120

OPTIMIZAREA COMPONENEI MEDIULUI NUTRITIV PENTRU

CULTIVAREA CIANOBACTERIEI Nostoc linckia (Roth)
Born et Flah CNM-CB-03
Cojocari Angela
Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM
Productivitatea este unul din parametrii principali ce caracterizeaz creterea i
dezvoltarea cianobacteriilor. Acest parametru poate f infuenat puternic de condiiile
de cultivare i de calitatea mediului nutritiv utilizat.
Pentru cultivarea cianobacteriilor au fost propuse o serie ntreag de medii
minerale, n componena crora intr elementele necesare proceselor de biosintez
celular. Practic toate mediile propuse refect de fapt numai cerinele cianobacteriilor fa
de elementele biogene, necesare pentru creterea i dezvoltarea organismelor autotrofe
[1]. Pentru marea majoritate a mediilor este caracteristic prezena macroelementelor,
printre care cele cu o pondere maximal cantitativ sunt azotatul de sodiu, dihidrofosfatul
i hidrofosfatul de potasiu, sulfatul de magneziu, i microelementelor aa ca acidul
boric, clorura de mangan, oxidul de molibden .a. Este de menionat faptul c aceste
medii sunt elaborate pentru grupe destul de eterogene de cianobacterii i sunt destinate
n special meninerii culturilor respective.
Atunci ns, cnd se cultiv obiecte biotehnologice biomasa crora urmeaz a f
utilizat n calitate de surs de preparate bioactive, cerinele fa de mediul de cultivare
sunt altele i se axeaz pe asigurarea unei productiviti maximal posibile precum i
a unei cantiti semnifcative a compuilor biochimici de importan major, concret
pentru tulpina dat.
Cercetrile ce in de selectarea unor medii nutritive optimale, destinate cultivrii
cianobacteriilor, balansate dup componena n macro- i microelemente cu scopul
obinerii unei productiviti sporite rmne a f actual.
Pornind de la cele expuse mai sus ne-am propus scopul s obinem un mediu
nutritiv, care ar asigura o productivitate maximal a nostocului.
Pentru selectrea unui mediu nutritiv adecvat pentru optimizare au fost studiate
particularitile de cretere a tulpinii pe diferite medii nutritive. Cianobacteria Nostoc
linckia (Roth) Born et Flah CNM-CB-03 a fost cultivat n baloane Erlenmayer cu
volumul de 100 ml a cte 50 ml suspenzie cianobacterian. Experienele au fost
efectuate respectnd urmtoarele condiii de cultivare: cantitatea de cultur utilizat
pentru inoculum a fost de 0,2 g/l, iluminare permanent cu intensitate de 3000 lx,
temperatura de 28C. Cantitatea biomasei se determin spectrofotometric apoi se
separ prin centrifugare (5000g) la ziua a 15-a de cultivare. Rezultatele obinute sunt
prezentate n tabelul 1.
Dup cum refect rezultatele obinute n cercetrile ntreprinse, mediul Bold 3
nu asigur creterea nostocului, un nivel minim al productivitii l asigur mediile
Bold 1 i Bold 5, iar mediile Bold 2 i Bold 4 sunt acceptabile pentru cultivarea
cianobacteriei Nostoc linckia (Roth) Born et Flah CNM-CB-03.
121
Tabelul 1. Productivitatea cianobacteriei Nostoc linckia (Roth) Born et Flah
CNM-CB-03 la cultivarea pe diferite medii nutritive.
Mediul Biomasa absolut uscat, g/l
Bold 1 0,606
Bold 2 0,677
Bold 3 -
Bold 4 0,675
Bold 5 0,621
Gromov nr. 6 0,767
Conform rezultatelor prezentate n tabelul de mai sus, drept factori iniiali
pentru optimizare au fost alese elementele mediului Gromov Nr 6 cu urmtoarea
componen:
Macroelemente (g/l) - KNO
3
-1,0, K
2
HPO
4
-0,2, NaHCO
3
- 0,2 , MgSO
4
7H
2
O-
0,2, CaCl
2
-0,15.
Microelemente (mg/l)- ZnSO
4
7H
2
O - 0,22, MnSO
4
1,81, CuSO
4
5H
2
O
0,079, H
3
BO
3
1,022, (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
4H
2
O 1,0, FeSO
4
7H
2
O 9,3, CaCl
2
-1,2,
Co(NO
3
)
2
H
2
O 0,02, EDTA 10,0.
Optimizarea mediului de nutriie Gromov 6 n scopul obinerii unei productiviti
sporite a fost efectuat n cteva etape consecutive.
Primul pas a constituit determinarea dependenei acumulrii biomasei de
nostoc de concentraia fecrui factor pe fonul stabilitii celorlali componeni ai
mediului. Cercetrile n direcia dat au permis de a stabili zonele ce redau dependena
productivitii culturii de concentraia factorului.
n studiu au fost luate 13 elemente ale mediului de nutriie, pentru fecare n parte
find montate experiene monofactoriale, a cte 9 concentraii pentru fecare factor. n
calitate de martor a fost utilizat mediul Gromov 6. Concentraiile n studiu au fost
stabilite pentru fecare component al mediului n parte n aa mod, ca diapazonul s
includ valori mai mici i valori mai mari fa de cele aplicate n mediul stabilit n
calitate de mediu de referin. Rezultatele experienelor monofactoriale pentru toi
compuii mediului de nutriie au fost supuse analizei statistice i regresionale i sunt
prezentate n form generalizat n tabelul 2.
n baza datelor obinute au fost alese unitile de variere a factorilor pentru
montarea etapelor ulterioare ale optimizrii. Toi 13 factori ai mediului pentru cultivarea
nostocului, au fost inclui n matricea experienei conform planului Balana aleatoare.
Nivelele maxim i minim au fost determinate n corespundere cu rezultatele primei
etape a optimizrii (nivelul maxim din zona concentraiilor optime, iar cel minim din
zona concentraiilor extreme minimale).
Evidenierea factorilor cu efecte eseniale n procesul de acumulare a biomasei a
fost efectuat n cteva trepte, utiliznd metoda balanei aleatoare. La fecare treapt s-au
selectat calitativ efectele cu valoare esenial. Procesul de evideniere s-a efectuat pn
la egalarea dispersiei rezultatelor n comparaie cu media lor aritmetic, cu dispersia
reproductiv a rezultatelor, conform criteriului Fier (tabelul 4)
122
C
o
m
p
o
n
e
n
t
u
l
m
e
d
i
u
l
u
i
E
c
u
a

i
a

d
e

r
e
g
r
e
s
i
e
C
o
m
p
o
n
e
n
t
u
l

X
B
A
U
,

g
/
l
F
t
F
c
a
l
c
n
i
v
e
l
C
o
n
c
e
n
t
r
.
g
/
l
M
e
d
i
a


d
i
n
e
x
p
e
r
i
e
n

V
a
l
o
a
r
e
a
c
a
l
c
u
l
a
t

K
N
O
3
Y
=
0
.
9
0
1
8
5
2

0
.
0
3
8
7
5
5
5
9

X
-
+
0
,
5
4
,
5
0
,
8
7
1

0
,
0
1
1
0
,
7
2
9

0
,
0
3
0
0
,
8
8
2
0
,
7
2
7
2
,
6
0
,
8
8
6
6
7
6
K
2
H
P
O
4
Y
=
1
.
8
5
9
6
3
2

5
.
7
4
2
8

X

+

8
.
8
1
5
8
4

X
2
-
+
0
,
0
5
0
,
4
5
1
,
6
6
5

0
,
0
4
8
1
,
0
4
7

0
,
0
1
7
1
,
5
9
5
1
,
0
6
1
2
,
7
2
,
7
8
3
2
3
1
N
a
H
C
O
3
Y
=
1
.
1
8
8
9
7
1

+

2
.
6
2
8
6

X

2
.
0
7
4
9
7
9

X
2
-
+
0
,
0
5
0
,
4
5
1
,
3
5
7

0
,
0
6
8
1
,
9
1
3

0
,
1
0
3
1
,
3
1
5
1
,
9
5
2
2
,
7
1
,
5
4
5
1
1
5
M
g
S
O
4

7
H
2
O
Y
=
1
.
1
0
2
2
2
3

+

0
.
7
8
5
9
5
2
2

X

1
.
3
0
3
0
1
6

X
2
-
+
0
,
0
5
0
,
3
0
1
,
0
8

0
,
0
2
3
1
,
2
2

0
,
0
1
2
1
,
1
3
8
1
,
2
2
1
2
,
7
2
,
3
2
7
4
3
8
C
a
C
l
2
Y
=
1
.
2
5
9
2
7
1

+

3
.
9
8
8
1
1
2

X

6
.
0
1
2
6
6
6

X
2
-
+
0
,
0
5
0
,
2
5
1
,
4
4
1

0
,
0
3
5
1
,
8
4
1

0
,
0
4
5
1
,
4
4
4
1
,
8
8
1
2
,
7
0
,
9
1
4
8
2
9
6
Z
n
S
O
4

7
H
2
O
Y
=
0
.
9
4
9
4
0
3
9

+

1
.
2
0
4
4
2
9

X

1
.
9
8
7
7
4
5

X
2
-
+
0
,
0
0
0
0
5
0
,
0
0
0
4
5
1
,
0
1
7

0
,
0
0
7
1
,
0
8
0

0
,
0
1
0
1
,
0
0
5
1
,
0
8
9
2
,
7
0
,
9
4
9
0
8
2
2
M
n
S
O
4
Y
=
1
.
0
8
4
8
1
5

0
.
0
4
5
3
3
3
4
2

X
-
+
0
,
0
0
0
5
0
,
0
0
2
0
1
,
0
4
3

0
,
0
1
2
0
,
9
5
3

0
,
0
0
7
1
,
0
6
2
0
,
9
9
4
2
,
6
1
,
6
3
9
5
9
6
C
u
S
O
4

5
H
2
O
Y

1
,
1
7
2
6
8
3

+

1
,
5
9
9
1
7
6

X

4
,
5
2
5
1
7
2

X
2
-
+
0
,
0
0
0
0
0
5
0
,
0
0
0
1
8
0
1
,
1
5
3

0
,
0
0
9
1
,
3
8
3

0
,
0
3
3
1
,
1
8
1
1
,
3
1
4
2
,
7
1
,
5
5
8
5
2
H
3
B
O
3
Y
=

0
.
7
7
1
8
5
1
6

+

0
.
0
1
0
6
6
6
8
5

X
-
+
0
,
0
0
0
2
5
0
,
0
0
2
2
5
0
,
7
4
0

0
,
0
3
0
0
,
7
9
0

0
,
0
0
6
0
,
7
7
5
0
,
7
9
6
2
,
6
0
,
9
7
7
3
8
8
7
(
N
H
4
)
6
M
o
7
O
2
4

4
H
2
O
Y
=

0
.
6
9
4
5
0
0
3

+

0
.
0
5
7
9
1
0
9
2

X
-
+
0
,
0
0
0
2
5
0
,
0
0
2
5
0
,
6
8
0

0
,
0
1
7
0
,
8
1
3

0
,
0
4
1
0
,
7
0
9
0
,
8
2
5
2
,
6
2
,
4
7
1
4
7
F
e
S
O
4

7
H
2
O
Y
=
1
.
2
6
1
5
5
7

+

1
.
5
0
8
3
2
5

X
-
+
0
,
0
0
5
0
,
0
1
9
1
,
2
2
6

0
,
0
2
9
1
,
2
4
5

0
,
0
3
6
1
,
2
6
9
1
,
2
9
0
2
,
6
1
,
7
8
4
0
6
3
C
o
(
N
O
3
)
2

H
2
O
Y
=
1
.
0
0
8
4
1
4

+

1
1
.
8
9
3
2
2

X

2
3
2
.
7
5
3
5

X
2
-
+
0
,
0
0
0
0
0
5
0
,
0
0
0
0
2
5
1
,
0
7
7

0
,
0
2
7
1
,
1
4
3

0
,
0
0
7
1
,
0
6
2
1
,
1
6
0
2
,
7
1
,
0
4
1
6
3
E
D
T
A
Y
=
1
.
0
6
6
2
0
1

+

0
.
0
2
5
8
1
3
4
2

X

0
.
0
0
0
8
2
5
8

X
2
-
+
0
,
0
0
2
5
0
,
0
1
5
1
,
1
1
7

0
,
0
4
1
1
,
3
2
0

0
,
0
2
6
1
,
1
2
5
1
,
2
5
5
2
,
7
1
,
2
8
7
8
2
7
T
a
b
e
l
u
l

2
.

R
e
z
u
l
t
a
t
e
l
e

e
x
p
e
r
i
e
n

e
l
o
r

m
o
n
o
f
a
c
t
o
r
i
a
l
e
.
123
Tabelul 3. Planul experimentului conform metodei balana aleatoare (matricea
13 factori 16 experimente)
X
1
X
2
X
3
X
4
X
5
X
6
X
7
X
8
X
9
X
10
X
11
X
12
X
13
n
i
v
e
l

i
n
f
.

(
-
)
0
,
5
0
,
0
5
0
,
0
5
0
,
0
5
0
,
0
5
0
,
0
5
0
,
5
0
,
0
0
5
0
,
2
5
0
,
2
5
0
,
0
0
5
0
,
0
5
2
,
5
n
i
v
e
l

s
u
p
.
(
+
)
4
,
5
0
,
4
5
0
,
3
0
,
2
5
0
,
4
5
0
,
4
5
2
,
0
0
,
1
8
2
,
2
5
2
,
2
5
0
,
0
1
9
0
,
0
2
5
1
5
Conc.
g
/
l
g
/
l
g
/
l
g
/
l
g
/
l
m
g
/
l
m
g
/
l
m
g
/
l
m
g
/
l
m
g
/
l
g
/
l
m
g
/
l
m
g
/
l
1 - - + + + - + - + - + + -
2 + - - + - - - - - + - - -
3 - + - + + - - + + + + - +
4 + + + + + + - - + + - + -
5 - - - - - + + + - - + - -
6 + - + - + + + - + + + - +
7 - + + - - + + - + + - + +
8 + + + - - - - + - - + - -
9 - - + - - + - + - + + + +
10 + - - - - + - - - - - - +
11 - + - - + - + - + - - - -
12 + + + - + - - - - - - - +
13 - - - + + + - + - + + + +
14 + - + + - - + + + - + + -
15 - + + + - - + + + + - + +
16 + + - + + + + + - - - + -
Legend:
X
1
- KNO
3
X
2
- K
2
HPO
4
,
X
3
- MgSO
4
7H
2
O, X
4
- CaCl
2
,
X
5
- NaHCO
3
, X
6
- ZnSO
4
7H
2
O,
X
7
- MnSO
4
, X
8
- CuSO
4
5H
2
O,
X
9
- H
3
BO
3
, X
10
- (NH
4
)6Mo
7
O
24
4H
2
O,
X
11
- FeSO
4
7H
2
O, X
12
- Co(NO
3
)2H
2
O,
X
13
- EDTA
Rezultatele experienelor (BAU g/l)
Y
1
= 1.06 Y
9
= 1.188
Y
2
= 1.07 Y
10
= 0.971
Y
3
= 1.048 Y
11
= 1.140
Y
4
= 1.008 Y
12
= 0.842
Y
5
= 1.069 Y
13
= 1.310
Y
6
= 0.824 Y
14
= 0.932
Y
7
= 1.268 Y
15
= 1.658
Y
8
= 0.748 Y
16
=1.058
124
Tabelul 4. Evidenierea factorilor eseniali
Pasi
Efectul
interaciunii
(b) a factorilor
Valoarea Ponderea
Micorarea
dispersiei la
pasul i, %
Micorarea
total a
dispersiei, %
1 b
1
-0,27513 esenial 46,155 46,155
2 b
11
-0,16916 esenial 17,448 63,602
3 b
12
0,14384 esenial 12,615 76,218
4 b
1,8
-0,09979 esenial 5,693 81,911
5 b
3,9
0,08681 esenial 3,448 85,358
6 b
3,8
0,09065 esenial 4,696 90,055
7 b
4,13
0,08173 esenial 3,819 93,874
8 b
8,11
-0,06573 esenial 1,975 95,849
9 b
1,13
-0,05387 esenial 1,659 97,508
10 b
3,12
-0,3567 esenial 0,582 98,089
Astfel, dup prelucrarea rezultatelor obinute n experiena Balana aleatoare,
au fost evideniai 8 factori eseniali: KNO
3
; MgSO
4
7H
2
O; CaCl
2
; CuSO
4
5H
2
O; H
3
BO
3
; FeSO
4
7H
2
O; Co(NO
3
)
2
H
2
O i EDTA.
Ulterior a fost montat experiena conform planului factorial fracionat EFF2
8-4
,
pentru aprecierea sensului pozitiv sau negativ al varierii factorilor evideniai. Valoarea
factorilor neeseniali corespunde experimentului nr.15 din Balana aleatoare, n care
s-a obinut cel mai nalt rezultat, iar cei eseniali - conform matricei EFF 2
8-4
(tabelul 5).
Tabelul 5. Planul experienei factoriale fracionate EFF 2
8-4
Compusul x
1
x
2
x
3
x
4
x
5
x
6
x
7
x
8
BAU
g/l
Concentraia g/l g/l g/l mg/l mg/l g/l mg/l mg/l
- 0,5 0,05 0,05 0,005 0,25 0,005 0,005 2,5
+ 4,5 0,3 0,25 0,18 2,25 0,019 0,025 15,0
1 - - - - - - - - 1.061
2 + - - - + + + - 1.146
3 - + - - + + - + 0,963
4 + + - - - - + + 0,873
5 - - + - + - + + 1,969
6 + - + - - + - + 1.143
7 - + + - - + + - 1.864
8 + + + - + - - - 1.026
9 - - - + - + + + 0,745
10 + - - + + - - + 0,792
11 - + - + + - + - 1.029
12 + + - + - + - - 0,714
13 - - + + + + - - 1.923
14 + - + + - - + - 1.037
15 - + + + - - - + 1,689
16 + + + + + + + + 0,932
Legend:
X
1
- KNO
3
; X
5
- H
3
BO
3
;
X
2
- MgSO
4
7H
2
O; X
6
- FeSO
4
7H
2
O;
X
3
- CaCl
2
; X
7
- Co(NO
3
)
2
H
2
O
X
4
- CuSO
4
5H
2
O; X
8
- EDTA.
125
Rezultatele obinute n experiena EFF 2
8-4
au fost analizate dup algoritmul
Iets, calculndu-se coefcienii de regresie cu valori maxime i factorii ce le corespund.
n rezultat a fost determinat direcia de modifcare a concentraiei compuilor
corespunztori (spre micorare sau mrire) n scopul sporii continuie a productivitii.
n continuare optimizarea factorilor eseniali selectai s-a efectuat prin metoda
ascendenei (metoda Boox-Wilson), care prezint o experien factorial cu micarea
pe gradient. Aceast experien permite de a selecta combinaia cantitativ optim
a tuturor componentelor mediului, care asigur o productivitate maxim posibil n
condiiile date.
Planul experienei micarea pe gradient se alctuete n baza rezultatelor
obinute la prelucrarea EFF 2
8-4
(tabelul 6).
Tabelul 6. Planul experienelor Micarea pe gradient
Valorile
*
Factorii
KNO
3
MgSO
4
CaCl
2
CuSO
4
H
3
BO
3
FeSO
4
Co(NO
3
)
2
EDTA
b(i) -1,79 -1,03 -0,72 -1,07 -0,75 -2,02 -1,01 -1,12
(i) 2,0 0,125 0,1 0,175 1,0 0,007 0,01 6,25
B(i) (i) -3,58 -0,129 -0,072 -0,187 -0,75 -0,014 -0,01 -7
K(i) 1 0,04 0,02 0,05 0,2 0,004 0,003 1,25
Paii H(i) -0,5 -0,02 -0,01 -0,025 -0,1 -0,002 -0,0015 -1
Concentr. g/l g/l g/l mg/l mg/l g/l mg/l mg/l
1 2,5 0,175 0,15 0,0925 1,25 0,012 0,015 8,75
2 2,0 0,155 0,14 0,0675 1,15 0,010 0,0135 7,75
3 1,5 0,135 0,13 0,0455 1,05 0,008 0,012 6,75
4 1,0 0,115 0,12 0,0205 0,95 0,006 0,0105 5,75
5 0,5 0,095 0,11 0 0,85 0,004 0,009 4,75
6 0 0,075 0,1 0 0,75 0,02 0,0075 0,253
Not* b(i) - coefcientul de regresie; (i) uniti de variaie; K(i)- coefcientul
de proporionalitate; H(i) pasul ascendenei.
Rezultatele experienelor (BAU g/l)
Y
1
= 1.326 Y
4
= 1,771
Y
2
= 1.357 Y
5
= 2,210
Y
3
= 1,630 Y
6
=1,973
Astfel, cercetrile efectuate la acest capitol au fnalizat cu elaborarea unui nou
mediu de nutriie MN1- cu urmtoarea compoziie:
Macroelemente(g/l) - KNO
3
-0,5
,
K
2
HPO
4
-0,45, NaHCO
3
-0,05, MgSO
4
7H
2
O-
0,1l, CaCl
2
-0,1.
Microelemente (mg/l) - ZnSO
4
7H
2
O - 0,05, MnSO
4
2,0l
,
H
3
BO
3
0,85l,
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
4H
2
O 2,25, FeSO
4
7H
2
O 4, Co(NO
3
)
2
H
2
O 0,009, EDTA 4,75.
Utilizarea acestui mediu de nutriie penru cultivarea cianobacteriei Nostoc linckia
(Roth) Born et Flah CNM-CB-03 permite obinerea a 2,21 g/l biomas absolut uscat,
fa de 0,77 g/l la cultivarea pe mediul Gromov 6.
126
n concluzie menionm, c dintre mediile nutritive utilizate n prezent la
cultivarea cianobacteriei Nostoc linckia, cel mai convenabil poate f considerat mediul
Gromov 6. Optimizarea acestui mediu cu aplicarea metodei matematice de planifcare a
experienelor a dus la elaborarea unui mediu nutritiv mai ieftin cu 25% i care asigur
o productivitate de aproximativ trei ori mai mare dect mediul iniial.
Bibliografe:
1. . , 1991, 226 .
Articolul este prezentat de academicianul V.Rudic
PROCEDEE DE OBINERE A BIOMASEI DE HAEMATOCOCCUS
PLUVIALIS CU UN CONINUT SPORIT DE ASTAxANTIN
Miscu Vera
Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM
Ficobiotehnologia este orientat spre obinerea biomasei algale ca surs ieftin
de protein alimentar i furajer i pentru obinerea unor compui bioactivi aa ca
-carotenul, astaxantina, acizi grai polinesaturai, aminoacizi, vitamine etc., pentru
aplicare n agricultur, medicin i veterinrie.
Alga verde Haematococcus pluvialis prezint o surs promitoare de carotenoizi,
n special de -caroten i astaxantin i are o mare perspectiv biotehnologic find unica
microalg ce acumuleaz cantitatea record a pigmentului dat [1,2,4,11,14]. Cercetrile
au artat, c astaxantina protejeaz pielea de efectul nociv al razelor UV; protejeaz
organismul de aciunea cancerogenilor de natur chimic, activizeaz sistemul imun.
Datorit structurii sale moleculare astaxantina este unul din cei mai puternici poteniali
neutralizatori ai radicalilor liberi. Moleculele de astaxantin n interiorul celulelor
localizeaz efcient radicalii lipidelor i distrug produsele reaciilor de peroxidare,
protejnd astfel acizii grai i membranele sensibile [9,12,17]. Activitatea antioxidativ
a astaxantinei este aproximativ de 10 ori mai pronunat fa de ali carotenoizi;
aproximativ de 500 ori mai puternic fa de -tocoferol, find uneori numit i super
vitamina E [6,15].
A fost constatat de asemenea i efectul hemoprotector nalt al astaxantinei, care
poate f explicat prin aciunea antiproliferativ pe care o are asupra celulelor epiteliale
n rezultatul fortifcrii rspunsului imun. [10].
Multiplele rezultate permit de a considera c astaxantina moduleaz imunitatea
umoral i celular; sporete producia de interleucin 1 i factor de necrotizare
a tumorilor. De asemenea astaxantina asigur o inducie sporit a activitii
citochininelor. Acest pigment posed o activitate extrem de mare n sporirea nivelului
de imunoglobuline A i G i anticorpilor T-helper, chiar i n cazul cantitilor minime
de antigeni [7, 8,13].
Din literatura de specialitate este cunoscut faptul, c pentru sporirea cantitii
de astaxantin este nevoie de a menine cultura de Haematococcus pluvialis n condiii
nefavorabile ncepnd cu etapa staionar, aa ca temperatura nalt, iluminare intens,
stres salin, lipsa de azot i fosfor [1,2,9,11,15].