Metode de estimare a concentratiei proteinelor

Studiile biochimice necesita masurarea cantitativa a concentratiei proteinelor in solutie.

Datorita compozitiei diferite a proteinelor se apeleaza la diverse metode de cuantificare a
acestora.
1. Metoda biuretului si metoda Lowry
In cazul in care biomoleculele contin doua sau mai multe legaturi peptidice reactia cu
sulfatul de cupru alcalin (biuret) conduce la formarea unui complex purpuriu (atomii de azot din
legatura peptidica coordineaza ioni Cu2+, complexul prezinta un coeficient de extinctie maxima
la 540 nm). Cantitatea de produs format (dupa o incubare de 20-30 min) este influentata de
concentratia proteinei. In laborator, se impune construirea unei curbe de calibrare cu o proteina
standard (albumina serica). Concentratia proteinei de interes se extrapoleaza din curba de
calibrare. Metoda biuretului are dezavantajul unei sensibilitati reduse (1-20 mg).
Metoda Lowry a fost una dintre cele mai folosite metode la stabilirea concentratiei de
proteina. Culoarea albastra rezulta in urma complexarii legaturii peptidice cu sulfatul de cupru
alcalin (reactia biuretului) si a reducerii reactivului Folin-Ciocalteu (fosfomolibdat-fosfotungstat)
de catre resturile de tirozina si triptofan din proteina. Metoda are o sensibilitate cu doua ordine
de magnitudine mai mare decat cea a biuretului (5 - 100 g/ml). Dezavantajele metodei sunt:
interferenta cu diverse substante (lipide, detergenti), timp relativ ridicat de reactie (20-30 min) si
denaturarea ireversibila a proteinelor.
2. Testul Bradford
Dezavantajele metodei Lowry au impus gasirea unei metode noi de cuantificare a
concentratiei proteinelor din solutie. Metoda Bradford se bazeaza pe capacitatea proteinelor de a
lega colorantul (Coomassie Brilliant Blue G-250 sau Serva Blue G).
Legarea colorantului Coomasie Brilliant Blue la proteina in conditii acide determina o
deplasare a maximului de absortie (max) de la 465 la 595 nm. Absorbtia la 595 nm este
proportionala cu concentratia proteinei. In comparatie cu metoda Lowry aceasta metoda
utilizeaza numai un singur reactiv, o solutie acida de Coomasie Brilliant Blue G-250.
Metoda Bradford poate fi utilizata pentru determinarea concentratiei proteinelor in intervalul 1 20 g. Timpul scurt de aparitie al culorii (2-5 min) respectiv putinele interferente (datorate
detergentilor) au determinat utilizarea frecventa a acestei metode pentru determinarea
concentratie proteinelor.
Exista si situatii in care intervin interferente de la reactivi prezenti in solutie. Lipidele,
agentii cu sulf si EDTAul (agent de chelatare al Cu2+) interfera in cazul in care volumul probei
este relativ mare. In cazul in care concentratia proteinei din proba de analizat este suficient de
mare se prefera o dilutie pentru a diminua posibilele interferente.
3. Metoda spectrofotometrica directa
Majoritatea proteinelor prezinta un maxim de absorbtie la 280 nm, datorita prezentei
aminoacizilor tirosina si triptofan. In extractele celulare, prezenta acizilor nucleici (cu un maxim
de absorbtie la 260 nm) a impus gasirea unor metode de corectie a interferentelor aduse de acesti
compusi. Layne (1975) a propus ecuatia urmatoare:
Conc. proteinei (mg/ml) = 1,55 A280 0,76 A260

valabila pentru solutii de proteine care contin mai putin de 20% acizi nucleici.
Scopes (1974) a propus o metoda de determinare a concentratiei proteinelor utilizand
raportul A280 /A205. Aminoacizii triptofan, tirosina, fenilalanina si histidina absorb considerabil la

250-280 nm. Aminoacizii arginina, metionina si cisteina au un coeficient de extinctie mai slab la
aceeasi lungime de unda. Formula propusa de Scopes este:
A205/cprot (mg/ml) = 27,0 +120 (A280 /A205)

Parte experimentala: Determinarea concentratiei proteinelor din diverse surse

A. Echipamente si materiale necesare
Spectrofotometru; Cuve din plastic; Pipete Pasteur; Tuburi Eppendorf; Vortex
B. Reactivi
-Colorant Serva Blue G
-Solutie de -globulina (fractiunea 2; plasma bovina) sau albumina serica (1-2 mg/ml solutie)
-Etanol 95%
-Acid fosforic 85%.
-Solutie Bradford: 10 ml EtOH 95%, 20 ml acid fosforic 85% si 35 mg Serva Blue G.
-Solutia 1: 3 ml etanol 95%, 6 ml acid fosforic 85%, 6 ml solutie Bradford, 85 ml apa distilata.
Solutia se filtreaza printr-o hartie de filtru Whatman no 1 dupa care se pastreaza intr-o sticla
bruna pentru cateva saptamani.
C. Protocol
Mod de lucru (Metoda Bradford) Se pipeteaza solutia de analizat (maxim 100 l) intr-un tub
Eppendorf. Pentru dilutii (pentru standard se pipeteaza 1-10 l solutie de proteina iar pentru
proba de analizat, de exemplu ser sangvin, se pipeteaza 1-5 l solutie diluata 1:20) se
completeaza volumul de proba cu solutia tampon (NaPi 0,1M pH = 7,5) pana la volumul de 100
l. Se adauga 1 ml din solutia 1 si se agita amestecul. Se citeste valoarea absorbantei la 595 nm
dupa 5 min (incubarea poate fi prelungita pana la maxim 1 h, Bearden, 1978). Cu ajutorul curbei
de calibrare se estimeaza concentratia solutiei de proteina (sau concentratia totala a proteinelor
dintr-un extract).
Probleme
1. Folosind metoda Bradford estimati concentratia totala a proteinelor din urmatoarele
surse: ser sanguin, albus de ou, galbenus de ou sau saliva.
2. O solutie de BSA de concentratie 0,1 mg/ml este folosita pentru trasarea curbei standard
in scopul determinarii concentratiei de proteina dintr-o proba cu ajutorul reactivului
Bradford. Valoarea absorbtiei inregistrata la 595 nm pentru 1 mL de solutie de analizat,
diluata 1:10, a fost de 0,35. Calculati concentratia totala a proteinelor din solutia de
analizat.
3. Din ce motive se prefera estimarea concentratiei proteinelor prin metoda Bradford in
defavoarea metodei biuretului?
4. Ce aminoacizi din constitutia proteinelor absorb in intervalul 260-280 nm?
1.
2.
3.
4.

Bibliografie:
Legler, G. si al. (1985), On the chemical basis of the Lowry protein determination, Anal. Biochem., 150,
278-287.
Bradford, M. (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254.
Bearden, J. C. (1978).The protein protocol handbook (2nd edition) Walker, J. M. (ed), Humana Press Inc.,
Totowa, NJ, 2002.
Layne, E. (1957), Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. IV. Protein
estimation by UV absorbtion, p 451-457, in Methods in enzymology, 3, Eds Colowich, S. P. and Kaplan, N.
O., Academic Press, New York.