
221
Lista de lucr6ri 5u4licate 5e 5arcursul ela4orarii te7ei
226
Bi4lio9ra2ie
228
Introducere
Cunotinele despre plante dateaz din cele mai veci timpuri! primele documente
despre valoarea terapeutic a unor plante "iind descoperite #n $esopotamia %mil& '() '' #&*r&+!
,a-ilonia %mil& '' ) ' #&*r&+! 'ndia! ./ipt& 0rima scriere despre plante cu rol terapeutic aparine
unui cinez! 1en 2i! i tot #n Cina s)a ela-orat primul dicionar ilustrat al plantelor
cunoscute i utilizate de om&
0erioada renaterii marceaz "olosirea o-servaiei i a e3perimentului #n scopuri
medicale& 4e la 0aracelsus %1493)1541+! considerat #ntemeietorul cimioterapiei! i p5n #n
prezent! au "ost parcurse numeroase etape #n dezvoltarea di"eritelor ramuri ale cimiei! care
s)au dovedit indispensa-ile pro/reselor #n domenii cone3e precum "armacolo/ia! medicina!
-iolo/ia! a/ricultura&
6tudiul compuilor naturali cu aciune terapeutic este o preocupare de top a cercetrii
naionale i internaionale a3ate pe valori"icarea superioar a plantelor medicinale -azat pe
cunoaterea compuilor cimici constitueni& 7leiurile volatile! produi ai meta-olismului
secundar ve/etal! se /sesc #n anumite pri ale plantelor! #n caviti sau canale speciale!
alteori "iind prezente #n e3sudate naturale sau patolo/ice ale acestora %rezine! -alsamuri!
oleo/umirezine! /umirezine+& 6pectrul aciunilor terapeutice ale uleiurilor volatile reuneste
proprieti care se mani"est selectiv i modulat asupra tuturor or/anelor i sistemelor
or/anismului uman %Cercasov i cola-&! 2009+&
8ezistena -acterian la anti-iotice este o pro-lem acut a medicinei moderne!
reducerea consumului inutil de anti-iotice "iind o soluie aparent accesi-il! dar ridic5nd
pro-lematica sta-ilirii unui ecili-ru #ntre reducerea presupus a anti-iorezistenei i
-ene"iciile evidente ale anti-ioterapiei& 6u-iectul! e3trem de comple3! "ace o-iectul a
numeroase studii! "iind o preocupare ma9or a literaturii de specialitate %:eli si cola-&! 2012+&
;n ultimii ani! o scim-are de paradi/m a determinat de"inirea unor entiti nosolo/ice noi!
in"eciile cronice! pro"und di"erite de -olile acute! epidemice! speci"ice secolului trecut!
entiti #n str5ns corelaie cu dezvoltarea -io"ilmelor micro-iene pe dispozitive protetice
diverse& <pro3imativ 60)70= dintre in"eciile nosocomiale sunt in"ecii consecutive
implantrii>inserrii unui dispozitiv medical %,r?ers! 2008+& 7tilizarea dispozitivelor
medicale este indispensa-il practicii medicale moderne! datorit e"ectelor -ene"ice evidente
asupra calitii vieii i! #n anumite condiii! asupra ratei de supravieuire a pacienilor
%6unmu/aperumal! 2010+& @ varietate de -acterii :ram pozitive i :ram ne/ative! precum i
1
micro"un/i! au "ost identi"icati ca a/eni etiolo/ici ai in"eciilor consecutive introducerii #n
or/anismul uman a unui corp strin! ) Staphylococcus epidermidis i ali sta"ilococi
coa/ulazo)ne/ativi %CoA6+ "iind cel mai adesea implicai #n FBRI %"oreign body related
infections ) in"ecii cu microor/anisme incluse #n -io"ilme dezvoltate consecutiv implantrii
unui dispozitiv protetic+ dup implantarea dispozitivelor medicale temporare sau permanente&
FBRI cuprind toate entitile nosolo/ice cu etiolo/ie micro-ian! in"ecii localizate sau
-acteriemice! asociate cu implantarea>inserarea dispozitivelor medicale&
4escoperirea cea mai important a ultimilor ani este aceea c -acteriile aderente sunt
pro"und di"erite "enotipic de cele a"late #n suspensie& $odi"icrile cele mai importante se
produc la nivelul peretelui celular i al sistemelor de transport mem-ranar %Bazr! 2003+&
;nele/erea -azelor /enetice ale adaptrii reprezint o pro-lem central #n cercetarea
-iolo/ic& .lucidarea mecanismelor moleculare este complicat de "aptul c fitness)ul
microor/anismelor poate "i rezultatul modi"icrilor aprute pe mai multe ci de re/lare!
"iecare dintre acestea contri-uind la "enotipul adaptativ #ntr)o msur varia-il&
2olerana>recalcitrana la su-stane antimicro-iene este un proces multi"actorial! determinat
de "actori "izici i "iziolo/ici& Aatura rezistenei -io"ilmelor la su-stane antimicro-iene
rm5ne incomplet elucidat! "iind propuse mai multe mecanisme pentru e3plicarea acesteia&
;n acest conte3t! este pe deplin 9usti"icat interesul tiini"ic pentru "undamentarea tiini"ic a
"itoterapiei! at5t ca o alternativ! c5t i ca o component complementar a terapiei cu
medicamente de sintez&
Sco5ul lucr6rii de 2a:6 a 2ost'
4ezvoltarea unor metode alternative si complementare ecolo/ice de prevenire i
eradicare a in"eciilor consecutive dezvoltrii -io"ilmelor de ctre tulpini micro-iene virulente
i multirezistente! pe dispozitive protetice! -azate pe uleiuri volatile totale i "racionate i
optimizarea activitii antimicro-iene a e3tractelor ve/etale selectate prin o-tinerea unor
nanosisteme i-ride "uncionalizate&
2
ARTEA TEORETICA
I( Bio2il3ele 3icro4iene i i35licaiile 3edicale ale 2or36rii lor 5e
dis5o7itivele 5rotetice
I(1(Bio3ateriale utili7ate la 2a4ricarea dis5o7itivelor 5rotetice
6)a estimat c apro3imativ 20 milioane de indivizi au implantate dispozitive medicale
diverse& Costurile asociate cu aceste CterapiiD depesc 300 mld&E pe an i reprezint
apro3imativ 8= din #n/ri9irile medicale practicate #n #ntrea/a lume %8atner i cola-&! 2004+&
<plicaiile acoper domenii variate! de la cel cardiovascular! ortopedic! o"talmolo/ic i
stomatolo/ic! la cel al cirur/iei re/enerative %su-stituente pentru esuturi+ i industriei
"armaceutice %sisteme de transport la int sau matrice #ncorporant! senzorii pentru
dia/nostic+&
Ftiina -iomaterialelor este #n prezent un domeniu care necesit o a-ordare
interdisciplinar! care rezid din #ntreptrunderea a cel puin trei domeniiG %1+ tiina
materialelor i in/ineria procesrii H structurii ) proprietilorI %2+ tiine -iolo/ice! de la
anatomie i "iziolo/ie la -iolo/ie celular molecularI %3+ tiine medicale %6i! 2006+&
,iomaterialele tipice sau clasice %prezentate #n 2a-elul nr& 1+ sunt structuri metalice!
ceramice! polimerice sau materiale compozite&
2a-el nr& 1& 2ipuri de -iomateriale %dup 8atner i cola-&! 2004+&
Bio3ateriale AvantaJe De7avantaJe A5lica:ii
oli3erice Re7iliente De2or3a4ile. de9rada4ile ;n ti35 Suturi. 5rote7e vasculare. 5rote7e osoase.
su4stituen:i de :esuturi 3oi
Metalice Materiale dure. ductile Coro7iunea. 5rocedeele de 2a4rica:ie
co35licate -i costisitoare
Su4stituen:i de :esuturi dure. i35lanturi
dentare. dis5o7itive 5entru suturi
Cera3ice Bioco35ati4ile. inerte. re7istente la 5resiune Fra9ile. 5rocedee de 2a4rica:ie co35licate
-i costisitoare
I35lanturi dentare. trata3ente de
su5ra2a:6 5entru aco5erirea
i35lanturilor dentare sau orto5edice
Co35o7ite Materiale dure. 5ersonali7ate rocedee de 2a4rica:ie co35licate -i
costisitoare
I35lanturi articulare. valve cardiace
,iomaterialele moderne sunt acelea care utilizeaz materiale clasice #n com-inaie cu
medicamente %molecule mici "armacolo/ic active+! proteine cu rol terapeutic! molecule
-iolo/ice! populaii de celule via-ile& <cestea au determinat clasi"icarea -iomaterialelor #n
alte trei su-specialitiG %1+ -iomateriale cu supra"ee modi"icateI %2+ -iomateriale inteli/ente
H care #i scim- proprietile #n prezena unui "actor declanator din mediu! cum sunt
temperatura! valoarea p* sau diverse su-stane cimiceI %3+ -iomateriale -ioactive H care
#ncorporeaz a/eni "armacolo/ici precum "actorii de cretere! anticorpii! citoJinele! "actorii
de aderen sau conin situsuri de recunoatere enzimaticI %4+ in/ineria esuturilor %,atia!
2010+&
3
7tilitatea -iomaterialelor se reduce! totui! la aplicaii relativ simple din punct de
vedere structural i "uncional! deoarece "uncii -iocimice! precum cele realizate de "icat! sau
electrice i electrocimice! realizate de creier i or/anele de sim nu pot "i suplinite prin
utilizarea -iomaterialelor&
.voluia implantolo/iei este le/at de dezvoltarea materialelor! dar de a tenicilor
cirur/icale& 6uccesul -iomaterialelor #n or/anism depinde de "actori controla-ili! ca
proprietile i desi/nul materialelor! de -iocompati-ilitatea acestora! dar i de tenica
cirur/ical! starea de sntate i activitile pacientului& Kactorii de risc care nu pot "i
controlai i limiteaz sever utilizarea implantului sunt eventualele in"ecii! atacul sistemului
imunitar al or/anismului asupra implantului sau al implantului asupra or/anismului
%to3icitate! reacii aler/ice induse! carcino/enez+! "actori de care depinde cea mai important
calitate a -iomaterialelor! respectiv -iocompati-ilitatea& $ai concret! -iocompati-ilitatea
implic acceptarea implantului de ctre esuturile adiacente i de or/anismul /azd ca #ntre/&
$aterialele -iocompati-ile nu irit structurile 9u3tapuse i nu provoac rspuns in"lamator!
reacii aler/ice sau imunolo/ice&
$icroaritectura %micro/eometria! ru/ozitatea+ supra"eei -iomaterialelor i
compoziia cimic sunt caracteristici e3trem de importante& Aatura "izic a supra"eei la
nivel atomic! molecular sau mai mare #n "uncie de dimensiunile unitilor -iolo/ice implicate
%celule! -iomolecule+ se re"lect #n supra"aa de contact %ca "orm i dimensiune+! ceea ce
cauzeaz o cascad de reacii le/ate de tipurile de le/turi cu unitile -iolo/ice! crora le
sunt in"luenate structura i "unciile&
I(/( Aderen:a 3icro4ian6 la su4strat inert
I(/(1( As5ecte 9enerale i 5articulare ale aderen:ei la su4strat inert
4ac manu"acturarea i proprietile -iomaterialelor sau tenica cirur/ical sunt
"actori de risc controla-ili i previzi-ili #n implantolo/ie! in"eciile sunt "actori de risc care nu
pot "i controlai i limiteaz sever utilizarea oricrui implant& .tapele des"urrii unui
process in"ecios implic un de-ut le/at de colonizare! care depinde de capacitatea
microor/anismelor implicate de a adera la supra"ee&
Aoiunea de aderen #n -iolo/ie constituie un concept de o importan "undamental!
mecanismele de "i3are "iind o etap preala-il necesar ma9oritii proceselor -iolo/ice&
@r/anizarea aritectural comple3! ca i potenialul "uncional al #nveliurilor celulare! care
inter"er #n toate procesele -iolo/ice celulare! au determinat ca structurile de supra"a s
4
devin unul din su-iectele privile/iate ale -iolo/iei celulare i moleculare! dar i al
imunolo/iei %Bazr! 2003+&
4e peste 25 de ani cercettorii au investi/at capacitatea de aderen
microor/anismelor la di"erite supra"ee! pentru a identi"ica proprietile acestora le/ate de
aderen #n corelaie cu specia sau tipul de microor/anism! proprietile su-straturilor
implicate %su-straturi rezistente sau nu la colonizare+ i condiiile de mediu care in"lueneaz
semni"icativ acest proces %de e3emplu temperatura! valoarea p*! concentraia de electrolii+&
<u "ost i sunt #n studiu numeroase #ncercri de a controla acest "enomen #n sensul atarii
sau detarii microor/anismelor! #n corelaie cu mecanismele e3trem de diversi"icate ale
aderenei micro-iene& ;n consecin! orice studiu de aderen tre-uie s "ie -ine de"init i
controlat pentru a rspunde unei #ntre-ri speci"ice %<tlas i ,arta! 1999I <n i Kriedman!
2000+&
I(8( Mecanis3ele 5ato9ene7ei in2ec:iilor asociate i35lant6rii dis5o7itivelor 3edicale
7n concept "undamental #n pato/eneza in"eciilor le/ate de implantarea dispozitivelor
protetice este "ormarea -io"ilmelor micro-iene& @ varietate de -acterii :ram pozitive i :ram
ne/ative! precum i micro"un/i au "ost identi"icai ca a/eni etiolo/ici ai in"eciilor
consecutive introducerii #n or/anismul uman a unui corp strin! Staphylococcus epidermidis
i ali sta"ilococi coa/ulazo)ne/ativi "iind cel mai adesea implicai #n K,8' dup implantarea
dispozitivelor medicale temporare sau permanente& K,8' cuprind toate entitile nosolo/ice
cu etiolo/ie micro-ian! in"ecii localizate sau -acteriemii asociate cu implantarea
dispozitivelor medicale&
Kormarea unui -io"ilm este un proces multistadial ce presupuneG
1+ sedimentarea nutrienilor i "ormarea unui "ilm macromolecular sau condiionant pe o
supra"a dat pe care se concentreaz nutrienii! ca i microor/anismele planctonice prin
procese de transport activ %cemota3ie+ sau pasiv! care ader! procesul "iind la #nceput
reversi-il! apoi ireversi-il i dependent de sinteza micro-ian de su-stante polimericeI
2+ etapa de colonizare i eventual invazia su-stratului! #n "uncie de natura sa cimicI
celulele "erm aderate se multiplic "orm5nd microcolonii ce vor con"lua rezult5nd un biofilm!
la inceput unistrati"icat! apoi multistrati"icatI
3+ etapa de maturare a -io"ilmului! care #ncepe s devin neuni"orm! prin apariia unor
structuri asemntoare coloanelor i ciupercilor %pillar-like i mushroom-like+I celulele
5
-io"ilmului sunt acum #n/lo-ate #ntr)o matrice e3tensiv de e3opolizaaride %EPS-
extracellular polimeric substances) ce va in"luena "iziolo/ia -io"ilmuluiI
4+ detaarea de celule solitare sau a/re/ate celulare din -io"ilmul matur! care vor coloniza
noi spaii! relu5nd ciclul %"i/& 9+&

Ki/& 9& $odel de "ormare si dinamica dezvoltrii unui -io"ilm %dup Bazr! 2011+&
II( rinci5ii active din 5lante cu activitate anti3icro4ian6
II(1( Date 9enerale
7leiurile volatile sunt amestecuri comple3e de compui volatili produi de sisteme
-iolo/ice! de o-icei de plante! o-inute e3clusiv prin metode "izice %presare! distilare!
e3tracie simpl sau continu+ din planta #ntrea/ sau din or/ane ale acesteia& Componentele
amestecurilor sunt produi ai meta-olismului secundar ve/etal! secretate de structuri
anatomice specializate& 7leiurile pot "i pre"ormate i depozitate #n structuri anatomice
specializate sau eliminate prin celulele epidermale! ca urmare a unor activiti meta-olice! sau
a interaciunii plantei cu diveri a/eni declanatori sau pot "i prezente su- "orm de /licozide
%/lucosinolate+&
2oate or/anismele ve/etale prezint capacitatea de a produce! #n urma diverselor
reacii meta-olice! su-stane cimice volatile! dar! convenional! plante productoare de
uleiuri volatile! denumite curent plante aromatice! sunt acelea din care sunt e3trase uleiuri
volatile care prezint sau ar putea prezenta interes comercial& 7leiurile volatile de interes
comercial sunt selecionate! #n principal! dup dou criteriiG
aspectul calitativ le/at de proprieti aromatice deose-ite ale amestecului de compui
volatili! speci"ic "lorilor %e3emplu Rosa spp&! asminum sambac! Polyanthes tuberosa+!
care produc i elimin rapid prin epiderma petalelor componentele uleiului volatil
speci"ic& 8andamentul de e3tracie #n acest caz este sczut&
6
aspectul cantitativ H secreia i acumularea uleiurilor volatile la nivelul unor structuri
anatomice specializate! ceea ce conduce la creterea concentraiei uleiurilor volatile i a
randamentului de e3tracie %*LsnL Can ,aer i ,uc-auer! 2010+&
Ca i #n cazul altor e3tracte ve/etale! activitatea -iolo/ic a uleiurilor volatile este
determinat de anumii contitueni cimici! a cror aciune este siner/ic sau concertat&
4in a doua 9umtate a secolului al MM)lea! datorit evoluiei tenicilor de cimie
analitic %metode moderne de identi"icare H spectrometrie 8$A! spectrometrie de mas H i
de separare H metode cromato/ra"ice diverse+! cunotinele de "itocimie evolueaz
e3ponenial %*LsnL Can ,aer i ,uc-auer! 2010I 4udareva i cola-&! 2004+&
0olimor"ismul "itocimic al uleiurilor volatile! intra) i interspeci"ic! este demonstrat
de spectrul "oarte lar/ de aciuni -iolo/ice care depinde de ansam-lul constituenilor i de
proporia lor #n amestec& 4iversitatea compoziional este in"luenat calitativ i cantitativ de
mai muli "actori&
'mportana uleiurilor volatile industriale a determinat intensi"icarea studiilor pentru
identi"icarea cilor de -iosintez a acestora i utilizarea tenicilor de in/inerie /enetic pentru
o-inerea unor randamente sporite de e3tracie a unor compui utili! #ntre-uin5nd metoda
modelrii matematice pentru predicia i optimizarea unor parametri de studiu %8ios).stepa!
2010+&
II(1( Modalit6i de e@tracie i controlul calit6ii uleiurilor volatile
$etodele de o-inere a uleiurilor volatile sunt clasi"icate #nG !") metode industrialeI
!#) metode de la-oratorI !$) metode microe3tractive&
Ba -aza procedeelor de e3tracie a uleiurilor volatile din produsele ve/etale stau
proprietile "izico)cimice ale acestora! #n special tensiunea mare de vapori i solu-ilitatea #n
solveni volatili neapoi i #n su-stane /rase& 0rodusele supuse e3traciei pot "i at5t proaspete
c5t i uscate! #ntre/i sau "ra/mentate! concasate %or/ane su-terane+ sau su- "orm de rume/u
%lemnul+ %'studor! 2001+&
II(8( Activitatea anti3icro4ian6 a uleiurilor volatile
II(8(1( Date 9enerale
7
7nele "amilii de plante sunt cunoscute ca "iind productoare de uleiuri volatile& 4intre
acestea pot "i menionate "amiliileG %piaceae! %steraceae! &upressaceae! 'ypericaceae!
(amiaceae! (iliaceae! )yrtaceae! Pinaceae! Piperaceae! Rosaceae! Rutaceae! Fabaceae!
Santalaceae! *ingiberaceae! *ygophyllaceae %2ormar! 2011+&
8olul "iziolo/ic al uleiurilor volatile este puin precizat& 6e pare c acestea sunt
implicate #n autoaprarea speciilor respective #mpotriva in"eciilor -acteriene i "un/ice! #n
stimularea polenizarii cu a9utorul insectelor i deci #n semnalizarea interspeci"ic& 4atorit
"aptului c unii constitueni pot "i solu-ilizai prin /licozidare i depozitai #n esuturi! a "ost
propus ipoteza c uleiurile volatile ar putea avea i rol de su-tane de rezerv %'studor! 2001I
4udareva! 2004I 0icersJ? i 4udareva! 2006+& Carson C& i *ammer N& %2011+ susin
ipotezele anterior menionate privind aciunile "iziolo/ice ale uleiurilor volatile i "aptul c
aparenta lips a rolurilor "iziolo/ice nu se coreleaz cu a-sena real a acestora! ci mai
de/ra- cu lipsa studiilor de con"irmare a proprietilor unor su-stane de tipul meta-oliilor
secundari&
<ciunea terapeutic a uleiurilor volatile rezult din com-inarea proprietilor
terapeutice comune i speci"ice anumitor constitueni& <ceast com-inare a e"ectelor
terapeutice a constituenilor nu tre-uie privit ca o simpl sum a acestora! deoarece uleiuri
volatile care au unul sau mai muli constitueni comuni pot prezenta proprieti terapeutice
di"erite! demonstrate de numeroase studii pu-licate in literatura de specialitate& 0roprietile
terapeutice ale uleiurilor volatile includG
!") 0roprietatea antiin"ecioas& ."ectul antimicro-ian este unul dintre primele e"ecte
"armacolo/ice studiate pentru e3tractele din plante! literatura de specialitate conin5nd
"oarte multe ast"el de studii care reunesc o diversitate de metode i rezultate
e3perimentale& ,aza de date Pub)ed prezint rezultate ale acestor studii! care relev
aciunea anumitor uleiuri volatile %4a--a i cola-&! 1970I Oarai i cola-&! 2011I Pan/ i
cola-&! 2012+! sau concluzii e3perimentale asupra diverilor compui activi din plante i
modalitilor de aciune ale acestora %CoQan! 1999+& $etodele de testare a activitii
antimicro-iene reunesc metode de micro-iolo/ie clasic %tenica anti-io/ramei ) metoda
di"uzimetric adaptata! in mai multe variante metodolo/ice! metoda cinetic! metoda
microdiluiilor %Oen/ i cola-&! 2011I Naur i <rora 2009I NnoQless i cola-&! 2005! Na?a
i cola-&! 2008I *usnu can ,aser i ,uc-auer! 2010! 2ormar! 2011+! metode
microscopice %pentru demonstrarea unor modi"icri mor"olo/ice la tulpinile micro-iene
8
studiate H 2?a/i i $aliJ! 2010+& 4eraJsan i cola-&! 2010! demonstreaz proprietile
anti)pato/enice al uleiului din &uminum cyminum! %piaceae! asupra unor tulpini de
+lebsiella pneumoniae! mani"estat prin e"ectul anti-io"ilm! siner/ismele de aciune cu
anti-iotice curent utilizate #n clinic i prin vindecarea de plasmide indus prin
de/radarea <4A plasmidial la tulpinile studiate %4eraJsan i cola-&! 2010+& 6tudiile
asupra e"ectului antimicro-ian au demonstrat e"iciena uleiurilor volatile at5t in ,itro! c5t
i in ,i,o %6oJoviR i cola-& 2012+&
."ectul antiviral este de asemenea intens studiat pentru demonstrarea proprietilor
antiin"ecioase ale uleiurilor volatile %Pu i cola-&! 2010+&
!#) <ciunea antitumoral& ;n 2011! 6uail i cola-& demonstreaz activitatea proapoptotic a
uleiului volatil de Bos-ellia sacra asupra culturilor de celule standardizate 2474! $CK7!
$4<)$,)231 i $CK10)2<! prin studiul "ra/mentrii <4A /enomic! analiz Pestern
-lot i a re/lrii ciclului celular& 6cer-ina i cola-&! 2010! demonstreaz e"ectul
cemoterapeutic al pansamentelor ocluzive impre/nate cu concentraii speci"ice de ulei
volatil din (a,andula angustifolia.
!$) <ciunea antio3idant
!/) 0roprietile imunomodulatoare
!0) <ciunile asupra sistemului nervos central
!1) <ciunile asupra aparatului cardiovascular %'studor! 2001I 2ormar! 2011+&
4e "apt! spectrul aciunilor terapeutice ale uleiurilor volatile reunete proprieti care
se mani"est selectiv i modulat asupra tuturor or/anelor i sistemelor or/anismului uman
%Cercasov i cola-&! 2004+&
Ca i #n cazul altor produse ve/etale! i la uleiurile volatile! de activitatea -iolo/ic
este responsa-il ansam-lul constituenilor! care pot aciona siner/ic sau concertat! i mai rar
componentele izolate&
0ro-leme ca rezistena micro-ian la su-stanele anti-iotice e3istente i declinul
#nre/istrat #n "ormularea de noi anti-iotice au /enerat un interes sporit pentru medicamentele
pe -az de plante cu potenial antiin"ecios %:onzSlez)Bamote i cola-&! 2009! $urp?
CoQan! 2009+&
9
7leiurile volatile au inte de aciune multiple la nivelul celulei micro-iene! ceea ce
reprezint un avanta9 al utilizrii lor! ca su-stane antimicro-iene! cu activitate siner/ic sau
concertat a componentelor H activitatea lor antimicro-ian! i nu numai! "iind o rezultant a
"aptului c sunt sisteme multicomponent& 4e asemenea! e3tractele din plante pot mani"esta
a"initate pentru anumite esuturi i or/ane! ceea ce orienteaz activitatea -iolo/ic ctre
situsuri speci"ice unde di"eritele principii active realizeaz concentratii active "armacolo/ic
%*usnu can ,aer i ,uc-auer! 2010I 4udareva i cola-&! 2004+& Aumeroase studii
demonstreaz activitatea antimicro-ian a unor componente ma9oritare ale amestecurilor de
tipul uleiurilor volatile %,rem)6tecer i Tonson! 2003+! iar altele sta-ilesc posi-ile
mecanisme de aciune pentru constituenii cu activitate antimicro-ian %2rom-etta i cola-&!
2005+&
."ectul micro-icid sau micro-iostatic al -iocidelor de ori/ine ve/etal poate in"luena
sensi-ilitatea unor tulpini rezistente la su-stane anti-iotice& intele de aciune ale acestora
includ! ca i #n cazul anti-ioticelor! inter"erena cu procesul de -iosintez a peptido/licanului!
ini-area activitii pompelor de e"lu3! desta-ilizarea inte/ritii mem-ranei e3terne
%:onzSlez)Bamote i cola-&! 2009+& 4e asemenea! -iocidele din plante pot aciona prin
ini-area e3presiei "actorilor de virulen la nivelul celulelor micro-iene %Uiu i cola-&! 2010I
Uiu i cola-&! 2010I Uiu i cola-&! 2011+&
'n ultima perioad un interes deose-it este atri-uit comportamentului social al
microor/anismelor! respectiv capacitii de aderen a acestora la su-straturi vii sau inerte!
"actor de virulen cu implicaii clinice ma9ore %dezvoltarea in"eciilor micro-iene cu
producere de -io"ilme+! dar i un important aspect ecolo/ic i practic cu e"ecte -ene"ice sau
detrimentale& Consecutiv aderenei la su-strat se "ormeaz -io"ilmele micro-iene! iar la -aza
acestui proces st un mecanism re/lator U6! de cuanti"icare a densitii populaionale&
,iocidele de ori/ine ve/etal au "ost studiate i ca posi-ili ini-itori ai acestui "actor de
virulen! prin -locarea acestui mecanism de comunicare %prin interaciuni "izico)cimice+
%NnoQles i cola-&! 2005I <donizio i cola-&! 2008+& <ctivitatea anti-io"ilm a e3tractelor
ve/etale ar putea "i #ns privit i ca o consecin a modi"icrilor su-stratului %modi"icarea
potenialului de o3ido)reducere! a rezistivitii sau a a valorii p*+&
<ctivitatea antimicro-ian a unor uleiuri volatile! dar i a componentelor acestora! a
"ost demonstrat "a de o /am lar/ de microor/anisme! -acterii :ram pozitive i :ram
ne/ative i "un/i& 6e pare c -acteriile :ram ne/ative sunt mai rezistente la activitatea
10
-iocidelor o-inute din plante! datorit lipopolizaaridelor prezente la nivelul mem-ranei
e3terne! dar e3ist i e3cepii %$urp? CoQan $&! 1999I :onzSlez)Bamote i cola-&! 2009+&
$ecanismele activitii antimicro-iene sunt relativ puin #nelese! #n special pentru
uleiurile volatile! care sunt amestecuri comple3e de terpenoide %,ont i cola-&! 1995I
*?ld/aard i cola-&! 2009+&
II(8(8( Activitatea anti,5ato9enic6 -i 3ecanis3ele de ac:iune ale uleiurilor volatile
<tenuarea virulenei! #n opoziie cu e"ectul micro-icid direct! pare s "ie o strate/ie de
lupt antiin"ecioas care se impune #n cercetarea actual& $oleculele anti)pato/enice ini-
producerea de to3ine la nivelul celulei micro-iene sau a"ecteaz capacitatea
microor/anismelor de a se adapta la condiiile de mediu o"erite de /azd! con"erind ast"el un
avanta9 competitiv sistemului imunitar al /azdei care va putea realiza clearance)ul
microor/anismelor in"ectante& <vanta9ul acestei a-ordri rezid din conservarea micro-iotei
normale a /azdei! care nu va "i a"ectat de moleculele anti)pato/enice! dar i din lipsa
presiunii selective care conduce la selecionarea tulpinilor micro-iene rezistente i
multirezistente %<lvana i cola-&! 2011+& <st"el de molecule anti)pato/enice e"iciente
#mpotriva -acteriilor :ram ne/ative se adreseaz #ntreruperii mecanismelor de comunicare
U6! sistemelor de secreie i capacitii de aderen mediat de pili! #n timp ce la -acteriile
:ram pozitive este studiat ini-iia capacitii de aderen& 6upresia producerii to3inelor
-acteriene! ca i inter"erena cu mecanismele de evitare a rspunsului imun al /azdei sunt
posi-ile ed"ecte anti)pato/enice %,arczacJ i *un/! 2009+& <ceast a-ordare se poate corela
cu mecanismele de aciune antimicro-ian ale uleiurilor volatile! relativ puin studiate! care se
mani"est pe urmtoarele ciG %1+ permea-ilizarea #nveliurilor celulare! %2+ depolarizarea
mem-ranei plasmatice! %3+ a"ectarea polimor"ismului lipidic! %4+ interaciunea cu proteinele
mem-ranare la -acterii :ram ne/ative! %5+ a"ectarea proceselor respiratorii! %6+ coa/ularea
materialului citoplasmatic! %7+ ini-iia istidin)decar-o3ilazei %8+ depleia <20 intracelular!
%9+ supresia producerii de to3ine micro-iene& ;nc i mai puine sunt in"ormaiile le/ate de
siner/ismul sau anta/onismul de aciune al componentelor uleiurilor volatile! care acioneaz
concertat! ceea ce su/ereaz importana studiilor de transcriptomic i proteomic pentru
elucidarea cilor de aciune i a spectroscopiei 8$A! cristalo/ra"iei de raze M sau modelrii
moleculare pentru elucidarea interaiunilor la nivel molecular! care s "undamenteze tiini"ic
utilizarea uleiurilor volatile ca strate/ie de lupt antiin"ecioas %*?ld/aard i cola-&! 2012+&
II(8(<( rocedee de sta4ili7are a uleiurilor volatile
11
7tilizarea uleiurilor volatile este limitat de volatilitatea constituenilor& <cest "apt se
re"lect asupra aplicaiilor practice #n domenii diverse ale acestora! dar i asupra metodelor de
testare a activitii lor& 2estele care demonstreaz activitatea antimicro-ian a uleiurilor
volatile pot "i /rupate #nG metode di"uzimetrice! metoda diluiilor i metode auto-io/ra"ice&
<ceste metode sunt citate #n literatur! dar nu e3ist standardizare #n testarea activitii
antimicro-iene a uleiurilor volatile! metodele menionate "iind adaptate dup metodele CB6'
pentru testarea activitii antimicro-iene a anti-ioticelor& <daptrile au "ost realizate #n
"uncie de domeniul de aplica-ilitate a uleiurilor volatile testate! comparaia #ntre rezultatele
o-inute "iind imposi-il& 4ei activitatea antimicro-ian a acestor compui a "ost intens
studiat! totui in"luena "raciilor volatile asupra testelor prin metoda microdiluiilor a "ost
adesea ne/li9at& Aov? i 8ondevaldova! 2011! demonstreaz c vaporii de timocinon pot
conduce la "alse rezultate pozitive la testarea suscepti-ilitii microor/anismelor la standardul
de timocinon&
6ta-ilitatea este de"init drept capacitatea unei su-stane medicamentoase de a)i
menine proprietile %de e3emplu identitatea cimic! proprietile terapeutice! proprietile
"izico)cimice! puritatea+! #n accord cu speci"icaiile tenice! pe toat perioada de vala-ilitate!
sau p5n la termenul recomandat pentru retestare&
;ncapsularea uleiurilor volatile av5nd ca e"ect reducerea volatilitii constituenilor i
lr/irea zonelor de aplica-ilitate a "ost intens studiat #n cercetarea industrial! numeroase
-revete av5nd acest su-iect& Controlul parametrilor de #ncapsulare va depinde de natura
su-stanelor volatile care urmeaz s "ie #ncapsulate! dar i de matricea utilizat&
;ncapsularea uleiurilor volatile ar putea permite i #m-untirea relevanei studiilor
pentru demonstrarea activitii -iolo/ice a acestora& 2otui! procedeele de #ncapsulare sunt
la-orioase! iar caracterizarea sistemelor o-inute necesit aparatur de la-orator comple3&
II(8(>( I35ortanta nanote=nolo9iei ;n 2or3ularea 2ar3aceutic6
'n ultimii 35 de ani! dezvoltarea nanotenolo/iei a descis noi perspective #n tiinele
medicale! #n special #n domeniul industriei "armaceutice& ,iodisponi-ilitatea optim a
"ormulrilor "armaceutice! ca i minimizarea e"ectelor secundare sau creterea e"icienei
terapeutice odat cu scderea dozei principiului activ sunt doar c5teva dintre avanta9ele
"ormulrii nanosistemelor "armaceutice pentru transport la int>eli-erare controlat& ;n
12
ultimii ani numrul studiilor prezentate #n literatura de -revete! dar i al produselor
comerciale e3istente a crescut semni"icativ& Cele mai cunoscute aplicaii vizeaz terapia
-olilor canceroase! utiliz5nd nanosistemele comercialeG Cael?3V! 4o3ilV! 2ransdru/V!
<-ra3aneV etc&
0olimerii sunt su-stanele cele mai utilizate ca vectori #n nanosistemele "armaceutice
cu transport la int>eli-erare controlat& 4imensiunile acestora variaz #ntr)un interval lar/!
de la c5iva nanometri p5n la c5teva sute de nanometri& $area varietate a matricelor
purttoare a su-stanelor active rezid din necesitatea optimizrii "ormulrilor pentru a o-ine
e"icien "armaceutic ma3im&
4e la primele sisteme nanoparticulate pentru transport la int>eli-erare controlat!
propuse de :re/or? :re/oriadis #n 1974! cercetrile au condus la descoperiri importante
-azate pe a-ordri multidisciplinare! cu aplicaii clinice #n toate specialitile medicale
%0ataJ i 2assu! 2009+&
An conclu7ie. uleiurile volatile sunt amestecuri "itocimice comple3e! conin5nd p5n
la 100 de compui cimici aparin5nd la clase di"erite& Cea mai modern a-ordare #n
cercetrile de identi"icare a constituenilor amestecurilor multicomponente este aceea de
utilizare a cupla9elor tenice! utiliz5nd metode cromato/ra"ice& Cupla9ele tenice au permis
e"ectuarea studiilor de meta-olomic i meta-onomic pentru atestarea calitii uleiurilor
volatile provenite dintr)un material ve/etal&
0ro-leme ca rezistena micro-ian la su-tanele anti-iotice e3istente i declinul
#nre/istrat #n "ormularea de noi anti-iotice au /enerat un interes sporit pentru medicamentele
cu potenial antiin"ecios e3trase din plante&
,iocidele sunt su-tane antimicro-iene cu inte de aciune multiple la nivelul celulei
micro-iene! ceea ce reprezint un avanta9 al utilizrii lor& ,iocidele de tipul uleiurilor volatile
conin compui cu activitate siner/ic sau concertat! activitatea lor antimicro-ian! i nu
numai! "iind o rezultant a "aptului ca sunt sisteme multicomponent&
.3tractele din plante pot mani"esta a"initate pentru anumite esuturi i or/ane! ceea ce
orienteaz activitatea -iolo/ic ctre situsuri speci"ice! unde di"eritele principii active
realizeaza concentratii active "armacolo/ic&
13
<tenuarea virulenei! #n opoziie cu e"ectul micro-icid direct! pare s "ie o strate/ie de
lupt antiin"ecioas care se impune #n cercetarea actual& $oleculele antipato/enice ini-
producerea de to3ine la nivelul celulei micro-iene sau a"ecteaz capacitatea
microor/anismelor de a se adapta la condiiile de mediu o"erite de /azd! con"erind ast"el un
avanta9 competitiv sistemului imunitar al /azdei! care va putea realiza clearance)ul
microor/anismelor in"ectante&
7tilizarea uleiurilor volatile este limitat de volatilitatea constituenilor& <cest "apt se
re"lect asupra aplicaiilor practice #n domenii diverse ale acestora! dar i asupra metodelor de
testare a activitii lor! procedeele de sta-ilizare a acestora reprezent5nd direcii importante de
cercetare&
'n ultimii 35 de ani! dezvoltarea nanotenolo/iei a descis noi perspective #n tiinele
medicale! #n special #n domeniul industriei "armaceutice& ,iodisponi-ilitatea optim a
"ormulrilor "armaceutice! ca i minimizarea e"ectelor secundare sau creterea e"icienei
terapeutice odat cu scderea dozei principiului activ sunt doar c5teva dintre avanta9ele
"ormulrii nanosistemelor "armaceutice pentru transport la int>eli-erare controlat&
ARTEA E%ERIMENTAL
DEZ!OLTAREA UNOR METODE ALTERNATI!E ECOLO&ICE BAZATE E
COMU"I FITOTERAEUTICI , ULEIURI !OLATILE. ENTRU RE!ENIREA
"I ERADICAREA INFEC#IILOR CU MICROOR&ANISME INCLUSE AN
BIOFILME
Sco5 -i o4iective
@portunitatea studiului compuilor naturali cu aciune terapeutic este evident #n
conte3tul nevoii acute de soluii terapeutice pentru rezolvarea pro-lemei rezistenei la
anti-iotice i a to3icitii>e"ectelor secundare caracteristice su-stanelor 3eno-iotice utilizate
ca medicamente& ;n acest conte3t! sco5ul te7ei a "ostG
De7voltarea unor 3etode alternative -i co35le3entare ecolo9ice. de 5revenire i
eradicare a in2eciilor consecutive de7volt6rii 4io2il3elor de c6tre tul5ini 3icro4iene
virulente i 3ultire7istente. 5e dis5o7itive 5rotetice. 4a7ate 5e uleiuri volatile totale i
2racionate -i o5ti3i7area activit6:ii anti3icro4iene a e@tractelor ve9etale selectate 5rin
o4:inerea unor nanosiste3e =i4ride 2unc:ionali7ate(
14
O4iectivele dup care s)a condus studiul au "ostG
a+ Caracterizarea "enotipic i /enotipic a unor tulpini micro-iene izolate din in"ecii
consecutive dezvoltrii -io"ilmelor pe dispozitive -iomedicaleI
-+ @-inerea i caracterizarea "izico)cimic a unor e3tracte ve/etaleI
c+ .valuarea calitativ i cantitativ a activitii antimicro-iene i anti-io"ilm! ca i a
mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor micro-iene #n suspensie i a
celor aderate la un su-stratI
d+ 2estarea in"luenei e3tractelor i componentelor selectate pe -aza activitii
antimicro-iene asupra celulelor eucariote
e+ @-inerea unor nanosisteme i-ride "uncionalizate anor/ano)or/anice cu activitate
antimicro-ian>anti)-io"ilm pe -az de uleiuri volatile&
III(1( MATERIALE SI METODE
III(1(1( OBINEREA. CARACTERIZAREA FIZICO,C$IMIC I
DEMONSTRAREA ACTI!ITII ANTIMICROBIENE "I ANTIBIOFILM A UNOR
ULEIURI !OLATILE ASURA TULINILOR MICROBIENE !IRULENTE I
MULTIREZISTENTE
0entru studiul activitii antimicro-iene a uleiurilor volatile s)a realizat o selecie a
materialului ve/etal! din specii cunoscute ca "iind productoare de uleiuri volatile i o seecie
a tulpinilor micro-iene testate! prin a-ordarea unor metode "enotipice i /enotipice de
caracterizare a acestora&
III(1(1(1( Caracteri7area 2enoti5ic6 i 9enoti5ic6 a unor tul5ini 3icro4iene virulente i
3ultire7istente i7olate din 5ro4e clinice
2ulpinile izolate din pro-e clinice diverse s)au identi"icat -iocimic i s)au
caracterizat din punct de vedere al pro"ilului "actorilor de virulen&
III(1(1(1(1( Identi2icarea 4ioc=i3ic6 5e 4a7a testelor 4ioc=i3ice a unor tul5ini
3icro4iene virulente i 3ultire7istente i7olate din 5ro4e clinice
Tul5ini 3icro4iene i7olate din 5ro4e clinice( 0entru sta-ilirea e"ectului
antimicro-ian al uleiurilor volatile s)au utilizat tulpini -acteriene aparin5nd speciilor
S. aureus! S. epidermidis i Ps. aeruginosa i specii "un/ice aparin5nd /enurilor &andida!
Saccharomyces i %spergillus& 'denti"icarea tulpinilor s)a realizat cu a9utorul /aleriilor
15
microtest I2$# Staph! %PI #34E! Fungichrom I& ;n acest studiu s)au utilizat 30 tulpini de
Ps. aeruginosa i 30 de S. aureus selectate dintr)o colecie de tulpini izolate din in"ecii cu
producere -io"ilme #ntre anii 2005)2008! "urnizate de Ba-oratorul de $icro-iolo/ie al
'nstitutului de ,oli Cardiovasculare CC& C& 'liescuD din ,ucureti&
III(1(1(1(/( Deter3inarea ca5acit6ii de aderen6 la su4strat inert a tul5inilor 4acteriene
5ato9ene 5rin testul 5roducerii de slime
2estul slime s)a utilizat pentru evidenierea capacitii de aderen la su-stratul inert
reprezentat de materialul polimeric din care sunt con"ecionate plcile cu 96 de /odeuri
%principiul metodei va "i descris #n capitolul '''&1&1&3&3+&
III(1(1(1(8( Metoda Brun,Buisson 5entru deter3inarea cantitativ6 a ca5acit6ii de
aderen6 la su4strat inert 5entru tul5inile 2un9ice 5ato9ene
rinci5iul 3etodei( Kra/mente de catetere din polipropilen de 1 cm
2
au "ost supuse
colonizrii prin incu-are cu o suspensie micro-ian a9ustat ne"elometric con"orm
standardului $cKarland 0&5& 4up colonizare s)a evaluat dezvoltarea -io"ilmelor
e3perimentale monospeci"ice #n dinamic temporal! cuanti"ic5ndu)se 7KC la 24! 48!
respectiv 72&
III(1(1(1(<( Caracteri7area 2enoti5ic6 a 2actorilor de virulen:6 solu4ili 5entru tul5inile
2un9ice studiate
Caracterizarea "enotipic a "actorilor de virulen solu-ili pentru tulpinile "un/ice
studiate s)a realizat prin metode enzimatice speci"ice! descrise #n cap& '''&1&1&3&5&
III(1(1(1(>( Caracteri7area 9enoti5ic6 a 2actorilor de virulen6 4acterieni utili7Bnd
3etodele si35le@ i 3ulti5le@ CR
<4A /enomic a "ost e3tras din c5te cinci tulpini aparin5nd speciilor S. aureus i
Ps. aeruginosa! respectiv cate patru tulpini clinice i o tulpin <2CC& @ colonie din "iecare
cultur dezvoltat pe /eloz simpl a "ost inoculat #n 5 ml de mediu ,*' %,rain *eart
'n"usion+! supensiile rezultate "iind incu-ate peste noapte %18+ la 37WC! cu a/itare la 300
rpm&
4in culturile o-inute! e3tracia <4A a "ost realizat cu a9utorul Jitului 5i6ard 24%
7enomic Purification %0rome/a! 76<+! #n acord cu recomandrile productorului& <4A
/enomic o-inut a "ost utilizat ca matri pentru toate e3perimentele 0C8&
16
Detectarea 5rin CR a 9enelor de virulen:6 la tul5inile de S. aureus
Caracterizarea la nivel molecular a prezenei /enelor care codi"ic pentru patru "actori
de virulen la tulpinile de S. aureus studiate a "ost realizat cu a9utorul tenicii 0C8& 2oate
reaciile 0C8 au "ost e"ectuate cu a9utorul 8hermal &ycler &orbet&
2enica 0C8 a "ost utilizat pentru detectarea a opt /ene care codi"ic pentru
principalele adezine $6C8<$$s la tulpinile de S& aureus.
Detectarea 5rin CR a 9enelor de virulen:6 la tul5inile de Ps. aeruginosa
Caracterizarea la nivel molecular a prezenei /enelor care codi"ic pentru 11 "actori de
virulen la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate a "ost realizat cu a9utorul tenicii 0C8&
<st"el! detectarea /enelor care codi"ic pentruG trei proteaze! ramnolipid! dou "os"olipaze!
sidero"orul pioverdin si pentru patru e3oto3ine %.3o<! .3o6! .3o7! .3o2+ s)a realizat prin
teste 0C8 simple3 pentru "icare /en utiliz5nd 8hermal &ycler &orbet&
4etectarea /enelor care codi"ic pentru proteazele elastaza %lasB+! proteaza alcalin
%apr%+ i pentru ramnolipidul %rhl%B+ s)a realizat prin 0C8 simple3 pentru "iecare /en
"olosind acelai pro/ram de ampli"icare& 4e asemenea! /ena ce codi"ic pentru proteaza '( a
"ost detectat printr)un 0C8 simple3 cu primeri speci"ici& 4etectarea /enei plc'9 care
codi"ic pentru sinteza "os"olipazei C emolitice i a /enei plc4! care codi"ic pentru
"os"olipaza C neemolitic! s)a realizat prin dou reacii 0C8 simple3 pentru "iecare /en
"olosind acelai pro/ram de ampli"icare& 4etectarea /enei p,d% care codi"ic pentru
sidero"orul pioverdin a "ost realizat printr)un 0C8 simple3 cu primeri speci"ici& C5teva
e3oto3ine %.3o<! .3o6! .3o2 i .3o7+ au "ost detectate prin reacii 0C8 individuale
"olosind primeri /enici speci"ici %Cotar! 2009+&
Caracteri7area siste3elor de GS la tul5inile de S. aureus -i Ps. aeruginosa
a# Deter3inarea 5rin CR a ti5ului de siste3 GS agr la tul5inile de S. aureus
Caracterizarea la nivel molecular a sistemului U6 agr la tulpinile de S. aureus studiate
a "ost realizat prin real-time multiple3 0C8&
Caracteri7area 9enoti5ic6 a siste3elor GS las -i rhl la tul5inile de Ps. aeruginosa
Caracterizarea molecular a locilor /enici responsa-ili de U6 la tulpinile de
Ps. aeruginosa analizate s)a realizat prin detectarea prin real)time)multiple3 0C8 a /enelor
lasI! lasR9 care codi"ic pentru sistemul U6 las i a /enelor rhlI! rhlR9 care codi"ic pentru
sistemul U6 rhl %Cotar i cola-&! 2008+&
III(1(1(/( O4inerea i caracteri7area 2i7ico,c=i3ic6 a e@tractelor ve9etale
III(1(1(/(1( Materialul ve9etal , recoltare -i 5re96tirea 5entru e@trac:ie
17
$aterialul ve/etal pentru e3tracii a "ost o-inut de la "urnizori locali %Rosmarinus
officinalis9 )entha x piperita9 Foeniculum ,ulgarae9 Sal,ia officinalis9 Eugenia
caryophyllata9 &itrus maxima+! din "lora spontan %Picea abies+! dintr)o cultur or/anic
%%nethum gra,eolens+! din cultura :rdinii ,otanice din Clu9 %Forsythia sp&+! din pepiniera
'stitutului de Cercetare 4ezvoltare pentru 0omicultur 0iteti)$rcineni %%ronia
melanocarpa+ i a 'nstitutului de Cercetri i <mena9ri 6ilvice %'C<6+ %ar-ori din "amilia
0inaceae+&
III(1(1(/(/( O4inerea uleiurilor volatile 5rin =idrodistilare
0lantele sau prile de plante recoltate %%nethum gra,eolens! Picea abies! Pinus nigra!
(arix decidua! %bies alba! Pseudotsuga men6iesii+ au "ost uscate i separate manual&
8ecoltarea s)a realizat #n "eno"aze optime de dezvoltare a plantelor pentru separarea
or/anelor vizate pentru e3tracia uleiurilor volatile& 0lantele aciziionate de la "urnizori
locali %&itrus maxima! Eugenia carryophyllata! )entha piperita! Rosmarinus officinalis!
Foeniculum ,ulgare+ au "ost identi"icate #nainte de a "i utilizate pentru e3tracia uleiurilor
volatile& 0ro-ele de material ve/etal uscat>proaspt au "ost idrodistilate #ntr)un aparat de tip
Aeo)Cleven/er timp de 4 %Karmacopeea 8om5n! ed& a)M)a+&
III(1(1(/(8( O4inerea uleiurilor volatile 5rin =idrodistilare asistat6 de 3icrounde
0rocedeul este similar idrodistilrii clasice! #nclzirea realiz5ndu)se #n condiii de
microunde! ceea ce scurteaz durata de e3tracie i crete randamentul #n ulei volatil&
III(1(1(/(<( O4inerea 3aceratului din Forsythia s55(
$aterialul ve/etal a "ost reprezentat de tulpini! "runze i "lori din cultura :rdinii
,otanice din Craiova& 6peciile utilizate au "ost F. suspensa! F. ,iridissima i i-ridul
Forsythia 3 intermedia& $etoda de o-inere a e3tractuluiG macerarea la temperatura camerei
cu o soluie de alcool 96=! timp de 10 zile& $aceratul s)a prelucrat #n continuare prin
evaporare la sec i resolu-ilizare a compuilor din e3tract #ntr)o solutie alcoolic 20=&
III(1(1(/(>( O4inerea 5rin 5resare la rece a e@tractului din Aronia melanocarpa
Kructele au "ost recoltate din pepiniera 'nstitutului de Cercetare 4ezvoltare pentru
0omicultur de la 0iteti)$rcineni& 0entru meninerea proprietilor "ructelor p5n la
e"ectuarea e3traciei acestea s)au con/elat la H45XC& .3primatul s)a o-inut din "ructele
mo9arate! sonicate i supuse centri"u/rii #n vederea separrii sucului& 0entru testarea
18
proprietilor i caracterizarea compuilor coninui de "ructe de %ronia melanocarpa au "ost
identi"icate calitativ i cuanti"icate su-staneleG acid ascor-ic! Y)caroten i antocianii&
III(1(1(/(D( Caracteri7area 2i7ico,c=i3ic6 a e@tractelor ve9etale
III(1(1(/(D(1( M6surarea densit6ii uleiurilor volatile
6)a realizat prin msurarea /reutii la -alana analitic %precizie cinci zecimale+ i raportare
la volum& 0entru acuratee! masa a "ost msurat "olosind un pro/ram statistic al -alanei! cu
10 determinri&
III(1(1(/(D(/( M6surarea indicelui de re2racie al uleiurilor volatile
;n cazul licidelor transparente! indicele de re"racie se poate determina cu a9utorul
re"ractometrului <--Z&
III(1(1(/(D(8( Anali7a &C,MS a uleiurilor volatile
0entru determinarea compozitiei cimice s)a utilizat un cromato/ra" de /aze Kisons
'nstruments :C 8000! cuplat cu spectrometru de mas cu ionizare prin impact i analizor
[uadrupol! model $4 800&
III(1(1(/(D(<( Deter3inarea acidului ascor4ic
0entru determinarea cantitativ a acidului ascor-ic a "ost aplicat metoda
dicromatometric! care utilizeaz ca titrant dicromatul de potasiu! soluie standard i ca
indicator amidonul& .3cesul de ioni dicromat reacioneaz cu ionii de iodur de potasiu
eli-er5nd iod! iar acesta coloreaz amidonul din mediul de reacie #n al-astru&
III(1(1(/(D(>( Deter3inarea con:inutului total de antociani
0entru determinarea coninutului total de antociani a "ost utilizat metoda di"erenei
de p*& <ceast metod este una spectro"otometric! rapid i simpl! -azat pe trans"ormrile
structurale ale antocianilor atunci c5nd se modi"ic valoarea p* %soluie colorat la p*\1!0 i
soluie incolor la p*\4!5+ %,ratu i Cr5maru! 2000+&
III(1(1(/(D(D( E@trac:ia -i deter3inarea carotenoi7ilor
19
$etoda spectro"otometric de determinare cantitativ a totalului carotenoidic
%Pillst]der i 6toll! citai de Tun/min i cola-oratorii! 2005+ "olosete ca su-stan de
re"erin Y)caroten soluie 2!5 m/= preparat #n -enzen i const #n saponi"icarea esterilor
3anto"ilici cu N@* 10=! e3tracia 3anto"ilelor rezultate #n eter i msurarea a-sor-anei
soluiei eterice la spectro"otometru la ^\460 nm! #n cuve de 1 cm %Tun/min i cola-&! 2005&
III(1(1(/(D(E( Deter3inarea con:inutului ;n 5oli2enoli totali e@5ri3a:i ;n acid ca2eic
6)a realizat prin metoda Kolin)Cioc5lteu&
III(1(1(8( Evaluarea calitativ6 i cantitativ6 a activit6ii anti3icro4iene i
anti4io2il3. ca i a aciunilor siner9ice i a 3ecanis3elor de aciune ale
uleiurilor volatile asu5ra celulelor 3icro4iene ;n sus5ensie i a celor
aderate la un su4strat
III(1(1(8(1( Deter3inarea calitativ6 a s5ectrului anti3icro4ian al e@tractelor ve9etale
2estele calitative e"ectuate pentru determinarea spectrului activitii antimicro-iene al
e3tractelor ve/etale au "ost metoda di"uzimetric! metoda dinamicii instalrii e"ectului
micro-icid i tenica citometriei #n "lu3&
III(1(1(8(1(1( Metoda di2u7i3etric6 standard
0entru testarea calitativ a activitii antimicro-iene s)au preparat suspensii
micro-iene a9ustate la 1&5310
8
7KC>mB con"orm standardului $cKarland 0!5 din culturi de
15)18 dezvoltate pe mediu solid %6a-ouraud+& <ctivitatea antimicro-ian s)a determinat
prin metoda di"uzimetric adaptat! standardizat pentru controlul activitii antimicro-iene a
anti-ioticelor! CB6' %Clinical and Laboratory Standards $nstitute+! 2009&
III(1(1(8(1(/( Cur4a dina3icii te35orale a e2ectului 3icro4iostatic?3icro4icid
0rincipiul metodei presupune meninerea #n contact a suspensiilor micro-iene cu
e3tractele ve/etale! #n proporie de 1G1! timp de contact de 1! 3! 5! 15! 30 minute!
determin5ndu)se numrul de celule via-ile %7KC+ prin #nsm5nare pe mediu solid %/eloz
simpl>6a-ouraud pentru speciile -acteriene> "un/ice+&
III(1(1(8(1(8( Evaluarea activit6:ii anti2un9ice a uleiului volatil utili7Bnd te=nica
cito3etriei ;n 2lu@
20
0entru analiza citometric! diluii seriale! #n intervalul de concentraii
3&125)200_B>mB s)au testat #n trei variante de lucru! #n care timpii de incu-are pentru "iecare
pro- au "ostG 5! 30 min i 24 ore %0ina)(az i cola-&! 2004+& 0entru marcare s)a utilizat ca
"luorocrom iodura de propidiu! care a-soar-e la 488nm i emite la 562)568 nm i se lea/
speci"ic de acizii nucleici& Concentraia "luorocromului a "ost de 5 `/>mB! iar protocolul de
colorare a "ost aplicat la temperatura camerei timp de 10 min #nainte de aciziia de date H
citometrul K<C6 Cali-ur& 0rodusul soft-are Pin$4' 2&8 a "ost utilizat pentru analiza
statistic&
III(1(1(8(/( Deter3inarea cantitativ6 a activit6:ii anti3icro4iene -i sta4ilirea
concentra:iei 3ini3e in=i4itorii *CMI+
<naliza cantitativ s)a realizat prin metoda microdiluiilor seriale #n mediu licid! #n
plci cu 96 de /odeuri>tu-uri .pendor" de 1&5mB %Bazr i cola-oratorii! 2005+& C$' s)a
sta-ilit macroscopic! ca "iind ultima concentraie la care nu s)a o-servat apariia creterii
micro-iene! respectiv apariia tur-iditii mediului i prin citire spectro"otometric a
a-sor-anei la 620nm&
III(1(1(8(8( Studiul in2luen:ei uleiurilor volatile asu5ra ca5acit6:ii de aderen:6 la
su4strat inert a unor tul5ini 4acteriene 5rin testul 5roducerii de sli3e
'n"luena asupra capacitii de aderen la su-strat inert s)a cuanti"icat dup e"ectuarea
protocolului analizei cantitative a e"ectului antimicro-ian! prin metoda microtitrrii!
evalu5ndu)se -iomasa! dup "i3are cu metanol i colorare cu cristal violet&
III(1(1(8(<( Studiul in2luenei asu5ra sesnsi4ilit6ii la anti4iotice a tul5inilor studiate
III(1(1(8(<(1( Metoda di2u7i3etric6 ada5tat6
2estarea sensi-ilitii la anti-iotice a tulpinilor de S. aureus i Ps. aeruginosa studiate
a "ost realizat prin metoda di"uzimetric %Nir-?),auer+ standardizat! recomandat de CB6'9
ediia 2009& Citirea rezultatelor s)a realizat prin msurarea comparativ a diametrelor zonelor
de ini-iie /enerate de di"erite anti-iotice! respectiv anti-iotice i soluie stoc de ulei volatil!
cu a9utorul unei ri/le /radate&
III(1(1(8(<(/( Metoda 3icrodiluiilor seriale 7eci3ale 5entru deter3inarea co35arativ6
a concentra:iei 3ini3e in=i4itorii
21
<naliza cantitativ comparativ s)a realizat prin metoda microdiluiilor seriale #n
mediu licid %-ulion $ueler)*inton+! #n plci cu 96 de /odeuri>tu-uri .pendor" de 1&5mB
%Bazr i cola-&! 2005+& 6)au realizat diluii speci"ice pentru anti-ioticele neomicin!
-acitracin! ce"ota3im i /entamicin& 6oluiile iniiale de anti-iotic s)au realizat la
concentraia 1m/>mB #n 4$6@& ;n /odeuri s)a adu/at soluie stoc ulei volatilG4$6@! 0&1=
%v>v+& C$' s)a sta-ilit macroscopic! ca "iind ultima concentraie la care nu s)a o-servat
apariia creterii micro-iene! respectiv apariia tur-iditii mediului i prin citire
spectro"otometric a a-sor-anei la 620nm&
III(1(1(8(>( In2luen:a uleiurilor volatile -i a unor 2rac:ii din acestea asu5ra 5roducerii
2actorilor de virulen:6 solu4ili *to@ine 2or3atoare de 5ori. e@oen7i3e+
0entru sta-ilirea in"luenei asupra producerii "actorilor de virulen solu-ili tulpinile
de S. aureus i Ps. aeruginosa9 crescute #n concentraii su-ini-itorii de soluii stoc ulei
volatilG4$6@ %C$'>2+ i martorii pozitivi %tulpina netratat+ au "ost utilizate pentru
#nsm5narea "iecrui tip de mediu de cultur speci"ic pentru detectarea "iecrui "actor de
virulen solu-il %emolizine! 4A)az! lecitinaze! lipaze! cazeinaz! amilaz! "actori
sidero"ori)like+ %'ordace i cola-&! 2008+&
III(1(1(8(D( Evaluarea activit6:ii uleiurilor volatile -i a unor 2rac:ii ale acestora asu5ra
4io2il3elor 3icro4iene e@5eri3entale 3onos5eci2ice de7voltate 5e su4straturi inerte
III(1(1(8(D(1( Deter3inarea in2luen:ei in=i4itorii a uleiurilor volatile asu5ra 4io2il3elor
3icro4iene e@5eri3entale de7voltate 5e su4strat inert su43ersat
6tudiul s)a realizat pentru 45 de tulpini micro-iene izolate din pro-e clinice!
aparin5nd speciilor S. aureus! Ps. aeruginosa i &. albicans! &. glabrata! &. famata! &.
krusei& 7leiurile volatile utilizate au "ost e3trase din ). piperita9 R. officinalis9 E.
caryophyllata 9 S. officinalis %. gra,eolens& Concentraiile uleiurilor volatile #n mediul de
cultur au "ost C$'35& ,io"ilmele micro-iene %de 24! 48+ dezvoltate pe su-stratul inert
reprezentat de plcile cu 96 de /odeuri s)au tratat cu soluii stoc ulei volatilG4$6@ 1G1 %v>v+
i s)au incu-at 24& 0entru evaluarea -iomasei aderate s)a utilizat testul slime %cap&
'''&1&1&3&3&+&
III(1(1(8(D(/( Deter3inarea in2luen:ei in=i4itorii a uleiului volatil din E( carrKo5=Kllata
asu5ra 4io2il3elor e@5eri3entale de Candida s5( de7voltate 5e su4strat inert te@til
22
Kra/mentele de pansamente sterile au "ost supuse colonizrii utiliz5nd o suspensie
micro-ian de &. albicans <2CC 10231 a9ustat ne"elometric con"orm standardului
$cKarland 0&5& 0entru evidenierea in"luenei ini-itorii a uleiului volatil din mu/uri de E.
caryophyllata asupra -io"ilmelor e3perimentale dezvoltate timp 72 s)au utilizat metode
microscopice %6.$+ i metoda ,run),uisson&
III(1(1(8(D(8( Deter3inarea 5rin cito3etrie ;n 2lu@ a in2luen:ei in=i4itorii a uleiurilor
volatile -i a unor 2rac:ii ale acestora asu5ra 4io2il3elor e@5eri3entale de Candida
albicans ATCC 10/81 de7voltate 5e su4strat inert *la3ele de sticl6+
0rocentul de celule via-ile din "iecare pro- s)a determinat calitativ prin tenica
citometriei #n "lu3& 7leiurile volatile utilizate au "ost e3trase din planteleG %. gra,eolens9 ).
piperita9 F. ,ulgare9 E. caryophyllata9 R. officinalis. Kracii din uleiurile volatile H limonen!
carvon! "elandren au "ost evaluate pentru in"luena asupra -io"ilmelor pre"ormate&
Concentraiile acestora #n mediul de cultur au "ost C$'35&
III(1(1(8(E( Eviden:ierea in2luen:ei uleiurilor volatile -i a unor 2rac:ii ale acestora asu5ra
e@5resiei unor 9ene care codi2ic6 5entru 2actori de virulen:6 -i 3olecule i35licate ;n
se3nali7area intercelular6
E@trac:ia ARN total la tul5inile de S. aureus -i Ps. aeruginosa
E@tracia ARN total s)a realizat din culturile -acteriene de 18 ore variante tratate sau
netratate cu 4$6@>uleiuri utiliz5nd Jitul :eneTet 8A< 0uri"ication %Kermentas+& .3tracia
<8A din S. aureus s)a "acut la "el ca i la Ps. aeruginosa! cu o sin/ura e3cepie H s)a "acut
suplimentar tratament cu lizozim %concentraie "inal 10m/>mB+ i cu lizosta"in %concentraie
"inal 10m/>ml+! care s)au adau/at #n tamponul 2.&
Cuanti"icarea nivelului de e3presie a /enei a/r s)a "acut prin [0C8 cu primeri i sonde
speci"ice&
III(1(/( DETERMINAREA ACIUNII E%TRACTELOR !E&ETALE SELECTATE
ASURA CELULELOR EUCARIOTE I OTIMIZAREA ACTI!ITATII
ANTIMICROBIENE RIN OB#INEREA UNOR NANOSISTEME $IBRIDE
FUNCTIONALIZATE
III(1(/(1( Testarea citoto@icitatii e@tractelor ve9etale asu5ra celulelor eucariote 5rin
3etoda colora:iei cu tri5an 4lue
23
'n"luena e3tractelor ve/etale asupra celulelor eucariote s)a realizat prin metoda coloraiei cu
tripan blue i apreciere a numrului de celule via-ile dup 24 de tratament cu soluie stoc
ulei volatilG4$6@! asupra celulelor eucariote aparin5nd liniei standardizate *eBa&
Celulele tratate cu ulei volatil din E. caryophyllata i suc din "ructe de %.
melanocarpa au "ost prelucrate pentru analiza ciclului celular&
III(1(/(/( O4:inerea unor 3ateriale nanostructurate =i4ride anor9ano,or9anice cu
5ro5riet6i antiaderente i anti3icro4iene
III(1(/(/(1( Sinte7a 3a9netitei 2uncionali7ate cu acid oleic
;n lucrarea de "a! s)a "olosit urmatorul un protocol! adaptat dup metoda $assart
%1981+&
III(1(/(/(/( Sinte7a nanotu4urilor de car4on 3ultistrat *MFCNT+
$PCA2)urile au "ost o-tinute prin procesare #n plasm %,uteic i cola-&! 2011+ i
puri"icate prin e3tracie cu solvent %succesiv cu -enzen! diclormentan i o)diclor-enzen+I
impuritatile anor/anice au "ost indepartate cu ameste de acid azotic>acid cloridric "ier-inteI
$PCA2)urile au "ost spalate cu apa ultrapura si uscate la temperatura de 300
0
C&
III(1(/(/(8( Asa34larea nano2luidului 5e 4a7a de 3a9netita si uleiuri esentiale 5entru
o4tinerea de su5ra2ete antiaderente
Ki/ura 42& 6cema asam-lrii sistemului nanostructurat core)sell)e3trasellG a1b suspendarea
nanoparticulelor ma/netice #n cloro"orm! a2b mo9ararea nanoparticulelor ma/netice cu ulei volati! a3b
evaporare la sec a4b suspendarea #n cloro"orm pentru o-inerea unei distri-uii uni"orme a
"itocomponenilor pe supra"aa nanos"erelor ma/netice a5b evaporare cloro"orm
Aanoparticulele ma/netice de tip core-shell %ma/netit "uncionalizat cu acid oleic+
s)au suspendat #n cloro"orm #n proporie de 30m/>mB! respectiv ulei volatil #n proporie de
1G3 #n cloro"orm& Componentii au "ost amestecati p5n la evaporare la sec a cloro"ormului!
dup care au "ost mo9arai timp de cinci minute& 0rocedeul a "ost repetat de trei ori pentru a
o-ine o distri-uie uni"orm a "itocomponenilor pe supra"aa nanos"erelor ma/netice %"i/&
42+&
24
III(1(/(/(<( Asa34larea MFCNT,urilor 5e 4a76 de car4on,2ier i 2itoco35oneni ai
a5elor de co=o4aie 5entru o4inerea 3aterialelor antiaderente
4up e"ectuarea procedeului de e3tracie prin idrodistilare asistat de microunde!
materialul ve/etal a "ost #ndeprtat prin "iltrare! iar apele de coo-aie au "ost separate #n vase
cu volume e/ale %"i/& 43+&
Ki/ura 43& 6cema e3traciei compuilor din apa de coo-aie pe nanoparticule ma/netice $PCA2
III(1(/(/(>( O4inerea su5ra2eelor antiaderente
III(1(/(/(>(1( Modi2icarea su5ra2eelor 5rin i3ersare ;n nano2luid aliniat ;n cB35
3a9netic
Aano"luidul o-inut s)a orientat #n c5mp ma/netic! iar suporturile pentru peliculizare
s)au imersat #n suspensie pentru o-inerea unui strat uni"orm de nanoparticule! dup
evaporarea solventului! o-in5ndu)se sistemul nanostructurat de tip core,shell,extrashell&
6uporturile peliculizate s)au sterilizat prin iradiere 7( %timp de e3punere 10 min+&
25
III(1(/(/(>(/( Modi2icarea su5ra2eei dis5o7itivelor 3edicale 5rin de5unere asistat6 laser
utili7Bnd te=nica MALE *Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation+
4epunerile s)au realizat cu un laser NrK %248nmI 200mT>cm
2
+! cu o rat de repetiie de
10*z! #ntre 7200 i 20000 de pulsuri& 6upra"eele peliculizate au "ost imersate #n ulei volatil
i usacate&
III(1(/(/(D( Caracteri7area 3aterialelor nanostructurate 5rin DR%. FT,IR. AFM. AT&
i TEM
III(1(/(/(D(1( Di2racto3etrie de Ra7e % *DR%+
Cristalinitatea materialului la dimensiuni nanometrice a "ost analizat prin
di"ractometrie de raze M cu a9utorul unui di"ractometru 6imadzu M84 6000 la temperatura
am-iental&
III(1(/(/(D(/( S5ectrosco5ia ;n In2raro-u *FT,IR+
0entru a pune #n eviden /rupele "uncionale ale materialului de dimensiuni
nanometrice a "ost utilizat un spectrometru K2)'8 Aicolet 6700 %2ermo Aicolet! $adison!
P'+ conectat la pro/ramul de lucru @mnic %versiunea 7&0& 2ermo Aicolet+&
III(1(/(/(D(8( Microsco5ia Electronic6 5rin Trans3isie *TEM+
'ma/inile au "ost o-inute pentru materialul su- "orm de pul-ere! utiliz5nd *8)2.$
%%igh !esolution &ransmission Electron Microscope+& $icroscopul a operat #n modul
transmisie la 300J(! rezoluie punctual 2 c! rezoluie liniar 1 c& 0ul-erea s)a suspendat #n
etanol a-solut prin sonicare timp de 15 min& @ pictur din pro-a diluat s)a plasat #n
suportul din cupru te3turat cu car-on&
III(1(/(/(D(<( Microsco5ie cu 2or6 Ato3ic6 *AFM+
4imensiunea peliculelor a "ost msurat utiliz5nd un sistem 6t?lus 0ro"iler M0) 2
%<m-ios+ cu rezoluie vertical 0&1 nm& $icro/ra"iile <K$ au "ost o-inute cu a9utorul
plat"ormei 60$)A2e/ra model 0rima #n contrast de "az& 'ma/inile s)au #nre/istrat pe o
supra"a de 25 `m
2
&
III(1(/(/(D(>( Anali7a Ter3o,&ravi3etric6 *AT&,TD+
26
0entru evaluarea cantitatii de ulei volatil adsor-it pe supra"aa nanos"erelor de
ma/netit a "ost utilizat un instrument Aetzsc 2: 449C 62< Tupiter& $aterialul
nanostructurat a "ost o-inut dintr)un /ram de ma/netit "unctionalizat i 1 mB de ulei
volatil&
III(1(/(8( Deter3inarea activit6ii anti3icro4iene? anti,4io2il3 a nanosiste3elor 5e 4a76
de uleiuri volatile
III(1(/(8(1( Evaluarea calitativ6 a activit6:ii anti,4io2il3 5rin 3icrosco5ie con2ocal6
0ro-ele au "ost vizualizate "olosind un microscop C6B$ 2C6)60 Beica dotat cu 0B
KB7@2<8 i un laser <r)Ae re/lat la 488nm& < "ost o-inut o rezoluie lateral de 200 nm&
0ro-ele reprezentate de -io"ilme e3perimentale monospeci"ice dezvoltate pe
su-straturile inerte dup 24>48>72 de ore de la incu-are au "ost spalate de 3 ori cu tampon
"os"at salin! "i3ate cu metanol i uscate #nainte de e3aminarea microscopic&
III(1(/(8(/( Deter3inarea CMI 5entru MFCNT,uri ;nca5sulate ;n 2itoco35oneni din
a5a de co=o4aie din E. caryophyllata
4eterminarea C$' pentru MFCNTs?= %$PCA2>"itocomponeni+ s)a realizat prin
tenica diluiilor -inare& 6istemul MFCNTs?= s)a suspendat #n 4$6@ %100m/>mB+! iar
apoi s)au realizat diluii seriale -inare #n intervalul 50)0&39 m/>mB! #n plci cu 96 de /odeuri&
4eterminarea C$' s)a realizat con"orm protocolului descris anterior&
III(1(/(8(8( Deter3inarea cantitativ6 a ca5acit6ii de aderen6 la su4strat inert 5entru
tul5inile 2un9ice 5ato9ene *3etoda Brun,Buisson 3odi2icat6+ *descris6 ;n ca5(
III(1(1(1(8+
III(1(/(8(<( Deter3inarea activit6ii anti5ato9enice a nano2luidului 5e 4a76 de 3a9netit6
i ulei volatil din 3u9uri de E. caryophyllata
0entru studiul activitii anti)pato/enice a Ke
3
@
4
>C
18
>7( %Ke
3
@
4
>acid oleic>ulei volatil+
s)a realizat un e3periment in ,i,o pe oareci al-i de la-orator #n v5rst de 4)5 sptm5ni!
c5ntrind apro3imativ 25/& <nimalele au "ost pretratate prin administrarea oral a "ito)
nanosistemului timp de o sptm5n %100 _B+! dup care au "ost in9ectate intraperitoneal cu
200 _B suspensie -acterian a9ustat ne"elometric con"orm standardului $cKarland 0&5!
o-inut dintr)o cultur dezvoltat pe mediu solid %/eloz simpl+ de Ps. aeruginosa izolat
dintr)o emocultur pozitiv& 2ratamentul oral s)a des"urat timp de #nc dou sptm5ni de
27
la in9ectare& <nimalele au "ost evaluate prin inspecie zilnic! urmrindu)se comportamentul!
/reutatea i situsul in9eciei&
III(/( REZULTATE "I DISCUII
III( /(1( CARACTERIZAREA FENOTIIC I &ENOTIIC A UNOR TULINI
MICROBIENE IZOLATE DIN INFECII CONSECUTI!E DEZ!OLTRII
BIOFILMELOR E DISOZITI!E BIOMEDICALE
0entru sta-ilirea spectrului de activitate antimicro-ian al uleiurilor volatile s)au
utilizat tulpini de colecie aparin5nd speciilor Staphylococcus aureus! Enterococcus faecalis!
Bacillus subtilis! Bacillus cereus9 Pseudomonas aeruginosa! Escherichia coli! +lebsiella
pneumoniae! &andida albicans! %spergillus niger&
III(/(1(1( Deter3inarea ca5acit6ii de aderen6 la su4strat inert i 2or3are consecutiv6 a
4io2il3elor 3onos5eci2ice 5entru tul5ini 3icro4iene a5arinBnd s5eciilor S. aureus. Ps.
aeruginosa i C. albicans
;n studiul de "a a "ost caracterizat capacitatea de aderen la su-strat inert i de
"ormare consecutiv a -io"ilmelor a unor tulpini de S. aureus! Ps. aeruginosa %c5te 15 tulpini+
i &andida sp& %40 de tulpini+ izolate din pro-e clinice di"erite! considerat "iind criteriu de
selecie a tulpinilor cu pro"iluri de virulen semni"icative care au "ost utilizate #n
demonstrarea activitii -iolo/ice a unor uleiuri volatile i e3tracte ve/etale&
0entru 7 tulpini de S. aureus i 8 de Ps. aeruginosa capacitatea de colonizare a
su-stratului inert! dup protocolul testului slime9 a "ost mai mare de 1m<u! acestea "iind
clasi"icate drept #nalt aderente&
8eprezentarea /ra"ic a distri-uiei tulpinilor de &andida sp& studiate in "uncie de
capacitatea lor de aderen>"ormare -io"ilme! determinat prin metoda ,run),uisson
modi"icat! a permis clasi"icarea acestora #n aderente %36=+! #nalt aderente %37=+ i
neaderente %27=+&
III(/(1(/( Studiul 5lasticit6ii 3or2olo9ice la tul5ini 2un9ice din s5ecii di2erite
.lucidarea mecanismelor de pato/enitate ale "un/ilor pato/eni %de e3emplu
%spergillus fumigatus9 &andida albicans+ a suscitat un mare interes! datorit numrului #n
continu cretere de cazuri de in"ecii "un/ice invazive& @ caracteristic esenial a acestor
in"ecii este interaciunea dintre di"eritele mor"otipuri "un/ice cu celulele epiteliale sau
e"ectorii imunitari #n /azda uman %*orn i cola-&! 2012+&
28
;n studiul de "a! 3 dintre tulpinile "un/ice selectate au mani"estat plasticitate
mor"olo/ic #n condiiile incu-rii cu adaos de ser -ovin #n mediul de cultur&
III(/(1(8( Caracteri7area 2enoti5ic6 a 2actorilor de virulen6 solu4ili 5entru tul5ini
3icro4iene a5arinBnd s5eciilor S. aureus. Ps. aeruginosa i C. albicans
,acteriile posed sisteme e"iciente de sintez! secreie i translocare a "actorilor de
virulen! care modi"ic mor"o)"uncional celula /azd permi5nd colonizarea su-staturilor
tisulare&
0entru selectarea tulpinilor cu pro"iluri de virulen semni"icative care au "ost utilizate
pentru demonstarea activitii -iolo/ice a uleiurilor volatile i e3tractelor ve/etale s)a analizat
"enotipic e3presia "actorilor de virulen solu-ili! to3ine "ormatoare de pori %lecitinaz!
emolizine! lipaz+ i e3oenzime %cazeinaza! amilaza! 4A)aza! "actori sidero"ori)like+ produi
de microor/anismele studiate&
III(/(1(<( Caracteri7area 9enoti5ic6 a tul5inilor selec:ionate 5entru 5re7en:a unor 9ene
de virulen:6
III(/(1(<(1 Distri4u:ia 9enelor de virulen:6 la tul5inile de Sta5=Klococcus aureus
.3presia mai multor "actori de virulen la S. aureus este su- controlul agr care! la
intrarea #n "aza staionar! represeaz e3presia proteinelor asociate supra"eei celulare
%proteina < i coa/ulaza+ i stimuleaz e3presia "actorilor solu-ili %de e3emplu! lipaz!
emolizine! proteaze+! care 9oac un rol important in invazia tisular si to3i/enez %Cotar!
2008+&
Anali7a re7ultelor testelor CR( Ba S. aureus 4 tulpini poseda /ena agr '''! iar tulpina de
re"erin apartine /rupului agr '&
III(/(1(<(/( Distri4u:ia 9enelor de virulen:6 la tul5inile de Ps. aeruginosa selec:ionate
6tudiile din literatur au demonstrat contri-uia sistemelor de U6 #n pato/eneza
in"eciilor cu Ps. aeruginosa& <naliza cur-elor de ampli"icare o-inute #n e3perimentul real-
time 0C8 la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate a aratat ca toate tulpinile posed cele patru
/ene care codi"ic pentru sistemele de semnalizare las i rhl! dar i un important spectru de
/ene de virulen&
III(/(1(>( Conclu7ii
<l/oritmul de selecie a tulpinilor care au "ost utilizate #n demonstrarea activitii
-iolo/ice a uleiurilor volatile s)a -azat pe caracterizarea "enotipic a e3presiei "actorilor
de virulen solu-ili! to3ine "ormatoare de pori %lecitinaz! emolizine! lipaz+ i
e3oenzime %cazeinaza! amilaza! 4A)aza! "actori sidero"ori)like+! dar i pe evidenierea
29
capacitii de aderen la su-straturi inerte a acestora! iar in cazul "un/ilor a capacitii de
a /enera "orme "ilamentoase&
2ulpinile de S. aureus au sintetizat toi "actorii de virulen! cele mai virulente dovedindu)
se cele izolate din secreiile de pla/& 0roducerea "actorilor de virulen solu-ili nu se
coreleaz cu sursa de izolare la tulpinile de Ps. aeruginosa studiate& 0ro"ilurile "actorilor
de virulen solu-ili pentru tulpinile "un/ice incluse #n studiul de "a au "ost relativ
uni"orme %di"erenele nu au "ost statistic semni"icative+! "actorii cei mai a-undent secretai
"iind amilaza! lipaza i a/enii celatori de "ier& 4e asemenea! tulpinile "un/ice studiate s)
au dovedit a "i sensi-ile la anti"un/icele curent utilizate #n clinic %itraconazol!
voriconazol! am"otericina ,! caspo"un/in H metoda .)test+&
Ba S. aureus au "ost evidentate prin 0C8 /enele care codi"ica pentru re/latorul de [uorum
sensin/ a/r! identi"icandu)se tipurile agr '''! si agr '! precum si /eneler ce codi"ic nou
receptine %asociate supra"eei celulare i respectiv secretate+G fnb%9 ce codi"ic sinteza
unei proteine de le/are a "i-ronectinei %Kn-p<+ i /ena fnbB! ce codi"ic o protein
omoloa/ de le/are a "i-ronectinei %Kn-p,+ /ena cfl%9 care codi"ic pentru "actorul
clumping <&! ena fib! care codi"ic pentru proteina e3tracelular care lea/ "i-rino/enul
clfB! care codi"ic pentru "actorul clumping ,&
<naliza cur-elor de ampli"icare o-inute #n e3perimentul real-time 0C8 la tulpinile de
Ps. aeruginosa analizate a artat ca toate tulpinile posed cele 4 /ene care codi"ic pentru
sistemele de semnalizare intercelular las i rhl! precum i /enele pentru proteaza '(!
elastaza , !lasB)! ramnolipid %rhl%B+& :ena plc4! ce codi"ic "os"olipaza C neemolitic
%0BC)A+ o emolizin la-il termic este prezent la toate tulpinile studiate! ca i /ena
plc'9 care codi"ic sinteza "os"olipazei C emolitice %0BC)*+& :ena care codi"ic pentru
proteaza alcalin! apr%! a "ost detectat la toate cele cinci tulpini studiate! iar ena care
codi"ic pentru proteaza '( a "ost a-sent la tulpinile izolate din urocultur& <naliza
rezultatelor 0C8 privind prezena /enelor exo%9 exo89 exoS i exo:! care codi"ic pentru
to3inele .3o2! .3o6 i .3o7! a artatat c toate tulpinile studiate posed /enele exo%!
exoS i exo:! iar exo8 este a-sent la tulpinile izolate din urocultur& :ena care codi"ic
pentru pioverdin! p,d% a "ost detectat la trei dintre cele 5 tulpini studiate&
30
;n urma acestei a-ordri comple3e! "enotipice i moleculare! au "ost selectate 7 tulpini de
S. aureus! 8 de Ps. aeruginosa i 15 tulpini "un/ice cu pro"iluri de virulen semni"icative!
pentru a "i utilziare #n e3perimentele ulterioare&
III(/(/( OBINEREA I CARACTERIZAREA FIZICO'C$IMIC A
E%TRACTELOR !E&ETALE
III(/(/(1( E@tracia i caracteri7area 2i7ic6 a uleiurilor volatile
0entru e3tracia uleiurilor volatile i teste -iolo/ice s)au ales reprezentani din specii
de plante din /rupul an/iospermelor %din "amiliile %piaceae! (amiaceae! )yrtaceae!
Rutaceae+ i din /rupul /imnospermelor %"amilia Pinaceae+! cunoscute ca "iind productoare
de uleiuri volatile %2ormar! 2011+&
6elecia realizat a "ost ar-itrar! cunoscut "iind din literatur e"ectul antimicro-ian al
ma9oritii uleiurilor volatile! e"ect doz)speci"ic! micro-icid %concentraia minim ini-itorie
i concentraia minim -actericid cu valori sensi-il e/ale+! mani"estat la concentraii su- 5=
%v>v+ %2ormar! 2011+&
7leiurile volatile au "ost caracterizate "izic determin5ndu)se densitatea i indicele de
re"racie&
III(/(/(1( Caracteri7area c=i3ic6 a uleiurilor volatile a relevat compoziia #n terpene i
terpenoide! specie speci"ic&
III(/(/(8( Caracteri7area sucului o4:inut din 2ructe de Aronia melanocarpa
0entru testarea proprietilor i caracterizarea compuilor coninui de "ructele de
%ronia melanocarpa au "ost determinaiG acidul ascor-ic! Y)carotenul i antocianii&
III(/(/(<( Caracteri7area e@tractelor din Forsithya s55&
2a-elul 37 Compoziia cimic a e3tractelor alcoolice din Forsithya spp&
ro4e 39 2enoli *e@5ri3ai ca acid ca2eic+?3L e@tract
F1 2!5772
F/ 3!0594
F8 1!5644
III(/(/(>( Conclu7ii
2erpenoidele sunt cel mai mare /rup de compui naturali! numr5nd apro3imativ
23000 de compui cunoscui! unele dintre ele av5nd activitate "armacolo/ic&
4iversitatea cimic i structural a terpenoidelor ca i a cilor lor de -iosintez este
impresionant! ceea ce "ace ca potenialele aplicaii ale acestor su-stane s acopere o
31
palet lar/ de domenii& ;n 2002! v5nzrile produselor "armaceutice pe -az de
terpene a9un/eau la sume de d12mld& E& Cele mai cunoscute produse "armaceutice pe
-az de terpene sunt 2a3ol
V
! medicament antitumoral! i antimalaricul <rtimesinin&
;n studiul de "a au "ost caracterizate "izico)cimic uleiuri volatile e3trase din
reprezentani aparin5nd /rupului an/iospermelor! din "amiliile <piaceae! Bamiaceae!
$?rtaceae! 8utaceae! i plante aparin5nd "amiliei 0inaceae! din /rupul
/imnospermelor cunoscute ca "iind productoare de uleiuri volatile!cu e"ect doz)
speci"ic! micro-icid %concentraia minim ini-itorie i concentraia minim
-actericid cu valori sensi-il e/ale+! mani"estat la concentraii su- 5= %v>v+&
7leiurile volatile au "ost e3trase din cantiti di"erite de material ve/etal! cuprinse
#ntre 50 i 200/! iar randamentul de e3tracie a "ost cuprins #ntre 0&1 i 8&4=! cel mai
mare coninut de uleiuri volatile "iind prezent #n mu/urii uscai din E. caryophyllata.
.3tractele etanolice din Forsithya spp& au "ost caracterizate pentru coninutul de
poli"enoli totali! iar sucul din %. melanocarpa pentru coninutul de acid ascor-ic!
antociani i Y)caroten&
III(/(8( E!ALUAREA CALITATI! "I CANTITATI! A ACTI!IT#II
ANTIMICROBIENE? ANTIATO&ENICE "I A MECANISMELOR DE AC#IUNE
ALE ULEIURILOR !OLATILE ASURA CELULELOR MICROBIENE AN
SUSENSIE "I A CELOR ADERATE LA UN SUBSTRAT
<ctivitatea antimicro-ian a uleiurilor volatile i a e3tractelor ve/etale! evaluat
calitativ i cantitativ! este adesea prima proprietate "armacolo/ic demonstrat pentru acestea
%*usnu can ,aser i ,uc-auer! 2010+! #ns speci"icitatea i comple3itatea interaciunilor la
nivel molecular #ntre componente celulare i componente ale e3tractelor din plante sunt
su-iecte #nc ne#nelese pe deplin& ;n cazul #n care mecanismele de aciune antimicro-ian a
uleiurilor volatile au "ost investi/ate! au "ost descrise e"ecte variate i speci"ice&
7leiurile volatile mani"est o activitate antimicro-ian di"ereniat! str5ns corelat cu
structurile cimice ale componentelor prezente #n uleiuri! in"luenat de mecanisme speci"ice
de siner/ism>anta/onism #ntre componente sau de "actori de mediu ori speci"ici
microor/anismelor studiate&
(alorile C$' sunt cuprinse #ntre 125 i 500_B>mB %"i/& 83)85+! pentru e3tractele
ozidice i respectiv 6&25 i 50 _B>mB %"i/& 85)87+ pentru cele de tip uleiuri volatile! cele mai
sensi-ile la aciunea antimicro-ian "iind tulpinile "un/ice i speciile -acteriene :ram
32
pozitive! ceea ce poate "i corelat cu "aptul c uleiurile volatile! meta-olii secundari ai
plantelor au rol de protecie antimicro-ian a acestora! ma9oritatea "itopato/enilor "iind :ram
ne/ativi&
III(/(8(/( Evaluarea activit6:ii anti5ato9enice -i a 3ecanis3elor de ac:iune ale uleiurilor
volatile asu5ra celulelor 3icro4iene ;n sus5ensie -i a celor aderate la un su4strat
III(/(8(/(1 Studiul dina3icii te35orale a e2ectului 3icro4icid al uleiurilor volatile
$etoda citometriei #n "lu3 a "ost aplicat #n studiul de "a pentru con"irmarea
rezultatelor o-inute calitativ! respectiv instalarea timpurie a e"ectului micro-icid al
e3tractelor ve/etale de tip uleiuri volatile&
III(/(8(/(/( Studiul in2luen:ei in=i4itorii a e@tractelor ve9etale asu5ra sinte7ei 2actorilor
de virulen:6 solu4ili 4acterieni eviden:ia:i 2enoti5ic
2ulpinile testate s)au dovedit productoare de "actori de virulen enzimatici! cu rol de
to3ine "ormatoare de pori #n mem-rana celulelor eucariote i #n invazie %lecitinaz!
emolizine lipaz! cazeinaz+& 'n"luena modulatorie a uleiurilor volatile asupra pro"ilului
"actorilor de virulen solu-ili la tulpinile selectate s)a mani"estat #n sensul ini-iiei
producerii acestor enzime! la concentraii C$'>2 ale uleiurilor volatile din E. caryophyllata!
R. officinalis! ). piperita i F. ,ulgarae9 "r speci"icitate pentru tulpinile studiate&
6tandardele analitice au e3ercitat un e"ect ini-itor! dar tulpin speci"ic&
2estarea a "urnizat rezultate predicti-ile! dac se ine seama de comple3itatea
compoziional a uleiurilor volatile %"i/& 98)102+& Carson i *ammer %2011+ analizeaz
literatura de specialitate i menioneaz studiile asupra e3presiei "actorilor de virulen
e"ectuate pentru uleiurile volatile %2ormar! 2011+I datele din literatur pentru acest su-iect
sunt relativ puine! dat "iind amploarea su-iectului! dar concluziile care se pot tra/e sunt
clare! pled5nd pentru relevana e"ectului antipato/enic al uleurilor volatile&
.3presia "actorilor de virulen solu-ili a "ost in"luenat de concentraii
su-ini-itorii ale e3tractelor ozidice din Forsithya sp& studiate prezente #n mediul de
cultur! #n sensul e3primrii sau represiei! e3tractul din F. intermedia dovedindu)se cel
mai activ&
33
III(/(8(/(/( Activitatea anti4io2il3 a e@tractelor ve9etale
III(/(8(/(/(1( In=i4area ca5acit6ii de aderen6 la su4straturi inerte
<ctivitatea anti-io"ilm asupra tuturor tulpinilor micro-iene selectate! dar i asupra
tulpinilor de colecie! s)a o-servat la concentraii C$'>2 ale uleiurilor volatile studiate&
'n"luena asupra capacitii de aderen la sus-strat inert a concentraiilor su-ini-itorii ale
e3tractelor etanolice asupra tulpinilor "un/ice selectate s)a o-servat dup un pra/ critic! cel
mai e"icient dovedindu)se a "i e3tractul din F. ,iridissima9 a crui activitate anti-io"ilm s)a
mani"estat pe domeniul cel mai lar/ de concentraii! 1&95)31&25`B>mB&
III(/(8(/(/(/( Eradicarea 4io2il3elor 3onos5eci2ice e@5eri3entale de7voltate 5e
su4straturi inerte
0rocesul stadializat de "ormare a -io"ilmelor poate "i in"luenat prin e"ectul cidal al
unei su-stane #n oricare din etapele sale& ;n studiul de "a s)a studiat in"luena concentraiilor
C$'35 ale uleiurilor volatile din R. officinalis! E. caryophyllata! F. ,ulgarae! %. gra,eolens i
a "raciilor limonen! carvon! "elandren& ;n "i/ura 107 este evideniat eradicarea -io"ilmelor
e3perimentale monospeci"ice de &. albicans <2CC 10231 #n v5rst de 48! dezvoltate pe
su-straturi inerte reprezentate de lamele de sticl %1 cm
2
+&
Ki/& 107& Cuanti"icarea prin citometrie #n "lu3 a celulelor via-ile
%&. albicans <2CC 10231+ dup tratarea -io"ilmelor pre"ormate cu uleiuri volatile %cui48\cuanti"icarea
numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu ulei volatil din E. caryophyllata9 848\
cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu ulei volatil din R. officinalis!
$e48\cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu ulei volatil din ).
piperita! $a48\ cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu ulei volatil
34
din %. gra,eolens! Ke48\ cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu ulei
volatil din F. ;ulgarae! Bim48\ cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48
cu "racia limonen! Carv48\ cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu
"racia carvon! Ke48 \cuanti"icarea numrului de celule via-ile dup tratamentul -io"ilmului de 48 cu "racia
"elandren+
0entru tulpinile de S. aureus i Ps. aeruginosa din minicolecia de tulpini micro-iene
s)a determinat e"ectul concentraiilor C$'35 asupra -io"ilmelor monospeci"ice e3perimentale
dezvoltate pe su-straturi inerte reprezentate de /odeurile plcilor multi-ell& 6tudiul s)a
realizat pentru -io"ilme #n v5rst de 24 i 48! prin determinare spectro"otometric a densitii
optice a materialului -iolo/ic resuspendat! dup tratament cu uleiurile volatile din R.
officinalis! E. caryophyllata! ). piperita! %. gra,eolens! S. officinalis&
(alorile 4@ %densitate optic+ o-inute dup tratamentul cu ulei volatil al -io"ilmelor
e3perimentale s)au redus semni"icativ! "iind cuprinse #ntre 4@>4 i 4@>2 comparativ cu
martorul "r tratament& Celulele incluse #n -io"ilmele pre"ormate s)au dovedit a "i mai
rezistente la aciunea uleiului volatil din ). piperita&
;n concordan cu e"ectul o-servat asupra creterii micro-iene la celulele planctonice!
#n cazul tulpinilor de Ps. aeruginosa e"ectul ini-itor a "ost moderat! #n special la 24!
o-serv5ndu)se un e"ect de stimulare a creterii -acteriene de ctre uleiurile volatile! #n medie
pentru 7 din cele 15 tulpini&
Ba studiul in ,itro al dezvoltrii -io"ilmelor de &andida albicans <2CC 10231 pe
supra"aa unor seciuni de pansament te3til i in"luena uleiului volatil din E. caryophyllata
asupra -io"ilmului e3perimental monospeci"ic s)a demonstrat e"ectul de eradicare a
-io"ilmului pre"ormat la o concentraie de ulei volatil de 15&75`B>mB& 8educerea numrului
7KC>cm
2
a "ost de 3 lo/7KC>cm
2
%"i/& 113+&
Ki/ura 114& 4eterminarea 7KC>cm
2
pentru -io"ilmele e3perimentale de &. albicans 10231
.valuarea calitativ prin microscopie electronic %6.$+ %"i/& 115+ a con"irmat
rezultatele cantitative! demonstr5nd a-sena celulelor micro-iene #n prezena uleiului volatil&
35
Ki/ura 115& .valuarea prin microscopie electronic %6.$+ a -io"ilmelor e3perimentale de &. albicans 10231
a!-)-io"ilm e3perimental de &. albicans 20231 #n v5rst de 24 I c!d)eradicarea -io"ilmului pre"ormat %24+ de
ctre uleiul volatil din mu/uri de E. caryophyllata %"i/& st5n/a 10003! "i/& dr& 25003+
III(/(8(/(/(8( E2ectul 3odulator asu5ra e@5resiei 9enelor de GS la tul5ini de S. aureus i
Ps. aeruginosa
<v5nd #n vedere rolul important pe care sistemele de semnalizare #l 9oac #n re/larea
e3presiei "actorilor de virulen! ini-area e3primrii acestor sisteme ar putea conduce la
scderea e3presiei virulenei tulpinilor pato/ene& 0entru cuanti"icarea relativ s)a utilizat
e3perimentul &omparati,e <uantitation H un pro/ram de cuanti"icare relativ al
instrumentului $330050! care compar nivelurile de e3presie a /enei int #n 5ro4a de testat
*denu3it6 necunoscut6+ "a de o pro- de re"erin %denu3it6 cali4rator+& 0ro-a
necunoscut conine <4Ac o-inut prin revers)transcrierea <8A total e3tras din cultura
-acterian crescut #n prezena uleiului volatil>"raciei de ulei volatil! #n timp ce cali-ratorul
este reprezentat de pro-a ce conine <4Ac o-inut prin revers)transcrierea <8A total e3tras
din aceeai cultur! dar care a "ost crescut #n prezena 4$6@& <cest tip de e3periment
"urnizeaz o metod e"icient de comparare a nivelului de <4Ac pentru mai multe pro-e!
atunci ne"iind necesar cunoaterea cantitii a-solute a /enei int #n "iecare pro-&
.3presia /enelor de U6! s)a studiat prin teste de cuanti"icare relativ 82)[0C8! la
tulpinile de Ps. aeruginosa cultivate #n prezena uleiurilor volatile i a "raciilor acestora!
comparativ cu aceleai tulpini cultivate #n prezena solventului 4$6@! s)a modi"icat #n
sensul modulrii nivelului de e3presie relativ a acestor /ene&
36
0ro-ele de S. aureus <2CC 6538 tratate cu uleiuri volatile i "racii ale acestora au
prezentat o scdere a nivelului e3presiei relative a agr' pentru variantele de tratament
S. officinalis! R. officinalis! %. alba! E. caryophyllata! limonen! eu/enol i eucaliptol! ceea ce
su/ereaz e3ercitarea unui e"ect ini-itor asupra e3presiei /enelor de U6 i indirect asupra
virulenei tulpinii studiate&
.3primarea /enelor las i rhl la Ps. aeruginosa 399 este ini-at di"ereniat de
tratamentul cu uleiuri volatile> "racii din uleiurile volatile& 7leiul din E. caryophyllata ini-
e3presia tuturor /enelor de U6 la tulpina studiat& .3presia /enelor rhl este sensi-il
in"luenat de tratamentul cu uleiuri volatile! iar /ena las ' este supere3primat! cu e3cepia
tratamentului cu ulei volatil din E. caryophyllata&
III(/(8(/(8( E2ectul 5otenator al uleiurilor volatile asu5ra activit6ii anti3icro4ien4e a
anti4ioticelor
."ectul soluiilor stoc de ulei volatil %1G1! v>v! ulei volatilG4$6@+ ca potenatoare ale
aciunii anti-ioticelor s)a demonstrat pentru tulpinile de S. aureus utiliz5nd uleiurile volatile
din coni"ere i uleiul din E. caryophyllata& 2oate uleiurile volatile au determinat modi"icarea
diametrelor zonelor de ini-iie a creterii -acteriene! dar i scim-area spectrului de
sensi-ilitate la anti-iotice&
2ulpinile de Ps. aeruginosa au "ost testate con"orm recomandrilor CB6'! 2011!
pentru urmtoarele anti-ioticeG piperacilin! ticarcilin)acid clavulanic! imipenem! aztreonam!
ce"tazidim! cipro"lo3acin! colistin i /entamicin! diametrele zonelor de ini-iie "iind
similare pentru toate variantele de lucru! respectiv martor i discuri suplimentate cu soluii de
uleiuri volatile& .ste de menionat "aptul c! din punct de vedere al rezistenei la anti-iotice!
toate cele 4 tulpini izolate din pro-e clinice au prezentat "enotipul $,B %"i/& 118+! rezisten
la piperacilin>ticarcilin! /entamicin si tetraciclin&
Ki/ura 118 Kenotipul de rezistenta multipla la anti-iotice! $,B!
la Ps. aeruginosa 261>1&
37
4eoarece testarea calitativ a activitii anti-acteriene a uleiurilor volatile nu
"urnizeaz rezultate care s poat "i cuanti"icate semicantitativ s)a utilizat i metoda
microdiluiilor pentru evidenierea e"ectului siner/ic al uleiului volatil din E. caryophyllata cu
anti-ioticele /entamicin! ce"ota3im! -acitracin i neomicin! asupra unor tulpini de S.
aureus i Ps. aeruginosa& <ciunea siner/ic a uleiului volatil cu anti-ioticele testate cu
mecanisme di"erite de aciune la nivelul celulei -acteriene su/ereaz comple3itatea
interaciunilor dintre uleiul volatil i celula -acterian&
III(/(8(/(<( Conclu7ii
Aumeroase studii de literatur studiaza activitatea antimicro-ian a e3tractelor
ve/etale din punct de vedere al mecanismelor de aciune comple3e ale su-stanelor
puresau aleunor "racii de e3tracte ve/etale comple3e! #n #ncercarea de a o"eri un
"undament tiini"ic o-servaiilor empirice pe -aza crora e3tractele ve/etale sunt
utilizate #n medicina tradiional&
;n studiul de "a a "ost demonstrat activitatea antimicro-ian a unor uleiuri volatile
i a unor "racii ale acestora asupra unui spectru lar/ de microor/anisme H -acterii
:ram pozitive! :ram ne/ative i "un/i!prin a-ordarea unei palete lar/i de tenici cu
rspunsuri di"ereniate! demonstr5nd interaciunea acestora cu celulele micro-iene
p5n la nivel molecular&
Concentraiile minime ini-itorii sunt cuprinse #ntre 125 i 500_B>mB pentru
e3tractele ozidice i respectiv 3&125 i 50 _B>mB pentru cele de tip uleiuri volatile!
cele mai sensi-ile la aciunea antimicro-ian "iind tulpinile "un/ice i speciile
-acteriene :ram pozitive! ceea ce poate "i corelat cu "aptul c uleiurile volatile!
meta-olii secundari ai plantelor au rol de protecie antimicro-ian a acestora!
ma9oritatea "itopato/enilor "iind :ram ne/ativi&
0entru tulpinile micro-iene din studiu s)a realizat i evaluarea #n dinamic temporal a
aparitiei e"ectului micro-icid>micro-iostatic e3ercitat de e3tractele ve/etale i
uleiurile volatile asupra microor/anismelor studiate! o-serv5ndu)se instalarea acestuia
la 10)15 min de contact cu soluiile stoc %ulei volatilG4$6@! 1G1 %v>v+! respectiv
e3tracte alcoolice cu 20= alcool etilic+! uleiurile volatile mani"est5nd e"ectul
micro-icid cel mai rapid&
38
<ctivitatea antimicro-ian precoce este corelat cu "racia uoar a uleiului volatil!
e"ect o-servat "r speci"icitate de tulpin! respectiv de uleil volatil&
Capacitatea de aderen la su-strat inert a tulpinilor de colecie i a tulpinilor izolate
din pro-e clinice a "ost ini-at de toate e3tractele ve/etale la concentraii
su-ini-itorii %C$'>2+! cu e3cepia sucului din %ronia melanocarpa! care a ini-at
aderena la su-strat inert a tulpinii de C& al-icans <2CC 10231&
$etoda citometriei #n "lu3 aplicat pentru tulpinile levurice selectate a permis
determinarea valoarii C$' de 12&5`B>mB! la 30 min de la contactul cu uleiurile
volatile e3trase din R. officinalis! S. officinalis! ). piperita! E. caryophyllata9 cu o
compoziie -o/at #n terpenoide&
.radicarea -io"ilmelor e3perimentale monospeci"ice de &. albicans <2CC 10231 #n
v5rst de 48! dezvoltate pe su-straturi inerte reprezentate de lamele de sticl %1cm
2
+!
s)a demonstrat pentru concentraii C$'35 ale uleiurilor volatile din R. officinalis!
E. caryophyllata! F. ,ulgarae! %. gra,eolens i a "raciilor limonen! carvon!
"elandren&
0entru tulpinile de S. aureus i Ps. aeruginosa numrul celulelor incluse #n -io"ilm
cuanti"icate spectro"otometric s)a redus semni"icativ dup tratamentul cu uleiuri
volatile din R. officinalis! E. caryophyllata! ). piperita! %. gra,eolens! S. officinalis&
Celulele de S. aureus incluse #n -io"ilmele pre"ormate s)au dovedit a "i mai rezistente
la aciunea uleiului volatil din ). piperita& ;n concordan cu e"ectul o-servat asupra
creterii micro-iene la celulele planctonice! #n cazul -io"ilmelor monospeci"ice
dezvoltate de tulpinile de Ps. aeruginosa9 e"ectul ini-itor a "ost moderat! #n special la
24! o-serv5ndu)se un e"ect de stimulare a creterii -acteriene de ctre uleiurile
volatile! #n medie pentru 7 din cele 15 tulpini studiate&
7leiurile volatile! cu e3cepia uleiurilor din coni"ere! mani"est un e"ect modulator
asupra pro"ilurilor "actorilor de virulen solu-ili la tulpinile de S. aureus i Ps.
aeruginosa! compara-il cu acela al "raciior din uleiuri studiate& ."ectele o-servate
sunt tulpin speci"ice! dar "r speci"icitate pentru clasi"icarea :ram&
.3presia "actorilor de virulen solu-ili a "ost in"luenat de concentraii su-ini-itorii
ale e3tractelor ozidice din Forsythia sp& studiate prezente #n mediul de cultur! #n
39
sensul e3primrii sau supresiei! e3tractul din F. intermedia dovedindu)se cel mai
activ&
0ro-ele de S. aureus <2CC 6538 tratate cu uleiuri volatile i "racii ale acestora au
prezentat o scdere a nivelului e3presiei relative a locusului agr'! implicat #n re/larea
e3presiei "actorilor de virulen la S. aureus pentru variantele de tratament
S. officinalis! R. officinalis! %. alba! E. caryophyllata! limonen! eu/enol i eucaliptol!
ceea ce su/ereaz e3ercitarea unui e"ect ini-itor asupra e3presiei /enelor de U6 i
indirect asupra virulenei tulpinii studiate& 7leiurile din coni"ere! cu o compoziie
-o/at #n terpene! au stimulat e3presia agr'! cu e3cepia uleiului din %. alba! care a
e3ercitat un e"ect ini-itor reprezent5nd 50= din e"ectul ini-itor al "raciei limonen!
cu care s)a e"ectuat #n paralel tratamentul tulpinii studiate&
.3presia /enelor las i rhl #n re/larea e3presiei coordonate a "actorilor de virulen la
tulpinile pato/ene de Ps. aeruginosa #n cursul procesului in"ecios la Ps. aeruginosa
399 este ini-at di"ereniat de tratamentul cu uleiuri volatile>"racii din uleiurile
volatile& 7leiul din E. caryophyllata ini- e3presia tuturor /enelor de U6 studiate&
.3presia /enelor rhl este sensi-il in"luenat de tratamentul cu uleiuri volatile! iar
/ena las' este suprae3primat! cu e3cepia tratamentului cu ulei volatil din E.
caryophyllata&
0entru uleiurile volatile testate s)au o-servat siner/isme de aciune #n special cu
anti-ioticele care ini- sinteza proteic& S. aureus 12! #n prezena tuturor uleiurilor
volatile testate! s)a convertit de la rezistent la sensi-il la tetraciclin! iar #n prezena
uleiului din P. men6iesii la o3acilin& S. aureus 19K a devenit sensi-il la eritromicin
su- in"luena uleiurilor din (. decidua! Ps. men6iensii! E. caryophyllata! iar S. aureus
35pl a devenit sensi-il la /entamicin& 7leiul cu e"ect potenator ma3im s)a dovedit a
"i uleiul din Pinus nigra&
III(/(<( STUDIUL BIOCOMATIBILIT#II "I OTIMIZAREA ACTI!IT#II
ANTIMICROBIENE A E%TRACTELOR !E&ETALE SELECTATE RIN
OB#INEREA UNOR NANOSISTEME $IBRIDE FUNC#IONALIZATE
III(/(<( 1( Deter3inarea ac:iunii e@tractelor ve9etale selectate asu5ra celulelor eucariote
<naliza ciclului celular al celulelor eucariote aparin5nd liniei standardizate *eBa
relev scderea procentului de nuclei din pro-a analizat #n "aza :0>:1 i creterea acestuia
#n "aza de sintez a ciclului celular& Ba concentraii de ulei volatil de 1G5000 se o-serv un
40
e"ect proapoptotic prin apariia peacJ)ului su-:0! rezultat con"irmat i de testul pentru
citoto3icitate e"ectuat prin aprecierea cantitativ a via-ilitii celulare dup coloraie cu
tripan&
III(/(<( /( Caracteri7area siste3elor nanostructurate anor9ano,or9anice
0entru prevenirea in"eciilor consecutive cateterizrii se utilizeaz dou strate/ii
principaleG !a) ela-orarea de -iomateriale cu proprieti antiadezive "olosind metode "izico)
cimice %6tripple i cola-oratorii! 2008! Pit9es i cola-oratorii! 2009! 0erni i cola-oratorii!
2011+ i !b)! #ncorporarea #n -iomateriale sau acoperirea acestora cu su-straturi care reduc #n
mod semni"icativ aderena micro-ian %de e3emplu! impre/narea cu ioni de ar/int a
cateterelor urinare& .ste #ns demonstrat c nivelurile su-ini-itorii de su-stane
antimicro-iene ar putea "avoriza selecia "enotipurilor rezistente sau creterea e3presiei
adezinelor %utilizarea concentraiilor su-ini-itorii de [uinupristin)dal"opristin utilizate
#mpotriva speciilor sta"ilococice "recvent asociate cu in"ecii dezvoltate consecutiv
implantrii dispozitivelor protetice+ %2imsit i cola-&! 2011I 4anese! 2002I 8acid i cola-&!
2000+&
;n studiul de "a s)au realizat modele e3perimentale cu scopul optimizrii activitii
antimicro-iene a uleiurilor volatile din R. officinalis9 E. caryophyllata i
%. gra,eolens! selecionate pentru activitatea antimicro-ian i randamentul mare de
e3tracie& Aanoparticulele de tip core)shell Ke
3
@
4
>C
18
utilizate pentru o-inerea "ito)
nanosistemelor pe -az de uleiuri volatile s)au caracterizat prin K2)'8! 48M! <2:)24 i
*8)2.$&
III(/(<(8( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Candida 5e su5ra2a:a
dis5o7ivitelor 3edicale re5re7entate de sec:iuni de cateter *ne+5eliculi7ate cu
nano2itosiste3 *3a9netit6 2unc:ionali7at6 -i ulei volatil de !osmarinus. o""icinalis+
41
Ki/ura 130 'ma/ini CB6$ %250_m 3 250_m+I o-iectiv %40M! A< 0&7+ o-inute prin tenica #n re"le3ie %<)* H
st5n/a+ i respectiv #n transmisie %<)* Hdreapta+ !%) aderena la su-strat inert i dezvoltarea -io"ilmului de &.
albicans 2026 la 48 de incu-areI !B) rare celule "un/ice de &. albicans 2026 aderate la supra"aa cateterului
peliculizatI !&) celule de &. albicans 2026 aderate la supra"aa cateterului la 72 de incu-areI !2) celule "un/ice
de &. albicans 2026 izolate! aderate la supra"aa cateterului peliculizat la 72 de incu-areI !E=F)&. tropicalis
1957 #n prezena> a-sena "ito)nanosistemului la 48 de incu-areI !7=')&. tropicalis 1957 #n prezena> a-sena
"ito)nanosistemului la 72 de incu-are&
III(/(<(<( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Candida sp. 5e su5ra2a:a la3elelor
de sticl6 *ne+5eliculi7ate cu 2ito,nanosiste3 5e 4a76 de Salvia o""icinalis
;n "i/ura 132 sunt prezentate ima/inile CB6$ pentru analiza calitativ a capacitii de
aderen a celulelor levurice la su-stratul inert reprezentat de lamele de sticl i e"ectul
ini-itor al "ito)nanosistemului peliculizat pe -az ma/netita "unctionalizata nepolar si ulei
volatil de>din S. officinalis&
42
Ki/ura 132& 'ma/inile CB6$ H %250_m 3 250_m+I o-iectiv %40M! A< 0&7+ ale su-straturilor inerte reprezentate
de lamele de sticl peliculizate cu "ito)nanosistemul pe -az de ulei volatil de S. officinalisG !a) celule de
&. albicans 2026 aderate #n a-sena nano"itosistemului %control+I !b) a-sena celulelor aderateI !c) celule de
&. tropicalis aderate! #n a-sena "ito)nanosistemului %control+I !d) a-sena celulelor aderate de &. tropicalis i a
dezvoltrii -io"ilmului #n prezena "ito)nanosistemului
4eterminarea cantitativ evideniaz scderea semni"icativ a 7KC>cm
2
! #n special pentru
tulpina &. albicans 2026 %"i/& 133+&
Ki/ura 133& 4eterminarea 7KC>cm
2
pentru tulpinile &. albicans 2026 i &. tropicalis 1957 #n prezena i
respectiv #n a-sena "ito)nanosistemului
III(/(<(>( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de Candida 5e su5ra2a:a la3elelor de
sticl6 *ne+5eliculi7ate cu 2ito,nanosiste3 5e 4a76 3a9netitia 2unctionali7ata ne5olar -i
ulei volatil de Anethum. graveolens
;n "i/urile 134)137 sunt prezentate c5teva dintre rezultatele o-inute la e3aminarea prin
microscopie con"ocal #n dinamic temporal! cu evidenierea activitii
antimicro-iene>anti-io"ilm a uleiului de %. gra,eolens asupra unor tulpini "un/ice&
43
Ki/ura 134& 'ma/inile CB6$ ale su-straturilor inerte reprezentate de lamele de sticl %ne+peliculizate cu "ito)
nanosistemul pe -az de ulei volatil de %. gra,eolens relev prezena -io"ilmului pluristrati"icat! matur! #n cazul
controlului pozitiv i rare celule "un/ice> microcolonii pentru suporturile peliculizate pentru &. albicans 2026
,io"ilmul matur! pluristrati"icat! "ormat de tulpina &. albicans 2026 la 48 de
incu-are! acoper uni"orm #ntrea/a supra"a disponi-il pentru aderen! prezent5nd structuri
canaliculare adiacente a/lomerrilor celulare! contrast5nd evident cu ima/inile microscopice
ale supra"eei modi"icate prin peliculizare cu "ito)nanosistem %"i/& 134+&
Ki/ura 135 'ma/inile CB6$ pentru su-straturile contaminate cu &. krusei relev prezena -io"ilmului
unistrati"icat! cu structuri canaliculare de di"erite dimensiuni! acoperind omo/en #ntrea/a supra"a a suportului
&. krusei 15 "ormeaz un -io"ilm unistrati"icat cu structuri canaliculare de dimensiuni
varia-ile! dispus omo/en pe #ntrea/a supra"a a lamelelor de sticl& 6istemul nanostructurat
peliculizat pe supra"aa lamei de sticl determin modi"icarea proprietilor de supra"a ale
acesteia! ini-5nd "ormarea -io"ilmului de &. krusei 15 %"i/& 135+&
44
Ki/ura 136 'ma/inile CB6$ pentru su-straturile inerte contaminate cu &. famata 198 relev distri-uia te3turat
a -io"ilmului pe lame! dup 48 de incu-are
0ro"ilul de aderen al tulpinii de &. famata 198 relev "ormarea unui -io"ilm cu o
distri-uie insular pe supra"aa lamelei de sticl supuse colonizrii! e"ectul ini-itor al
"ilmului nanstructurat "iind evideniat #n "irura 136&
Ki/ura 137& 'ma/inile CB6$ pentru suporturile contaminate cu S. cere,isiae arat prezena unui -io"ilm matur!
pluristrati"icat! acoperind omo/en supra"aa suportului
.ste remarca-il pro"ilul de aderen al tulpinii S. cere,isiae 200 izolat dintr)o in"ecie
pulmonar la un pacient imunocompromis! care a determinat la contaminarea lamelei de
sticl "ormarea unui -io"ilm pluristrati"icat! distri-uit neuni"orm pe supra"a& <ceast
proprietate e3plic potenialul pato/en al tulpinii izolate& 0eliculizarea>modi"icarea
supra"eei lamelei determin modularea pro"ilului de aderen al tulpinii studiate %"i/& 136+&
III(/(<(D( Studiul in vitro al de7volt6rii 4io2il3elor de S. aureus 5e su5ra2a:a la3elelor de
sticl6 *ne+5eliculi7ate cu 2ito,nanosiste3 *3a9netit6 2unc:ionali7at6 -i acid usnic+
45
$odelul e3perimental propus demonstreaz calitativ %ima/ini microscopice+ i
cantitativ potenialul ini-itor al materialului nanostructurat asupra capacitii de aderen la
su-strat inert a tulpinii studiate&
Ki/ura 138& %a! -! c+ 'ma/inile CB6$ pentru -io"ilme de 6& aureus dezvoltate pe su-straturi inerte core-shell-
extrashell !a) aderena S.aureus <2CC 25923 la lamela nepeliculizat !b) peliculizat cu Ke3@4> acid oleic !c)
peliculizat cu Ke3@4> acid oleic> acid usnic
Ki/ura 139& 4eterminarea comparativ a 7KC>cm
2
pentru cuanti"icarea capacitii de aderen a tulpinii
S. aureus <2CC 25923 la su-straturile inerte %ne+peliculizate cu nanosistem> "ito)nanosistem
III(/(<(E( Studiul in vitro al activit6:ii anti3icro4iene a 2ito,nanosiste3ului *Fe
8
O
<
?acid
oleic drop'cast vs 2il3 su4ire+ 5e 4a76 de E. caryophyllata asu5ra unor tul5ini de
S. aureus
6tudiul comparativ al capacitii de aderen la su-straturile inerte Ke
3
@
4
> acid oleic
drop-cast ,s "ilm su-ire a tulpinilor S. aureus <2CC 6538 i Ps. aeruginosa <2CC 27853! a
relevat valori compara-ile 7KC>cm
2
pentru cele dou supra"ee! pro-a-il corelate cu
omo/enizarea pro"ilului de ru/ozitate #n urma tratamentului de asam-lare a sistemului
core-shell-extrashell! scderea capacitii de aderen la materialul nanostructurat comparativ
cu lamelele din silicon "iind cuprins #ntre 1&18)1&433lo/7KC>cm
2
pentru S. aureus <2CC
6538 i respectiv 1&4)1&55 3lo/7KC>cm
2
pentruPs. aeruginosa <2CC 27853&
46
III(/(<(H( Studiul in vitro al activit6:ii anti3icro4iene a 2ito,nanosiste3ului 5e 4a76 de
MFCNTs -i 2itoco35onente din a5a aro3atic6 de E. carriophyllata asu5ra unor tul5ini
de S. aureus
0rin adsor-ia uleiurilor volatile pe materiale nanostructurate s)a urmrit sta-ilizarea
e"ectului -iolo/ic! #n special al "raciilor uoare ale acestora! care nu puteau "i cuanti"icate
relevant ca activitate antimicro-ian! deoarece prseau sistemul sau sta-ileau concentraii de
"racii volatile #n mediul de testare! satur5nd atmos"era i determin5nd o-inerea de rezultate
nerelevante la testarea prin metoda microdiluiilor seriale&
;ncapsularea $PCA2)urilos s)a dovedit a "i o metod e"icient de e3tracie a
compuilor din apele aromatice! comparativ cu e3tracia #n solvent or/anic %control+! relev5nd
prezena componentelor eu/enol %92&42=+ i e)cario"ilen %5&44=+! pentru am-ele variante
e3tractive&
Componentele evideniate prin analiza de tip 2'C pentru cele dou varinate e3tractive!
cloro"orm i $PCA2! sunt componente principale ale uleiului volatil din E. caryophyllata
%"i/& 141+&
Kitocomponentele e3trase din apa aromatic de E. caryophyllata utiliznd $PCA2
ma/netice au mani"estat activitate anti-acterian asupra tuturor tulpinilor de S. aureus testate!
la concentraia de 50 m/>mB! #n timp ce concentraiile mai sczute au stimulat creterea
-acterian&
III(/(<(I( De3onstrarea in vivo a activit6:ii anti3icro4iene a nanosiste3elor 5e 4a76 de
ulei volatil din 3u9uri de Eugenia caryophyllata
<ctivitatea antipato/enic a uleiului volatil din "ructe de E. caryophyllata a "ost
demonstrat asupra unor loturi de oareci de la-orator& 4up dou zile de la inocularea
intraperitoneal cu suspensia -acterian de Ps. aeruginosa s)a o-servat o in"ecie localizat la
animalele din loturi! cu e3cepia /rupului pretratat cu nanosistem pentru sta-ilizarea aciunii
uleiului volatil& 0e durata e3perimentului nu a "ost #nre/istrat mortalitate la /rupul tratat cu
nanosistem&
47
Ki/& 143 ."ectul pato/enezei P. aeruginosa 11 la oareci de la-oratorG
a+ apariia unei in"ecii localizate la situsul de in9ecie pentru toate variantele e3perimentaleI
-+ a-sena in"eciei cutanate #n cazul animalelor crora li s)a administrat pro"ilactic suspensia stoc
nanosistem pe -az de ulei volatil &
III(/(>( Conclu7ii
7na din direciile de cercetare #n tiina -iomaterialelor este o-inerea supra"eelor
modi"icate! cu scopul prevenirii dezvoltrii -io"ilmelor micro-iene pe dispozitive
protetice&
7tilizarea uleiurilor i a terpenelor #n domenii diverse dar i metodele de testare a
activitii lor sunt limitate de volatilitatea acestor constitueni& &
;n studiul de "a au "ost testate di"erite metode pentru sta-ilizarea uleiurilor volatile!
respectiv pentru optimizarea e"ectului -iolo/ic al acestora! prin o-inerea unor
"ito)nanosisteme cu proprieti anti)pato/enice! evideniate prin studii in ,itro i in ,i,o.
Aanosistemele utilizate #n studiu au "ost o-inute prin metoda precipitarii sarurilor de Ke
f2
si Ke
3f
in mediu -azic %Ke
3
@
4
>acid oleic+! respectiv prin ionizare #n plasm %$PCA2+! iar
adsor-ia "itocomponentelor pentru asam-larea sistemelor core-shell-extrashell s)a
realizat prin imersare i din ape de coo-aie& Caracterizarea "izic a materialelor
nanostructurate s)a realizat prin K2)'8! <28! 48M! microscopie %*8)2.$! CB6$!
<K$+&
Kito)nanosistemele o-inute pe -az de acid usnic i uleiuri volatile din R. officinalis9 E.
caryophyllata S. officinalis9 %. gra,eolens! au "ost selecionate pentru randamentul optim
de e3tracie i activitatea antimicro-ian&
48
Kito)nanosistemul pe -az de R. officinalis peliculizat pe lamele de sticl a determinat
ini-area -io"ilmelor "ormate de toate tulpinile "un/ice analizate e"ectul ini-itor asupra
capacitii de aderen meninandu)se timp de 72& Kito)nanosistemul pe -az de ap>
aromatic> din E. caryophyllata a avut aciune anti) S. aureus! iar cel pe -az de ulei
volatil administrat pro"ilactic i curativ unor loturi de oareci de la-orator in"ectai cu
Ps. aeruginosa s)a dovedit o soluie terapeutic optim #n studiul de "a! rezultatele
o-inute put5nd reprezenta premise pentru o-inerea unei "ormule "armaceutice&
III(8( CONCLUZII &ENERALE
6pectrul de utilitate al dispozitivelor medicale cuprinde proceduri de dia/nostic i>sau
tratament! dar sunt necesare i pentru #n/ri9irile acordate pacienilor #n stadiu critic&
4ispozitivele medicale implanta-ile> insera-ile sunt utilizate pentru tratament sistemic!
precum i localizat! cu adresa-ilitate universal #n ceea ce privete esutul mamalian a-ordat&
0rin urmare! implantolo/ia %de e3emplu! valve cardiace protetice! stimulatoare cardiace!
cordul arti"icial! dispozitivele ortopedice+! cateterizarea intravascular! unturile pentru
dializ renal! unturile pentru BC8! cateterele pentru dializa peritoneal! au devenit o parte
inte/rant i indispensa-il a #n/ri9irilor medicale moderne& 4ar! supra"eele dispozitivelor
protetice! mai ales cele con"ectionate din -iopolimeri! o"er su-stratul ideal pentru aderenta si
colonizarea micro-ian! a"late in corelatie inversa cu -iocompati-ilitatea materialelor
protetice&
;n acest conte3t! importana procesului de aderen micro-iana si "ormare de -io"ilme
a microor/anismelor pe di"erite su-straturi! animate i neanimate! cu e"ecte at5t detrimentale
%#n domeniul medical! datorit toleranei la su-stane antimicro-iene+! c5t i -ene"ice %cu
semni"icaie ecolo/ic i -iotenolo/ic+! 9usti"ic cercetrile intense pe aceast tem! #n
scopul identi"icrii mecanismelor comple3e ale colonizrii di"eritelor su-straturi i a unor
strate/ii e"iciente de control al acestui "enomen %ataare>detaare+&
;n studiul de "a s)a urmrit pe parcursul a patru o-iective /enerale demonstrarea
activitii antimicro-iene> anti-io"ilm a unor e3tracte ve/etale i optimizarea e"ectelor anti)
pato/enice o-servate ale uleiurilor volatile! printr)o a-ordare nano)-iotenolo/ic& Kenomene
comple3e de di"ereniere i comportament colectiv au "ost demonstrate pentru o serie de
microor/anisme aparin5nd la specii di"erite! capacitatea de aderen i "ormare de -io"ilme
"iind considerat un "actor de virulen la microor/anismele pato/ene& 8ezultatele o-inute au
condus la urmtoarele concluzii /eneraleG
49
<l/oritmul de selecie a tulpinilor care au "ost utilizate #n demonstrarea activitii
-iolo/ice a uleiurilor volatile! dar i pentru caracterizare /enotipic s)a aplicat pentru
15 tulpini de S. aureus! 15 tulpini de Ps. aeruginosa i 40 tulpini "un/ice aparin5nd la
specii di"erite! izolate din pro-e clinice diverse&
0rimul criteriu de selecie a "ost evidenierea capacitii de aderen la su-straturi
inerte su-mersate! care a permis clasi"icarea tulpinilor studiate #n neaderente %27=+!
aderente %36=+ i #nalt aderente %37=+ pentru tulpinile "un/ice! respectiv selectarea
tulpinilor #nalt aderente pentru tulpinile -acteriene %7 tulpini de S. aureus i 8 de Ps.
aeruginosa+&
0ro"ilurile "actorilor de virulen ale tulpinilor! evideniate "enotipic! s)au completat
cu caracterizarea e3presiei "actorilor de virulen solu-ili! to3ine "ormatoare de pori
%lecitinaz! emolizine! lipaz+ i e3oenzime %cazeinaza! amilaza! 4A)aza! "actori
sidero"ori)like+! tulpin speci"ic #n cazul speciilor -acteriene %corelat cu sursa de
izolare la S. aureus! cele mai virulente "iind tulpinile izolate din secreii pla/+! iar #n
cazul "un/ilor cu speci"icitate pentru enzimele evideniate! "actorii cei mai a-undent
secretai "iind amilaza! lipaza i a/enii celatori de "ier&
6tudiul plasticitii mor"olo/ice a evideniat capacitatea de producere a "ormelor
"ilamentoase la trei dintre cele ase tulpini "un/ice selectate din specii aparin5nd
/enurilor &andida i Sacharomyces&
Caracterizarea /enotipic a unor tulpini de S. aureus i Ps. aeruginosa cu pro"iluri de
virulen semni"icative evideniate "enotipic! a permis completarea al/oritmului de
selecie&
Ba toate tulpinile de S. aureus studiate %patru tulpini din pro-e clinice i tulpina de
colecie+ se remarc redundana /enelor ce codi"ic adezineG proteine de le/are a
"i-ronectinei! "actorul clumpin/ <! ,! proteina care lea/ "i-rino/enul&
<naliza cur-elor de ampli"icare o-inute #n e3perimentul real-time 0C8 la tulpinile de
Ps. aeruginosa analizate a artat c toate cele patru tulpini izolate din pro-e clinice!
precum i tulpina de colecie posed /enele care codi"ic pentru sistemele de
semnalizare intercelular las i rhl& :enele de virulen! exo8! /ena care codi"ic
pentru proteaza '( i /ena p,d% au "ost evideniate selectiv! #n corelaie cu sursa de
50
izolare! #n timp ce /enele plc'! plc4! exo%! exoS! exo:! au "ost detectate la toate
tulpinile studiate&
0entru e3tracia uleiurilor volatile i teste -iolo/ice s)au ales reprezentani din specii
de plante din /rupul an/iospermelor %din "amiliile %piaceae! (amiaceae! )yrtaceae!
Rutaceae+ i din /rupul /imnospermelor %"amilia Pinaceae+! cunoscute ca "iind
productoare de uleiuri volatile& 6elecia realizat s)a -azat pe datele din literatur!
cunoscut "iind e"ectul antimicro-ian al ma9oritii uleiurilor volatile! mani"estat la
concentraii speci"ice&
0rocedeele de e3tracie utilizate comparativ! idrodistilare i idrodistilare asistat de
microunde! pentru uleiul din &itrus maxima au condus la rezultate similare din punct
de vedere al compoziiei uleiurilor volatile! "iind #m-untit randamentul i timpul de
e3tracie&
7leiurile volatile au "ost e3trase cu randamente di"erite! cel mai mare coninut de
uleiuri volatile "iind prezent #n mu/urii uscai din Eugenia caryophyllata %)yrtaceae+&
4in punct de vedere al compoziiei uleiurile volatile din speciile aparin5nd unor
/enuri din "amilia Pinaceae i uleiul volatil din &itrus maxima s)au dovedit -o/ate #n
monoterpene! av5nd un coninut de 12&44)84&5=& 7leiul volatil din Foeniculum
,ulgare i Eugenia caryophyllata au o compoziie -o/at #n terpenoide aromatice!
86&27! respectiv 84=&
.3tractele etanolice din Forsithya spp& au "ost caracterizate pentru coninutul de
poli"enoli totali! iar sucul din %ronia melanocarpa pentru coninutul de acid ascor-ic!
antociani i Y)caroten&
.3tractele ve/etale o-inute au mani"estat un spectru lar/ de activitate antimicro-ian
"a de -acterii :ram pozitive! :ram ne/ative i micro"un/i! concentraiile minime
ini-itorii "iind mai mici! iar e"ectul micro-icid mani"estat mai rapid! #n cazul
uleiurilor volatile! comparativ cu e3tractele ozidice! cele mai sensi-ile "iind tulpinile
"un/ice i ale speciilor -acteriene :ram pozitive&
Capacitatea de aderen la su-strat inert a tulpinilor de colecie i a tulpinilor izolate
din pro-e clinice a "ost ini-at de toate e3tractele ve/etale la concentraii
51
su-ini-itorii %C$'>2+! cu e3cepia sucului din %ronia melanocarpa! care a ini-at
doar aderena la su-strat inert a tulpinii de &. albicans <2CC 10231&
7leiurile volatile din R. officinalis! E. caryophyllata! F. ,ulgarae! %. gra,eolens au
"ost e"iciente #n eradicarea -io"ilmelor e3perimentale monospeci"ice de &. albicans! la
concentraii C$'35&
,io"ilmele e3perimentale monospeci"ice de S. aureus i Ps. aeruginosa au "ost
ini-iate de uleiurile volatile din R. officinalis! E. caryophyllata! ). piperita! %.
gra,eolens! S. officinalis! #ntr)o manier dependent de e3tractul studiat! uleiul volatil
din ). piperita! av5nd e"ect antimicro-ian minim asupra tulpinilor studiate de S.
aureus i in"luen5nd pozitiv dezvoltarea -io"ilmelor! la apte dintre cele 15 tulpini de
Ps. aeruginosa studiate&
7leiurile volatile e3trase din speciile de an/iosperme! mani"est un e"ect modulator
asupra pro"ilurilor "actorilor de virulen solu-ili i al e3presiei /enelor de ?uorum
sensing la tulpinile de S. aureus i Ps. aeruginosa! reprodus de "raciile ma9oritare ale
acestora %limonen! eu/enol! eucaliptol+&
7leiurile volatile testate! #n special cel de Pinus nigra! urmat de Pseudotsuga
men6iesii! (arix decidua! Eugenia caryophyllata! poteneaz activitatea anti-ioticelor
care ini- sinteza proteic %clindamicin! /entamicin! tetraciclin+&
Ba concentraii su-ini-itorii uleiurile ve/etale inter"er cu e3presia adezinelor
micro-iene! av5nd drept consecin ini-area dezvoltrii -io"ilmelor pe di"erite
su-straturi! demonstrat at5t prin metode -azate pe cuanti"icarea celulelor via-ile
incluse #n -io"ilme %evaluate prin determinarea 7&K&C& i citometrie #n "lu3+! c5t i prin
metode de microscopie %CB6$! 6.$! 2.$+&
;n scopul dezvoltrii unor alternative ecolo/ice e"iciente de prevenire i eradicare a
in"eciilor consecutive dezvoltrii -io"ilmelor pe dispozitive protetice de ctre tulpini
micro-iene virulente i multirezistente uleiurile volatile au "ost sta-ilizate prin
includerea #n nanosisteme de tip core-shell-extrashell utiliz5nd di"erite procedee
e3perimentale i metode comple3e de caracterizare %K2)'8! *8)2.$! CB6$! <K$+!
urmate de testarea e"icienei lor anti)pato/enice! prin metode in ,itro i in ,i,o&
52
Kito)nanosistemele pe -az de acid usnic i uleiuri volatile din R. officinalis! E.
caryophyllata! S. officinalis! %. gra,eolens! au ini-at dezvoltarea -io"ilmelor
micro-iene pe "ra/mente de catetere i lamele de sticl peliculizate cu materialele
nanostructurate&
Kito)nanosistemul pe -az de ulei volatil din E. caryophyllata administrat in ,i,o s)a
dovedit o soluie pro"ilactic i terapeutic e"icient #n in"ecia e3perimental cu Ps.
aeruginosa a oarecilor de la-orator! demonstr5nd sta-ilizarea e"ectului "armacolo/ic
al uleiului volatil&
;n perspectiv! rezultatele o-inute 9usti"ic necesitatea continurii studiilor la nivel
molecular! #n scopul clari"icrii mecanismelor de aciune ale uleiurilor volatile i
"raciilor acestora asupra celulelor micro-iene i a intelor lor speci"ice de aciune&
4e asemenea! e3ploatarea -iotenolo/ic a sta-ilizrii uleiurilor volatile utiliz5nd
materiale nanostructurate ar putea constitui o premis valoroas pentru o-inerea unor
materiale "uncionalizate! cu supra"ee modi"icate! cu e"ect ini-itor asupra capacitii
de aderen la su-straturi inerte a microor/anismelor! i a unor "ormule "armaceutice
pentru transport la int i> sau eli-erare controlat&
53
Lista de 5u4lica:ii
Reviste cotate ISI
1& :rumezescu <&$&! 6aviuc C&! Ci"iriuc $&C&! *ristu 8&! $iaiescu 4&.&! ,alaure 0&!
6tanciu :&! 'ni-itir? activit? o" Ke3@4>oleic acid>usnic acid H core sell e3trasell
nano"luid on S. aureus -io"ilm development! '... 2ransactions on Aano,ioscience!
2011! 10%4+! 269)274&
2& $oldovan BI :aspar <! 2oma BI Craciunescu @ I6aviuc C! Comparison o"
0ol?penolic Content and <ntio3idant Capacit? o" Kive 8omanian 2raditional
$edicinal 0lants! 8evista de Cimie! 2011! 62%3+! 299)303&
3& 8adulescu! (I 6aviuc! CI Ci"iriuc! CI @prea! .I 'lies! 4CI $arutescu! BI Bazar! (I
Cemical Composition and <ntimicro-ial <ctivit? o" .ssential @il "rom 6oots
6pruce %0iceaa-ies B+! 8evista de Cimie! 2011! 62%1+! 69)74&
4& 6aviuc C& ! :rumezescu <&$&! Ci"iriuc C&$&! $iaiescu 4&.&! *ristu 8&! 6tanciu :&!
@prea .&! 8adulescu (&! Bazar (&! *?-rid Aanos?stem Kor 6ta-ilizin/ .ssential @ils
'n ,iomedical <pplications!4i/est Tournal o" Aanomaterials and ,iostructures! 2011!
6%4+! 1657)1666&
5& ,u-ulica $&(&! <n/el '&! :rumezescu <& $&! 6aviuc C&! <n/el :& <&! Ci"iriuc
$&C&! :eor/e '&! Bazar (&! 0opescu <&! In ,itro evaluation o" -actericidal and
anti-io"ilm activit? o" (onicera tatarica and ;iburnum opulus plant e3tracts on
Staphylococcus strains! Karmacia! 2012! 60 %1+! 80)91&
6& Ci"iriuc $&C&! :rumezescu (&! :rumezescu <&$& ! 6aviuc C&! Bazr (& and
<ndronescu .&! *?-rid ma/netite nanoparticles>Rosmarinus officinalis essential oil
nano-ios?stem Qit anti-io"ilm activit?! 4anoscale Research (etters! 2012! 7G209&
7& Cristescu 8&! 0opescu C&! 6ocol :&! 'ordace '&! $iailescu '&A&! $iaiescu 4&.&!
:rumezescu <&$&! ,alan <&! 6tamatin '&! Ci"iriuc $&C&! ,leotu C&! 6aviuc C&! 0opa
$&! Crise? 4&,&! 2012! $a/netic core>sell nanoparticle tin "ilms deposited -?
$<0B.G 'nvesti/ation -? cemical! morpolo/ical and in ,itro -iolo/ical assa?s !
<pplied 6ur"ace 6cience! 258%23+! 9250H 9255&
8& 6aviuc C &! :rumezescu <&$&! ,anu @&! Ci"iriuc C&! $iaiescu 4&! ,alaure 0&! Bazar
(&! ,iocompati-le $a/netic $PCA2s ,ased on 0?tocomponents "rom Eugenia
carryophyllata9 8evista de Cimie! 2012! 63%5+! 531)535&
Reviste BDI
1& C& 6aviuc ! <& $& :rumezescu! .& @prea! (& 8adulescu! B& 4ascalu! C& Ci"iriuc! $&
,ucur! @& ,anu! (& Bazar! <nti"un/al activit? o" some ve/etal e3tracts on Candida
54
-io"ilms developed on inert su-stratum ! ,iointer"ace 8esearc in <pplied Cemistr?!
1! 1! 15! %2011+
2& C& 6aviuc ! <& $& :rumezescu! $& C& Ci"iriuc! C& ,leotu! :& 6tanciu! 8& *ristu! 4&
$iaiescu! (& Bazar! 'n vitro metods "or te stud? o" micro-ial -io"ilms!
,iointer"ace 8esearc in <pplied Cemistr?! 1! 1! 32! %2011+&
3& Crina 6aviuc ! <le3andru $iai :rumezescu! <lina *ol-an! Carmen Ci"iriuc! 4an
$iaiescu! (eronica BazarG *?-rid nanostructurated material "or -iomedical
applications! ,iointer"ace 8esearc in <pplied Cemistr?! 1! 2! 64! %2011+&
4& Crina 6aviuc ! <le3andru $iai :rumezescu! Coralia ,leotu! <lina *ol-an! Carmen
Ci"iriuc! 0aul ,alaure! (eronica BazarG 0enotipical studies "or raQ and nanos?stem
em-edded Eugenia carryophyllata -uds essential oil e""ect on Pseudomonas
aeruginosa and Staphylococcus aureus strains pato/enesis! ,iointer"ace 8esearc in
<pplied Cemistr?! 1! 3! 111! %2011+
5& <le3andru $iai :rumezescu! Crina 6aviuc! <lina *ol-an! 8adu *ristu! :eor/e
6tanciu! Carmen Ci"iriuc! 4an $iaiescu! 0aul ,alaure! (eronica Bazar! $a/netic
citosan "or dru/ tar/etin/ and in vitro dru/ deliver? response! ,iointer"ace 8es& in
<pp& Cem&! 1! 5! 160 %2011+
6& Crina6aviuc! Buminia4asclu! $ariana Carmen Ci"iriuc! (aleria 8dulescu! .liza
@prea! $arcela 0opa! 8adu*ristu! :eor/e 6tanciu! (eronica Bazr! 2e 'ni-itor?
<ctivit? @" 0omelo .ssential @il @n 2e ,acterial ,io"ilms 4evelopment @n 6o"t
Contact Benses! 8oum <rc $icro-iol 'mmunol&! 69! 3! 145 %2010+
7& 6tanciuc <$! :aspar <! $oldovan B! 6aviuc C! 0opa $! $ruescu B&! 'n vitro
antimicro-ial activit? o" 8omanian medicinal plants ?droalcoolic e3tracts on
planJtonic and adered cells! 8oum <rc $icro-iol 'mmunol&! 70%1+G11)4! %2011+&
55
BIBLIO&RAFIE
1( <donizio <&! Non/ N&)K&! Nalai $atee N&! 2008! 'ni-ition o" Uuorum 6ensin/)
Controlled (irulence Kactor 0roduction in Pseudomonas aeruginosa -? 6out Klorida 0lant
.3tracts! %ntimicrobial agents and &hemotherapy! 52%1+! 198H203&
/( <n C& ! No C& ! Pa/ar .&! Pon/ 8&6&! 6aQ P&P&! 1996! $icro-ial evaluationI 139
implants removed "rom s?mptomatic patients! Plast. Reconstr. Surg.! 98 !1225 H 1229&
8( <lp .&! (oss <&! 2006! (entilator associated pneumonia and in"ection control! %nnals
of &linical )icrobiology and %ntimicrobials! 5! 7&
<( <min P&$&<&! 6leem <&<&! 2007 Cemical and -iolo/ical stud? o" aerial parts o" dill
%%nethum gra,eolens B&+! Egypt. . Biomed. Sci.! 23 %1+! 73)90&
>( <n *&! Kriedman T&! 2000! *and-ooJ o" -acterial adesionG 0rinciples! $etods! and
<pplications! *umana 0ress 'nc&! 2otoQa! 7&6&<&
D( <n 1&*&! Kriedman 8&T&! 1998! Concise revieQ o" mecanisms o" -acterial adesion
to -iomaterial sur"aces! Biomed )ater Res! 43! 338)348&
E( <nderl T&! KranJlin $&! 6teQart 0&! 2000! 8ole o" <nti-iotic 0enetration Bimitation in
+lebsiella pneumoniae ,io"ilm 8esistance to <mpicillin and Cipro"lo3acin! %ntimicrob
%gents &hemother!44! %7+! 1818H1824&
H( <ndronescu .caterina! Kicai $&! (oicu :&! $anzu 4&! Kicai <&! 2010! 6?ntesis and
caracterization o" colla/en> ?dro3?apatite H ma/netite composite material "or -one cancer
treatmentI ournal of )aterials Sciences-)aterials in )edicine! 21%7+! 2237)2242&
56
I( <n/ioni <&! ,arra <&! Cereti .&! ,arile 4&! Coisson T& 4&! <rlorio $&! 2004! Cemical
composition! plant /enetic di""erences! antimicro-ial and anti"un/al activit? investi/ation o"
te essential oil o" Rosmarinus officinalis B&! ournal of %gricultural and Food &hemistry!
52%11+! 3530H3535&
10( <nna Ta/ielsJa! 2009! 'denti"ication o" .uropean and Tapanese larces and teir
?-rids -ased on /enetic marJers! 0oznag! 0oland! poster presentation&
11( <rmendSriz <&I KernSndez)0an '&I $atZ T&'! <ntimicro-ial <ctivit? o" Oein Kilms
Pit .ssential @ils 'ncorporated ! 2010! International &onference in Food Inno,ation&
1/( <tJinson 6& and Pilliams 0&! 2009! Uuorum sensin/ and social netQorJin/ in te
micro-ial Qorld! . R. Soc. Interface! 6! 959H978&
18( <tlas &8&$&! ,arta 8&! 1999 $icro-ial ecolo/?G "undamentals and applications!
,en9amin>Cummin/s 0u-l& Comp&! 'nc! Cali"&
1<( <tti)6antos <&C&! 8ossato $&! 0auletti :&K&! 4uarte 8ota B&! 8ec T&C&! 0ansera $&8&!
</ostini K&! <tti B&! $o?na 0&! 2005! 0?sico)cemical .valuation o" Rosmarinus officinalis
B& .ssential @ils! Bra6ilian %rchi,es of Biology and 8echnology9 48%6+! 1035)1039&
1>( ,ahci .&! 4ihraJ $&! 19969 <ntimicro-ial <ctivit? o" .ssential @ils o" some %bies
%Kir+ 6pecies "rom 2urJe?! Fla,our and Fragrance ournal9 11%4+! 251H256&
1D( ,arczaJ <&! *un/ 4&! 2009! 0roductive steps toQard an antimicro-ial tar/etin/
virulence! &urr @pin )icrobiol&! 12%5+! 490H496&
1E( ,aslas ,& N& and ,aslas 8& N&! 1971! Cemical studies into te essential oils "orm te
plants o" %nethum gra,eolens i %netham so-a %dill oils+! Indian Perfumer9 15G27)29&
1H( ,eloin C&! 8ou3 <&! :i/o T&)$&! 2008! Escherichia coli -io"ilms! &urr 8op
)icrobiol Immunol! 322! 249H289&
1I( ,eutler T& <&! 2009! Aatural 0roducts as a Koundation "or 4ru/ 4iscover? ! &urr
Protoc Pharmacol&! 46! 9&11&1H9&11&21&
/0( ,atia 6&! 2010! ,iomaterials "or Clinical <pplications! 6prin/er! AeQ 1orJ! 76<&
57
/1( ,ui?an A&'&! ,e/um T&! Aandi A&C&! <Jter K&! 2010! Constituents o" te essential oil
"rom leaves and -uds o" clove %Sy6igium caryophyllatum %B&+! %frican ournal of Plant
Science! 4%11+! 451)454&
//( ,om-er/er T&! $ac.acran 4&! Coutermars ,&! 1e 6&! @j2oole :&! 6tanton ,&! 2009!
Bon/)4istance 4eliver? o" ,acterial (irulence Kactors -? Pseudomonas aeruginosa @uter
$em-rane (esicles! P(oS Pathog&! 5%4+G e1000382&
/8( ,orlee ,&! :oldman <&! $uraJami N&! 6amudrala 8&! PozniaJ 4&! 0arseJ $&! 2010!
Pseudomonas aeruginosa uses a c?clic)di):$0)re/ulated adesin to rein"orce te -io"ilm
e3tracellular matri3! )ol )icrobiol.! Ke-ruar?I 75%4+! 827H842&
/<( ,ratu $&$&! Cr5maru $&! 2000! ;ndrumar de lucrri practice de -iocimie! .ditura
$edical! ,ucureti&
/>( ,rem)6tecer ,&! Tonson .&! 2003! 6ensitization o" Staphylococcus aureus and
Escherichia coli to <nti-iotics -? te 6es[uiterpenoids Aerolidol! Karnesol! ,isa-olol! and
<pritone! %ntimicrobial agents and &hemotherapy! 47%10+! 3357H3360&
/D( ,rooun <&! Biu 6&! BeQis N&! 2000! < dose)response stud? o" anti-iotic resistance in
0seudomonas aeru/inosa -io"ilms! %ntimicrobial %gents and &hemotherapy! 44%3+! 640)6&
/E( ,uiuc 4&! Ae/u $&! 2009! 2ratat de micro-iolo/ie clinic! ed& a)''')a! .d& $edical!
,ucureti&
/H( ,urt 6&! 2004! .ssential oilsG teir anti-acterial properties and potential applications in
"oods ) a revieQ! Int Food )icrobiol9 94! 223&
/I( ,urt 6&! 2004! .ssential oilsG teir anti-acterial properties and potential applications in
"oods)a revieQ!. . Food )icrobiol.9 94%3+! 223& )253&
80( ,uteic <& 6&! $iaiescu 4& .&! :rumezescu <& $&! (asile ,& F&! 0opescu <&! Clina
4&! $iaiescu @& $&! 2010. 2e c?toto3icit? o" %non+ma/netic nanoparticles tested on
Escherichia coli and Staphylococcus aureus! 2igest ournal of 4anomaterials and
Biostructures. 5%3+! 651)655&
81( Cai P&! Pan T&! 2007! Kacile s?ntesis o" superparama/netic ma/netite nanoparticles
in li[uid pol?ols! ournal of &olloid and Interface Science! 305%2+! 366H370&
58
32. Cercasov C&! @prea .&! 0opa C&)(&! Krcanu '&C&! 2009! vol& ''! Compui naturali cu
aciune terapeutic! .ditura 7niversitii din ,ucureti&
33. Cercasov C&! 0opa C&)(&! 2006! vol& '! Compui naturali cu aciune terapeutic!
.ditura 7niversitii din ,ucureti&
34. Cercasov C&! 0opa C&)(&! 4umitracu K&! 4r/ici C&! 2004! Compui cu aciune
terapeutic! naturali i de sintez! .ditura 7niversitii din ,ucureti&
8>( Candra T&! Nun 4&! $uJer9ee 0&! *o?er B&! $ccormicJ 2& and :annoum $&!
,io"ilm Kormation -? te Kun/al 0ato/en &andida albicansA 4evelopment! <rcitecture!
and 4ru/ 8esistance! ournal of Bacteriology! 2001! 183%18+! 5385)5394&
8D( Cao 6&! 1oun/ :&! @-er/ C&! AaJaoJa N&! 2008! 'ni-ition o" meticillin)resistant
Staphylococcus aureus %$86<+ -? essential oils Fla,our Fragr. .! 23! 444H449&
8E( Cao! 6&! 1oun/ :&! @-er/ C&! 2000! 6creenin/ "or ini-itor? activit? o" essential oils
on selected -acteria! "un/i and viruses! . Essent. @il Res&! 12G639)649&
8H( Ci"iriuc C ! :rumezescu (! :rumezescu <$! 6aviuc C! Bazr (! <ndronescu .&!
2012! *?-rid ma/netite nanoparticles>Rosmarinus officinalis essential oil nano-ios?stem
Qit anti-io"ilm activit?! 4anoscale Res (ett.9 7! 209&
8I( Ci"iriuc $& C&! 0ircala-ioru :&! Bazr (&! :#lea ,&! 4asclu B&! .nace :&
!
,leotu C&
!
2011! 'mmuno/enicit? o" di""erent cellular "ractions o" ;ibrio parahaemolyticus strains
/roQn under su-)letal eat and osmotic stress! %frican ournal of )icrobiology Research!
5%1+! 65)72&
<0( Ci"iriuc $&C&! ,leotu C&! 0elinescu 4&)8&! Bazar (&! 4itu B&)$&! (assu 2&! 6toica '&!
4racea @&! <vram '&! 6asarman .&! 2012! 0atterns o" colonization and immune response
elicted "rom interactions -etQeen enteropato/enic -acteria! epitelial cell and pro-iotic
"ractions! International ournal for Biotechnology and )olecular Biology Research! 4%1+! 47)
57&
<1( Ci"iriuc $C ! 4iu B$! @prea .! Biescu 6! ,ucur $! $ruescu B! .nace :!
6aviuc C! ,urli-aa $! 2ristaru 2! 2nse :! Bazr (&! 2009! @ct)4ec! In ,itro stud? o" te
59
ini-itor? activit? o" usnic acid on dental pla[ue -io"ilm! Roum %rch )icrobiol Immunol.!
68%4+! 215)222&
</( Coi .&$ &! *Qan/ T&N&! 2004! <ntiin"lammator?! anal/esic and antio3idant activities
o" te "ruit o" Foeniculum ,ulgare! Kitoterapia! 75%6+! 557)565&
<8( Ciulei '&! 'studor (&! 0alade $&! Aiculete .&! :ard C&! 1995! <naliza "armaco/nostic
i "itocimic a produselor ve/etale! .ditura k2enoplast companz 6&8&B&k! ,ucureti&
<<( Col[ue)Aavarro 0&! 0alma $&! 6o4er[uist ,&! KlocJ T&)'&! $ol-? 8&! 2000! <nti-od?
8esponses in 0atients Qit 6tap?lococcal 6epticemia a/ainst 2Qo Staphylococcus aureus
Ki-rino/en ,indin/ 0roteinsG Clumpin/ Kactor and an .3tracellular Ki-rino/en ,indin/
0rotein9 &linical and 2iagnostic (aboratory Immunology! 7%1+! 14H20&
<>( Cotar <& '&! Ci"iriuc C& $&! 4inu 6&! ,ucur $&! 'ordace C&! ,anu @&! 4racea @&!
Barion C&! Bazar (&! 2010! 6creenin/ o" $olecular (irulence $arJers in Staphylococcus
aureus and Pseudomonas aeruginosa 6trains 'solated "rom Clinical 'n"ection! Int. . )ol.
Sci&! 11%12+!5273H5291&
<D( Cotar <&'&! 2009! 'mplicaiile "enomenului de [uorum sensin/ #n e3primarea
coordonat a "actorilor de pato/enitate i virulen la tulpini de 6tap?lococcus aureus i
0seudomonas aeru/inosa! tez de doctorat&
<E( Cotar <&'&! 4inu 6&! Ci"iriuc $&C&! ,anu @&! 'ordace C&! Barion C&! ,ucur $&!
4racea @&! Bazar (&! 2008! 6creenin/ o" molecular marJers o" [uorum sensin/ in
0seudomonas aeru/inosa strains isolated "rom clinical in"ections! Romanian
Biotechnological (etters! 13 %3+! 3765)3770&
<H( Cotar <&'&! 4inu 6&! Ci"iriuc $&C&! ,anu @&! 'ordace C&! Bi3andru $&! 4racea @&!
,ucur $&! Bazar (&! 2008! $olecular marJers o" [uorum)sensin/ and virulence /ene
re/ulators in Staphylococcus aureus strains isolated "rom -io"ilm associated in"ections!
Romanian Biotechnological (etters! 13%3+! 3771)3778&
<I( CoQan $& $&! 1999! 0lant 0roducts as <ntimicro-ial </ents! &lin )icrobiol Re,&!
12%4+! 564H582&
60
>0( CoQan $&! 1999! C0lant 0roducts as <ntimicro-ial </entsD! &linical )icrobiology
Re,ie-s! 12%4+G 564H582&
>1( Cristescu 8&! 0opescu C&! 6ocola :&! 'ordace '&! $iailescu '&A&! $iaiescu 4&.&!
:rumezescu <&$&! ,alanc <&! 6tamatinc '&! Ci"iriuc C&! ,leotu C&! 6aviuc C&! 0opa $&!
Crise? 4&,&! 2012! $a/netic core>sell nanoparticle tin "ilms deposited -? $<0B.G
'nvesti/ation -? cemical! morpolo/ical and in vitro -iolo/ical assa?s! %pplied Surface
Science! 258%23+! 9250H 9255&
>/( 4a--a 8&!& .dQards (& $! $oats P& <&! 1970! <ntimicro-ial <ction o" 6ome Citrus
Kruit @ils on 6elected Kood),orne ,acteria! %ppl )icrobiol&! 19%1+! 27H31&
>8( 4amian '&! 0opov 4&! 2003! 8eme experimentale9 .ditura 0olitenica! ,ucureti&
><( 4anese 0&A&! 2002! <nti-io"ilm approacesG prevention o" cateter colonization!
&hem. Biol&! 9%8+! 873)880&
>>( de ,ont T& <& $&! 0oolman ,&! 6iJJema T&! 1995! $ecanisms o" $em-rane 2o3icit?
o" *?drocar-ons! )icrobiological Re,ie-s! 59%2+! 201H222&
>D( 4ela[uis 0&T&! 6tanic N&! :irard ,&! $azza :&! 2002! <ntimicro-ial activit? o"
individual and mi3ed "ractions o" dill! cilantro! coriander and eucal?ptus essential oils! Int. .
Food )icrobiol.9 74%1+! 101&
>E( 4eraJsan 6&! 6attari $&! ,i/deli $&! 2010! .""ect o" cumin %&uminum cyminum+
seed essential oil on -io"ilm "ormation and plasmid inte/rit? o" +lebsiella pneumoniae9
Pharmacogn )ag&! 6%21+! 57H61&
>H( 4eQirst K&.&! Cen 2&! 'zard T&! 0aster ,&T&! 2anner <&C&! 1u P&*&! BaJsmanan <&!
Pade P&:&! 2010! 2e uman oral micro-iome! Bacteriol.9 192%19+!5002)5017&
>I( 4onlan 8& $&! 2001& ,io"ilms and 4evice)<ssociated 'n"ections! Emerging
Infectious 2iseases9 7%2+! 277)281&
D0( 4onlan 8&$ &! Costerton T&P&! 2002! ,io"ilmsG survival mecanisms o" clinicall?
relevant microor/anisms! &lin )icrobiol Re,! 15%2+! 167)93&
D1( 4orman *&! 4eans 6&:&! 2000! <ntimicro-ial a/ents "rom plantsG anti-acterial activit?
o" plant volatile oils! . %ppl. )icrobiol&! 88%2+! 308)316&
61
D/( 4uda)CodaJ <&! 2arJo 2&! 6tateJ $&! 2008! 2e .""ect o" <ntio3idants on
(actobacillus &asei Cultures %cta Sci. Pol.9 8echnol. %liment.9 7%4+! 39)51&
D8( 4udareva A&! 0icersJ? .&! and :ersenzon T&! 2004! ,iocemistr? o" 0lant (olatiles!
Plant Physiology! 135! 1893H1902&
D<( 4u[uesno? .! Castola (! Casanova T&! 2007! Composition and cemical varia-ilit? o"
te tQi/ oil o" %bies alba $iller "rom Corsica! Fla,our Fragr. &! 22!293&
D>( 4uraipandi?an (&! <-dulla <l)*ar-i A&! '/nacimutu 6&! $utuJumar C&! 2012!
<ntimicro-ial activit? o" ses[uiterpene lactones isolated "rom traditional medicinal plant!
&ostus speciosus %Noen e3&8etz&+ 6m ! B)& &omplement %ltern )ed. 12! 13&
DD( ."timiadou .&N&! 2ziveleJa B&)<&! ,ilalis 0&! Nordas :&! 2012! Aovel 0B<
modi"ication o" or/anic microcontainers -ased on rin/ openin/ pol?merizationG 6?ntesis!
caracterization! -iocompati-ilit? and dru/ loadin/>release properties! International ournal
of Pharmaceutics! 428%1H2+! 134H142&
DE( .isen-er/ 4&$ &! *arris .&6&! Bittle"ield ,&<&! Cao 6&! Cra?cro"t T&<&! 6colten 8&!
,a?liss 0&! Ku 1&! Pan/ P&! Uiao 1&! Oao O&! Cen *&! Biu 1&! NaptcuJ 2&! *an P&C&!
Pan/ M&! 8o-erts 2&! 6amu C&.&! Clard? T&! 2011! 4evelopin/ a li-rar? o" autenticated
2raditional Cinese $edicinal %2C$+ plants "or s?stematic -iolo/ical evaluation ) rationale!
metods and preliminar? results "rom a 6ino)<merican colla-oration! Fitoterapia! 82%1+! 17)
33&
DH( .ste-an T&! :omez),arrena .&! Cordero T&! $artln)de)*i9as A&O&! Ninnari 2&T&!
Kernandez)8o-las 8&! 2008! .valuation o" [uantitative anal?sis o" cultures "rom sonicated
retrieved ortopedic implants in dia/nosis o" ortopedic in"ection ! &lin )icrobiol&! 46%2+!
488)92&
DI( .3plorarea structurii i "unciilor celulare! ,ratosin 4&! .ditura m(asile :oldim
7niversit? 0ress! <rad! 2007
E0( Ka9aro K&! 6et?aQan *&! Pidi?astuti P&! Pinardi 6&! 2012! 6?ntesis o" ma/netite
nanoparticles -? sur"actant)"ree electrocemical metod in an a[ueous s?stem! %d,anced
Po-der 8echnology! 23%3+! 328)333&
62
E1( KedtJe '! $ader 4! Noler 2! $oll *! Aicolson :! ,isQas 8! *enseler N! :ntz K!
O]rin/er 7&! 0escel ! 2007! %. )ol )icrobiol.!65%4+G1078)1091&
E/( KedtJe '&! $ader 4&! Noler 2&! $oll *&! Aicolson :&! ,isQas 8&! *enseler N&!
:ntz K&! O]rin/er 7&! 0escel <&! 2007! < Staphylococcus aureus ypfP mutant Qit stron/l?
reduced lipoteicoic acid %B2<+ contentG B2< /overns -acterial sur"ace properties and
autol?sin activit?! )ol )icrobiol.9 65%4+! 1078H1091&
E8( Kelden ,&! (andenesc K&! ,ouloc 0&! 8om-? 0&! 2011! 2e Staphylococcus aureus
8Aome and 'ts Commitment to (irulence! P(oS Pathog&! 7%3+G e1002006&
E<( Kicai 4&! Kicai <&! <le3ie $&! $a/anu $ :uran&! C&! <ndronescu .&! 2011! <mino)
"unctionalized Ke
3
@
4
>6i@
2
><02$6 nanoparticles Qit core)sell structure as potential
materials "or eav? metals removal! Re,. &him.! 62%6+! 622)625&
E>( Kicai 4&! Kicai <&! (asile ,& 6&! Kicai $&! @prea @&! :uran C&! <ndronescu .&! 2011!
6?ntesis o" rod)liJe ma/netite -? usin/ loQ ma/netic "ield! 4i/est Tournal o" Aanomaterials
and ,iostructures! 6%3+! 943)951&
ED( Kit '& A&! 8apuntean :&! 8apuntean 6&! Cirila K&! Aadas :& C&! 2009! <nti-acterial
.""ect o" .ssential (e/etal .3tracts on Staphylococcus aureus Compared to <nti-iotics! 4ot.
Bot. 'ort. %grobot. &luB 37 %2+! 117)123&
EE( Koster! 2& T& .idin 4& A&! (audau3 0&! Krancioli 0&! $oreillon 0&! 2000! Contri-ution
o" Clumpin/ Kactor , to 0ato/enesis o" .3perimental .ndocarditis due to Staphylococcus
aureus9 Infection and Immunity! 68 %9+!5443H5446&
EH( Koster! 2& T& .idin 4& A&! (audau3 0&! Krancioli 0&! $oreillon 0&! 2000! Contri-ution
o" Clumpin/ Kactor , to 0ato/enesis o" .3perimental .ndocarditis due to Staphylococcus
aureus9 Infection and Immunity9 68 %9+! 5443H5446&
EI( Krancois 0&! Noessler 2&! *u?/e <&! *ar-art 6&! ,ento $&! BeQ 4&! .tienne T&! 0ittet
4&! 6crenzel1 T&! 2006! 8apid Staphylococcus aureus agr 2?pe 4etermination -? a Aovel
$ultiple3 8eal)2ime Uuantitative 0C8 <ssa?! &lin )icrobiol&! 44%5+! 1892H1895&
H0( KranJ N&B&! 4el 0ozo T&B&! 0atel 8&! 2008! Krom clinical micro-iolo/? to in"ection
pato/enesisG oQ darin/ to -e di""erent QorJs "or 6tap?lococcus lu/dunensis ! &lin
)icrobiol Re,.9 21%1+! 111)33&
63
H1( :& ,ernotieno! @& AivinsJieno! 8& ,utJieno! 4& $ocJuto! 2007! .ssential oil
composition varia-ilit? in sa/e %Sal,ia officinalis B&+! &hemiBa! 18%4+! 38H43&
H/( :a99ar 0&! 0ettee ,&! ,ritt 4&P&! *uan/ P&! Tonson P&0&! <nderson <&T&! 2009!
<ntimicro-ial activities o" commercial nanoparticles a/ainst an environmental soil micro-e!
Pseudomonas putida N22440! Biol Eng! 3! 9&
H8( :arcia)6ancez 6&! <u-ert 6&! 'ra[ui '&! Tan-on :&! :i/o T&$&! dp.n"ert C! 2004!
&andida albicans -io"ilmsG a developmental state associated Qit speci"ic and sta-le /ene
e3pression patterns! Eukaryot &ell! 3!536)545&
H<( :ar?),o-o $&! *ocine @&! ,revet 4&! $a?nadier $&! 8aem B&! 8iceter 6&!
Carasson (&! BoocJ ,&! $orqre <&! $aillard 0&! :arcia $&! 4urand T&@&! 2012! Cancer
terap? improvement Qit mesoporous silica nanoparticles com-inin/ tar/etin/! dru/
deliver? and 042! International ournal of Pharmaceutics! 423%2+! 509H515&
H>( :ersenzon T&! 4udareva A&! 2007! 2e "unction o" terpene natural products in te
natural Qorld! 4at &hem Biol ! 3%7+! 408 )414&
HD( :il-ert 0&! $aira)Bitran 2&! $c,ain <&! 8icJard <&! P?te K&! 2002! 2e p?siolo/?
and collective recalcitrance o" micro-ial -io"ilm communities! %d,ances in )icrobial
Physiology! 46! 203H256&
HE( :ol @&! Kriedric <&! *oppert $&! <vero"" ,&! 2006! 2e 2in 0ili o"
%cinetobacter sp& 6train ,4413 $ediate <desion to ,iotic and <-iotic 6ur"aces! %ppl
En,iron )icrobiol& 72%2+! 1394H1401&
HH( :onzSlez)Bamote 8&! $itcell :&! :attuso 1$&! 4iarra $&! $alouin K&! ,ouara-N&!
2009! 0lant <ntimicro-ial </ents and 2eir .""ects on 0lant and *uman 0ato/ens!
International ournal of )olecular Sciences! 10! 3400)3419&
89. :ostner T& $&!& Prulic @& <! Tenn? $&! Kucs 4&! K& 7e-erall! 2012! <n update on
te strate/ies in multicomponent activit? monitorin/ Qitin te p?toparmaceutical "ield!
B)& &omplement %ltern )ed&!12! 18&
64
I0( :ostner T&! Prulic @&! Tenn? $&! Kucs 4&! 7e-erall K&! 2012! <n update on te
strate/ies in multicomponent activit? monitorin/ Qitin te p?toparmaceutical "ield! B)&
&omplement %ltern )ed.I 12! 18&
I1( :rumezescu <&$&! 6aviuc C&! *ol-an <&! *ristu 8&! Croitoru C&! 6tanciu :&! Ci"iriuc
C&! $iaiescu 4&! ,alaure 0&! Bazar (&! 2011! $a/netic citosan "or dru/ tar/etin/ and in
vitro dru/ deliver? response! Biointerface Research in %pplied &hemistry! 1%5+! 160)165&
I/( :u//en-icler T&0&! <ssadian @&! ,oesQald $&! Nramer <&! 2011! 'ncidence and
clinical implication o" nosocomial in"ections associated Qit implanta-le -iomaterials )
cateters! ventilator)associated pneumonia! urinar? tract in"ections! 7)S +rankenhhyg
Interdis6ip9 6%1+&
I8( :ul"raz $&! $emood 6&! $inas A&! Ta-een A&! Nausar 8&! Ta-een N&! <rsad :&!
2008! Composition and antimicro-ial properties o" essential oil o" Foeniculum ,ulgare!
%frican ournal of Biotechnology9 7 %24+! 4364)4368&
I<( :upta 8&! 2001! *and-ooJ o" *er-s and 6pices! Poodead 0u-lisin/ Bimited!
<-in/ton *all! <-in/ton! Cam-rid/e! 7&N&
I>( :urinder T& N&! 4al9it 6& <&! 2009! <nti-acterial and p?tocemical screenin/ o"
%nethum gra,eolens! Foeniculum ,ulgare and 8rachyspermum ammi! B)& &omplementary
and %lternati,e )edicine9 9! 30&
ID( *ada 2&! 6iraisi <&! Kuruse 6&! 'noue 1&! *amasima *&! $asuda N&! 6io9ima N&!
6imada T&! 2003! 'ni-itor? e""ects o" terpenes on te /roQt o" Staphylococcus aureus9 4at.
)ed.! 57%2+! 64&
IE( *ammer! N&<&! Carson! C&K&! 20119 cap& <nti-acterial and <nti"un/al <ctivities o"
.ssential @ils! 256)293! #n 2ormar *&! 2010! Bipids and essential oils as antimicro-ial
a/ents! Ton Pile? i 6ons! Btd&! Cicester! 7&N&
IH( *e M&6&! 6i P&1&! 2009! @ral micro-iolo/?G past! present and "uture! Int @ral Sci!
1%2+!47)58&
II( *elanova! (&! CvilicJova! '&! $artinJova! $&! $eloun! $&! Nu-an! (&! 2006!
<pplication o" multivariate statistical anal?sis to -iolo/ical data& (ariations o" monoterpene
content in "res needles o" Picea abies %B+ Jarst! &hem. %nal. - 5arsa-! 51%4+! 551)566&
65
100( *entzer $&! 2eitzel :&! ,alzer :&! *e?dorn <&! $olin 6&! :ivsJov $&! 0arseJ $&!
2001! <l/inate overproduction a""ects Pseudomonas aeruginosa -io"ilm structure and
"unction! ournal of Bacteriology! 183%18+! 5395&
101( *entzer $ &! 2eitzel :&$&! ,alzer :&T&! *e?dorn <&! $olin 6&! :ivsJov $&! 0arseJ
$&8&! 2001! <l/inate overproduction a""ects Pseudomonas aeruginosa -io"ilm structure and
"unction! Bacteriol9 183%18+!5395)401&
10/( *o 6ui 6&! Ked?naJ <&! *siao P&! Ban/ille $&! ,rinJman K&! 2009! 2e <ssociation
o" (irulence Kactors Qit :enomic 'slands! P(oS @ne! 4%12+! e8094&
108( *olm 1&! *iltunen 8&! 1997! (ariation and ineritance o" monoterpenes in (arix
species! Fla,. Fragr. .! 12! 335)339&
10<( *olu-ovS (&! CvlllrJovS '&! Nu-Sst (&! 2000! Comparison o" 0rocedures "or
'solation o" $onoterpene *?drocar-ons "rom Kres Aeedles o" Picea abies and Picea
omorica! &ollect. &6ech. &hem. &ommun! 65! 1073)1081&
10>( *ori N&! $atsumoto 6&! 2010! ,acterial adesionG Krom mecanism to control!
Biochem. Eng. .I48! 424)434&
10D( *orn K&! *eineJamp 2&! Nnieme?er @&! T& 0ollm]cer! (aliante (&! ,raJa/e <& <&!
2012I 6?stems ,iolo/? o" Kun/al 'n"ection ! Front )icrobiol&! 3! 108&
10E( *sie P&)C&! Can/ C&)0&! :ao 1&)B&! 2006! Controlled release properties o" Citosan
encapsulated volatile Citronella @il microcapsules -? termal treatments! &olloids and
Surfaces BA Biointerfaces! 53! 209H214&
10H( *unter T&4&! 2006! (entilator associated pneumonia! Postgrad )ed .! 82%965+! 172)
178&
10I( *LsnL can ,aer N&! ,uc-auer :&! 2010! *and-ooJ o" .ssential @ils& 6cience!
2ecnolo/? and <pplications! &R& Press 8aylor C Francis 7roup&
110( *ussain $&! *eilmann C&! 0eters :&! *errmann $&! 2001! 2ecoic acid enances
adesion o" 6tap?lococcus epidermidis to immo-ilised "i-ronectin! )icrob. Pathogenesis!
31! 261H270&
66
111( *?eon 2&! Bee 6&6&! 0arJ T&! Cun/ 1&! Aa *&,&! 2001! 6?ntesis o" i/l? cr?stalline
and monodisperse ma/emite nanocr?stallites Qitout a size)selection process! . %m. &hem.
Soc.! 123! 12798)12801&
11/( *?ld/aard $&! $?/ind 2&! $e?er 8&B&! 2012! .ssential @ils in Kood 0reservationG
$ode o" <ction! 6?ner/ies! and 'nteractions Qit Kood $atri3 Components! Front
)icrobiol&I 3! 12&
118( 'ordace K&! 'ordace C&! Ci"iriuc $& C&! ,leotu C&! 6marandace 4&! 6asarman .&!
Bazr (&! ,ucur $&! 4racea @&! Barion C&! Cotar <&! Bi3andru $&! 2008! <ntimicro-ial and
immunomodulator? activit? o" some pro-iotic "ractions Qit potential clinical application!
%rchi,a *ootechnica! 11%3+! 41)51&
11<( 'ovu $&! Aicolescu 2&@&! 2009! Cimie @r/anic& $etode .3perimentale9 .ditura
7niversitar mCarol 4avilam! ,ucureti&
11>( 'srail <&)$&! ,alotescu)Ci"iriuc $&)C&! 2009! Kenomenul de comunicare
inter-acteriana ) noi concepte in terapia antiin"ectioasa! .d& <sclepius! ,ucureti&
116. 'studor (&! 2001! Karmaco/nozie! Kitocimie! Kitoterapie! vol ''! .ditura medical!
,ucureti&
11E( 'vanov '&. &! Nintz .&A&! 0orter B&<&! :old-er/ T&,&! ,urnam A&<&! Camesano 2&<&!
2011! 8elatin/ te p?sical properties o" 0seudomonas aeru/inosa lipopol?saccarides to
virulence -? atomic "orce microscop?! Bacteriol! 193%5+! 1259)66&
11H( T&*eitman! 2011! $icro-ial pato/ens in te "un/al Jin/dom! Fungal Biology
Re,ie-s! 24%1+! 48)60&
11I( Ta-ra)8izJ $&< &! KalJler P&<&! $eiller 2&K&! 2004! Kun/al -io"ilms and dru/
resistance! Emerg Infect 2is.! 10%1+! 14)19&
1/0( Taco-sen 6&$ &! 6ticJler 4&T&! $o-le? *&B&! 6irtli"" $&.&! 2008! Complicated
cateter)associated urinar? tract in"ections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis!
&lin )icrobiol Re, &! 21%1+!26)59&
67
1/1( Taco-sen 6&$ &! 6ticJler 4&T&! $o-le? *&B&! 6irtli"" $&.&! 2008! Complicated
cateter)associated urinar? tract in"ections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis!
&lin )icrobiol Re, &! 21%1+! 26)59&
122. Tirovetz

B&! 0uscmann C&! 6to9anova <&! $etodiev 6&! ,uc-auer :&! 2000! <nal?sis
o" te essential oil volatiles o" 4ou/las "ir %Pseudotsuga men6iesii+ "rom ,ul/aria! Fla,our
and Fragrance ournal! 15%6+! 434H437&
1/8( Tudzentiene <&! T& ,uzel?te! 2006! Cemical composition o" essential oils o"
%rtemisia ,ulgaris B& %$u/Qort+ "rom Aort Bituania! &hem. . %.! 17! 12)15&
1/<( Tun/min B! 4urst 8 P! Prolstad 8 .! ,arnes N P! .isele 2! :iusti $ $! *ace T!
*o"sommer *! NosQi/ 6! Nrue/er 4 <! Nupina 6! $artin 6 N! $artinsen , N! $iller 2 C!
0a[uette K! 8?a-Jova <! 6Jrede :! 2renn 7! Pi/tman T 4! ournal of %@%& International!
2005! 88 %5+! 1269)1278&
1/>( N&N&! Nanu9a 6&0&6&! <mad <&! Numar 2&8&6&! :upta (& N&! Numar 6&! 2002!
<ntimicro-ial activit? pro"iles o" te tQo enantiomers o" limonene and carvone isolated "rom
te oils o" )entha spicata and %nethum so-a! Fla,our. Frag. .! 17%1+! 59)63&
1/D( Napoor 1&! 2omas T&! 2an :&! Ton 1&! Caucan <&! 2009! 6ur"actant) laden so"t
contact lens "or e3tended deliver? o" optalmic dru/s! Biomater! 30! 867) 878&
1/E( Narlsson 0&! 2e/marJ N&! $or"eldt .&! <rvidson 6&! 2001! 4ecreased <mounts o" Cell
Pall)<ssociated 0rotein < and Ki-ronectin),indin/ 0roteins in Staphylococcus aureus sar%
$utants due to 7p)8e/ulation o" .3tracellular 0roteases! Infection and Immunity9 69%8+!
4742H4748&
1/H( NatsiJo/ianni $&! $issirlis 1&K&! 2004! Concise revieQ o" mecanisms o" -acterial
adesion to -iomaterials and o" tecni[ues used in estimatin/ -acteriamaterial interactions!
European cells and )aterials! 8! 37)57&
1/I( Naur :&! <rora 4&!2009! <nti-acterial and p?tocemical screenin/ o" %nethum
gra,eolens ! Foeniculum ,ulgare and 8rachyspermum ammi ! B)& &omplem. %ltern. ).! 9!
30&
68
180( Navanau/ T&6&! 2oendel $&! *orsQill <&8&! 2007! < role "or t?pe ' si/nal peptidase
in Staphylococcus aureus [uorum sensin/! )ol. )icrobiol. !65!780H98&
181( Na?a '&! 1ihit A&! ,enli $&! 2008! <ntimicro-ial activit? various e3tracts o" @cimum
basilicum B& and o-servation o" te ini-ition e""ect on -acterial cells -? use o" scannin/
electron microscop?! %fr. . 8raditional! &omplementary and %lternati,e )edicines! 5 %4+G
363 H 369&
18/( Neane 0&K&! ,onner $&C&! Tonston 6&8&! Oa"ar <&! :orman 6&0&! 1994!
Caracterization o" -io"ilm and encrustation on ureteral stents in ,i,o! Br. . :rol.973! 687 H
691&
188( Neren '&! Naldalu A&! 6poerin/ <&! Pan/ 1&! BeQis N&! 2004! 0ersister cells and
tolerance to antimicro-ials! FE)S )icrobiol. (ett& ! 230! 13 H 18&
18<( Nim T& 6&! NuJ .&! 1u N& A&! Nim T&)*&! 0arJ 6& T&! Bee *& T&! Nim 6& *&! 1oun/ N& 0&!
0arJ 1& *&! *Qan/ C&)1&! Nim 1&)N&! Bee 1&)6&! Teon/ 4& *&! Co $&)*&! <ntimicro-ial
e""ects o" silver nanoparticles! Ph24anomedicineA 4anotechnology9 Biology9 and )edicine!
2007! 3%1+! 95H 101&
18>( Nlausen $&! *e?dorn <&! 8a/as 0&! Bam-ertsen B&! Tur/ensen <& <&! $olin 6& 2olJer)
Aielsen 2&! 2003! ,io"ilm "ormation -? Pseudomonas aeruginosa Qild t?pe! "la/ella and t?pe
'( pili mutants! $olecular $icro-iolo/?! 48%6+! 1511H1524&
18D( NnoQles T& 8&! 8oller 6&! $urra? 4& ,&! Aaidu <& 6&! 2005! <ntimicro-ial <ction o"
Carvacrol at 4i""erent 6ta/es o" 4ual)6pecies ,io"ilm 4evelopment -? Staphylococcus
aureus and Salmonella enterica 6erovar 2?pimurium! %pplied and En,ironmental
)icrobiology! 71%2+! 797)803&
18E( Noeni/ 6&$ &! 2ruQit T&4&! 2006! (entilator)associated pneumoniaG dia/nosis!
treatment! and prevention! &lin )icrobiol Re,.919%4+!637)57&
18H( Non T&! Pels P&! Nni/t 4&! 2007! < neQ approac to te rationale discover? o"
pol?meric -iomaterials Toacim! Biomaterials! 28%29+! 4171H4177&
18I( No9ic .&! 4arouice 8&! 2004! &andida 'n"ections o" $edical 4evices! &lin )icrobiol
Re,&! 17%2+! 255H267&
69
1<0( NouJos 0& N&I 0apadopoulou! N& '&I 0atiaJa! 4& 2&I 0apa/iannopoulos <& 4&! 2000!
Cemical composition o" essential oils "rom needles and tQi/s o" -alJan pine %Pinus peuce
:rise-ac+ /roQn in Aortern :reece! . %gric. Food &hem.! 48%4+! 1266)1268&
1<1( NouJos 0&N&! 0apadopoulou N&'&! 0apa/iannopoulos <&4&! 2001! .ssential oils o" te
tQi/s o" some Coni"ers /roQn in :reece! 'ol6 als Roh-und -erkstoff&! 58! 437)438&
1</( Nritzman N&! $arJus <&! 6tron/in 0&! Binder C&! 2009! <pplications o"
microencapsulated essential oils! 762009>0186096 <1&
1<8( NuprinsJieno .! 6tiJlieno <! Tudventieno <&! 2008! 2e essential oil [ualitative and
[uantitative composition in te needles o" Pinus syl,estris B& :roQin/ alon/ industrial
transects! En,iron PollutI 155%3+ 481H491&
1<<( NupcinsJiene .&! 6tiJliene <&! Tudzentiene <&! 2008! 2e essential oil [ualitative and
[uantitative composition in te needles o" Pinus syl,estris B& /roQin/ alon/ industrial
transects! En,iron. Pollut&! 155%3+! 481)491&
1<>( B& Ca-rera! 6& :utierrez! A& $enendez! $&0& $orales! 0& *errasti! $a/netite
nanoparticlesG .lectrocemical s?ntesis and caracterization! .lectrocimica <cta! 53!
3436H3441! 2008&
1<D( Bam-ert 8& T& P&! 6Jandamis 0& A&! Coote 0& T&! A?cas :& T& .&! 2001! < stud? o" te
minimum ini-itor? concentration and mode o" action o" ore/ano essential oil! t?mol and
carvacrol9 %ppl )icrobiol! 91! 453H462.
147. Bao 1&)$&! Tian/ T&):&! 1an B&! 2009! <pplication o" meta-onomic anal?tical
tecni[ues in te modernization and to3icolo/? researc o" traditional Cinese medicine! Br
Pharmacol.9157%7+! 1128H1141&
1<H( Baoason/Jram N&! $aamaJtudsanee 2&! CaiQanicsiri 6&! 2011!
$icroencapsulation o" $acadamiaoil -? spra? dr?in/! Procedia Food Science! 1! 1660H1665&
1<I( BaQrence ,&! 2007! $int& 2e :enus )entha! .d& C8C 0ress! ,oca 8aton! 7&6&<&&
1>0( Bazar (! ,alotescu $&C&! Cernat 8&! ,ulai 4&! Aiu :&! 'lina B&! 2003! 0enot?pic
anti-ioticresistance o" some entero-acterial strains adered to an inert su-stratum& 'n vitro
models "or -io"ilm "ormation in li[uid and solid media! &lin )icrobiol Infect& 9! 227&
70
1>1( Bazr (&! 2003! <derena micro-ian! BucureDti9 Edit. %cad. Rom.9 88)146&
1>/( Bazar (&! 2007! $icro-iolo/ie $edical! ed& a)'')a! .d& 7niversitii din ,ucureti&
1>8( Bazr (&! 2011! Uuorum sensin/ in -io"ilms)oQ to destro? te -acterial citadels or
teir coesion>poQerw! %naerobe!17%6+! 280)285&
1><( Bazr (&! ,alotescu! C&! $oldovan B&! <le3andru (&! ,ulai 4&! Cernat 8.9 4iu B&)$&9
20059 Comparative evaluation o" [ualitative and [uantitative metods used in te stud? o"
anti-acterial and anti"un/al activit? o" ?droalcoolic ve/etal e3tracts9 Rom. Biotech. (etters9
10! 2225 ) 2232&
1>>( Bazr (&! Ci"iriuc $&C&! 2010! $edical si/ni"icance and neQ terapeutical strate/ies
"or -io"ilm associated in"ections! Roum %rch )icrobiol Immunol &! 69%3+! 125)38&
1>D( Bazar! (eronica! ,alotescu! Carmen! Cernat! 8amona! ,ulai! 4oina! 2007! )etoda de
determinare a sensibilitatii la substante antimicrobiene a biofilmelor bacteriene in mediu
lichid. ,8.(.2 4. 'A(.A2'. nr& 123145> 30&12&2010I depus la @6'$ H<>1089>
28&12&2005 si pu-licat in rezumat in Bul. oficial de Proprietate Industr. E 6ect& 'nventii Ar& 6
din 2007 si disponi-il pu-licului la sediul @6'$>29&06&2007&
157. BeQenza 6 &! Kalsa"i 8&N&! Pinsor :&! :ooderam P&T&! $c0ee T&,&! ,rinJman K&6&!
*ancocJ 8&.&! 2005! Construction o" a mini)2n5)lu3C4<,. mutant li-rar? in Pseudomonas
aeruginosa 0<@1G a tool "or identi"?in/ di""erentiall? re/ulated /enes! 7enome Res.9 15%4+!
583)589&
1>H( Bi M&O&! AiJaido *&! 2009! .""lu3)$ediated 4ru/ 8esistance in ,acteriaG an 7pdate!
2rugs! 69%12+! 1555H1623&
1>I( Bi 1&)*&! 2ian M&! 2012! Uuorum 6ensin/ and ,acterial 6ocial 'nteractions in
,io"ilms Sensors %,asel+! 12%3+G 2519H2538&
1D0( Bis),alcin $&! 4eans 6& :&! .a/lesam .&! 1998! 8elationsip -etQeen -ioactivit?
and cemical composition o" commercial essential oils! Fla,our Frag. &! 13%2+! 98)104&
1D1( Bis),alcin $&! *art 6&! 4eans 6&:&! .a/lesam .&! 1996! Comparison o" te
parmacolo/ical and antimicro-ial action o" commercial plant essential oils! T& *er-s 6pices
$ed& 0lants! 4%2+! 69)86&
71
1D/( Biu M&! Oan/ M&! Bee N&! 2005! <ntimicro-ial <ctivit? o" te .3tracts o" Forshytia
suspensa and 2endranthema indicum! %gricultural &hemistry C Biotechnology! 48%1+! 29)
35&
1D8( BivaJ NT! 6cmitt/en 24! 2001! <nal?sis o" relative /ene e3pression data usin/ real)
time [uantitative 0C8 and te 2%)4elta 4elta C%2++ $etod! )ethods! 2>! 402)408&
1D<( Budle?! N& .&! TicJells! 6& $&! Cam-erlain! 0& $&! PitaJer! T& and 8o-inson! C& *&!
2009! 4istri-ution o" monoterpenes -etQeen or/anic resources in upper soil orizons under
monocultures o" Picea abies! Picea sitchensis and Pinus syl,estris! Soil Biol Biochem.! 41! 1)
10&
1D>( Budo <&*& $uller! Ton *& $cCusJer $icrosatellite anal?sis o" /enetic diversit?
amon/ clinical and nonclinical Saccharomyces cere,isiae isolates su//ests eteroz?/ote
advanta/e in clinical environments $ol .col& 2009 Tul?I 18%13+G 2779H2786
1DD( B?czaJ T&! Cannon C&! 0iera :&! 2000! .sta-lisment o" Pseudomonas aeruginosa
in"ectionG lessons "rom a versatile opportunist! )icrobes and Infection! 2! 1051x1060&
1DE( $aira)Bitran 2&! <llison 4&:&! :il-ert 0&! 2000! <n evaluation o" te potential o" te
multiple anti-iotic resistance operrron %mar+ and te multidru/ e""lu3 pump acr<, to
moderate resistance toQards cipro"lo3acin in Escherichia coli -io"ilms! ournal of
%ntimicrobial &hemotherapy! ! 45%6+! 789)795&
1DH( $a9i 2&N &! ,arua '&! 4u-e 6&! *ussain $&8&! 2007! $icroencapsulation o"
Oanto3?lum limonella oil %OB@+ in /lutaralde?de crosslinJed /elatin "or mos[uito
repellent application! Bioresour 8echnol.! 98%4+! 840)844&
1DI( $rculescu <&! :leizes $&! 2001! 6tudii asupra compoziiei de su-stane volatile la
specii de coni"ere din zona montan H Krunzele de -rad %%bies alba $ill&+&! Re,. &him&!
52%12+! 774)787&
1E0( $rculescu! <I :leizes! $! 2002! Studies on the composition of ,olatile oils in the
conifer species from the mountain area. ". 8he pine-tree leafs !Picea ecelsa (ink)! Re,.
&him&! 53 %1+86)94&
1E1( $arJus <&! Binder C&! 2004! .ncapsulated .ssential @ils! 762007>0042182 <1&
72
1E/( $asoudi <&! *osseini *&8&$&! 6oJr/ozar $&<&! <madi 8&! @/a-ian $&*&! 2012!
2e e""ect o" pol?%et?lene /l?col+ coatin/ on colloidal sta-ilit? o" superparama/netic iron
o3ide nanoparticles as potential $8' contrast a/ent! International ournal of Pharmaceutics!
433! 1H2! 129H141&
1E8( $a?ers 4&! 2009! <ntimicro-ial 4ru/ 8esistance! vol&1! )echanisms of 2rug
Resistance! .d& *umana 0ress! AeQ 1orJ! 7&6&<&
1E<( $iescu :&! Ci"iriuc C&! 4iu B& $&! 2007! $icro-iolo/ie /eneral! .d& 7niv&
,ucureti! 552
1E>( $iaiescu 4&.&! :rumezescu <&$&! ,alaure 0&C&! $o/osanu 4&.&! 2raistaru (&! 2011!
$a/netic sca""old "or dru/ tar/etin/G evaluation o" cepalosporins controlled release pro"ile!
Biointerface Research in %pplied &hemistry! 1%5+! 191)195&
1ED( $o/tader $! <"zali 4! 2009! 6tud? o" te <ntimicro-ial 0roperties o" te .ssential
@il o" 8osemar?! %merican-Eurasian . %gric. En,iron. Sci.! 5%3+! 393)397&
1EE( $o/tader $&! 6alari *! Karamand <&! 2010! .valuation o" te anti"un/al e""ects o"
rosemar? oil and comparison Qit s?ntetic -orneol and "un/icide on te /roQt o"
<sper/illus "lavus! ournal of Ecology and the 4atural En,ironment9 3%6+! 210)214&
1EH( $uoo A9oro9e 6&! Noaze *&! A?ota Naran9a 0&! 6aQamura $&! 2005! (olatile
constituents o" red-lus /rape"ruit %&itrus paradisi+ and pummelo %&itrus grandis+ peel
essential oils "rom Nen?a! %gric Food &hem.9 53! 9790)9794&
1EI( $uJer9ee 0&N&! Candra T&! Nun 4&$&! :annoum $&<&! 2003! $ecanism o"
"luconazole resistance in &andida albicans -io"ilmsG pase)speci"ic role o" e""lu3 pumps and
mem-rane sterols! Infect Immun9 71!4333)4340&
1H0( $ulca? *&! Carron)$azenod B&! BeQenza 6&! 2008! .3tracellular 4A< Celates
Cations and 'nduces <nti-iotic 8esistance in Pseudomonas aeruginosa ,io"ilms! P(oS
Pathog&!4 %11+&
1H1( Aedovic (&! Nalusevic <&! $ano9lovic (&! Bevic 6&! ,u/arsJi ,&! 2011! <n overvieQ
o" encapsulationtecnolo/ies "or "oodapplications! 0rocedia Kood 6cience! 1! 1806H1815!
""th International &ongress on Engineering and Food&
73
1H/( Aicols P& P&! 4orrin/ton 6& $&! 6lacJ $& 0&! Palmsle? *& B&! 1988! 'ni-ition o"
to-ram?cin di""usion -? -indin/ to al/inate! %ntimicrob %gents &hemother! 32%4+! 518H523&
1H8( Aorouzi K&! $ansouri 6&! $oradi $&! 8azavi $&! 2010! Comparison o" cell sur"ace
?dropo-icit? and -io"ilm "ormation amon/ .6,B)and nonH.6,B)producin/
Pseudomonas aeruginosa clinical isolates! %frican ournal of )icrobiology Research! 4 %11+!
1143)1147&
184. @ni/a ' &! @prean 8&! 2oiu <&! ,enedec 4&! 2010! Cemical composition o" te
essential oil o" 6alvia o""icinalis B& "rom 8omania! Re, )ed &hir Soc )ed 4at Iasi9 114%2+!
593)605&
1H>( @rtan <&! 0opescu $& B&! 4inu)0irvu C&! 2008! %nethi %etheroleumG Cemical
Composition <nd ,iolo/ical .""ects! Scientific Bulletin Biotechnology! 8! 558 H 566&
1HD( @tto $&! 2008! 6tap?lococcal ,io"ilms! Current 2opics in $icro-iolo/? and
'mmunolo/?! 322! 207)28&
1HE( 0dure '& $&! B& ,dulescu!

4ediu 2&! 2008! $orpo)<natomical and 0?tocemical
8esearces 8e/ardin/ Pseudotsuga men6iesii %$ir-el+ Kranco %0inaceae+! %nalele DtiinFifice
ale :ni,ersit>Fii G%l. I. &u6aH IaDi! 2omul B'(! "asc& 1! s& '' a& ,iolo/ie ve/etal&
1HH( 0a9u 6&! 6cannapieco K&<&! 2007! @ral -io"ilms! periodontitis! and pulmonar?
in"ections! @ral 2is.9 13%6+!508)12&
1HI( 0anizzi B&I Klamini :&I Cioni 0&B&I $orelli '&! 1993! Composition and antimicro-ial
properties o" essential oils o" "our $editerranean Bamiaceae! . Ethnopharmacol.! $I! 167)
170&
1I0( 0apadopoulou! N&! NouJos 0&! 1996! (ariation in te essential oils o" te leaves! tQi/s
and cones o" ,alJan pine %Pinus peuce :rise-ac+ /roQn in :reece! . Essent. @il Res.! 8G
499)502&
1I1( 0arJ T! ,ronzino T! 2003! ,iomaterialsG principles and applications! C8C 0ress! ,oca
8aton! 76<&
1I/( 0ataJ 1&! 2assu 4&! 2009! 4ru/ 4eliver? Aanoparticles Kormulation and
Caracterization! .d& 'n"orma *ealtcare! AeQ 1orJ! 7&6&<&
74
1I8( 0auli <&! 6ciler *&! 2004! 2004! 6peci"ic 6election o" .ssential @il Compounds "or
2reatment o" Cildrenps 'n"ection 4iseases! Pharmaceuticals! 1%1+! 1)30&

1I<( 0erni 6&! 0ratten T&! Pilson $&! 0iccirillo C&! 0arJin '&0&! 0roJopovic 0&! 2011!
<ntimicro-ial properties o" li/t)activated pol?uretane containin/ indoc?anine /reen! 0 T
Biomater %ppl! 25%5+!387)400&
1I>( 0etrova @&! 6auer N&! 2009! < Aovel 6i/nalin/ AetQorJ .ssential "or 8e/ulatin/
Pseudomonas aeruginosa ,io"ilm 4evelopment ! P(oS Pathog.! 5%11+G e1000668
1ID( 0icersJ? .&! Aoel T&! 4udareva A&! 2006! ,ios?ntesis o" 0lant (olatilesG Aatureps
4iversit? and 'n/enuit?! Science! 311%5762+! 808H811&
1IE( 0ina)(az C&! :ontalves 8odri/ues <&! 0into .&! Costa)de)@liveira 6&! 2avares C!
6al/ueiro B&! Cavaleiro C&! :ontalves $&T&! $artinez)de)@liveira T&! 2004! <nti"un/al
activit? o" 8hymus oils and teir ma9or compounds! E%2;! 18! 73H78&
1IH( 0osea :&! 2005G :eo/ra"ia 8om5niei! .ditura <cademiei 8om5ne! ,ucureti! vol (&
1II( Uazi 6aara A& <&! Counil .&! $orrisse? T&! 8ees C& .& 4&! CocJa?ne<&! Pinzer N&!
Can P& C&! Pilliams 0&! *ill 0& T! 2001!& agr .3pression 0recedes .scape o" 'nternalized
Staphylococcus aureus "rom te *ost .ndosome! Infection and Immunity! 69 %11+! 7074H
7082&
/00( Uiu T&! Ken/ *&! Bu T&! Mian/ *&! Pan/ 4&! 4on/ T&! Pan/ T&! Pan/ M&! Biu T&! 4en/
M&! 20109 .u/enol 8educes te .3pression o" (irulence)8elated .3oproteins in
Staphylococcus aureus9 %pplied and En,ironmental )icrobiology9 Sept.9 76%17+! 5846H5851.
/01( Uiu T&! Pan/ 4&! Mian/ *&! Ken/ *&! Tian/ 1&! Mi B&! 4on/ T&! Bu T&! 1u B&! 4en/ M&!
2010! 6u-ini-itor? Concentrations o" 2?mol 8educe .nteroto3ins < and , and a
*emol?sin 0roduction in Staphylococcus aureus 'solates! P(oS @4E! 5%3+ e9736&
/0/( Uiu T&! Oan/ M&! Buo $&! Bi *&! 4on/ T&! Pan/ T&! 2011! 6u-ini-itor?
Concentrations o" 0erilla @il <""ect te .3pression o" 6ecreted (irulence Kactor :enes in
Staphylococcus aureus! 6%1+ e16160&
/08( Uue 1&)<&! *ae"li/er T& <&! 0irot B&! Krantois 0&! Pidmer .&! .ntenza T& $&! 6ina
,&! *errmann $&! Krancioli 0&! (audau3 0&! $oreillon 0&! 2005! Ki-rino/en and "i-ronectin
75
-indin/ cooperate "or valve in"ection and invasion in Staphylococcus aureus e3perimental
endocarditis9 E).! 201%10+! 1627)1635&
/0<( 8acid 6&! @lsen N&! Pitte P&! *acJer T&! Oie-ur P&! 2000! .""ect o" su-ini-itor?
anti-iotic concentrations on pol?saccaride intercellular adesin e3pression in -io"ilm)
"ormin/ Staphylococcus epidermidis! %ntimicrob. %gents &hemother&!44%12+! 3357)3363&
/0>( 8dulescu (&! 0opescu $& B&! 'lie 4& C&! 2010! Cemical Composition o" te (olatile
@il Krom 4i""erent 0lant 0arts o" %nethum 7ra,eolens B& %:mbelliferae+ Cultivated in
8omania! Farmacia! ! 58! 5! 594)600&
/0D( 8dulescu (&! 6aviuc C&! Ci"iriuc C&! @prea .&! 'lie 4&C&! $ruescu B&! Bazr (&!
2011! Cemical composition and antimicro-ial activit? o" essential oil "rom soots spruce
%Picea abies B+! Re,. &him. Bucharest! 62%1+! 69)74&
/0E( 8a/avendran N&! $?lotte T&$&! 6cannapieco K&<&! 2007! Aursin/ ome)associated
pneumonia! ospital)ac[uired pneumonia and ventilator)associated pneumoniaG te
contri-ution o" dental -io"ilms and periodontal in"lammation! Periodontol #333! 44! 164)77&
/0H( 8ai <&! 0ra-une <&! 0err? C&C&! 2010! <nti-iotic mediated s?ntesis o" /old
nanoparticles Qit potent antimicro-ial activit? and teir application in antimicro-ial
coatin/s! )ater &hem! 20%32+! 6789)6798&
/0I( 8ames A! 0ri?adarsini $&! 6umati C&6&! ,alasu-ramanian (&! *emapri?a T&!
Nannan 8&! (irulence Kactors and <nti Kun/al 6ensitivit? 0attern o" &andida sp& 'solated
"rom *'( and 2, 0atients! Indian )icrobiol! 51%3+G273H278&
/10( 8ao <&! Oan/ 1&! $uend 6&! 8ao 8&! 2010! $ecanism o" <nti"un/al <ctivit? o"
2erpenoid 0enols 8esem-les Calcium 6tress and 'ni-ition o" te 2@8 0atQa?!
%ntimicrobial %gents and &hemotherapy! 54%12+! 5062)5069&
/11( 8atner ,&4&! *o""man <&6&! 6coen K&T&! Bemons T&.&! 2004! ,iomaterials 6cienceG
'ntroduction to $aterials in $edicine! 2nd .dition! Else,ier %cademic Press9 6an 4ie/o!
7&6&<&
/1/( 8iede '&! 2012! 2ere-intina Baricina in ,orreliosisG Comparison Qit <nti-iotic
2erapies! 'omeop %yur, )ed! 1! 110&
76
/18( 8ios).stepa 8&! Ban/e '&! Bee T& $&!& Ban/e ,& $&! 2010! $atematical $odelin/)
:uided .valuation o" ,iocemical! 4evelopmental! .nvironmental! and :enot?pic
4eterminants o" .ssential @il Composition and 1ield in 0eppermint Beaves! Plant Physiol&!
152%4+! 2105H2119&
/1<( 8istl 8&! 6teiner N&! Oarscler N&! Oa?ni 6&! $essner 0&! 6ca""er C&! 2011!2e 6)
Ba?er :l?comey<ddin/ to te 6u/ar Coat o" ,acteria! International ournal of
)icrobiology! 16 pa/es&
/1>( 6accetti :&! $aietti 6&! $uoli $&! 6ca/lianti $&! $an"redini 6&! 8adice $&! 2005!
Comparative evaluation o" 11 essential oils o" di""erent ori/in as "unctional antio3idants!
antiradicals and antimicro-ials in "oods! Food &hemistry! 91! 621H632&
/1D( 6Senz <&! 8ivera)$uzoz .&! ,rostoQ P&! Castazo (&! 1999! Ceramic ,iomaterialsG
<n 'ntroductor? @vervieQ! ournal of )aterials Education9 21 %5)6+! 297 H 306&
/1E( 6ansuJcarearnpona <&! PanicQecarun/ruan/ 6&! Beepipatpai-oon A&!
Nerdcaroend 2&! <ra?acuJeat 6&! 2010! *i/ loadin/ "ra/rance encapsulation -ased on a
pol?mer)-lendG 0reparation and release -eavior! International ournal of Pharmaceutics9
391! 267H273&
/1H( 6auer N&!

Camper <&! .rlic :& !

Costerton P&! 4avies 4&! 2002! Pseudomonas
aeruginosa 4ispla?s $ultiple 0enot?pes durin/ 4evelopment as a ,io"ilm! Bacteriol.9
184%4+! 1140H1154&
/1I( 6aQamura $&! 6on/ *&! Coi *&! 6a/aQa N&! 7Jeda *&! 2001! Caracteristic <roma
Components o" 2osa)-untan %&itrus grandis @s-ecJ "orma 2osa+ Kruit! Food Sci 8echnol
Res&! 7! 45H49&
//0( 6edlaJova T&! Bo9Jova B&! Nu-as (&! 2003! :as Cromato/rapic 4etermination o"
$onoterpenes in 6pruce Aeedles %Picea abies! P. omorica and P. pungens+ a"ter 6upercritical
Kluid .3traction! &hem. Pap&! 57 %5+359)363&
//1( 6eziJ .&! 7stun @&! 4emirci ,&! *usnu can ,aer N&! 2010! Composition o" te
essential oils o" Pinus nigra <rnold "rom 2urJe?! 8urk &hem! 34! 313 H 325&
77
///( 6aQ 0&! :oodner N&! $osonas $&! *earn C&T&! 2001! Comparison o" /rape"ruit
?-rid "ruit Qit parent "ruit -ased on composition o" volatile components! Sci 'ortic.9
91!71H80&
//8( 6cer-ina 1&! 8ot O&! Aussinovitc <&! 2010! 0?sical 0roperties o" :um Nara?a)
6tarc).ssential @il 0atces! %%PS PharmSci8ech&! 11%3+! 1276H1286&
//<( 6i 4&! 2006! 'ntroduction to ,iomaterials! 2sin/ua 7niversit? 0ress! ,ei9in/! Cina
//>( 6irtli"" $&! Beid T&! 2e 8ole @" ,io"ilms 'n 4evice)related 'n"ections! 2009!
6prin/er)(erla/! ,erlin! :ermania&
//D( 6unmu/aperumal 2&! 2010! ,io"ilm .radication and 0reventionG < 0armaceutical
<pproac to $edical 4evice 'n"ections! Ton Pile? i 6ons! 'nc&! *o-oJen! 7&6&<&
//E( 6i 6&! Bi C&! Pan/ M&! 1u 4&! 0en/ U&! Bi 1&! $a/netic $onodisperse Ke
3
@
4
Aanoparticles Cr?stal :roQt 4esi/n! 2005! 5%2+! 391)393&
//H( 6in/ :&! Napoor '&0&6&! 0ande? 6&N&! 6in/ 7&N&! 6in/ 8&N&! 2001! 6tudies on
essential oilsG part 10! <nti-acterial activit? o" volatile oils o" some spices! Phytother. Res&!
16! 680)682&
//I( 6in/ :&! $aur?a 6&! 4e Bampasona $&0&! Catalan C&! 2006! Cemical constituents!
antimicro-ial investi/ations! and antio3idative potentials o" %nethum gra,eolens B& essential
oil and acetone e3tract! ournal of Food Science! 70%4+! 208)215&
/80( 6in/ $! 6in/ 6! 0rasad 6! :am-ir ' 6! 2008! Aanotecnolo/? in medicine and
anti-acterial e""ect o" silver nanoparticles! 2igest ournal of 4anomaterials and
Biostructures! 3%3+! 115)122&
/81( 6in/ A&! </raQal <&! 0emmara9u 6&! 0anQar 8&! 0ruti (&! 2011! 'mpact o"
in"ectious &andida albicans -io"ilm on -iomaterials! Indian ournal of Biotechology! 10!
417)422&
/8/( 6limestad 8&2orsJan/erpoll N&! Aateland *&6& et al&! 2005! Klavonoids "rom -lacJ
coJe-erries! %ronia melanocarpa! Food &ompost %nal! 18! 61)68&
/88( Fo"letea A&! Curtu B&! 2007! 4endrolo/ie! .d& 7niversitii 2ransilvania! ,raov&
78
/8<( 6oJoviR $&! :lamorli9a T&! {iriR <&! NataranovsJi 4&! $arin 0&! (uJo9eviR T&! ,rJiR
4&! 2012! <nti"un/al <ctivit? o" te .ssential @ils and Components in ,itro and in ,i,o on
.3perimentall? 'nduced 4ermatom?coses at 8ats! 2igest ournal of 4anomaterials and
Biostructures! 7%3+! 959 H 966&
235. 6olomon , ! 6ale K&K&! :e-re)$ariam 2&! <sres N&! Aeu-ert 8&*&! 2012!
$icroencapsulation o" citronella oil "or mos[uito)repellent applicationG "ormulation and in
vitro permeation studies! Eur Pharm Biopharm.9 80%1+! 61)66&
/8D( 6poerin/ <&B&! (ulic $&! BeQis N&! 2006 ! :lp4 and 0ls, participate in persister cell
"ormation in Escherichia coli! . Bacteriol&! 188%4+! 5136 H 5144&
/8E( 6riramulu 4&! BLnsdor *&! Bam T&! 8nmlin/ 7&! 2005! $icrocolon? "ormationG a novel
-io"ilm model o" Pseudomonas aeruginosa "or te c?stic "i-rosis lun/! )ed )icrobiol9
54%7+! 667)676&
/8H( 6tanciu :&! 6avu ,&! *ristu 8&! 2008! CB6$ H <pplication in te investi/ation o"
micro-ial -io"ilms! PorJsopG $edical si/ni"icance o" micro-ial -io"ilms&
/8I( 6torti <&! $anzato! <&T&! 0izzolitto! <&C&! 0izzolitto .&B&! 2006! <ssessment o" central
venous cateterassociated in"ections usin/ semi [uantitative or [uantitative culture metods!
Re,. &iJnc. Farm. BKsica %pl.! 27%3+! 213)220&
/<0( 6tripple *&! Pestman 8&! *olm 4&! 2008! 4evelopment and environmental
improvements o" plastics "or ?dropilic cateters in medical careG an environmental
evaluation! &lean Prod! 16%16+! 1764H1776&
/<1( 6uail $& $&! Pu P&! Cao <&! $ondaleJ K& :&! Kun/ N&)$&! 6i 0&)2&! Kan/ 1&)2&!
Poolle? C&! 1oun/ :&! Bin *&)N&! 2011! ,osQellia sacra essential oil induces tumor cell)
speci"ic apoptosis and suppresses tumor a//ressiveness in cultured uman -reast cancer cells!
B)& &omplement %ltern )ed.! 11! 129&
/</( 6ui 6&T&*&! Ked?naJ <&! *siao P& P& B&! Ban/ille $& :& '&! ,rinJman K& 6& B&! 2009!
2e <ssociation o" (irulence Kactors Qit :enomic 'slands ! P(oS @ne&I 4%12+! e8094&
/<8( 6ures 0&! 'n/le (& N&! (i9a?alaJsmi (&! 1992! <nti-acterial activit? o" .u/enol in
comparison Qit oter anti-iotics! ournal of Food Science and 8echnology! 29! 254H56&
79
/<<( 2e|eviR (&! $ilosavl9eviR 6&! (a9s (&! }or~eviR '&! 6oJoviR $&! BavadinoviR (&!
AovaJoviR $&! 2009! Cemical composition and anti"un/al activit? o" te essential oil o"
4ou/las "ir %Pseudosuga men6iesii $ir-& Kranco+ "rom 6er-ia&! . Serb. &hem. Soc. L/ %10+!
1035H1040&
/<>( 2oendel $&! Navanau/ T&6&! KlacJ C&.&! *orsQill <&8&! 2011! 0eptide si/nalin/ in
te 6tap?lococci! &hem Re,&! 111%1+! 117H151&
/<D( 2ormar *&! 2010! Bipids and .ssential @ils as <ntimicro-ial </ents! Ton Pile? i
6ons! Btd&! Cicester! 7&N&
/<E( 2imsit T&! 4u-ois 1&! $inet C&! ,onadona <&! Bu/osi $&! <ra)6omoano C&!
*amid"ar 8&! 6cQe-el 8&! AeQ materials and devices "or preventin/ -io"ilm associated
in"ections! %nnals of Intensi,e &are! 2011! 1! 34&
/<H( 2ouami <&! Terico $& *&! ,o?d T& $&! ,everid/e 2& T&! 2006! Aanoscale
caracterization and determination o" adesion "orces o" Pseudomonas aeruginosa pili -?
usin/ atomic "orce microscop?! . Bacteriol.9 188! 370)377&
/<I( 2rampuz <&! Oimmerli P&! 2006! <ntimicro-ial a/ents in ortopaedic sur/er?G
0rop?la3is and treatment! 2rugs9 66%8+!1089)105&
/>0( 2rom-etta 4&! Castelli K&! 6arpietro $& :&! (enuti (&! Cristani $&! 4aniele C&! 6ai9a
<&! $azzanti :&! and ,isi/nano :&! 2005! $ecanisms o" <nti-acterial <ction o" 2ree
$onoterpenes! %ntimicrobial agents and &hemotherapy! 49%6+! 2474H2478&
/>1( 2umen '&! *a"izo/lu *&! Nilic <&! 4nnmez '& .&! 6ivriJa?a *&! 8eunanen $&! 2010!
1ields and Constituents o" .ssential @il "rom Cones o" Pinaceae spp& Aativel? :roQn in
2urJe?! )olecules! 15%8+! 5797)5806&
/>/( 2urtola 6&! 6allas B&! *olopainen T&N&! TulJunen)2iitto 8&! Nainulainen 0&! 2006!
Bon/)term e3posure to enanced 7(), radiation as no si/ni"icant e""ects on /roQt or
secondar? compounds o" outdoor)/roQn 6cots pine and AorQa? spruce seedlin/s!
En,ironmental Pollution! 144%1+! 166)171&
80
/>8( 2?a/i <& N&! $aliJ <&! 2010! Bi[uid and vapour)pase anti"un/al activities o" selected
essential oils a/ainst &andida albicansG microscopic o-servations and cemical
caracterization o" c?m-opo/on citratus! B)& &omplement %ltern )ed& 10! 65&
/><( 7ppuluri 0&! Caturvedi <&N&! 6rinivasan <&! ,aner9ee $&! 8amasu-ramaniam <&N&!
2010! 4ispersion as an 'mportant 6tep in te &andida albicans ,io"ilm 4evelopmental
C?cle& P(oS Pathog! 6%3+G e1000828
/>>( (alceva)Nuzmanova 6( ! ,elceva <&! 2006! Current JnoQled/e o" %ronia
melanocarpa as a medicinal plant! Folia )ed !Plo,di,).! 48%2+! 11)17&
/>D( (allet ' &! 4i//le 6&0&! 6tace? 8&.&! CSmara $&! (entre '&! Bor? 6&! BazdunsJi <&!
Pilliams 0&! Killou3 <&T&! 2004! ,io"ilm "ormation in Pseudomonas aeruginosa G "im-rial cup
/ene clusters are controlled -? te transcriptional re/ulator $va2! Bacteriol &! 186%9+! 2880)
90&
/>E( (an ,eeJ! 2009! .nanced <ntimicro-ial <ctivit? o" 0lant .ssential @ils
762009>0285904 <1&
/>H( (edi?appan :&! 8ossi/nol 2&! dp.n"ert C&! 2010! 'nteraction o" &andida albicans
,io"ilms Qit <nti"un/alsG 2ranscriptional 8esponse and ,indin/ o" <nti"un/als to ,eta)
:lucans! %ntimicrobial %gents %nd &hemotherapy! 54%5+! 2096)111&
/>I( (enJatacalam N& (&! N9onaas 8&! Croteau 8&! 1984! 4evelopment and .ssential @il
Content o" 6ecretor? :lands o" 6a/e % Sal,ia officinalis +! Plant Physiol.9 76%1+! 148H150&
/D0( (er/ara)'ri/ara? $ ! $aira)BitrSn 2! $erino A! 0ier :&,&! 0enadZs T&8&! Basa '&! 2008!
Pall teicoic acids are dispensa-le "or ancorin/ te 0A<: e3opol?saccaride to te
Staphylococcus aureus cell sur"ace! )icrobiology! 154%3+! 865)77&
/D1( (er/ara)'ri/ara? $I $aira)BitrSn 2I $erino AI 0ier :,I 0enadZs T8I Basa '&! 2008!
Pall teicoic acids are dispensa-le "or ancorin/ te 0A<: e3opol?saccaride to te
Staphylococcus aureus cell sur"ace! )icrobiology! 154! 865)877&
/D/( Pan/ 1&P&! Oen/ P&C&! Mu 0&1&! Ban 1&T&! Ou 8&M&! Oon/ N&! *uan/ 1&A&! :ao
*&! 2012! Cemical Composition and <ntimicro-ial <ctivit? o" te .ssential @il o" Num[uat
%Kortunella crassi"olia 6Qin/le+ 0eel! Int )ol Sci&! 13%3+! 3382H3393&
81
/D8( Pei/el B&! 4onlan 8&! 6in 4&*&! Tensen ,&! ClarJ A&! $c4ou/al B&! Ou P&! $usser
N&! 2ompson T&! Nolerscmidt 4&! 4umas A&! Bim-er/er 8&! 0atel T&! 2007! *i/)Bevel
(ancom?cin)8esistant Staphylococcus aureus 'solates <ssociated Qit a 0ol?micro-ial
,io"ilm! %ntimicrob. %gents &hemother9 51%1+! 231)238&
/D<( Pen 6&! *ui"u M& and *ao *&! 2010! .""ects o" te e3tract o" Forsythia suspensa on
in"luenza < *1A1 in"ection in ,itro! ournal of )edicinal Plants Research! 4%14+! 1455)
1458&
/D>( Pillco3 $& 4& 0&! Ou *&! Coni-ear 2& C& 8&! *ume .& ,& *&! :ivsJov $&! N9elle-er/
6&! 6& <& 8ice! 2008! 8ole o" [uorum sensin/ -? Pseudomonas aeruginosa in micro-ial
Jeratitis and c?stic "i-rosis! )icrobiology9 154! 2184H2194&
/DD( Pillco3 $& 4& 0&! Ou *&! Coni-ear 2& C& 8&! *ume .& ,& *&! :ivsJov $&! N9elle-er/
6&! 8ice 6& <&! 2008! 8ole o" [uorum sensin/ -? Pseudomonas aeruginosa in micro-ial
Jeratitis and c?stic "i-rosis! )icrobiology9 154! 2184H2194&
/DE( Pilson 6&N &! Costerton T&P&! 2012! ,io"ilm and penile prostesis in"ections in te era
o" coated implantsG a revieQ! Sex )ed &! 9%1+G44)53&
/DH( Pit9es T&<&! 4el 0opolo :&! $ar-er/er $&! Tonsson @&! Naps *&0&! 2009! Capple
C&8&! < multicenter! dou-le)-lind! randomized! parallel /roup stud? comparin/ pol?vin?l
cloride and pol?vin?l cloride)"ree cateter materials! :rol! 182%6+G2794)2798&
/DI( Piu"" C&! Oappala 8&$& 8e/oes 8&8& ! :arner N&A& ! ,a[uero K&! Bevin ,&8&! 2005!
0enot?pic toleranceG anti-iotic enricment o" noninerited resistance in -acterial
populations! %ntimicrob. %gents &hemother&! 49%4+! 1483 H 1494&
/E0( Pood 2&! *oon *on/ 6&! $a U&! 2010! .n/ineerin/ -io"ilm "ormation and dispersal!
8rends Biotechnol&! 29%2+! 87H94&
/E1( Pu 6&! 0atel N& ,&! ,oot B& T&! $etcal" T& 0&! Bin *&)N&! Pu P&! 2010! 0rotective
essential oil attenuates in"luenza virus in"ectionG <n in vitro stud? in $4CN cells! B)&
&omplement %ltern )ed&!10! 69&
/E/( Micotencatl)Cortes T &! $onteiro)Aeto (&! 6aldaza O&! Bedesma $&<&! 0uente T&B&!
:irn T&<&! 2009! 2e t?pe 4 pili o" enteroemorra/ic Escherichia coli @157G*7 are
multipurpose structures Qit pato/enic attri-utes! Bacteriol! 191%1+!411)421&
82
/E8( Mie :&! Cain 0&6&:&! Bo C&! Biu N)B&! :ans T&! $erritt T&! Ui K&! 2010! Communit?
and /ene composition o" a uman dental pla[ue micro-iota o-tained -? meta/enomic
se[uencin/! )ol @ral )icrobiol.! 25%6+! 391H405&
/E<( 1an/ 6&<&! Teon 6&N&! Bee .&T&! 'm A&N&! Tee N&*&! Bee 6&0&! Bee '&6&! 2009! 8adical
6caven/in/ <ctivit? o" te .ssential @il o" 6ilver Kir %<-ies al-a+! &lin Biochem 4utr.!
44%3+! 253)9&
/E>( 1azdanparast 8&! ,aramiJia 6&! 2008! .valuation o" te e""ect o" %nethum
gra,eolens B& crude e3tracts onserum lipids and lipoproteins pro"iles in
?percolesterolaemic rats! 2%R:! 16%2+! 88)94&
/ED( 1ili <&! <isa *& <&! $aJsimov (&! (esJurova @& A&! 6aliJov 6& '&! 2009! Cemical
composition and antimicro-ial activit? o" essential oil "rom seeds o" %nethum gra,eolens
/roQin/ in 7z-eJistan! &hem 4at &omp! 280! 45! 2&
/EE( 1ili <&! <isa! *& <&! $aJsimov (&! (esJurova @& A&! 6aliJov 6& '&! 2009!
Cemical composition and antimicro-ial activit? o" essential oil "rom seeds o" <netum
/raveolens /roQin/ in 7z-eJistan! &hem 4at &omp! 45 %2+ ! 280)281
/EH( Oarai O&! Nadri <&! Co--a '& ,&! $ansour 8& ,&! ,eJir <&! $e9dou- *&! :arsalla
A&! 2011!2e in-,itro evaluation o" anti-acterial! anti"un/al and c?toto3ic properties o"
)arrubium ,ulgare B& essential oil /roQn in 2unisia! (ipids 'ealth 2is&! 10! 161&
/EI( Oein 6&! <Qada 6&! <mal <&)*&! 8acidi 6&! 0ascale 6&! *ussein N&! 2012! (ariation o"
t?mol! carvacrol and t?mo[uinone production "rom Qild and cultivated @riganum
syriacum o" 6out Be-anon! ournal of )edicinal Plants Research! 6%9+! 1692)1696! 9&
/H0( OeJoviR &! Bepo9eviR 6&! $iliR 4&! <damoviR '& $&! 2009! 6upercritical C@2
e3traction o" menta %)entha piperita B&+at di""erent solvent densities! . Serb. &hem. Soc.!
74%4+! 417H425&
/H1( Oeneli : &! 2sitsimpiJou C&! 0etraJis 0&(&! Aa3aJis :&! *a-ili 4&! 8oussis (&! 2001!
Koliar and corte3 oleoresin varia-ilit? o" silver "ir %<-ies al-a $ill&+ in <l-ania! O
Aatur"orsc C! 56%7)8+! 531)539&
83
282. Oen/ *&! 2ian T&! Oen/ 1&! ,an M&! Oen/ T&! $ao 1&! Pan/ 1&! 2011! In ;itro and In
;i,o <ctivities o" .ssential @il "rom te 6eed o" %nethum gra,eolens B& a/ainst &andida
spp&! E,id Based &omplement %lternat )ed! <rticle '4 659704! 8 pa/es&
/H8( Oen/ O&! Cau K&! Can *&! Ceun/ C&! Bau 2&! Pei 6&!&$oJ 4& N! Can C&! Bian/ 1&!
2008! 8ecent advances in te compound)oriented and pattern)oriented approaces to te
[ualit? control o" er-al medicines! &hin )ed&! 3!9&
/H<( Oan/ O&T&! Pan/ O&B&! CaJoumaJos ,&C&! 1in T&6&! 1998! 2emperature 4ependence
o" Cation 4istri-ution and @3idation 6tate in $a/netic $n)Ke Kerrite Aanocr?stals! Tournal
o" <merican Cemical 6ociet?! 120%8+! 1800)1804&
/H>( Oi9n/e (&! van BeeuQen $&,&! 4e/ener T&.&! <--as K&! 2urneer 2&! :mLr 8&!
*armsen *&T&! 2010! @ral -io"ilm arcitecture on natural teet! P(oS @ne9 5%2+! e9321&
"i site,urile'
1( <cree 2&! <rn *&! 2004! :as cromato/rap? ) ol"actometr? %:C@+ o" natural products!
'nG Klavornet and uman odor space! 2%8: Inc.9 ttpG>>QQQ&"lavornet&or/&
/( <dams 8&0&! 2001! 'denti"ication o" .ssential @il Components -? :as Cromato/rap? >
Uuadrupole $ass 6pectroscop?! %llured Publ. &orp&! Carol 6tream! 'llinois&
8( .l)6a?ed <&$& Kloral Compounds H 'nde3& 'nG 2e 0ero-aseG 4ata-ase o" 'nsect
0eromones and 6emiocemicals! &hemical Ecology E (incoln
ttpG>>QQQ&pero-ase&com 2003)2009&
<( ttpG>>mpJ-&or/>media>ome>pato/enesis>micro-iota>-io"ilm
>( ttpG>>te3t-ooJo"-acteriolo/?&net>
D( ttpG>>QQQ& te3t-ooJo"-acteriolo/?&net>normal"lora&tml
E( ttpG>>QQQ&tan/ram&co&uJ>2')0ol?mer)6rinJa/einplastics&tml! 2an/ram
2ecnolo/? Btd& 2002! modi"icat 13&04&2012
8. '6@ 4720G2002 ) .ssential oils H Aomenclature! seciunea 'C6 71& 100& 60G .ssential oils
I( Q&Q&Q& && mededandtec&-lo/spot&com
84
2007G <mena9amentul ,azei .3perimentale '&C&<&6& Fte"neti! ,ucureti&
Karmacopeea 8om5n! editia aMa! 1993! .ditura $edical! ,ucureti&
Clinical Ba-orator? 6tandards 'nstitute %2009+& )"33-S"I. Performance standards
for antimicrobial susceptibility testingA "Ith informational supplement.
Clinical Ba-orator? 6tandards 'nstitute! 1989! )ethods for 2etermining Bactericidal
%cti,ity of %ntimicrobial %gents.
85