Noile Vaccinuri VLPs mpotriva

Virusului Gripal Pandemic i

Interpandemic
USMF Nicolae Testemianu, Chiinu 2009

Elaborat: Veronica Gudumac

Coordonator: Dr. Vadim Gavrilua

Date Generale
Gripa, este o boal infecioas, cauzat de
ARN-virusuri din familia Orthomyxoviridae (viruii
gripali),care afecteaz psrile i mamiferele.
Denumirea genuin, provine de la latinescul
influenza, ceea ce semnific "influen" (Latin:
influentia).
Tipic, gripa,se transmite prin aer prin tuse sau
strnut, formnd aerosoli cu ageni gripali. Gripa,
mai poate fi transmis prin intermediul
secreiilor psrilor, salivei, secreiilor nazale,
snge i faeces, la contactul direct cu aceste
fluide, sau cu suprafeele contaminate.
Transmiterea pe cale aerian este totui cea
mai important, dar mecanismul acesteia nc
nu a fost pe deplin elucidat.Viruii gripali pot fi
inactivai prin radiaii UV, Dezinfectani i
Detergeni. Se recomand splarea frecvent a
minilor cu spun,acesta distrugnd virusul gripal
i reducnd riscul infectrii.

Structura Virusului Gripal

Mecanismul Transmiterii

Replicarea i infectarea
organismului

Subtipurile Virusului Gripal

Sezonier

Virusul gripal afecteaz 15-60

mln oameni n SUA n fiecare
an;
--36000 cazuri letale
--200000 internri
n lume, virusul gripal este
responsabil de circa 0,5
MLN(!!!) cazuri de moarte;
Numrul cel mai mare de cazuri
letale se nregistreaz n rndul
copiilor i a persoanelor n
etate;
Sunt necesare vaccinuri
antivirale speciale categoriile
de vrst sus-numite.
--adaptate la intensitatea i gradul
de afectare/agresivitate al
agentului viral al gripei.

Pandemic

Virusul gripal pandemic se

atest cnd apare un nou tip al
virusului gripal care poate fi
uor contractat de ctre oameni
i apoi uor rspndit;
3 mari tipuri de virus gripal
pandemic, au omort mai mult
de 50 MLN VIEI!!!;
Metodele curente de obinere
a vaccinului, nu corespund
standardelor
--latenei de obinere
--cultivrii pe ou
Este sesizabil necesitatea
obinerii unui vaccin adecvat
virusului gripal pandemic,
obinut n timp rapid.

Semne i Simptome
Simptomul sensitivitiatea specificitatea

Febra

68-86%

25-73%

Tusea

84-98%

7-29%

Congestia
Nazal

6891%

1941%

Cum deosebim o simpl RCEAL

de
Gripa
H1N1???!!!
Similariti

Simptome: Simptomele caracteristiceH1N1 i unei simple rceli sezoniere,

sunt foarte asemntoare ncluznd: Febra, dureri musculo-articulare, cefalee,
inflamaiile mucoaselor cilor respiratorii superioare, nasul iritat i nroit,
frisoane, astenie, este posibil diareea i/sau voma asociat.
Cile de rspndire: Se consider c virusul H1N1 are aceleai ci de
rspndire ca i simpla rceal de sezon. Viruii gripali se transmit preponderent
de la o persoan la alta prin tuse sau strnut de la persoanele infectate.
Cteodat persoanele devin infectate contactnd cu obiecte/suprafee infectate,
apoi atingindu-i nasul, gura, sau plgile deschise preexistente.
Diferene
Cine este afectat: De vreme ce oricine se poate infecta de H1N1, numrul de
cazuri de letale i/sau de infectare cu H1N1, este mai mic pentru persoanele cu
virsta n jur de 64 ani,dect n cazurile unei rceli/gripe simple. Drept confirmare,
Centrul SUA CDC (Centers for Disease Control and Prevention, raporteaz
c ..noul H1N1 a cauzat mbolnviri n mas cu mult mai mari la persoanele mai
tinere de 25 ani, dect la persoanele n etate. (citez din:
http://www.cdc.gov/h1n1flu/qa.htm)
Vaccinuri: Vaccinurile contra H1N1 sunt vaccinuri de tip nou, nevirulente, de tip
VLPs(Virus-like particles). Pentru gripa sezonier, se elaboreaz n fiecare an noi
vaccinuri, pentru a spori protecia contra agentului viral, lund n consideraie
abilitatea nalt a virusului gripal de aforma tulpini noi mutagene rezistente.
info.findaflushot.com .

De unde tiu dac am

contractat
H1N1???!!!
De vreme ce simptomele

virusului gripal H1N1 sunt foarte

asemntoare virusului gripal
sezonier, nu vei putea stabili
diagnosticul corect n condiii de
domiciliu. Dac constatai
simptome specifice gripei,
adresai-v medicului Dvs, pentru
a evita riscul infectrii
persoanelor din jur i pentru a
efectua testele clinice pentru
H1N1,fapt ce v-ar ajuta n
stabilirea diagnosticului
prezumptiv, iar apoi i a celui
final.
http://info.findaflushot.com/learn/
what-is-the-difference-betweenseasonal-flu-and-h1n1

Viruii Pandemici ai secolului

trecut i pn n prezent

Puseele evoluionale ale gripei pandemice

de la 1918

Rata impacturilor gripale tip 1918 n

dependen de vrst
Rata atacurilor gripale pandemice cu semne clinice pronunate din 1918,
1957 i 1968

Vrsta

DE CE apare gripa pandemic?

Drift-uri i Shift-uri Antigenice
3 Subtipuri ale Virusului Gripal A sunt responsabile de marea
majoritate a pandemiilor i epidemiilor Gripale: H1N1, H2N2, i H3N2
Drifturile Antigenice induc modificri minore n structura
proteinelor membranare de suprafa (HA, NA) ale virusului Gripal
Pot determina apariia unor ageni virali modificai, ceea ce la-ar
permite parial sau chiar n totalitate s ocoleasc reaciile din
partea sistemului imun induse de agenii virali predecesori
Solicit revizuirea anual a compoziiei vaccinului antigripal
Shift-urile Antigenice apar cnd noi tipuri i structuri ale subtipurilor
de HA sau NA invadeaz organismul uman
Nu exist imunitate preexisten; Prin urmare, virusul se poate
rspndi rapid i cauza pandemii
Se poate nregistra mortalitate nalt chiar i n rndul adulilor tineri
i sntoi.

Mecanismul fortificrii rezistenei

agentului gripal pandemic prin
recombinri genetice

Pandemii Gripale Cunoscute:

188990 Asiatic (Rus)
Grip, rata mortalitii fiind
de 0.751 moarte per 1000
posibile H2N2
1900 H3N8
191820 Gripa Spaniol ,
500 milioane bolnavi, dintre
care 2040 milioane de
decesuri.Agentul- H1N1
195758 Gripa Asiatic , n
jur de 1- 1.5 milioane mori
din cauza H2N2
196869 Gripa de Hong
Kong , 3/4 - 1 milion au
decedat din cauza H3N2.

Mecanismul Generrii Agenilor Virali cu

Potenial Pandemic (Shift-uri Antigenice)

Direct

Rezervuar
pentru numeroi
ageni gripali:
16HAs,
9NAs

Virusul
gripei
aviare

Virusul
uman

Virusul
recombinat

Vaccinarea devine problema-cheie

contra instalrii pandemiilor i
epidemiilor gripale

Ordinul MS al SUA de la
1918, cu privire la regulile
igienice de prevenie ale
infectrii cu virusul gripal

ACTUALITI
n ultima vreme, s-a
demonstrat necesitatea
sintezei unei linii noi de
vaccinuri, care ar prezenta :
1. 100% eficacitate mpotriva
leziunilor precanceroase i/sau
previrale, pretoxice;
2. inofensivitatea acestora
pentru organismul uman;
3. eficacitate;
4. durat nalt de aciune;
5. meninerea unui titru nalt
de anticorpi n snge.

n acest sens, au fost elaborate vaccinurile revoluionare de genera ia

a 3-a vaccinuri ce consist din particule ce posed mimicrie viral.
Acestea sunt vaccinuri recombinante neinfecioase preparate din
particule asemntoare virusului (VLPs-Virus Like Particles), cu grad
mare de purificare ale proteinelor majore de capsid a viruilor n
cauz. VLPs nu conin AND viral, deci :
ele nu pot infecta celulele
nu se pot reproduce =>
nu pot cauza boala.

Structura Vaccinului VLPs

Gripal
Selectai proteinele importante pentru
imunitate:
- Hemaglutinina (HA)
- Neuraminidaza (NA)
- Matricea (M1)

Gene ce
codific
proteinele HA,
NA i M,
implantate n
baculovirus

R-baculovirus

Infectm coloniile
celulare (Sf9) cu
baculovirusul

Asamblarea
spontan a
proteinelor n
VLPs

VLPs Capsulate i Neincapsulate

VLPs sunt constituite din copii numeroase ale
antigenului proteic, care, fiind asamblate
mpreun, formeaz un virus nativ. nveliul
proteic care acoper virusul, denumit capsid,
este un component major al vaccinului. Unii
virui sunt incapsulai, ceea ce semnific
acoperirea capsidei cu o membran lipidic
cunoscut drept capsul viral, aceasta avind
rol adeziv n protecia, dar i sporirea
patogenitii virusului n cauz. Exemple de
virusuri incapsulai sunt: gripa, virusul sinciial
respirator (RSV-Respiratory Syncytial Virus),
virusul herpesului, precum i HIV. Exemple de
virusuri neincapsulate: Norovirus-ul, rotavirus si
Pappilomavirus-ul(HPV).

n prezent, exist VLPs-vaccinuri att pentru tipurile

incapsulate, ct i pentru cele neincapsulate

fig. 1-electronograma reprezentnd un norovirus

Fig. 1a- electronograma reprezentind un

VLPs norovirus

Fig. 2- electronograma reprezentnd

virusul gripei

fig. 2a- electronograma reprezentnd un

VLPs virus gripal

n producerea vaccinurilor VLPs, se folosesc

numeroase sisteme de expresie :

E. Colli
Drojdii
Baculovirus-ul
Mamiferele (expresie stabil i nerezident)
Asamblarea i purificarea VLPs, se realizeaz
prin:
Cromatografie n coloan
Filtrarea cu torent tangenial (TFF- Tangential
Flow Filtration)
Ultracentrifugare analitic i preparativ
Analizele concluzive, se fac prin intermediul:
Microscopiei electronic
Tehnicii Western blot
Tehnicii ELISA

Aplicaiile VLPs
Aceste particule, au fost produse pentru un diapazon larg de
virusuri structural i taxonomic diferii i au avantaje unice n
ceea ce vizeaz termenii de securitate i imunogenicitate, n
comparaie cu vaccinurile precedente. mpreun cu noile
vaccinuri de tip VLPs contra papillomavirus care ctig piaa
economic, vom argument c aceast tehnologie este pe
poziia unu a topului din prezent i deci trebuie considerat o
strategie de vaccinare viabil.
Mai mult ca att, VLPs vaccinurile sunt bine recunoscute
de ctre sistemul imun i sunt prezentatoare de antigeni virali
ntr-o conformaie cu mult mai adecvat dect celelalte
vaccinuri. VLPs au demonstrat deci o eficacitate
extraordinar, fiind foarte competitive i deci trebuiesc
appreciate drept o cale a urmtoarelor generaii de vaccinuri i
asta nu e tot: fabricnd VLPs ce vor conine adiional protein
structural, ne vor permite de a determina mecanismele
rspunsului imun n cazul infeciilor cu anumii ageni viraliEbola, HIV, Marburg, Parvovirus, Rotavirusi multe alte
sue virale.

Avantajele Imunologice ale

Vaccinului VLPs Pandemic Gripal

VLPs H5N1

Conine 3 proteine
imunologic importante
Vaccinurile curente conin
practic doar HA
Identitate genetic 100%
egal cu identitatea genetic
a virusului gripal agresiv
Procesarea de ctre celulele
dendritice i stimularea
direct a limfocitelor din gg
limfatici

Virus gripal caracterizat pleiomorf

prin tomografie crioelectronic

Ac HA-neutralizant previne infectarea

Ac NA-neutralizant reduce severitatea
manifestrilor bolii
Rspunsul celular mediat M1 reduce
severitatea infeciei
A se evita modificri proteice n HA , care pot
aprea n cultivarea pe ou
Dimensiunile mici ale particulelor VLPs permit
procesarea acestora pe mai multe ci de ctre
sistemul imun
---vaccinurile curente sunt prea voluminoase
pentru a fi procesate pe anumite ci

Vaccinurile VLPs O Bun

Alternativ
Vaccinurile VLPs
Vaccinurile

--Corespundere perfect
agentului provocator;
--Pentru agenii
--Profil imunologic
cultivabili pe ou;
considerabil mrit;
--Eficacitate limitat la
--Recombinant,
btrni i copii;
Rapid,Simplu i Eficient n
--Injectate anual i/sau n producere/ administrare.
perioade de pandemii.

Tradiionale

Obiective Clinice Enunate Sistemului

de Producere Al Vaccinului VLPs pentru
Virusul Gripal Pandemic
Crearea unui vaccin mpotriva subtipurilor
virusului gripal cu potenial pandemic:
--Securitate
--Imunogenitate nalt
--Eficacitate nalt
Instalarea unui rspuns imun VAST:
--Capacitatea de a neutraliza Ac pentru a preveni
infectarea i a reduce severitatea bolii
--Instalarea imunitii mediate celular pentru a reduce
severitatea bolii
Inducerea reactivitii ncruciate mpotriva
viruilor de acelai subtip
--Va proteja organismul n cadrul valurilor de afeciuni
pandemice
Efectivitate pentru toate categoriile de vrst

Etapele Crerii VLPs

1. Clonarea Genelor HA, NA, i M1 prin generarea de baculovirus

recombinant

Genele pentru HA, NA, i M1 procreante

pentru Vaccinul VLPs H5N1 au fost
sintetizate de ctre GeneArt (Germania)
bazate pe secvenele ISDN125873,
ISDN125875, ISDN125876, urmate de
clonarea n cadrul bacmidelor E. coli (Fig.
1A), Purificarea de plac a
baculoviruilor recombinani cu gene
pentru HA, NA i M1 n cadrul unui singur
vector i expresarea n celulele tip Sf9
ale speciei de insecte podoptera
frugiperda (ATCC CRL-1711). La 72 ore
dup transinfectare, celulele au fost
electate pentru producerea de VLPs.
Controlul Expresiei Particulelor a fost
efectuat prin Ultracentrifugare cu Gradient
de Sucroz i tehnica SDS-PAGE, urmate
de Western blot(dup descrierea lui
Pushko,rus.) i purificarea particulelor

2. Expresia paticulelor VLPs de tip

H5N1

[FIG. 1]

3.Refiltrarea VLPs i controlul puritii i

autoasamblrii particulelor

La 72 ore postinfectare, culturile au fost curite pentru a nltura impuritile i

agenii gazdei.VLPs au fost separate prin filtrare cu flux tangenial cu filtru din
fibr cu masa molecular de 500,000
Concentratul se filtreaz a 2-a oar pentru eliminarea proteinelor PBS ale gazdei
de clonare.
Diafiltratul (filtrat de 2 ori) se centrifugheaz timp de 18 ore la 5,000g cu 20
60% gradieni de sucroz.Astfel VLPs au fost separate de particulele
baculovirus-ului printr-o band ce conine un gradient de sucroz de cca 30% .
Separarea particulelor VLPs de baculovirus a fost nfptuit folosind
cromatografia cu schimb de ioni.Puritatea VLPs a fost msurat prin scanarea
densitometriei rezultatelor electroforezei SDS-PAGE folosind sistemul OneDscan
(BD Biosciences, Rockville, MD, USA) (Fig. 1B).
Analizm capacitatea VLPs de a se autoasambla graie prezenei
hemagglutininelor. Probele vor fi acoperite cu reele fine de aur acopeit de
carbon,mpregnate cu sol. 5% de Ammonium Molybdate, apoi uscate cu aer.
Procesul se urmrete la microscopul electronic ultraperformant A Zeiss 902
CEM (la 80 kV,cu sistemul Olympus Soft Imaging Solutions,
GMBH).Fotografierea-Aparatul digital Mega View II cu rezoluia de 12801024
pixeli. Prezena Elementelor HA pe suprafaa particulelor cu diametrul de 100
200 nm se confirm folosind imprinting-ul imunologic cu compui ai Au cu Ac
anti-HA de iepure(Controlul Ac precum este artat n Fig. 1C n dreapta i stnga
respectiv).

4. Teste Serologice

Se promoveaz metoda cantitativ ELISA pentru aprecierea IgG

anti-HA specific sau izotipurile IgG in serul imun. Anticorpul
nefixat a fost nlturat i probele-splate. Apoi sunt citite
rezultatele prin intermediul analizei densitii optice eroarea
standard (SE).

5. Analize Serologice,Biochimice,de
Rezonan.....

6. Alegerea Adjuvantului

7.Etapa Testelor Clinice

Obiective:
1. Aprecierea inofensivitii vaccinurilor antigripale
VLPs pe modelele H5N1 i H1N1;
2. Aprecierea imunogenicitii vaccinului VLPs
mpotriva virusului gripal pandemic;
3. Selectarea dozei corespunztoare pentru
eventuale studii n faza II de studii clinice.

V.S.

Etapele Studiului Clinic

Etapa A: Creterea dozelor
2 injecii 15 g, 45 g,
placebo
N=70
Raportatea rezultatelorDecembrie,2007
Etapa B: Lrgirea Diapazonului de
Dozare
2 injecii: 15 g, 45 g, 90 g,
placebo
N=160
Raportarea rezultatelor asupra
securitii i Imunogenicitii

Securitatea Vaccinului-Candidat
VLPs Antigripal

Etapa A
Studiile unblinded au artat ca vaccinurile au
fost bine tolerate de ctre participanii
studiului clinic;
Etapa B
SE aplic metoda ORB pentru excluderea
factorului psihologic;
Consiliul Comitetului DSMB (Data Safety
Monitoring Boards) a revizuit rezultatele
studiului i a recomandat continuarea
acestuia
---- Doza a fost extins pn la 90 g

Rezultatele Studiului Clinic

n grupele de vrst 18 - 40 ani, care au primit cte

2 injectri a cte15 g, 45 g sau 90 g de VLPs
H5N1
Vaccinul a fost bine tolerat
Vaccinul a fost imunogenetic pentru toate dozele
studiate
Neduntor, anti-HA, anti-NA.

Propuneri de perspectiv
1.Rezultatele Studiului asupra vaccinurilor VLPs contra
agenilor virusului gripal pandemic H5N1 i H1N1 susin
nscrierea adecvat a VLPs pentru elaborarea vaccinurilor
mpotriva altor maladii;
2. SIDA???!!!!

Concluzii
Vaccinurile antigripale tip
VLPs ofer alternative
vaccinului antigripal
clasic;
Datele preclinice i clinice
indic faptul c VLPs
sunt bine tolerate i nalt
imunogenice;
Procesul de manufactur
inedit implic
flexibilitate i confort n:
Suplinirea rapid a
stocurilor de vaccin
utiliznd tehnologii
recombinante.

SUCCESE REMARCABILE N
DOMENIUL VLPs

Succese Remarcabile
n Domeniul VLPs

Producerea vaccinului
H1N1
5 iunie 2009

Aparate de clonare a genelor virale

HA, NA i M i de obinere a
particulelor VLPs H1N1

Purificarea Rapid a VLPs

H1N1

Asamblarea celular a VLPs

H1N1

i ini
Republica
n Republica
Moldova....
Cervarix

Moldova....

Bibliografie Selectiv
1. 1.http://www.plosone.org/article/info:doi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0001501
2. 2.http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T3B-46W11YF4T&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searc
hStrId=1052202122&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersi
on=0&_userid=10&md5=2024f343683fc6fa6a3fd6c91dfd3bf3
3. 3. Gillim-Ross L, Subbarao K (2006) Emerging respiratory viruses: challenges and
vaccine strategies. Clin Microbiol Rev 19: 614636
4. Luke CJ, Subbarao K (2006) Vaccines for pandemic influenza. Emerg Infect Dis 12: 66
72.
5. Subbarao K, Murphy BR, Fauci AS (2006) Development of effective vaccines against
pandemic influenza. Immunity 24: 59.
6. Suguitan AL Jr, McAuliffe J, Mills KL, Jin H, Duke G, et al. (2006) Live, attenuated
influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and
ferrets. PLoS Med 3: e360.
7. Leroux-Roels I, Borkowski A, Vanwolleghem T, Drame M, Clement F, et al. (2007)
Antigen sparing and cross-reactive immunity with an adjuvanted rH5N1 prototype
pandemic influenza vaccine: a randomised controlled trial. Lancet 370: 580589.
8. Subbarao K, Klimov A, Katz J, Regnery H, Lim W, et al. (1998) Characterization of an
avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness.
Science 279: 393396.
9. Cheung CL, Rayner JM, Smith GJ, Wang P, Naipospos TS, et al. (2006) Distribution of
amantadine-resistant H5N1 avian influenza variants in Asia. J Infect Dis 193: 1626
1629.
10.de Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, et al. (2005) Oseltamivir resistance
during treatment of influenza A (H5N1) infection. N Engl J Med 353: 26672672.

11. Hurt AC, Selleck P, Komadina N, Shaw R, Brown L, et al. (2006)

Susceptibility of highly pathogenic A(H5N1) avian influenza viruses to
the neuraminidase inhibitors and adamantanes. Antiviral Res.
12. Le QM, Kiso M, Someya K, Sakai YT, Nguyen TH, et al. (2005) Avian flu:
isolation of drug-resistant H5N1 virus. Nature 437: 1108.
13. Stohr K (2005) Avian Influenza and PandemicsResearch Needs and
Opportunities. N Engl J Med 352: 333340.
14. Despres P, Combredet C, Frenkiel MP, Lorin C, Brahic M, et al. (2005)
Live measles vaccine expressing the secreted form of the West Nile
virus envelope glycoprotein protects against West Nile virus
encephalitis. J Infect Dis 191: 207214.
15. Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, Chunsuthiwat
S, Sawanpanyalert P, et al. (2005) Human disease from influenza A
(H5N1), Thailand, 2004. Emerg Infect Dis 11: 201209.
16. Booy R, Brown LE, Grohmann GS, Macintyre CR (2006) Pandemic
vaccines: promises and pitfalls. Med J Aust 185: S62S65.
17. Lin J, Zhang J, Dong X, Fang H, Chen J, et al. (2006) Safety and
immunogenicity of an inactivated adjuvanted whole-virion influenza A
(H5N1) vaccine: a phase I randomised controlled trial. Lancet 368:
991997.
18. Treanor JJ, Campbell JD, Zangwill KM, Rowe T, Wolff M (2006) Safety
and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1)
vaccine. N Engl J Med 354: 13431351.

19. Webster RG, Webby RJ, Hoffmann E, Rodenberg J, Kumar M, et al. (2006) The
immunogenicity and efficacy against H5N1 challenge of reverse geneticsderived H5N3 influenza vaccine in ducks and chickens. Virology 351: 303
311.
20. Subbarao K, Chen H, Swayne D, Mingay L, Fodor E, et al. (2003) Evaluation of
a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate
generated by plasmid-based reverse genetics. Virology 305: 192200.
21. Bresson JL, Perronne C, Launay O, Gerdil C, Saville M, et al. (2006) Safety and
immunogenicity of an inactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004
(H5N1) vaccine: phase I randomised trial. Lancet 367: 16571664.
22. Focosi D (2006) An inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine. N Engl J
Med 354: 27242725; author reply 2724-2725.
23. Govorkova EA, Webby RJ, Humberd J, Seiler JP, Webster RG (2006)
Immunization with reverse-genetics-produced H5N1 influenza vaccine
protects ferrets against homologous and heterologous challenge. J Infect Dis
194: 159167.
24. Qiao C, Yu K, Jiang Y, Li C, Tian G, et al. (2006) Development of a
recombinant fowlpox virus vector-based vaccine of H5N1 subtype avian
influenza. Dev Biol (Basel) 124: 127132.
25. Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, Chunsuthiwat S,
Sawanpanyalert P, et al. (2005) Human disease from influenza A (H5N1),
Thailand, 2004. Emerg Infect Dis 11: 201209.
26. http://www.virology.ws/2009/09/01/adjuvant-effect-on-h1n1-vaccine/

Oricine poate face lucrurile mai mari, mai

complexe i chiar mai violente.Este necesar
ns atingerea unui geniu i mult curaj,
pentru a schimba lucrurile n direcia
invers...
Albert Einstein