Virusurile schele pentru nanotransportori enzimatici naturali

Spnu tefan-Iulian i Creciun Veronica

Facultatea de Medicin, Universitatea Transilvania Braov

Organizarea unei cooperri ntre enzime i celule (componente naturale) este o cheie de
sporire a eficacitii nanoreactoarelor enzimatice n sistemele vii. De aceea, n domeniul
nanotehnologiei, efortul actual este focusat pe realizarea unor crui naturali ai enzimelor, iar
pentru obinerea acestora este nevoie de o rezoluie de ordinul nanometrilor nsoit de un
aliniament de mare precizie astfel nct enzima s fie ataat n interiorul nanorecipientului
sau la suprafaa acestuia. Capsida viral (componenta de nveli a acizilor nucleici virali
care pot fi ADN sau ARN) se auto-asambleaz fiind condus de combinaii supramoleculare
precise ale proteinelor specifice din structura acesteia.
Scopul articolului este de a oferi cteva exemple n ceea ce privete cele mai recente
progrese n utilizarea virusurilor cu afinitate pentru plante, a bacteriofagilor (virusuri care au
proprietatea de a distruge unele bacterii) i a particulelor virus-like (asemntoare virusurilor,
dar care nu au proprieti infecioase deoarece sunt lipsite de material genetic) pentru
obinerea unor nanotransportori enzimatici naturali, n cadrul crora enzimele pot ndeplini
diverse roluri, n special terapeutic.
Nanocruii enzimelor
Majoritatea enzimelor implicate n metabolism difuzeaza liber n citoplasm, iar activitatea
enzimatic a acestor enzime este mare in vivo, fiind optimizat n funcie de mediul biologic
de aciune.
Deoarece poziionarea enzimelor la nivelul nanocruului natural se realizeaz la nivel de
rezoluie nanometric, aceast fixare este deosebit de dificil de efectuat, necesitnd tehnici
care sunt n plin dezvoltare. Recent s-au gsit noi proceduri de conjugare a proteinelor de
ADN astfel nct enzimele se pot lega mai uor de acidul nucleic.
Cu toate acestea, organizarea supramolecular a enzimelor este dificil la scal
nanometric, deoarece nu se poate realiza o amplasare exact a structurilor date la nivelul
suprafeelor adsorbante, acestea fiind neomogene. Mai mult dect att, structura de ADN la
care se dorete fixarea enzimatic este sensibil la numeroase variaii fizico-chimice ale
parametrilor de mediu (n special temperatura).
Nanovehiculul la nivelul cruia este fixat enzima, este mult mai uor s fie poziionat pe
un anumit suport fa de fixarea enzimei la nivelul acestuia. Cuplarea enzimelor cu proteine
nalt ordonate (cum sunt cele de la nivelul capsidei virale) necesit realizarea unui control
poziional. Virusul, dei este proiectat n mod natural pentru stocarea i transportul
materialului genetic viral (ADN sau ARN), proprietile sale l fac atractiv pentru utilizarea sa
pe scar larg n cadrul aplicaiilor din biotehnologie, inclusiv transportul enzimelor.
Progresele n domeniul tehnologiei ADN-ului au fcut posibil modularea informaiei
genetice coninut de virus astfel nct s se regleze fin interfeele lor enzimatice.
Utilizarea bacteriofagilor drept nanocrui enzimatici
Bacteriofagii reprezint virusuri cu afinitate pentru bacterii, pe care le infecteaz i ulterior
le pot distruge. Acetia pot fi clasificai n funcie de morfologie ca fiind:
- filamentoi (bacteriofagii M13 i fd);
- icosaedrici (bacteriofagii MS2 i 174);
- icosaedrici alungii cu cozi helicoidale (bacteriofagii T4 i T7).
1

Bacteriofagii T4 acioneaz ca nanotransportori enzimatici prin faptul c au ataai

molecule de lizozim la nivelul cozii, enzim care catalizez hidroliza peptidoglicanilor de la
nivelul peretelui bacterian pe care astfel l perforeaz.
Bacteriofagii filamentoi M13 au fost utilizai pe scar larg pentru dezvoltarea unei
tehnici de mare sensibilitate prin care sunt selectate anumite peptide, inclusiv enzime care au
proprieti mbuntite (stabilitate n raport cu mediul i specificitate pentru substrat).
Substratului adsorbit n vecintatea enzimei la nivelul aceleiai particule virale, i este
facilitat ptrunderea la nivelul centrului activ enzimatic minimaliznd problemele de
difuziune. Enzima care este prezent la nivelul bacteriofagului M13 este reprezentat de Sfpfosfopanteteinil-transferaza care catalizeaz transferul unor grupri funcionale ntre diferite
molecule (peptide, acizi nucleici) n prezena coenzimei A (CoA) i a substratului specific
(ybbR) (Figura 1a). La nivelul zonei pIII a peretelui bacterian se va realiza interacia cu
enzima prezent la nivelul bacteriofagului astfel nct substratul va aciona facil la nivelul
centrului activ enzimatic.
Tot bacteriofagii M13 au fost folosii pentru a identifica i a selecta anumite peptide care
recunosc receptorii specifici de la nivelul suprafeei celulei canceroase. La acest nivel
peptidele se leag de captul N-terminal al -lactamazei, enzim expus la suprafaa
bacteriofagului M13 (Figura 1b). Aadar, -lactamaza servete drept suport de legtur ntre
peptide i celula canceroas, iar sistemul astfel rezultat poate fi utilizat n terapia
anticanceroas.
O alt categorie a bacteriofagilor este reprezentat de bacteriofagii litici care sunt virusuri
cu proprietatea de a liza bacteriile i pot completa tratamentul antibiotic n cazul anumitor
boli. Unele bacterii patogene pot secreta biofilme ce sunt substane care pot induce apariia
rezistenei la antibiotice. Aceast dezvoltare a rezistenei poate duce la complicaii infecioase,
cum ar fi pneumonia, mai ales la pacienii cu fibroz chistic (mucoviscidoz). Au fost deja
brevetai bacteriofagi care prezint la suprafa una sau mai multe enzime capabile s
degradeze biofilmele secretate de unele bacterii patogene. Aceti bacteriofagi acioneaz
printr-o dubl strategie:
enzimele de la nivelul bacteriofagului degradeaz matricea extracelular a biofilmului,
expunnd astfel bacteriile la aciunea direct a bacteriofagului;
populaia de bacteriofagi este amplificat concomitent.
Degradarea biofilmului de ctre celuloza A a fost mbuntit n mod semnificativ atunci
cnd enzima a fost expus la suprafaa bacteriofagului T7. Dac se adaug n sistem plasmid,
se va asigura formarea unei capside rezistente la nivelul bacteriofagului (Figura 1d).
Utilizarea virusurilor specifice mamiferelor pentru transportul enzimelor
Deoarece bacteriofagii utilizai ca vehicule pentru enzime nu sunt adaptai pentru enzimele
complexe ale mamiferelor care necesit modificri post-translaionale, se folosesc n mod
actual virusuri care n stare pur nu prezint capacitate de autoreproducere. Pentru aceasta ei
trebuie s ptrund ntr-o celul specific i s se iniieze mecanismul de replicare cu ajutorul
celulei gazd. Acidul nucleic viral este purttorul informaiei genetice pe baza creia se
realizeaz procesul de replicare i sintez a nveliului proteic specific.
Dac se utilizez ca vehicul enzimatic virusul leucemiei murine, este necesar cunoaterea
mecanismului de aciune al acestuia. Acest virus capt nveliul proteic numai dup ce trece
membrana plasmatic, iar activatorul plasminogenului tisular (tPA) se leag de captul Nterminal al receptorului transmembranar al factorului de cretere derivat din trombocite
(PDGFRtm).
n figura 1c se poate observa c dac celulei renale embrionare umane i este transferat un
virus al leucemiei murine care s conin un bagaj genetic pentru codificarea realizrii

legturii dintre tPA i PDGFRtm, atunci virusul se poate replica i i se poate forma capsida
specific.
La nivelul virusului leucemiei murine pot fi agregate un numr mediu de 818 enzime, mult
mai multe dect n cazul bacteriofagilor.
Utilizarea virusurilor cu afinitate pentru plante drept crui enzimatici
Marea majoritate a acestor virusuri sunt alctuite dintr-o capsid (constituit din proteine
specifice) i dintr-o component ADN sau ARN ca material genetic. Progresele n ceea ce
privete manipularea ARN-ului viral au facilitat producia unei capside virale ce prezint
peptide cu lanuri scurte la nivelul plantei infectate.
Cu toate acestea, limitarea principal n ceea ce privete asamblarea particulelor rmne
mpiedicarea steric. Vom descrie mai jos 3 strategii de formare a virusurilor cu specificitate
pe plante n domeniul nanotransportului enzimatic:
1) Strategia elementului de legtur.
Exist dou tipuri de liganzi, unul flexibil bogat n resturi de glicin i altul de form
helicoidal, ambii putnd fi folosii ca elemente de legtur ntre un virus specific (virusul
mozaicului tutunului) i un fragment proteic ce aparine bacteriei Staphylococcus aureus
(proteina A).
Aceast metod a demonstrat c pot s apar pn la 2100 de copii ale proteinei A
raportate la o particul viral i un numr foarte mare de nanoparticule n planta infectat
(Figura 1e). Totui pot s apar n mod neprevzut modificri de stabilitate ale capsidei astfel
modificate.
2) Strategia de asamblare a capsidelor hibrid ce depesc problema mpiedicrii sterice.
Pentru a evita problema mpiedicrii sterice care privete proteinele expuse la suprafaa
virusului X al cartofului (PVX), se va introduce peptidul 2A (alctuit din 16 aminoacizi)
provenit de la un alt virus (virusul bolii mn-gur-picior) (Figura 1f). Acest peptid poate
modifica sinteza proteinelor de la nivelul nveliului viral astfel nct la nivelul acestuia se va
gsi o combinaie de proteine specifice i de aceea capsida devine un hibrid.
La nivelul proteinei 2A se pot lega diverse enzime astfel nct sistemul obinut s poat
aciona asupra unui substrat specific.
3) Strategia de asamblare a capsidelor virale cu ajutorul legturilor necovalente.
Proteinele pot fi grefate la suprafaa unui virus in vitro prin tehnici speciale astfel nct
ntre capsida viral i protein s nu existe legturi covalente. Interaciile folosite n acest caz
sunt de tipul complexelor streptavidin-biotin.
La nivelul captului N-terminal din structura proteinelor din capsid se gsete un rest de
lisin (Lys) care este capabil s lege molecula de biotin ce interacioneaz cu molecula de
streptavidin, la nivelul creia se poate prinde protein-enzima (Figura 1g).
Utilizarea particulelor virus-like ca vehicule enzimatice
Aceste particule virus-like sunt asemntoare virusurilor, cu excepia faptului c nu mai
prezint material genetic viral i astfel ele sunt formate numai din capsida proteic i pot fi
folosite ca transportori enzimatici. Enzimele sunt introduse direct n interiorul particulelor in
vivo cu ajutorul unor bacterii. Dac enzima este reprezentat de toxina A extras din ricin (Nglucozidaz), aceasta are proprietatea de a bloca procesele de translaie ribozomale i se
adreseaz n special celulelor canceroase de la nivelul ficatului, cu condiia ca suprafaa
capsidei s prezinte dou peptide modificate: SP94, care recunoate celulele tumorale i
cellalt peptid care previne degradarea lizozomal a toxinei A. Acest mecanism este important
deoarece induce apoptoza celulelor canceroase, n timp ce esutul sntos rmne neafectat de
tratament.

Figura 1.
Concluzii:
Virusurile sunt materiale naturale de construcie pentru nanotransportorii enzimatici, n
cadrul crora moleculele mici pot difuza relativ uor, pe cnd macromoleculele sunt
inaccesibile spaiului intern al virusului. Bacteriofagii, unele virusuri cu specificitate pentru
plante sau pentru mamifere pot servi drept nanocrui enzimatici avnd unele avantaje
deosebit de importante cum ar fi: mrimea nanometric, tendina acestora de a se autoasambla n particule monodispersate de diferite forme i mrimi, stabilitatea,
biodisponibilitatea, biocompatibilitatea i producia lor n cantiti mari care se realizeaz
destul de uor.
n plus, capsidele proteice din compoziia virusului pot fi modificate cu ajutorul unor
tehnici genetice sau prin bioconjugare chimic. Cu toate acestea, modificrile amintite pot
influena n mod negativ ciclul infecios la nivelul gazdei, iar zonele de la nivelul capsidei
care sunt implicate n asigurarea stabilitii trebuie s rmn n mod obligatoriu neperturbate.
S-a ncercat i realizarea unor adeziuni ale proteinelor (enzime) la nivelul virusurilor
celulelor eucariote prin tehnici genetice, ns s-au dovedit foarte dificil de efectuat, deoarece
complexele obinute sunt deosebit de instabile i pot induce inclusiv efecte de tip toxic la
nivelul celulelor gazd.
n viitor se are n vedere dezvoltarea unor biosenzori care s fie alctuii dintr-o particul
viral i un senzor capabil s regleze instabilitatea aprut n cazul modificrii in vitro a
capsidei.
4

Virusurile, se pare c reprezint cele mai abundente i mai robuste entiti biologice de pe
Terra. Spre exemplu, descoperirea noilor virusuri rezistente n mediu extrem de acid ne
deschide posibilitatea de a utiliza schele virale n unele scopuri care erau crezute a fi de
nerealizat.
n cele din urm, creativitatea uman se pare c este singura limitare a potenialului de
utilizare al virusurilor.
Bibliografie:
[1]
Daniela Cardinale, Nolle Carette, Thierry Michon, Virus scaffolds as enzyme
nano-carriers, Cell Press, 2012, 369-377.
[2]
L. Andrew Lee, Zhongwei Niu, Qian Wang, Viruses and Virus-Like Protein
Assemblies-Chemically Programmable Nanoscale Building Blocks, Tsinghua
University Press, 2009.
[3]
Gleb B. Sukhorukov, Helmuth Mhwald, Multifunctional cargo systems for
biotechnology, Science Direct, 2007, 93-98.
[4]
L. Andrew Lee, Qian Wang, Adaptations of nanoscale viruses and other
protein cages for medical applications, Science Direct, 2006, 137-149.
[5]
Coman Gh., Drghici C., Badea M., Bgiu N., Ciurea C., Biochimie
descriptiv, Ed. Universitaii Transilvania Braov, 2009.
[6]
Coman Gh., Badea M., Bgiu N., Vlceanu A., Biochimie clinic. Enzimologie,
Ed. Universitaii Transilvania Braov, 2012.