Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Zenovia Olteanu
BIOLOGIE MOLECULAR
Metode experimentale
Refereni tiinifici:
Prof.univ.dr. Emeritus Vlad Artenie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai
apl. Prof. em. Dr. rer. nat. Roderich Brandsch, Institute of Biochemistry and
Molecular Biology, ZBMZ, Freiburg, Germania
BIOLOGIE
MOLECULAR
Metode experimentale
Prefa de Gheorghe Benga
2012
CUPRINS
PREFA de GHEORGHE BENGA ....................................................................... XI
INTRODUCERE ................................................................................................. 1
I. TEHNICI DE BAZ UTILIZATE N LABORATORUL DE BIOLOGIE
MOLECULAR .................................................................................................. 3
I.1Sticlriaiinstrumenteledinmaterialeplastice.....................................................3
Siliconareasticlrieiiainstrumentelordinmaterialeplastice....................................4
Splareaiuscareavaselordelaborator......................................................................5
I.2Msurareavolumelor............................................................................................6
Msurareavolumelorcuajutorulpipetelor..................................................................7
I.3Msurareamaselor.............................................................................................12
Instruciuniprivindutilizareabalaneielectroniceanalitice......................................14
I.4Centrifugarea......................................................................................................15
Instruciuniprivindutilizareacentrifugii.....................................................................16
I.5Tehnicidebazfolositepentrumanipulareamicroorganismelor..........................17
Msuridebiosecuritate..............................................................................................17
Tehnicidesterilizare...................................................................................................21
VI
Cuprins
II.2CultivareaE.colipemediisolide........................................................................41
nsmnarealasuprafaamediilordecultursolide................................................42
nsmnareanprofunzimeamediilordecultursolide..........................................44
II.3CultivareaE.colinmediilichide........................................................................47
Inoculareaicultivareafolosindvolumemicidemediu.............................................47
Inoculareaicultivareafolosindvolumemaridemediu............................................48
II.4MonitorizareacreteriibacterieiE.colinmediilelichide....................................48
Determinareadensitiiopticecuajutorulspectrofotometrului...............................49
Determinareadensitiiopticecuajutorulhemocitometrului...................................51
DeterminareanumruluidebacteriiprincultivarenplciPetri...............................52
II.5PstrareaculturilordeE.coli.............................................................................54
Pstrareaprincongelarela80oC................................................................................55
Cuprins
VII
IV.4IzolareaADNuluidingelurideagaroz...........................................................103
IV.5PstrareaADNuluipurificat...........................................................................107
VIII
Cuprins
VIII.3PurificareaprinIMACaproteinelorrecombinatencondiiinative................192
VIII.4PurificareaprinIMACaproteinelorrecombinatencondiiidenaturante.......198
VIII.5Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrareprin
gel(GF)..................................................................................................................200
Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel
..................................................................................................................................206
CalibrareacoloaneideGFicalculareamaselormolare..........................................208
Cuprins
IX
ObinereaanticorpilorpoliclonalifolosindadjuvantulFreund.................................275
XI.2Imunoblotingul..............................................................................................278
Electrotransferulproteinelorpemembranensistemsemiuscat..........................279
Imunodeteciaproteinelortransferatepemembranedenitroceluloz...................282
PREFA
Biologia molecular poate fi definit cel mai simplu ca fiind un
concept de studiere a materiei vii prin prisma relaiei structur-funcie la
nivel molecular. Este un concept ce a revoluionat tiinele biologice i
medicale ncepnd cu a doua jumtate a secolului XX. Dar pe lng noile
cunotine teoretice, revoluia produs de biologia molecular a fost
posibil i datorit introducerii de noi metode i tehnici de laborator.
Toate lucrrile experimentale de biologie molecular implic utilizarea
unor astfel de metode i tehnici. De aici rezult i necesitatea unor cri
care s-i ajute pe cercettori n munca zilnic la masa de laborator
(bench). n Romnia nu cunosc s se fi scris o asemenea carte, care s
descrie toate metodele i tehnicile de biologie molecular la modul practic
de lucru.
Efortul tinerilor colegi Marius Mihan, Marius tefan i Zenovia
Olteanu de a redacta o astfel de carte mi se pare de aceea deosebit de
ludabil i rezultatul este o lucrare de mare valoare.
Merit subliniat c sunt descrise pe de o parte unele tehnici de
baz n laboratorul de biologie molecular (dar i n laboratoarele de
analize biomedicale, de biochimie i chimie clinic, de microbiologie, de
biofizic etc), precum: pregtirea sticlriei i a vaselor de laborator,
msurarea volumelor, a maselor, centrifugarea, tehnicile de baz folosite
pentru manipularea microorganismelor, metodele de determinare a
proteinelor, separarea electroforetic a proteinelor, tehnici de imunologie
(obinerea de anticorpi policlonali, imunodetecia proteinelor transferate
pe membrane de nitroceluloz) etc. Pe de alt parte sunt descrise metode
specifice biologiei moleculare: plasmide i tulpini de Escherichia coli
folosite frecvent n biologia molecular, izolarea ADN-ului, purificarea
proteinelor prin cromatografie de afinitate, metode computaionale de
studiu a proteinelor.
Descrierea metodelor i a tehnicilor este foarte bine fcut, de la
principiile teoretice, avantajele i limitele, pn la descrierea concret a
materialelor necesare i a modului de lucru.
n acest fel cartea este un valoros ghid pentru lucrul n laborator,
att pentru nceptori (studeni, masteranzi, doctoranzi), ct i pentru
avansai (cercettori postdoctorali, cadre didactice din nvmntul
Prefa
XII
INTRODUCERE
Dac biologia clasic s-a dezvoltat i a atins nivelul de cunoatere
de astzi prin folosirea cu precdere a studiilor observaionale, biologia
modern se bazeaz n mod fundamental pe noiunea de experiment i
pe procesul de experimentare n scopul dobndirii de noi informaii i
cunotine. Experimentul are rolul de a verifica validitatea unei ipoteze
formulate n prealabil utiliznd pentru aceasta un ansamblu de tehnici i
metode. Reuita unui experiment, adic formularea fr echivoc a unei
concluzii legate de ipoteza de testat, depinde n mare msur de
capacitatea cercettorului de a concepe un model de studiu, de a alege i
de a utiliza n mod corect una sau mai multe metode de investigaie.
Majoritatea lucrrilor de profil din ultima decad, care descriu
metode i tehnici de laborator utilizate n biochimie, enzimologie,
biologie celular i molecular, au fost realizate cu precdere n scopuri
didactice, fiind utilizate ca suport pentru prelegerile teoretice. Metodele
experimentale sunt reduse frecvent la un set de indicaii simple i clare pe
care studenii s le poat urma cu uurin. Lipsa unor informaii generale
despre principiile teoretice i aplicabilitatea metodelor dau ns o fals
impresie de imuabilitate a protocoalelor experimentale, ceea ce face ca
experimentatorul s fie pus deseori n dificultate atunci cnd trebuie s
adapteze metoda n mod specific.
n acest context, lucrarea de fa se dorete a fi un ghid detaliat al
unor metode-cheie, utilizate frecvent n biologia molecular, concentrndu-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci
i pe explicarea principiilor din spatele fiecrei metode n scopul
precizrii spectrului de aplicabilitate i a rezultatelor scontate. Fiecare din
metodele prezentate au fost testate i utilizate de ctre autori n cadrul
Laboratorului de Biochimie i Biologie Molecular al Facultii de
Biologie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai. Modul de
prezentare este adaptat specificului fiecrei metode n parte, cuprinznd n
general cinci seciuni distincte:
1.
principiul metodei ofer informaii legate de bazele teoretice ale
metodei utilizate;
2.
avantaje furnizeaz informaii legate de domeniul de aplicabilitate al metodei, rezultatele ateptate corelate cu date legate de
sensibilitate, randament etc.;
3.
Tehnici de baz
Tehnici de baz
A
A1
F
A2
C
D
E
FIGURA 1. Pipet mecanic monocanal cu volum variabil.
A buton pentru pipetare cu trei poziii; A1 eticheta pipetei; A2 striaii pentru
manipularea prin rotire a butonului (doar la anumite modele); B ecran i buton
pentru stabilirea volumului msurat; C tij; D prghie pentru detaarea vrfului;
E vrf detaabil din material plastic; F buton de comand pentru detaarea
vrfului(dup Tropschung, 2008) (1).
2.
3.
Tehnici de baz
20
2-20 l
200
20-200 l
1000
200-1000 l
galben
galben
albastru sau
alb
12,5 l
125 l
0,75 ml
Mod de citire
10
1
2
3
Tehnici de baz
11
12
Valva A armare
Valva Ssuciune
10 ml
Pipet
E
Lichid de
msurat
Valva Eevacuare
FIGURA 3. Folosirea parei din cauciuc pentru msurarea unor volume de lichid
folosind pipete din sticl
Tehnici de baz
13
14
Tehnici de baz
15
I.4 Centrifugarea
Procesul care implic utilizarea forelor centrifugale pentru
sedimentarea amestecurilor neomogene poart numele de centrifugare i
se realizeaz cu ajutorul unui dispozitiv numit centrifug. Acionat n
general de un motor electric (dei exist modele care sunt acionate
manual), centrifuga rotete eprubetele de centrifug n jurul unui ax fix,
aplicnd o for perpendicular pe acesta. Datorit acceleraiei centripete
apare fenomenul de sedimentare, substanele mai dense migrnd spre
fundul eprubetei iar cele mai uoare spre gura acesteia. Centrifuga este un
echipament care nu trebuie s lipseasc din dotarea nici unui laborator.
Pentru a descrie corect operaia de centrifugare i pentru a asigura
repetabilitatea ei n orice laborator, este necesar precizarea forei de
cetrifugare (RCF, msurat n g). Aceast for corespunde unei anumite
viteze (n rotaii pe minut, rpm) pentru o centrifug dat i un anumit
rotor. Folosind o alt centrifug sau aceeai centrifug dar cu un alt rotor,
pentru aceeai vitez de rotaie se va obine o alt for de centrifugare.
Relaia care descrie legtura dintre fora de centrifugare i viteza de
rotaie este:
16
Tehnici de baz
17
18
Tehnici de baz
19
20
Filtru HEPA
Filtru HEPA
Filtru HEPA
Perete de
protecie din
sticl
Suprafaa de
lucru
Pre-filtru
Suprafaa de
lucru
Tehnici de baz
21
Tehnici de sterilizare
Desfurarea experimentelor n condiii de asepsie presupune
sterilizarea distrugerea complet sau eliminarea tuturor organismelor
viabile de pe instrumentele sau din reactivii utilizai. Exist i reactivi care
nu necesit sterilizare: etanol, fenol, detergeni concentrai sau reactivi sterili
furnizai de ctre productori i care pot fi utilizai direct.
Exist mai multe tehnici de sterilizare care pot fi folosite cu succes
n laborator, bazate pe utilizarea temperaturilor sau presiunilor ridicate,
22
Tehnici de baz
23
(eprubete, plci Petri, pahare, baloane etc.), metalice sau alte obiecte care nu
se topesc la temperaturi cuprinse ntre 121oC i 180oC cldur uscat.
Deoarece cldura uscat are o putere mai mic de penetrare n celulele vii,
fiind necesar un timp mai mare de transfer, sterilizarea cu ajutorul etuvei se
realizeaz timp de dou ore la temperatura de 160oC sau o or la
temperatura de 180oC. Procedeul nu poate fi utilizat n cazul lichidelor sau
al obiectelor din cauciuc sau material plastic. Cu toate acestea, sterilizarea
cu ajutorul etuvei prezint unele avantaje: nu determin ruginirea obiectelor
metalice; inactiveaz enzimele care degradeaz ARN-ul (ARN-aze)
permind astfel sterilizarea sticlriei folosite n experimentele n care sunt
implicai acizii nucleici; poate fi utilizat pentru sterilizarea pulberilor sau
altor substane afectate de sterilizarea prin autoclavare.
Autoclavarea
Aceast tehnic de sterilizare se bazeaz pe aciunea vaporilor de
ap aflai sub presiune i presupune utilizarea autoclavului. Prin autoclavare
pot fi sterilizate rapid majoritatea obiectelor, mediilor de cultur i
substanelor care nu sunt termolabile. Vasele sau mediile de cultur care
conin solveni, substane chimice volatile sau corozive (fenol, acid
tricloracetic, eteri, cloroform) sau orice fel de izotopi radioactivi nu pot fi
autoclavate sub nicio form.
Autoclavarea se realizeaz la temperatura de 121oC, presiunea de
aproximativ 1 atm, timp de 20-30 minute, condiii care permit distrugerea
tuturor formelor de via, inclusiv a endosporilor bacterieni. Timpul i
temperatura de sterilizare pot varia n funcie de cantitatea i tipul
materialelor care urmeaz a fi autoclavate. Astfel, n anumite situaii
(obiecte cu suprafa care nu permite un transfer termic rapid sau cu o
capacitate mic de penetrare la vaporii de ap, volume de mediu mai mari
de un litru, tuburi de centrifug acoperite cu folie de aluminiu,
microorganisme patogene) se vor crete timpul, temperatura i presiunea de
autoclavare (30-60 min, 134oC, aproximativ 2 atm).
Prin aceast tehnic este posibil sterilizarea unor obiecte din
material plastic, mai precis a celor din polipropilen i policarbonat.
Obiectele din polietilen sau polietilen de nalt densitate nu pot fi
autoclavate. Pentru siguran se urmresc simbolurile de identificare a
materialului prezente pe obiectele respective: PP = polipropilen;
PC = policarbonat; PE = polietilen; HDPE = polietilen de nalt
densitate.
24
Tehnici de baz
25
26
Tehnici de baz
27
Bibliografie
1. Tropschung, M. (2008) Praktikum der Biochemie und Molekular
Biologie I&II, p. 6.
2. Guzy, M. (2008) Weight measurement in Current Protocols Essential
Laboratory Techniques (Gallagher, S., Wiley, E., Eds.), p. 1.2.11.2.11. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.
3. Bykowski, T., Stevenson, B. (2008) Aseptic Techniques in Current
Protocols Essential Laboratory Techniques (Gallagher, S., Wiley,
E., Eds.). John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.
4. Dunca, S., Ailiesei, O., Nimian, E., Stefan, M. (2001) Microbiologie
aplicat, p. 300. Ed. Tehnopress, Iai.
30
31
32
4. DL-aminoacizi 80 g/ml
5. antibiotice (Tabelul 2, pagina 40)
n cele ce urmeaz sunt prezentate reetele unor medii de cultur
minimale folosite cel mai frecvent pentru cultivarea bacteriei E. coli n
laborator.
Mediu M9(stoc concentrat 5X)
Na2HPO4
KH2PO4
NH4Cl
NaCl
CaCl2 (opional)
Ap distilat
30 g
15 g
5g
2,5 g
0,015 g
pn la 1000 ml
5g
22,5 g
52,5 g
2,5 g
pn la 1000 ml
33
100 g
2,5 g
pn la 1000
ml
Tripton
NaCl
Ap distilat
10 g
5g
pn la 1000
ml
Tripton
NaCl
Ap distilat
10 g
8g
pn la 1000
ml
Tripton
Extract de
drojdii
NaCl
Ap distilat
10 g
5g
Bulion-tripton
Mediu H
Mediu LB (Luria-Bertani)
5g
pn la 1000
ml
34
Bulion NZC
N-Z-Amine A
(Sigma)
NaCl
MgCl2 X 6H2O
Ap distilat
10 g
5g
2g
pn la 1000
ml
10 g
5g
5g
2g
1g
pn la 1000 ml
10 g
5g
5g
2g
pn la 1000
ml
Mediu NZM
N-Z-Amine A
(Sigma)
NaCl
10 g
5g
35
MgSO4 x 7H2O
Ap distilat
2g
pn la 1000
ml
Tripton
Extract de drojdii
NaCl
NaOH 1 N
Ap distilat
32 g
20 g
5g
5 ml
pn la 1000
ml
Tripton
Extract de drojdii
NaCl
Ap distilat
20 g
5g
0,5 g
pn la 980
ml
Mediu SB (super-bulion)
Mediu SOB
Tripton
Extract de drojdii
NaCl 1 M
KCl 1 M
Ap distilat
20 g
5g
10 ml
2,5 ml
pn la 980
ml
36
Mediu H
Tripton
NaCl
Agar
Ap distilat
10 g
2,5 g
15 g
pn la 1000 ml
Tripton
NaCl
Agar
Ap distilat
10 g
8g
15 g
pn la 1000 ml
Mediu LB (Luria-Bertani)
Tripton
Extract de
drojdii
NaCl
Agar sau
agaroz
Ap distilat
37
10 g
5g
5g
15 g
pn la 1000 ml
Agar de acoperire
Mediul se utilizeaz pentru a asigura repartiia uniform a fagilor
sau celulelor bacteriene ntr-un strat subire de agar la suprafaa altui
mediu de cultur. ntr-o astfel de aplicaie, agarul topit este amestecat cu
celulele, apoi este turnat deasupra mediului de cultur dintr-o plac Petri
i este lsat s se solidifice. Acest strat de celule se va dezvolta abundent,
formnd o plaj de colonii fuzionate.
Agarul de acoperire conine mai puin agar (0,75%) dect se
adaug n mod obinuit la prepararea mediilor de cultur solide, din acest
motiv poate rmne n stare topit mai multe zile dac este meninut la
temperatura de 45oC. n locul agarului se poate folosi i agaroza atunci
cnd aplicaiile vizeaz extracia direct a ADN-ului din fagii cultivai.
Mediul se prepar n recipiente de 1000 ml, se autoclaveaz timp
de 15 min la presiunea de 1 atm, se rcete la temperatura de 50oC, se
agit pentru omogenizare, se separ n recipiente de 100 ml i se
sterilizeaz, putnd fi ulterior pstrat la temperatura camerei. nainte de
utilizare se topete agarul prin nclzire pe o baie de ap sau ntr-un
cuptor cu microunde, apoi se rcete la temperatura de 45oC i poate fi
turnat n plci Petri.
38
Agar de acoperire H
Tripton
NaCl
Agar
Ap distilat
10 g
8g
7g
pn la 1000 ml
Tripton
Extract de
drojdii
NaCl
Agar
Ap distilat
10 g
5g
5g
7g
pn la 1000 ml
Tripton
NaCl
Agar
Ap distilat
10 g
2,5 g
7g
pn la 1000 ml
Tripton
NaCl
Agaroz
Ap distilat
10 g
8g
6g
pn la 1000 ml
Agar de acoperire LB
Agaroz de acoperire
10 g
5g
6g
10 mg
Tiamin
Ap distilat
39
10 mg
pn la 1000 ml
40
Concentraie
soluie stoc
(mg/ml)
5
Concentraie
soluie de lucru
(g/ml)
15
10 (n H2O)
50
Carbenicilin2
10 (n H2O)
50
Cloramfenicol
6 (n etanol
100%)
30
D-cicloserin3
10 (n 0,1 M
tampot fosfat
de sodiu,
pH=8)
200
Eritromicin
10 (n H2O)
50
Gentamicin
3 (n H2O)
15
Kanamicin
10 (n H2O)
50
Kasugamicin
10 (n H2O)
1000
Acidul nalidixic
(pH pn la 1 cu
NaOH)
Ampicilin (sare
de sodiu)
Mecanism de aciune
Bacteriostatic; inhib sinteza
ADN.
Bactericid; antibiotic lactamic care mpiedic
sinteza peretelui celular prin
inhibarea formrii legturilor
peptidoglicanice.
Acelai mecanism descris
pentru ampicilin.
Bacteriostatic;
mpiedic
sinteza
proteinelor
prin
inhibarea
translaiei
la
nivelul subunitii 50 S a
ribozomului datorit blocrii
reaciei de transpeptidare i
elongare a lanului de
aminoacizi.
Bactericid; inhib sinteza
peretelui
celular
prin
mpiedicarea
formrii
D-alaninei din L-alanin i
formarea
legturilor
peptidice
ce
presupun
D-alanin.
Bacteriostatic; antibiotic din
grupa macrolidelor care se
leag de subunitatea 50 S a
ribozomului
i
inhib
translaia
prin
blocarea
reaciei de transpeptidare.
Bactericid; antibiotic din
grupa aminoglicozidelor care
inhib sinteza proteinelor
prin legarea de subunitatea
30 S a ribozomului.
Bactericid; inhib sinteza
proteinelor.
Bactericid; inhib sinteza
proteinelor prin alterarea
Rifampicin4
Concentraie
soluie stoc
(mg/ml)
Concentraie
soluie de lucru
(g/ml)
20 (n metanol
sau DMSO)
100
Spectinomicin
20 (n H2O)
100
Streptomicin
10 (n H2O)
50
Tetraciclin4
2,5 (n etanol
50%)
12,5
41
Mecanism de aciune
reaciei de metilare a ARN
16 S.
Bactericid; inhib iniierea
transcripiei ARN prin legare
de ARN polimeraz.
Bactericid; antibiotic din
grupa aminoglicozidelor care
inhib sinteza proteinelor
prin legare de subunitatea
30 S a ribozomului.
Bactericid; antibiotic din
grupa aminoglicozidelor care
inhib sinteza proteinelor
prin legare de subunitatea
30 S a ribozomului.
Bacteriostatic; inhib sinteza
proteinelor prin legare de
subunitatea
30
S
a
ribozomului.
Toate antibioticele trebuie pstrate la temperatura de 4oC, cu excepia tetraciclinei care se pstreaz la -20oC.
Carbenicilina poate fi pstrat n soluie 50% etanol/50% ap la temperatura de -20oC.
3
Soluiile de D-cicloserin sunt instabile; din acest motiv trebuie utilizate imediat dup preparare.
4
Antibiotic sensibil la lumin; soluiile stoc se pstreaz la ntuneric.
Bactericid = omoar bacteriile.
Bacteriostatic = inhib creterea i multiplicarea bacteriilor.
2
42
43
Incubare
Striuri
Colonie
izolat
44
plac Petri
catifea steril
inel metalic
45
46
Modul de lucru
1. cu ajutorul unei pipete se introduc cte 5 ml LB n trei eprubete
sterile care se noteaz cu 1, 2 respectiv 3;
2. se transfer 5 l din cultura bacterian n eprubeta 1 i se agit cu
ajutorul unui vortex timp de 5 secunde;
3. se nlocuiete vrful pipetei cu unul steril i se transfer 5 l lichid
din eprubeta 1 n eprubeta 2; se agit timp de 5 secunde folosind
vortexul;
4. se repet pasul 3 pn la obinerea unei serii de diluii n cele trei
eprubete: n eprubeta 1 proba iniial a fost diluat de 1 x 103 ori
(1.000 de ori), n eprubeta 2 de 1 x 106 ori (1.000.000 ori), iar n
eprubeta 3 de 1 x 109 ori.
5. se inoculeaz cte o plac Petri ce conine mediu LB cu cte
100 l din fiecare diluie i se etaleaz;
6. se incubeaz peste noapte la temperatura de 37oC;
7. se numr coloniile dezvoltate, inndu-se cont c n fiecare plac
s-au dezvoltat celulele prezente n 1/10 dintr-un mililitru provenit
din fiecare diluie n parte; prin urmare, pentru a afla numrul de
celule/ml trebuie nmulit numrul de colonii cu 10 i apoi cu
diluia utilizat pentru nsmnare; de exemplu, dac s-au
dezvoltat 69 de colonii din diluia 10-6, numrul de celule/ml va fi:
69 x 10 x 106 sau 6,9 x 108;
8. pentru c fiecare colonie izolat poate fi ulterior folosit, se
recomand pstrarea plcilor la temperatura de 4oC nvelite cu
Parafilm sau folie din plastic.
Pentru obinerea coloniilor izolate se poate utiliza i tehnica
descrierii de striuri prezentat anterior (Figura 7). Metoda este mai uor
de utilizat n comparaie cu cea care presupune obinerea de diluii, ns
nu permite i numrarea celulelor dintr-o cultur. n situaia n care se
dorete obinerea de colonii izolate din mai multe culturi bacteriene se
prefer, din motive practice, mprirea suprafeei unei plci Petri n 4, 6
sau 8 sectoare, inoculndu-se fiecare sector n parte.
47
48
49
Faz
Faz de declin
staionar
Faz
de lag
Timp (ore)
50
Limitri:
Turbiditatea culturii este determinat att de celulele vii, ct i de
cele moarte, respectiv de alte particule prezente n mediul de cultur.
Turbiditatea nu este influenat numai de numrul, ci i de forma,
dimensiunea i compoziia celulelor. n plus celulele bacteriene i pot
schimba forma i dimensiunile n diferite faze ale creterii i n diferite
medii de cultur. Toate aceste motive se pot constitui ca surse de erori la
stabilirea numrului de celule dintr-o cultur bacterian prin folosirea
spectrofotometrului.
Mod de lucru:
Se aduce spectrofotometrul la 0 folosind mediu de cultur steril.
Se msoar densitatea optic a probelor la lungimea de und de 600 nm:
valorile DO finale ar trebui s varieze ntr-un interval optim cuprins ntre
0,1 i 1. n situaia n care densitatea celulelor este prea mare (DO > 1),
pentru msurtori precise este necesar diluarea probelor cu mediu steril,
folosind o rat de diluie zecimal (1/10) pn cnd valorile DO se
ncadreaz n intervalul optim.
n general, se consider c pentru fiecare 0,1 uniti DO corespund
1 x 108 celule/ml. ns este important de reinut faptul c aceasta este doar
o estimare (4),(1). Pentru a determina mai precis numrul de celule
folosind spectrofotometrul este necesar construirea unei curbe standard
utiliznd alte metode de numrare a celulelor mai precise aa cum sunt
observarea folosind camera de numrare sau determinarea numrului de
celule viabile prin cultivare n plci Petri. Dup construirea curbei
standard, DO a culturii poate fi determinat cu ajutorul
spectrofotometrului iar numrul de celule poate fi citit de pe curb.
Deoarece diferitele specii i tulpini bacteriene au celule cu forme i
dimensiuni diferite este necesar ntocmirea de curbe standard pentru
fiecare specie sau tulpin.
51
52
Lamel de sticl
Lam de sticl
Reea de grile
53
Limitri:
Un dezavantaj major al acestei metode const n presupunerea c
fiecare colonie are la origine o celul. n realitate aceast situaie este
rareori valabil, deoarece mai multe celule se pot agrega, ducnd la
formarea unei singure colonii. Din acest motiv se recomand diluarea
probei, utilizarea unui volum mic de inocul i etalarea ct mai corect a
acestuia pe suprafaa mediului de cultur. Un alt dezavantaj este dat de
timpul de incubare, de la momentul inoculrii i pn la momentul
numrrii fiind necesare aproximativ 18-24 ore. n situaia n care este
necesar s se cunoasc densitatea celular a unei culturi bacteriene ntr-un
timp mai scurt se recomand utilizarea celorlalte tehnici de numrare
prezentate anterior.
Mod de lucru:
1.
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Cultur de
E. coli n LB
Fiecare eprubet
conine 9 ml LB
steril
0,1 l
0,1 l
0,1 l
10-3
Etalare
FIGURA 12. Tehnica efecturii diluiilor zecimale
10-4
10-5
54
2.
3.
4.
unde:
UFC = uniti formatoare de colonii (se folosete n
loc de celule/ml);
a = numr mediu al coloniilor dezvoltate dup
nsmnare;
10n = diluie folosit pentru nsmnare (cu semn
schimbat);
V = volum (n ml) de suspensie folosit la nsmnare
Utilizarea acestei tehnici presupune realizarea cu atenie a
diluiilor i nsmnrilor astfel nct s se evite eventualele erori care
pot aprea. Pentru siguran se recomand numrarea coloniilor provenite
prin nsmnarea i incubarea a dou diluii diferite; valoarea final
obinut n cele dou situaii ar trebui s indice concentraii celulare
similare. Rata de cretere a diverselor tulpini de E. coli este diferit, prin
urmare timpul de incubare trebuie ajustat n funcie de fiecare tulpin
utilizat n cadrul experimentelor.
55
56
2.
3.
4.
58
Sursa 1
HindIII
Sursa 2
HindIII
59
Fragmentul ADN
de interes
Digestie cu enzime de restriie
Ligare
Vector recombinat
Transformare
60
2.
3.
4.
61
MCS
Secven
terminatoare
Operator
Promotor
Marker selectabil
ORI
FIGURA 15. Vector plasmidial de expresie tipic
RBS situs-ul de legare a ribozomului; MCS situs multiplu de clonare;
ORI origine de replicare
62
Vectorul pET-21a
vector de clonare i expresie avnd dimensiunea de 5,4kb;
expresia proteinei se induce prin adugarea n mediu a lactozei sau a
unui derivat al acesteia (IPTG);
proteina produs este recombinat avnd la captul N terminal 6 resturi
de histidin i o coad T7; resturile de histidin permit purificarea
proteinei produse prin cromatografie de afinitate pentru metale, iar coada
T7 permite purificarea proteinei prin tehnici imuno-cromatografice.
comercializat de Novagen;
harta situsurilor de restricie este prezentat n Anex, Figura A5.
Vectorul pMAL-c5x
vector de clonare i expresie;
proteina clonat este pus sub controlul promotorului tac, expresia
putnd fi indus prinadugarea n mediu a lactozei sau a unui derivat al
acesteia (IPTG);
proteina produs este fuzionat cu MBP (engl.Maltose Binding
Protein), protein cu afinitate pentru maltoz din E. coli, oferind astfel o
modalitate simpl de purificare prin cromatografie de afinitate
comercializat de NewEngland Biolabs;
harta situsurilor de restricie este prezentat n Anex, Figura A6.
63
64
TABEL 3. Notaii standard pentru cele mai frecvente mutaii i manifestrile lor
fenotipice la tulpini de E. coli cu utilizare n laborator
Notare
Manifestare fenotipic
F'[ ]
rB/K+/-
mB/K+/-
hsdS
hsdR
INV( )
ahpC
ara-14
araD
cycA
dapD
Notare
65
Manifestare fenotipic
diaminopimelat-transferaza care conduce la inactivarea
acesteia; tulpina are nevoie de acid succinic sau lizin i
metionin n mediu pentru a se dezvolta
( )
dam
dcm
deoR
dut1
endA 1
galE
galk
galU
gor
gyrA96
gyrA462
(lac)X74
66
Notare
Manifestare fenotipic
lacIq
sau
lacIQ
lacIQ1
lacY
lacZM15
leuB
lon
malA
mcrA
mcrB
metB
metC
mrr
mtlA
mutS
nupG
vezi deoR
ompT
(P1)
67
Notare
Manifestare fenotipic
(P2)
conine profagul P2
PlysS
proA/B
recA1
recBCD
relA
rha
rnc
rne
codific ribonucleaz E
rpsL
sr1
supE
glnV
supF
tyrT
thi
thyA
Tn10
Tn5
tonA
traD
68
Notare
Manifestare fenotipic
trxB
tsx
ung1
xyl-5
SmR
rezisten la streptomicin
69
asemenea conine gena pentru lizozim din fagul T7, un inhibitor al ARNpolimerazei T7; acesta elimin expresia constitutiv a ARN-polimerazei
T7, aspect extrem de util n clonarea genelor toxice pentru E. coli;
nu poate fi utilizat drept gazd pentru propagarea vectorilor, deoarece
plasmidul deja existent interfer cu izolarea acestora.
TulpinaE. coliDH1
endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17(rK-mK+) -;
derivat din tulpina Hoffman-Berling 1100;
permite transformarea eficient a plasmidelor de dimensiuni mari (4060 kb);
rezistent la acid nalidixic (14).
Tulpina E. coliDH5
F-endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15
(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK+), -;
derivat din tulpina E. coliDH1;
rezistent la acid nalidixic;
una dintre cele mai utilizate gazde pentru vectori.
Tulpina E. coliRosetta(DE3)pLysS
F-ompT hsdSB(RB-mB-) gal dcm (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1
sam7 nin5]) pLysSRARE (CamR);
tulpin derivat din E. coli B ce conine DE3, un profag cu genele
pentru ARN-polimeraza T7 i lacIq;
utilizat n special drept gazd pentru expresia de proteine recombinate
clonate n vectori plasmidiali specifici i puse sub controlul promotorului
bacteriofagului T7; prin adugarea n mediul de cultur a lactozei sau a
unui compus similar cu aceasta (de exemplu IPTG), ARN polimeraza T7
este activat i va duce la transcripia genelor aflate sub controlul
promotorului bacteriofagului T7, supra-exprimandu-le (12);
rezistent la cloramfenicol;
conine plasmidul pLysSRARE; acesta permite utilizarea n E. coli a
codonilor rari AGG, AGA, AUA, CUA, CCC i GGA, deoarece codific
genele ARNt pentru argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT, tyrU,
i thrU;
plasmidul pLysSRARE conine, de asemenea, gena pentru lizozim din
70
71
Bibliografie:
1. Arber, W., Linn, S. (1969) DNA modification and restriction, Annual
Review of Biochemistry,38, 467-500.
2. Roberts, R. J. (2005) How restriction enzymes became the
workhorses of molecular biology, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 102, 5905-8.
3. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. (2010) REBASE--a
database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and
genomes, Nucleic Acids Research, 38, D234-6.
4. Jackson, D. A. (1972) Biochemical Method for Inserting New
Genetic Information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40
DNA Molecules Containing Lambda Phage Genes and the
Galactose Operon of Escherichia coli, Proceedings of the National
Academy of Sciences, 69, 2904-2909.
5. Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W., Helling, R. B. (1973)
Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 70, 3240-4.
6. Lobban, P. (1973) Enzymatic end-to-end joining of DNA molecules,
Journal of Molecular Biology, 78, 453-460.
7. Brown, T. A. (2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An
Introduction (Brown, T., Ed.) 6th ed. Wiley&Blackwell.
8. Durfee, T., Nelson, R., Baldwin, S., Plunkett, G., Burland, V., Mau, B.,
Petrosino, J. F., Qin, X., Muzny, D. M., Ayele, M., Gibbs, R. A.,
Csrgo, B., Psfai, G., Weinstock, G. M., Blattner, F. R. (2008)
The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B:
insights into the biology of a laboratory workhorse, Journal of
Bacteriology, 190, 2597-606.
9. Hanahan, D., Jessee, J., Bloom, F. R. (1991) Plasmid transformation
of Escherichia coli and other bacteria, Methods in Enzymology,
204, 63-113.
10. Ferrndez, A., Garci, J. L., Daz, E. (1997) Genetic characterization
and expression in heterologous hosts of the 3-(3hydroxyphenyl)propionate catabolic pathway of Escherichia coli
K-12, Journal of Bacteriology, 179, 2573-81.
11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F.
(2009) Understanding the differences between genome sequences
72
74
75
76
devenit clasice n biologia molecular: liza alcalin (3) i liza prin fierbere
(4). Acestea se pot utiliza numai pentru plasmidele de dimensiuni mici
(pn la 10 kb), pentru cei de dimensiuni mari utilizndu-se metode mai
puin invazive, precum centrifugarea n gradient de CsCl (8). Sambrook
(7) descrie un numr foarte variat de protocoale pentru prepararea ADNului plasmidial, protocoale ce se pot adapta uor condiiilor i dotrii
existente n orice laborator.
Truse (kit-uri) comerciale disponibile pentru prepararea ADN-ului
plasmidial:
QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen;
Strataprep Plasmid Miniprep Kit, Stratagene;
Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit, Biorad;
Illustra plasmidPrep Mini Spin Kit, Amersham Biosciences.
77
78
Avantaje:
1. separarea moleculelor de ADN dublu catenar nchise, cu
dimensiuni mai mici de 10 kDa; pentru plasmidele de dimensiuni
mai mari se recomand utilizarea altor metode de liz (8);
2. uor de scalat ntre volume de 1 ml (mini-prep) i 1 L (maxi-prep)
mediu de cultur, permind obinerea unor cantiti mari de
ADN-plasmidial;
3. timpul de lucru este de sub o or pentru 12 probe, fiind o metod
mai rapid dect metoda prin fierbere, dar mai lent dect metoda
care folosete litiu (10);
4. randamentul de recuperare tipic este de 3-5 g ADN/ml mediu de
cultur, folosind plasmizi ce se replic n numr mare (precum
Xf3 sau pUC); cantitatea de ADN-plasmidial rezultat depinde de
numrul de copii n care plasmidul exist n celul; pentru
creterea randamentului recuperrii este recomandat s se utilizeze
medii de cultur mbogite (de exemplu Terrific Broth, TB) sau s
se efectueze un tratament cu cloramfenicol a culturilor bacteriene;
cloramfenicolul are capacitatea de a inhiba sinteza de proteine
ceea ce conduce la oprirea diviziunii celulare, dar nu afecteaz
multiplicarea plasmidelor (8); dei acest tratament nu mai este
necesar pentru vectorii plasmidiali moderni, el este totui utilizat
n ideea reducerii balastului proteic.
Limitri:
1. expunerea prelungit la valori mari de pH poate duce la
denaturarea ireversibil (11) sau chiar ruperea catenelor ADN-ului
plasmidial (12);
2. calitatea preparatului depinde de tulpina ce conine plasmidul, cele
mai bune rezultate obinndu-se cu tulpini cu activitate redus a
endonucleazei A care produc puine poliglucide (C600, DH1,
LE392).
79
Materiale necesare:
1. mediu Luria-Bertani (LB) 10 g NaCl, 5 g extract de drojdii i
10 g pepton se dizolv n 800 ml ap, se corecteaz pH-ul la 7 i
se autoclaveaz; mediul steril este stabil la temperatura camerei
timp nelimitat;
2. soluie glucoz-Tris-EDTA (GTE) glucoz 50 mM, Tris 25 mM,
EDTA 10 mM, pH 8; soluia nesteril nu este stabil la
temperatura camerei; dac se prepar cantiti mai mari, soluia se
repartizeaz n flacoane de 100 ml, se sterilizez i se pstreaz la
temperatura de 4oC;
3. soluie Tris-HC1 1 M, pH 8,0; soluia se filtreaz i se
autoclaveaz;
4. soluie EDTA 0,5M se cntrete cantitatea de EDTA i se
dizolv n aproximativ 70% din volumul de ap; se adaug NaOH
solid pn cnd soluia se clarific, dup care se verific pH-ul;
dac este necesar se adaug NaOH pn cnd pH-ul se situeaz n
intervalul
7-8 dup care soluia se filtreaz i se autoclaveaz; se pstreaz la
frigider;
5. soluie tampon TrisCl-EDTA (TE) 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA,
pH 8; pentru prepararea a 100 ml, ntr-un cilindru gradat de
100 ml se introduc 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8,0, 0,2 ml EDTA 0,5 M
i se completeaz la semn cu ap distilat;
6. soluie NaOH/SDS SDS 1% n NaOH 0,2 N,
7. Acetat de potasiu 3 M se prepar prin combinarea a 60 ml acetat
de potasiu 5 M, 11,5 ml acid acetic concentrat, 28,5 ml ap
distilat;
8. etanol 95% i 70%;
9. microeprubete de 1,5 ml;
10. microcentrifug;
11. facultativ: RN-az 10 mg/ml (enzima trebuie s fie lipsit de
activitate DN-azic), concentrator cu vacuum centrifugal
(SpeedVac concentrator, Eppendorf).
80
Mod de lucru:
1. 5 ml mediu LB steril coninnd antibioticul corespunztor se
inoculeaz cu o colonie bacterian purttoare a plasmidului de
interes. Cultura se incubeaz n vederea creterii bacteriei pn la
atingerea fazei staionare, urmnd protocolul specific pentru
microorganismul cu care se lucreaz (pentru E. coli, 37oC, 190 rpm,
peste noapte, ntr-un agitator termostatat).
2. 1,5 ml cultur bacterian se centrifugheaz timp de 20 secunde la
13000 rpm n vederea recuperrii celulelor. Supernatantul reprezentat
de mediul de cultur clar se arunc. Centrifugarea se poate realiza la
temperatura camerei sau la temperatura de 4oC.
3. Depozitul se resuspend n 100 l soluie GTE i se incubeaz timp de
5 minute la temperatura camerei. Dac depozitul nu este complet
resuspendat i dislocat (sunt vizibile fragmente n masa lichidului),
randamentul izolrii scade foarte mult.
4. Se adaug 200 l soluie NaOH/SDS, se amestec prin rsturnarea
microeprubetei i se incubeaz pe ghea timp de 5 minute. Lizatul
obinut trebuie s fie clar.
5. Peste lizat se adaug 150 l soluie acetat de potasiu i se agit imediat
prin rsturnarea microeprubetei. Pentru precipitare complet se
menine microeprubeta pe ghea timp de 5 minute.
6. Precipitatul este colectat pe fundul eprubetei prin centrifugare timp de
3 minute la 13.000rpm.
7. Supernatantul este transferat ntr-o microeprubet nou, se adaug
0,8 ml etanol 95% i se incubeaz timp de 2 minute la temperatura
camerei pentru precipitarea acizilor nucleici.
8. ADN-ul i ARN-ul sunt recuperai prin centrifugare timp de 1 minut la
13.000rpm
9. Supernatantul este nlturat, iar depozitul este resuspendat n etanol
70%. Acizii nucleici sunt recuperai prin centrifugare timp de 1 minut
la
13.000rpm. Aceast etap de splare are rolul de a elimina srurile
precipitate n prima etap.
81
82
Avantaje:
1. metoda este foarte asemntoare cu cea care folosete liza
alcalin, avnd aceleai avantaje i aplicaii;
2. este mai simpl i mai economic dect metoda prin liz alcalin,
necesitnd mai puini reactivi.
Limitri:
1. cantitatea de ADN obinut este, n general, mai mic prin
comparaie cu metoda care folosete liza alcalin;
2. calitatea preparatului depinde de tulpina ce conine plasmidul;
tulpinile derivate de la HB101 sau TG1 au un coninut ridicat de
poliglucide i de aceea este indicat utilizarea metodei prin liz
alcalin(1);
3. observaiile privind cantitatea de ADN recuperat n cazul lizei
alcaline sunt valabile i n cazul lizei prin fierbere.
Materiale necesare:
1. mediu LB 10 g NaCl, 5 g extract de drojdii i 10 g pepton se
dizolv n 1000 ml ap, se corecteaz pH-ul la 7 i se
autoclaveaz; mediul steril este stabil la temperatura camerei timp
nelimitat;
2. soluie Tris-HC1 1 M, pH 8; soluia se filtreaz i se autoclaveaz;
3. soluie NaCl 5 M 29 g NaCl se dizolv ntr-un volum final de
100 ml ap distilat; soluia obinut se filtreaz i se autoclaveaz;
4. soluie EDTA 0,5 M se cntrete cantitatea de EDTA i se
dizolv n aproximativ 70% din volumul de ap; se adaug NaOH
solid pn cnd soluia se clarific, dup care se verific pH-ul;
dac este necesar se adaug NaOH pn cnd pH-ul atinge o
valoare situat n intervalul 7-8, dup care soluia se filtreaz i se
autoclaveaz; soluia obinut se pstreaz la frigider;
5. soluie STET (Sare/Tris/EDTA/Triton X-100) 0,1 M NaCl,
10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, 5% Triton X-100, pH 8; pentru a
83
84
85
Principiul metodei
Celulele bacteriene sunt lizate i proteinele distruse prin aciunea
proteinazei K. Fragmentele din peretele celular, poliglucidele i restul de
proteine sunt precipitate selectiv cu CTAB, iar ADN-ul cu mas
molecular mare este recuperat prin precipitare cu izopropanol.
86
Avantaje:
1. randamentul este n general de 5-20 g/ml cultur bacterian.
Limitri:
1. unul dintre elementele cheie al metodei este coninutul de NaCl,
care nu trebuie s depeasc 0,5 M; dac se depete aceast
concentraie, ADN-ul cromozomial precipit(18);
2. toate operaiile trebuie realizate la temperaturi mai mari de 15oC
deoarece sub aceast temperatur se produce precipitarea CTAB.
Materiale necesare:
1. soluie Tris-HC1 1 M, pH 8 soluia se filtreaz i se
autoclaveaz;
2. soluie EDTA 0,5 M se cntrete cantitatea de EDTA i se
dizolv n aproximativ 70% din volumul de ap; se adaug NaOH
solid pn cnd soluia se clarific, dup care se verific pH-ul;
dac este necesar se adaug NaOH pn cnd pH-ul se ncadreaz
n domeniul 7-8, dup care soluia se filtreaz i se autoclaveaz;
soluia se pstreaz la frigider;
3. soluie tampon TE 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8; pentru a
preparara 100 ml, ntr-un cilindru gradat de 100 ml se introduc
1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M i se completeaz la
semn cu ap distilat;
4. soluie SDS 10% 10 g SDS se dizolv n 90 ml ap distilat;
5. proteinaz K 20 mg/ml 20 mg proteinaz K se dizolv n 1 ml
ap distilat; soluia obinut se repartizeaz n microeprubete,
cte4 L/microeprubet i se pstreaz la temperatura de -20C;
nu se recongeleaz;
6. soluie NaCl 5 M 29 g NaCl se dizolv ntr-un volum final de
100 ml ap distilat;
7. soluie CTAB/NaCl 10% CTAB n NaCl 0,7 M pentru
prepararea a 100 ml soluie, ntr-un cilindru gradat se introduc
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
Limitri:
Materiale necesare:
1.
2.
3.
4.
5.
azot lichid;
mojar cu pistil, rcite la temperatura de -20C;
spatule;
pahare de laborator cu capacitatea de 600 ml;
soluie tampon Tris-HC1 1 M, pH 8; soluia se filtreaz i se
autoclaveaz;
6. soluie EDTA 0,5 M, pH 8 se cntrete cantitatea de EDTA i se
dizolv n aproximativ 70% din volumul necesar de ap; se adaug
NaOH solid pn cnd soluia se clarific, dup care se verific
pH-ul; dac este necesar se adaug NaOH pn cnd pH-ul se
ncadreaz n domeniul 7-8, dup care soluia se filtreaz i se
autoclaveaz; soluia se pstreaz la frigider;
7. soluie tampon TE Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8
pentru prepararea a 100 ml, ntr-un cilindru gradat de 100 ml se
introduc, 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M i se
completeaz la semn cu ap distilat; soluia se autoclaveaz i
este stabil la temperatura camerei timp nelimitat;
98
99
100
101
Limitri:
1. expunerea ndelungat la fenol poate duce la degradarea ADN-ului
(1);
2. toxicitate deosebit a fenolului;
3. timp de procesare a probelor mai mare comparativ cu metodele
bazate pe membrane de siliciu.
Materiale necesare:
1. fenol/cloroform/alcool izoamilic 25:24:1 (v/v/v) (pentru detalii
privind prepararea acestui reactiv,c onsultai protocolul Izolarea
ADN-ului genomic din bacterii, pagina 85)
2. acetat de sodiu 3 M pH 5,2 408 g acetat de sodiu x 3H2O se
dizolv n 800 ml ap distilat; pH-ul se ajusteaz la 5,2 cu acid
acetic 3M i apoi se completeaz balonul cotat la semn, 1000 ml,
cu ap distilat;
3. etanol 100%, rcit;
4. etanol 70%, la temperatura camerei;
5. tampon TE pH 8 Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8;
6. desicator sau concentrator centrifugal (Speedvac sau echivalent).
Mod de lucru:
1. ntr-o microeprubet se pipeteaz soluia care conine ADN-ul de
purificat (un volum cuprins ntre 200 i 400 l) i se adaug un
volum egal de fenol/cloroform/ alcool izoamilic;
2. amestecul se agit energic (prin utilizarea unui vortex) i se
centrifugheaz timp de 15 secunde ntr-o microcentrifug la vitez
maxim; fazele organic i cea apoas trebuie s se separe foarte clar;
uneori, datorit coninutului mare de sare din prob (mai mare de
0,5 M), cele dou faze se pot inversa, faza organic putnd fi uor
identificat datorit culorii galbene; dac separarea ntre faze nu este
102
103
104
Avantaje:
simplitate, rapiditate;
utilitate pentru izolarea fragmentelor mai mari de 500 pb; fragmentele
mai mici se leag practic ireversibil de membran (5).
Limitri:
Materiale necesare:
1. soluie NaI 6 M se introduc 89,93 g NaI ntr-un balon cotat de
100 ml care se aduce la semn cu ap distilat; soluia se filtreaz
prin hrtie de filtru i este stabil pn la 3 luni dac este
meninut la ntuneric i temperatura de 4C;
2. soluie tampon de legare 0,75 g Na2SO3 i 57,3 g clorur de
guanidin se dizolv n 35 ml ap distilat; se completeaz cu ap
distilat pn la 100 ml i se sterilizeaz; soluia este stabil timp
de 3-4 luni la frigider, n sticl brun i nvelit n folie de
aluminiu; dac se observ formarea unui precipitat, soluia nu mai
poate fi utilizat;
3. soluie Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 1,21 g Tris baz se dizolv n
800 ml H2O i se ajusteaz pH-ul la 7,5 cu HCl concentrat; se
completeaz la 1000 ml cu ap distilat; important: pH-ul soluiei
variaz semnificativ cu temperatura (aproximativ 0,028 uniti de
pH/oC) i de aceea este indicat ca stabilirea valorii pH-ului necesar
s se realizeze la temperatura la care se va lucra; deoarece pKa
pentru Tris este 8,08, aceast soluie tampon nu poate fi utilizat
pentru valori de pH mai mici de 7,2 sau peste 9; soluia este
stabil timp nelimitat;
105
106
107
108
109
V. AMPLIFICAREA ENZIMATIC IN
VITRO A ACIZILOR NUCLEICI
Folosind oricare din metodele descrise n capitolul anterior,
purificarea acizilor nucleici din diverse surse devine o sarcin relativ
simpl, ADN-ul obinut putnd fi folosit direct n aplicaii diverse. n
unele cazuri ns, metodele descrise duc la obinerea unor cantiti mici,
inutilizabile de ADN. Un exemplu n acest sens l constituie
disponibilitatea unei cantiti foarte limitate de material biologic sau cnd
coninutul de ADN al acestuia este extrem de redus. n asemenea situaii
se face uz de o alt tehnic deosebit de important n laboratorul de
biologie molecular amplificarea enzimatic in vitro a acizilor nucleici.
Aceast tehnic permite copierea fidel de pn la 105 ori a unei molecule
de ADN dintr-o prob dat (1), realizndu-se astfel o amplificare masiv a
cantitii disponibile de ADN .
Extrem de important este faptul c simultan cu mrirea numrului
de molecule ADN disponibile dintr-o prob, tehnica realizeaz i o izolare
a fragmentelor de ADN care au o secven dat. Tehnicile de purificare
ale ADN-ului total enunate anterior permit obinerea ADN-ului genomic
total (sau plasmidial, dup caz) sub forma unor fragmente de dimensiuni
variabile. Amplificarea enzimatic in vitro a acizilor nucleici permite ns
izolarea unui fragment ADN specific a crui dimensiune i secven pot fi
controlate de ctre cercettor, detaliu esenial n procesul declonare.
n esen, tehnica de amplificarea in vitro a acizilor nucleici
folosete acelai mecanism bazat pe o ADN-polimeraz ADN-dependent
ntlnit i n cazul replicrii in vivo a ADN-ului. Dei principiul i
mecanismul amplificrii in vitro au fost formulate nc din anul 1971 de
Kleppe et al.(2), tehnica n sine a fost descris abia n anul 1986 de dou
echipe de cercettori, Mullis et al.(3) i Saiki et al.(4). Atunci a primit i
numele cu care s-a consacrat: Polymerase Chain Reaction, sauprescurtat
PCR, notaie ce va fi utilizat n cele ce urmeaz.
Metoda presupune folosirea unei polimeraze ADN-dependente i
parcurgerea unui ciclu care implic trei etape desfurate la temperaturi
diferite: 1. denaturarea moleculelor de acizi nucleici; 2. legarea
oligonucleotidelor amors (primer) i 3. sinteza propriu-zis a noilor
molecule de acizi nucleici.
112
113
1. Denaturare
2. Legare
3. Sintez
Un ciclu
PCR complet
ADN-polimeraza extinde
oligonucleotidele amors (primer)
i sintetizeaz noi catene de ADN
114
115
Ciclul 1
Ciclul 2
Ciclul 3
116
117
Aplicaii:
1. izolarea unui fragment specific de ADN dintr-o prob de ADN
genomic; secvena i dimensiunea fragmentului izolat sunt
controlate prin intermediul celor dou oligonucleotide amors
(primer) (Figura 18);
2. amplificarea specific a unor fragmente de pn la 4 kb cuprinse
ntre cele dou oligonucleotide amors (primer); ADN-ul de
amplificat poate fi de orice provenien (animal, vegetal, bacterian
sau viral); moleculele de ARN (ARN total, mesager, viral, de
transfer sau ribozomal) pot funciona ca matri doar dup ce au
fost convertite n aa numitul ADN complementar (ADNc) prin
utilizarea unei revers-transcriptaze (8),(9); n general, n urma unei
reacii PCR se obin 0,25-0,5 g (sau 105 copii) ADN amplificat
(1);
3. oligonucleotidele amors (primer) trebuie s fie perfect
complementare cu secvena de amplificat doar la captul 3`; la
cellalt capt acestea pot conine, de exemplu, situs-uri de
restricie pentru enzime ce vor fi ncorporate n secvena
amplificat;
4. dei n principiu reacia poate avea loc pornind chiar de la o
singur molecul ADN matri, n practic, proba de amplificat
trebuie s conin minimum 105 molecule ADN cu secvena de
amplificat, sau o cantitate de ADN genomic de ordinul
microgramelor.
Limitri:
1. dei permite izolarea unui fragment specific de ADN, acest lucru nu
este echivalent cu purificarea acestuia; metoda nu elimin complet
ADN-ul contaminant dintr-o prob dat ci, prin multiplicarea
extensiv a fragmentului de interes acesta devine predominant; pentru
eliminarea complet a ADN-ului contaminant din prob este necesar
utilizarea unor tehnici suplimentare (electroforez n geluri de
agaroz urmat de izolarea fragmentului de interes din gel);
118
119
Materiale necesare:
1.
120
TABEL 4. Principalele caracteristici ale diverselor tipuri de polimeraze ADNdependente utilizate n PCR
Denumire
comercial
Activitate
Fidelitate
Stabilitate
exonucleazic
termic (timp de
3'-5'
njumtire)
Vitez
de
sintez
(kb/min)
Taq DNA
polymerase
Absent
Foarte
mic
40-60 minute la
95oC
3-10
Fragmentul
Stoffel
Absent
Foarte
mic
21 minute la
97,5oC
Tth DNA
polymerase
Absent
Foarte
mic
1,5
rTth XL
Foarte slab
Redus
UlTma DNA
polymerase
Prezent, dar
slab
Redus
50 minute la
97,5oC
Pfu DNA
polymerase
Prezent
Mare
1140 minute la
95oC
Pfu DNA
polymerase
(Exo-form)
Absent
Foarte
mic
1140 minute la
95oC
Pfu DNA
polymerase
Deep Vent
Prezent
Mare
1380 minute la
95oC
>5
Prezent
Mare
Tbr DNA
polymerase
(Dynazyme)
Absent
Mic
150 minute la 96 C
Platinum Pfx
Prezent
Mare
6-18
Platinum Taq
Absent
Mic
96 minute la 95oC
4-10
Taq Pol
Prezent
Mare
30 minute la 75oC
121
122
Mod de aciune
Concentraie final n
amestecul PCR la care
se manifest efecte
Etanol
Uoar mbuntire la
10%
Uree
Scade Tm*-ul
oligonucleotidelor amors
Uoar mbuntire la
10%, efecte inhibitorii la
1M
DMSO
Scade Tm*-ul
oligonucleotidelor amors
mbuntire la 10%
Formamid
Scade Tm*-ul
oligonucleotidelor
amors; crete
specificitatea amplificrii
mbuntire la 1,5-10%,
efecte inhibitorii la peste
15%
SDS
Glicerol
Scade Tm*-ul
oligonucleotidelor amors
i mrete rezistena la
temeratur a polimerazei
mbuntire la 5-20%
Tween
20/NP40
Tween
20
0,05%(v/v),
0,05%(v/v)
0,01%(v/v)
Albumin
Neutralizeaz muli din
seric bovin compuii ce inhib
amplificarea
10-100 g/ml
Betain
0,5-1 M
0,1NP40
123
Aditiv
Mod de aciune
Concentraie final n
amestecul PCR la care
se manifest efecte
PEG 6000
5-15%
Spermidin
5-15% (w/v)
124
Mod de lucru:
n mod ideal, n vederea diminurii contaminrii cu ADN exogen,
toate operaiile necesare pentru realizarea reaciei de amplificare in vitro a
ADN-ului trebuie realizate ntr-o camer dedicat acestui scop, folosind
reactivi i echipamente rezervate numai pentru PCR. Aceasta este de cele
mai multe ori greu de realizat, dar totui pot fi luate cteva msuri de
prevedere pentru minimizarea contaminrii. Astfel, utilizarea unor reactivi
doar pentru reacia PCR este esenial. Rezervarea unor pipete strict
pentru aceast operaie i utilizarea de vrfuri cu filtru pentru pipete sunt
de asemenea dou msuri ce pot micora nivelul de contaminare.
Utilizarea mnuilor de protecie este obligatorie pe toat perioada
manipulrii reactivilor PCR.
Etapele realizrii unei reacii standard de amplificare in vitro a
ADN-ului sunt:
1. prepararea amestecului de reacie (master mix) prin pipetarea ntr-o
micro-eprubet steril a reactivilor, conform indicaiilor de mai jos;
Cantitate pentru o
prob
Cantitate pentru 10
probe
5 l
5 l
stoc dNTP 10 mM
1 l
10 l
pn la 48 l*
pn la 480 l*
Oligonucleotide
amors (primer)
Ap steril
125
Timp
(min.)
1 Denaturarea
iniial,Hot-Start*
95
2 Denaturare
95
variabil
Etap
3 Legarea
oligonucleotidelor
amors (primer)
4 Sintez
72
Observaii
Temperatura
depinde
de
valoarea temperaturii de
topire (Tm) specifice fiecrei
pereche de oligonucleotide
amors (primer)
dimensiunea fragmentului de
ADN amplificat i de viteza
de sintez a enzimei utilizate;
o bun aproximare a vitezei
de sintez este de 1 kb/min.
72
10
6 Finalizarea reaciei
* etapa de Hot-Start este necesar doar n cazul utilizrii polimerazei Taq; pentru detalii
consultai etapa 6 din protocol
126
127
Adres web
Primer3
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
GeneFisher2
http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de/genefisher2/
Primer3Plus
(13)
http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi
Oligo Calc
(14)
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
PrimerBLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=NcbiHomeAd
128
129
130
131
VI. DETERMINAREA
CONCENTRAIEI ACIZILOR
NUCLEICI N SOLUIE
Determinarea corect a concentraiei de acizi nucleici (ADN sau
ARN) este un aspect esenial pentru buna desfurare a etapelor ulterioare
n cadrul unui experiment ce are n vedere manipularea acestor molecule
(clonare, transformare). Alegerea i utilizarea unei metode de dozare
depinde, n principal, de necesitile specifice ale experimentului,
necesiti exprimate de trei parametri: specificitate, sensibilitate i
prezena compuilor care interfer.
n scopul dozrii acizilor nucleici au fost propuse dou abordri
majore:
dac proba este pur (fr cantiti semnificative de proteine, fenol sau
ali acizi nucleici) metoda ce trebuie utilizat este determinarea direct a
concentraiei prin spectroscopie UV.
dac proba conine cantiti mici de ADN sau cantiti semnificative de
impuriti, concentraia poate fi estimat folosind metode care presupun
cuplarea acizilor nucleici cu diveri derivai, complecii rezultai fiind
evaluai spectrofotometric sau fluorimetric.
134
135
Principiul metodei
Metoda se bazeaz pe capacitatea acizilor nucleici de a absorbi
radiaii UV. Soluia de analizat se dilueaz corespunztor n tampon i se
msoar absorbana la 260 nm. Concentraia de ADN se calculeaz n
funcie de tipul de prob, innd cont c valoarea 1 corespunde unei
concentraii de 50 g/ml ADN dublu-catenar, 40 g/ml ADN (ARN)
monocatenar sau 33 g/ml polinucleotide monocatenare.
Avantaje:
1. simplitate nu sunt necesare dect un spectroforometru UV i
cuve din cuar;
2. costuri reduse practic nu se utilizeaz nici un material consumabil;
3. nu se utilizeaz reactivi toxici i nu se genereaz deeuri toxice;
4. dup determinarea concentraiei, proba se poate recupera i utiliza.
Limitri:
1. poate fi cuantificat numai ADN-ul purificat, lipsit de contaminani;
2. pot fi cuantificate numai soluii concentrate, intervalul de detecie
fiind unul relativ ngust, 1-50 g/ml;
3. valorile nregistrate pot varia mult n funcie de condiiile locale,
n principal de pH-ul i tria ionic a soluiei (4);
4. metoda nu poate face distinie ntre ADN i ARN.
Materiale necesare:
1. soluie tampon TNE 10X Tris baz 100 mM, NaCl 1 M, EDTA
10 mM, pH 7,4: 1,21 g TRIS baz, 0,371 g EDTA i 11,68 g NaCl
se dizolv n 75 ml ap distilat i se corecteaz pH-ul la 7,4 cu
HCl concentrat; se completeaz volumul la 100 ml cu ap distilat
i se pstreaz la temperatura camerei;
136
2.
3.
4.
5.
ADN
dublucatenar:
ADN
dublucatenar:
ADN
monocatenar:
137
ADN
monocatenar:
ARN
monocatenar:
Oligonucleoti
de:
unde: S este mrimea moleculei de ADN n kpb
N reprezint numrul de resturi de adenin
(A), citozin (C), guanin (G) i timin (T)
(Gallagher, 2007 (5)
7. Se estimeaz gradul de puritate al probei de acizi nucleici folosind
raportul A260/A280 i valorile A230 i A325; n general, raportul
A260/A280 trebuie s se situeze n intervalul 1,8-2; valori mai mici
de 1,8 semnaleaz contaminare cu proteine, valori mai mari
semnaleaz contaminare cu fenol sau nucleotide libere; n Tabelul 7
sunt prezentate valori obinuite ale unei probe de ADN pure.
TABEL 7.Valori ale absorbanei unei probe de ADN nalt purificat cu concentraia
25 g/ml n tampon TNE 1X
Lungime de und
(nm)
Absorban
Observaii
325
0,01
valori
mai
mari
semnaleaz
contaminare cu fenol sau uree
280
0,28
260
0,56
230
0,3
138
139
140
141
Mod de lucru:
1. 2 ml soluie bromur de etidiu de lucru se pipeteaz n cuva
fluorimetrului i se fixeaz lungimile de und pentru determinarea
excitaiei la 302 nm (cuv din cuar) sau 546 nm (cuv din sticl)
i emisiei la 590 nm; se stabilete zero pe aparat sau se citete
cantitatea de lumin emis, dup caz;
2. se adaug 2 l soluie ADN standard n cuva din camera
fluorimetrului i se agit fie prin pipetare, fie prin acoperirea cuvei
cu parafilm i rsturnarea ei; se citete i se noteaz cantitatea de
lumin emis la toate probele cu soluie standard, amestecnd
soluia standard de fiecare dat cu soluie de bromur de etidiu de
lucru proaspt;
3. probele de analizat se msoar n aceeai manier ca i probele
standard notndu-se extincia; concentraia final de bromur de
etidiu n cuva de msurare este suficient pentru determinarea unei
concentraii de ADN de pn la 1000 ng/ml; creterea
concentraiei de bromur de etidiu la 10 g/ml va mri spectrul de
aplicabilitate al metodei pn la 10 g/ml ADN; n cei 2 ml soluie
bromur de etidiu de lucru se pot aduga pn la 10 l soluie de
analizat;
4. concentraiile probelor necunoscute se determin cu ajutorul
curbei de etalonare.
142
Avantaje:
1. simplitate deosebit;
2. nu necesit aparatur special;
3. utilizeaz o cantitate minim de reactivi i n consecin
reziduurile periculoase sunt relativ reduse;
4. n loc de soluie de bromur de etidiu se poate folosi colorantul
SYBR Gold (6).
Limitri:
1. nu se poate decela ADN de ARN;
2. precizie mic, aprecierea concentraiei fcndu-se vizual.
Materiale necesare:
1.
2.
3.
4.
Mod de lucru:
1. o bucat de folie din plastic transparent se aeaz pe suprafaa
143
144
Mod de lucru:
Proba de analizat se separ pe gel de agaroz mpreun cu probele
standard cu concentraii cunoscute de ADN, urmnd protocolul descris n
capitolul capitolul VII Separarea electroforetic a ADN-ului, pagina
147). La finalizarea migrrii propriu-zise, gelul se coloreaz (dac este
necesar) n vederea evidenierii fragmentelor de ADN, urmnd unul din
protocoalele prezentate n subcapitolul VII.3 Detecia ADN-ului n
geluri de agaroz, pagina168, dup care se fotografiaz. De pe fotografie
sau prin vizualizare direct se poate aprecia, prin comparaie cu probele
standard, cantitatea de ADN din proba de interes. Pentru acuratee
fotografia obinut poate fi utilizat pentru densitometrare cu ajutorul unei
aplicaii precum ImageJ (8), urmnd paii descrii n cazul gelurilor de
poliacrilamid (subcapitolul X.3 Detectia proteinelor separate prin
electroforeza pe geluri de poliacrilamid, pagina 257).
Bibliografie:
1. Waterborg, J. H., Matthews, H. R. (1984) The Burton Assay for DNA,
Nucleic Acids, 2, 1-3.
2. Sambrook, J. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Sambrook, J., Ed.) third., p. 2.13-2.19. Spring Harbor Laboratory
Press.
3. Stulnig, T. M., Amberger, A. (1994) Exposing contaminating phenol
in nucleic acid preparations., BioTechniques, 16, 402-4.
4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. (1997) Effect of pH
and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic
acid purity., BioTechniques, 22, 474-6, 478-81.
5. Gallagher, S., Wiley, E. (Eds.). (2008) Current Protocols Essential
Laboratory Techniques. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ,
USA.
6. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J.
G., Smith, A. J., Struhl, K. (2002) Short Protocols in Molecular
Biologyed. 5, p 10.1-10.31. John Wiley & Sons.
7. Glick, D., Le Pecq, J.-B. (1971) Use of Ethidium Bromide for
Separation and Determination of Nucleic Acids of Various
145
VII. SEPARAREA
ELECTROFORETIC A ADN-ULUI
Separarea electroforetic a moleculelor de ADN este una din
metodele care au stat la baza dezvoltrii foarte rapide a biologiei
moleculare. Tehnica permite nu numai separarea fragmentelor de ADN, ci
i izolarea, evidenierea i caracterizarea acestora. Rapiditatea metodei,
simplitatea aparaturii utilizate i nu n ultimul rnd rezoluia deosebit au
fcut ca electroforeza s nlocuiasc tehnicile bazate pe ultracentrifugare
n gradient de sucroz (zaharoz) nc din momentul descrierii primelor
protocoale de separare de ctre Thorne (1) i de evideniere a
fragmentelor de ADN de ctre Aaij i Borst (2) i Sharp (3).
Suporturile pentru separarea i evidenierea ADN-ului (agaroza
sau poliacrilamida) pot fi utilizate ntr-un numr foarte variat de sisteme
de separare care difer prin dimensiunea porilor, amplasarea gelului,
prezena diverilor aditivi n gel sau tamponul de separare utilizat.
Alegerea unui anumit sistem depinde, n principal, de dimensiunile
fragmentelor care urmeaz s fie separate.
Poliacrilamida este deosebit de eficient n separarea fragmentelor
de dimensiuni mici, 50 pb-500 pb (4). Rezoluia este foarte bun, putnd
fi separate fragmente ce difer n lungime doar printr-o pereche de baze
(5). Din acest motiv, gelurile de poliacrilamid au fost intens utilizate
pentru reacii de secveniere manual. Acest suport prezint dezavantajul
c este mai dificil de preparat i manipulat, iar fragmentele separate sunt
mai dificil de preluat din gel. Mai multe informaii legate de avantajele i
dezavantajele utilizrii gelurilor de poliacrilamid sunt prezentate n
excelentele manuale de laborator ale lui Sambrook (4) i Ausubel (6).
Utilizarea agarozei duce la micorarea puternic a rezoluiei,
avnd ns avantajul unui cost de exploatare mai mic i a simplitii
deosebite n prepararea i manipularea gelului. Au fost descrise, de
asemenea, numeroase metode de extragere a fragmentului separat din
gelurile de agaroz pentru utilizare n alte aplicaii. Gelul de agaroz este
suportul cel mai frecvent utilizat pentru separarea fragmentelor de ADN.
Sistemul cel mai comun permite separarea de fragmente cu dimensiuni
cuprinse ntre 0,5 kb-25 kb, ns diverse mbuntiri au condus la mrirea
domeniului de uzabilitate pn la fragmente de ordinul mpb.
148
Electroforeza ADN
149
Direcia de migrare
Molecule de ADN
FIGURA 19. Migrarea prin erpuire i nnodarea moleculelor de ADN (dup Reece,
2004 (5)
150
Electroforeza ADN
151
ADN liniar
Direcia de migrare
ADN circular
ADN
supraspiralizat
152
Agaroz standard
Agaroz cu temperatur de
topire sczut
0,5
700 pb -25 kb
0,8
500 pb - 15 kb
800 pb - 10 kb
250 kb - 12 kb
400 pb - 8 kb
1,2
150 pb - 6 kb
300 pb - 7 kb
1.5
80 pb - 4 kb
200 pb - 4 kb
100 pb - 3 kb
50 pb - 1 kb
Electroforeza ADN
153
Principiul metodei
Moleculele de ADN, ncrcate negativ datorit resturilor de fosfat,
plasate ntr-un cmp electric vor migra spre electrodul pozitiv. ntr-un gel
de agaroz viteza de migrare a moleculelor de ADN la aplicarea unui
cmp electric va depinde pe de o parte de sarcina moleculelor i, pe de
alt parte, de dimensiunea moleculelor datorit efectului de sit al gelului.
n acest fel are loc separarea fragmentelor de ADN n funcie de lungimea
lor, respectiv n funcie de masa molecular.
Avantaje:
1. permite separarea fragmentelor de acizi nucleici cu dimensiuni de
pn la 25 kb;
2. este utilizat pentru aprecierea maselor moleculare a fragmentelor
separate, dar i pentru cuantificarea cantitii de ADN;
3. prezint uurin n exploatare, rapiditate i simplitate a
materialelor i reactivilor necesari.
Limitri:
1. nu poate fi utilizat pentru separarea fragmentelor mai mari de
25 kb;
2. prezint rezoluie mai mic dect elecroforeza n geluri de
acrilamid.
Materiale necesare:
1. tampon electroforez TBE 10X, soluie stoc: 109,8 g Tris, 55 g acid
boric, 7,5 g EDTA n 5 L ap distilat;
2. soluie bromur de etidiu 0,5 mg/ml (facultativ, necesar doar n cazul
n care se adaug bromur de etidiu n gel) se dizolv 50 mg bromur de
etidiu n 100 ml ap distilat; soluia se pstreaz la ntuneric timp nelimitat;
154
Electroforeza ADN
155
156
Electroforeza ADN
157
158
Electroforeza ADN
159
Grup
taxonomic
F243
Actinomic
ete
Actinomic
ete
R513GC
Poziia
fragmentelor
ADN 16S
int*
226-243
513-528
Ref.
bibl.
GGATGAGCCCGCGGCCTA
(22)
GC.CGGCCGCGGCTGCTGGCACG
TA
GC.-ACGCGAAGAACCTTAC
(22)
F984GC
Bacteria
968-984
R1378
Bacteria
1378-1401
CGGTGTGTACAAGGCCCGGG
AACG
(22)
F27
Bacteria
8-27
AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTC
AG
(22)
R1492
Bacteria
1492-1513
(22)
F203
Proteobact
eria
174-203
TACGG(C/T)TACCTTGTTACG
ACTT
CCGCATACGCCCTACGGGGG
AAAGATTTAT
F948
Proteobact
eria
Archaea
931-948
CGCACAAGCGGTGGATGA
(23)
344-363
(24)
Archaea
934-915
GC.ACGGGGYGCAGCAGGCGCG
A
GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
FARC34
4 GC
RARC9
15
(22)
(23)
(24)
160
Primer
Grup
taxonomic
Fungi
Poziia
fragmentelor
ADN 16S
int*
20-38
NS1
GTAGTCATATGCTTGTCTC
(25)
FR1 GC
Fungi
1665-1648
GC.-AICCATTCAATCGGTAIT
(25)
Euk1A
REuk51
6 GC
GC.
Eukarya
Eukarya
4-20
563-548
CTGGTTGATCCTGCCAG
GC.-ACCAGACTTGCCCTCC
5'CGCCCGGGGCGCGCCCCGG
GCGGGGCGGGGGCACGGGG
GG-3'
F oligonucleotid amors (primer) forward
R oligonucleotid amors (primer) reverse
*
poziie corespunztoare n genomul bacteriei E. coli
Ref.
bibl.
(26)
(26)
(22)
Materiale necesare:
1. acrilamid, soluie 40% (acrilamid-bisacrilamid 37,5:1): se
cntresc 194,8 g acrilamid i 5,2 g bis-acrilamid i se adaug ap
distilat pn la 500 ml volum final; soluia se pstreaz la temperatura de
4oC.
Acrilamida i bisacrilamida monomere se absorb prin piele
i sunt neurotoxine deosebit de puternice, fiind de asemenea
suspectate de efecte cancerigene. Cntrirea i prepararea
soluiilor se realizeaz cu atenie, manevrarea fcndu-se cu
mnui i purtnd masc de protecie. Dei poliacrilamida
este considerat inofensiv, este indicat ca manipularea
gelurilor s se realizeze tot cu mnui, datorit resturilor de
acrilamid nepolimerizat.
2. uree.
3. formamid deionizat: se introduc 12,5 g rin schimbtoare
de ioni (de exemplu AG 501-X8, Bio-Rad) n 250 ml formamid 100%;
amestecul se agit timp de o or la temperatura camerei; se filtreaz
Electroforeza ADN
161
162
pieptene
cuv
modul
migrare
gel
distanier
controler
temperatur
suport
turnare
gel
FIGURA 21. Elementele componente ale sistemului pentru DGGE TV400 (Scie
Plas)
1. Curarea i asamblarea sistemului de electroforez
Componentele sistemului DGGE (plcile din sticl, cele dou
distaniere, pieptenul) trebuie splate bine cu ap nainte de utilizare. n
cazul plcilor din sticl trebuie ndeprtat orice urm de grsime prin
splare cu ap i spun. Dup uscare, plcile din sticl se cur cu etanol
96% folosind un erveel din hrtie, n scopul ndeprtrii ncrcrii
electrostatice i pentru a asigura omogenitatea gelului. Dei este suficient
curarea plcilor din sticl doar pe o parte, se recomand curarea
ambelor fee. Pentru manipularea plcilor din sticl se recomand purtarea
mnuilor.
Pentru asamblarea sistemului de electroforez n scopul turnrii
gelului se procedeaz n felul urmtor:
1. se aeaz plcile din sticl pe hrtie de filtru curat;
2. distanierele se fixeaz pe prile laterale ale plcii din sticl
mai lungi dup care se suprapune cea de-a doua plac din
sticl, mai scurt;
3. ansamblul astfel rezultat se prinde n modulul de migrare al
gelului i se fixeaz cu ajutorul uruburilor; se ntoarce modulul
pentru a se verifica dac plcile din sticl i distanierele sunt
Electroforeza ADN
163
164
Poliacrilamid
40% (37,5:1) 7,5 ml 7,5 ml
TAE 50X
1 ml
1 ml
Uree
0g
4,2 g
Formamid
0 ml
4 ml
pn la pn la
H2O distilat 50 ml 50 ml
7,5 ml
1 ml
6,3 g
6 ml
pn la
50 ml
70%
Electroforeza ADN
compartiment soluie L
165
pomp peristaltic
tub terminal
mixer de
gradient
agitator magnetic
FIGURA 22. Asamblarea sistemului de turnare a gelurilor n gradient de
concentraie de agent denaturant utilizate n DGGE
3. se oprete pompa peristaltic i se nchide robinetul dintre cele
dou compartimente precum i robinetul final;
4. se introduce tubul terminal ntre cele dou plci din sticl;
5. se introduc 15 ml soluie L n compartimentul din stnga
(Figura 22); se deschide i se nchide robinetul dintre cele
dou compartimente astfel nct o cantitate foarte mic de
soluie L s treac n cellalt compartiment; n acest fel se
mpiedic blocarea cu aer a canalului dintre cele dou
compartimente; se scoate soluia L din compartimentul din
dreapta cu o pipet i apoi se adaug 15 ml soluie H; volumul
soluiilor introduse variaz n funcie de dimensiunile plcilor
din sticl precum i de grosimea distanierelor folosite; n
general, se utilizeaz un volum final al soluiilor H i L care s
permit turnarea gelului pn la distana de 1 cm fa de
pieptenele inserat;
6. se pornete agitatorul magnetic;
7. se adaug soluia APS 10% (40-100 l) i TEMED
166
Electroforeza ADN
167
168
5. Migrarea probelor
Timpul de migrare i tensiunea electric sunt variabile cheie ale
separrii electroforetice. n general, geluri de calitate superioar se obin
folosind timpi mai mari de migrare i valori mai mici ale tensiunii
electrice (16 ore la 100 voli n comparaie cu 3 ore la 250 voli) (20). n
cazul sistemului DGGE TV400 (Scie Plas) se menine constant
temperatura la 60oC i se realizeaz mai nti o migrare timp de 10 minute
la 20 voli, urmat de o migrare de 5 ore la 200 voli.
La final se dezasambleaz modulul de migrare, se scoate cu grij
gelul i se poate trece la etapele de colorare i vizualizare. Dac la
asamblare, pe suprafaa intern a uneia din cele dou plci din sticl, se
ataeaz o folie de celofan, dup migrare gelul poate fi mai uor manipulat.
Electroforeza ADN
169
170
Electroforeza ADN
171
Mod de lucru:
Pentru evidenierea ADN-ului folosind bromura de etidiu, n
condiiile n care colorantul nu este ncorporat n gel, se parcurg
urmtoarele etape:
1. colorare dup finalizarea separrii electroforetice, gelul se
incubeaz sub agitare timp de 30 minute n 100 ml bromur de etidiu
(soluie de lucru);
2. decolorare gelul se menine timp de 30 minute n ap distilat,
sub agitare;
3. vizualizare gelul se amplaseaz pe transiluminator i se
fotografiaz.
Dac bromura de etidiu a fost ncorporat n gel, se poate trece
direct la etapa de vizualizare i fotografiere.
Expunerea pielii i ochilor la radiaii ultraviolet trebuie
redus la minimum, de aceea este obligatorie purtarea
ochelarilor de protecie (protecie complet pentru fa), a
mnuilor i a halatului n cazul n care se lucreaz cu
transiluminator deschis. De asemenea, n timpul
manipulrii gelului este indicat s se reduc timpul de
procesare a acestuia i s se evite atingerea altor suprafee
cu mnuile contaminate. Foarte frecvent sunt contaminate
tastatura computerului sau butoanele sistemului de
achiziie a imaginilor. Dac se urmrete izolarea unui
fragment de ADN din gel, este indicat s se reduc timpul
de expunere a acestuia la radiaii UV, reducndu-se riscul
de apariie a unor mutaii.
172
Mod de lucru:
Utilizarea acestor colorani presupune incubarea gelului dup
migrare n soluii diluate (1:10000) n soluie tampon de migrare timp de
Electroforeza ADN
173
174
Materiale necesare:
1. soluie tampon TAE 0,1X Tris 4 mM pH 8,3 corectat cu acid
acetic, EDTA 0,1 mM;
2. soluie albastru de metilen 0,002% n tampon TAE 0,1X;
3. agitator orbital;
4. transiluminator VIS i/sau sistem de fotografiere.
Mod de lucru:
1. datorit sensibilitii mai reduse, n gel trebuie ncrcat o
cantitate de 2 5 ori mai mare de ADN;
2. electroforeza se desfoar n condiiile obinuite descrise
anterior, pn cnd raportul dintre nivelurile colorantului inferior
i a celui superior indic separarea complet a fragmentelor de
interes;
3. dup ncheierea electroforezei gelul se transfer ntr-o cuv de
colorare coninnd cel puin cinci volume albastru de metilen
0,002% (pentru un gel de 50 ml sunt necesari aproximativ 250 ml
soluie albastru de metilen); se incubeaz la temperatura camerei
timp de 1-4 ore sau peste noapte la temperatura de 4oC;
4. decolorarea se realizeaz n soluie tampon TAE 0,1X, prin agitare
uoar pn se atinge nivelul dorit; tamponul trebuie schimbat cu
unul nou dup fiecare 30-60 minute;
5. gelul se plaseaz pe transiluminator sau pe o suprafa de culoare
alb i se fotografiaz.
Bibliografie:
1. Thorne, H. (1966) Electrophoretic separation of polyoma virus DNA
from host cell DNA, Virology, 29, 234-239.
2. Aaij, C. (1972) The gel electrophoresis of DNA, Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis, 269,
192-200.
Electroforeza ADN
175
176
S., Wiley, E., Eds.), p 00:7.2.1-7.2.20. John Wiley & Sons, Inc.,
Hoboken, NJ, USA.
16. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, p 6.3-6.6. Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
17. Waring, M. J. (1965) Complex formation between ethidium bromide
and nucleic acids, Journal of Molecular Biology, 13, 269-282.
18. LePecq, J. B., Paoletti, C. (1967) A fluorescent complex between
ethidium bromide and nucleic acids. Physical-chemical
characterization., Journal of Molecular Biology, 27, 87-106.
19. Ogden, R. C., Adams, D. A. (1987) Electrophoresis in agarose and
acrylamide gels., Methods in Enzymology, 152, 61-87
20. Green, S.J., Leigh, M.B., Neufeld, J. D. (2009) Denaturing gradient
gel electrophoresis (DGGE) for microbial community analysis, in
Microbiology of Hydrocarbons, Oils, Lipids, and Derived Compounds
(Timmis, K. N., Ed.), p 4137-4158. Springer, Heidelberg, Germany.
21. Muyzer, G., de Waal, E. C., Uitterlinden, A. G. (1993) Profiling of
complex microbial populations by denaturing gradient gel
electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified
genes coding for 16S rRNA., Appl. Envir. Microbiol., 59, 695-700.
22. Muyzer, G., Smalla, K. (1998) Application of denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel
electrophoresis (TGGE) in microbial ecology, Antonie van
Leeuwenhoek. Springer Netherlands.
23. Gomes, N. C. M., Heuer, H., Schnfeld, J., Costa, R., MendonaHagler, L., Smalla, K. (2001) Bacterial diversity of the rhizosphere
of maize (Zea mays) grown in tropical soil studied by temperature
gradient gel electrophoresis, Plant and Soil. Springer Netherlands.
24. Casamayor, E. O., Schafer, H., Baneras, L., Pedros-Alio, C., Muyzer,
G. (2000) Identification of and Spatio-Temporal Differences
between Microbial Assemblages from Two Neighboring Sulfurous
Lakes: Comparison by Microscopy and Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis, Applied and Environmental Microbiology, 66,
499-508.
25. Vainio, E. J., Hantula, J. (2000) Direct analysis of wood-inhabiting
fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified
ribosomal DNA, Mycological Research, 104, 927-936.
26. Dez, B., Pedrs-Ali, C., Marsh, T. L., Massana, R. (2001)
Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to
study the diversity of marine picoeukaryotic assemblages and
comparison of DGGE with other molecular techniques., Applied
and Environmental Microbiology,67, 2942-2951.
178
Metod de purificare
Afinitate fa de amiloz
Glutation S-transferaza
Afinitate fa de glutation
Proteina A
Afinitate fa de IgG
Represorul lac
GBP2
Afinitate fa de galactoz
IMAC3
Poli-Asp
Poli-Arg
Poli-Cys
Strep-tag II
Afinitate
pentru
streptavidin
avidin
sau
1MBPengl.
Maltose-Binding Proteine
GBP engl. Galatose-Binding Protein
3 IMAC cromatografie de afinitate pentru metale imobilizate (engl.
Immobilized Metal Affinity Chromatography)
2
179
180
Protein
Ni-NTA
Matrice
inert
FIGURA 23. Interaciunile dintre partenerii complexului matrice-Ni-NTA-protein
ce stau la baza cromatografiei de afinitate pentru metale imobilizate (IMAC)
Spacer
181
182
183
184
Principiul metodei
Fragmentul ADN este clivat n mod specific cu enzime de
restricie i ligat n vectorul de expresie pH5EX3. Amestecul de ligare
este n continuare folosit pentru transformarea celulelor competente de E.
coli. Celulele ce conin vectorul recombinat sunt selectate pe baza
rezistenei dobndite pentru ampicilin.
Avantaje:
1. clonarea unor fragmente cu dimensiuni de pn la 5 kb;
2. daca genele clonate sunt amplasate n cadrul de citire specific al
plasmidului, ele pot fi exprimate sub forma unor proteine
recombinate cu coada poli-His.
Limitri:
vectorul este utilizabil doar n E. coli; pentru clonare n alte
organisme gazd trebuie selectat un alt vector.
Materiale necesare:
1. vector plasmidial pH6EX3 purificat purificarea se poate
realizare prin utilizarea protocolului specific descris nsubcapitolul
IV.1 Izolarea ADN-ului plasmidial la pagina 75.
2. fragment ADN de clonat acesta trebuie s conin situs-urile de
restricie pentru enzimele de restricie ce urmeaz s fie utilizate;
dac fragmentul a fost izolat prin PCR este necesar purificarea lui
din amestecul de reacie folosind una din metodele descrise n
subcapitolul IV. 4 Izolarea ADN-ului din geluri de agaroz la
pagina 103 sau IV. 3 Purificarea ADN-ului din soluii apoase la
pagina 100;
3. ap distilat steril;
185
Volum
2,5 l
2,5 l
10-20 l
1 l
1 l
pn la 25 l
186
187
188
189
Principiul metodei:
Tulpina purtnd vectorul de expresie recombinat este cultivat
pn n faza de cretere exponenial, dup care se adaug IPTG n mediu
pentru inducerea expresiei genei clonate. Dup patru ore de cultivare,
celulele sunt separate de mediul de cultur prin centrifugare i lizate prin
sonicare. Lizatul celular, alturi de extractul proteic acelular obinut prin
centrifugare sunt apoi analizate prin SDS-PAGE pentru evaluarea
nivelului de solubilitate a proteinei exprimate. Lipsa benzii
corespunztoare proteinei recombinate n extractul proteic acelular indic
faptul c aceasta este insolubil.
Avantaje:
1. permite evaluarea nivelului de supraexpresie a unei proteine
recombinate;
2. permite evaluarea solubilitii unei proteine recombinate n
condiii de cultivare date.
Limitri:
sistemul de detecie descris n metoda prezentat nu este
aplicabil pentru proteine al cror nivel de expresie este extrem de sczut
(proteina recombinat nu este vizibil pe geluri SDS-PAGE); n acest caz
se recomand utilizarea unui alt sistem de detecie de exemplu tehnica
Western-Blot (pentru detalii consultai capitolul XI. Evidenierea
imunologic a proteinelor tehnica Western-Blot, pagina 273).
Materiale necesare:
1. plac Petri coninnd tulpina E. coli BL21 n care a fost introdus
plasmidul pH6EX3 cu gena clonat;
2. mediu LB steril cu ampicilin 50 mg/ml, 2 flacoane Erlenmeyer
190
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Mod de lucru:
1. se inoculeaz cei 10 ml mediu LB care conine ampicilin 50
mg/ml cu o singur colonie de E. coli de pe placa Petri;
2. eprubeta cu mediu inoculat se incubeaz peste noapte la 37oC sub
agitare (190 rpm);
3. 1 ml din cultura bacterian obinut se folosete pentru inocularea
celor dou flacoane Erlenmeyer cu 100 ml mediu LB suplimentat
cu ampicilin 50 mg/ml; flacoanele se incubeaz la 37oC i 190
rpm pn cnd densitatea optic a culturii la 600 nm atinge o
valoare cuprins n intervalul 0,7-1; n general, aceast condiie
este ndeplinit dup 2-3 ore de cultivare;
4. se induce expresia proteinei clonate prin adugarea n unul din
flacoane a 100 l IPTG 1 M; cantitatea de IPTG poate varia, fiind
unul dintre parametrii care trebuie stabilii pentru optimizarea
expresiei; cel de-al doilea flacon rmne neindus i reprezint
controlul procesului de expresie;
191
192
M 1
A
B
193
Avantaje:
Limitri:
1. pentru a mri afinitatea cozii poli-His fa de Ni2+, faza mobil
are un coninut relativ mare de NaCl ceea ce poate duce la
precipitarea unor proteine solubile prin fenomenul de saltingout(23);
2. eluia se realizeaz cu imidazol n concentraii relativ mari
(200-500 mM) ceea ce poate duce la precipitarea proteinei
izolate; de asemenea, imidazolul este un puternic inhibitor al
unor enzime precum monoamin-oxidazele (24); datorit
capacitii sale de absorbie la 280 nm, imidazolul nu permite
msurarea concentraiei proteinelor prin spectrofotometrie
UV-VIS.
Materiale necesare:
1. plac Petri coninnd tulpina E. coli BL21 n care a fost introdus
plasmidul pH6EX3 cu gena clonat;
2. mediu LB steril suplimentat cu ampicilin 50 mg/ml, dou
flacoane Erlenmayer de 5L cu 1000 ml mediu i o eprubet de
50 ml cu 10 ml mediu;
3. IPTG 1 M steril se cntresc 2,38 g IPTG i se dizolv n 10 ml
ap distilat; soluia se sterilizeaz prin filtrare, se mparte n
volume de cte 1 ml i se pstreaz la temperatura de -20oC;
4. soluie tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; pentru
194
195
Volum soluie
imidazol 1 M
(ml)
Volum HEPES
40 mM, NaCl
500 mM, pH
7,4.
(ml)
Volum final
(ml)
10
0,6
59,4
60
40
2,4
57,6
60
80
4,8
55,2
60
200
0,8
9,2
10
500
10
Mod de lucru:
I. Obinerea extractului proteic acelular:
196
197
Soluie
Volum
10 x CV (20 ml)
NaCl 0,5M
NaCl 1 M**
1 x CV (2 ml)
NaOH 1 M
10 x CV (20 ml)
Etanol 70%
10 x CV(20 ml)
Ap distilat
10 x CV (20 ml)
NiCl2 150 mM
4 x CV (8 ml)
11. dup regenerare sau dac rina este nou, aceasta se spal cu un
volum de 10 x CV (20 ml) ap distilat i se echilibreaz cu
aceeai soluie tampon n care au fost resuspendate celulele.
III. Separarea cromatografic propriu-zis:
1. este indicat ca toate operaiile descrise n cele ce urmeaz s fie
realizate la temperatura de 4oC. Dac acest lucru nu este posibil,
soluiile utilizate pentru purificare i cele ce conin proteina de
purificat vor fi meninute pe ghea.
2. extractul proteic acelular se pipeteaz n colonia din plastic, peste
rina Ni-NTA; viteza de curgere prin coloan trebuie s fie redus
i de aceea, dac se utilizeaz o pomp peristaltic, aceasta se
deconecteaz;
3. coloana se spal pentru eliminarea proteinelor legate nespecific
urmnd indicaiile din schema urmtoare:
Soluie
Volum
30 x CV (60 ml)
30 x CV (60 ml)
198
30 x CV (60 ml)
10 x CV (20 ml)
199
200
Mod de lucru:
I. Solubilizarea corpilor de incluziune:
Se urmeaz etapele 1-8 din protocolul anterior. Supernatantul din
ultima etap se arunc, iar depozitul se spal cu n HEPES 40 mM, NaCl
500 mM, Triton X 10% de trei ori. Depozitul obinut dup ultima splare
se resuspend n soluie tampon de denaturare HEPES 40 mM, NaCl
500 mM, guanidin-HCl 6 M. Denaturarea proteinei duce la solubilizarea
corpilor de incluziune. Este indicat ca procesul s se realizeze lent, sub
agitare continu timp de cel puin patru pn la 24 ore. Dup solubilizare,
se centrifugheaz la 14.000rpm, 30 min. Supernatantul obinut conine
proteina recombinat solubilizat.
II. Pregtirea coloanei cromatografice i III. Separarea
cromatografic propriu-zis se realizeaz identic ca i n metodologia
descris pentru IMAC n condiii native, cu observaia c soluia tampon
HEPES 40 mM, NaCl 500 mM pH 7,4 este nlocuit cu soluia tampon
HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, guanidin-HCl 6M n absolut toi
reactivii.
201
202
Injector
Rezervor cu soluie M
faz mobil
C Coloan
Detector
R
Recorder
F
Colector de fracii
FIGURA 25. Sistem cromatografic automat utilizat pentru gel-filtrare (dup Hagel,
2001) (29)
1. rezervor cu soluie reprezentnd faza mobil (M) capacitatea
minim a rezervorului este dat de dimensiunile coloanei
cromatografice, fiind necesar ca acesta s conin suficient faz
203
Productor/Distribuitor
Toyopearl HW 40S
100-10.000
Toso Haas
200-10.000
Toyopearl HW 50S
500-80.000
Toso Haas
Sephacryl S-100 HR
1.000-100.000
Toyopearl HW 55S
1.000-700.000
Toso Haas
3.000-70.000
Sephacryl S-200 HR
5.000-250.000
5.000-5.000.000
10.000-600.000
Sephacryl S-300 HR
10.000-1.500.000
Tip de suport
cromatografic/coloan
Suport cromatografic
204
Tip de suport
cromatografic/coloan
Interval de
aplicabilitate (Da)
Productor/Distribuitor
Sephacryl S-400 HR
20.000-8.000.000
Amersham Pharmacia
Sephacryl S-500 HR
20.000-30.000.000
Toyopearl HW 65S
50.000-5.000.000
Toso Haas
HiLoad Superdex 30
prep grade
200-10.000
TSK SW 2000
500-60.000
Toso Haas
HiLoad Sephacryl
S-100 HR
1.000-100.000
TSK SW 3000
1.000-300.000
Toso Haas
Protein-Pak 60
2.000-30.000
Waters
Superdex 75 HR 10/30
3.000-70,.000
HiLoad Superdex75
prep grade
3.000-70.000
5.000-100.000
Bio-Rad
G2000SWXL
5.000-150.000
Toso Haas
HiLoad Sephacryl
S-200 HR
5.000-250.000
TSK SW 4000
5.000-1.000.000
Toso Haas
Superose 6 HR 10/30
5.000-40.000.000
Protein-Pak 125
10.000-80.000
Waters
Glass GF-250
10.000-250.000
DuPont
10.000-300.000
Bio-Rad
G3000SWXL
10.000-500.000
Toso Haas
Superdex 200 HR
10/30
10.000-600.000
HiLoad Superdex
200 prep grade
10.000-600.000
HiLoad Sephacryl
S-300 HR
10.000-1.500.000
Coloane prempachetate
205
Tip de suport
cromatografic/coloan
Interval de
aplicabilitate (Da)
Productor/Distribuitor
G4000SWXL
20.000-10.000.000
Toso Haas
Glass GF-450
25.000-900.000
DuPont
5.
6.
7.
206
Materiale necesare:
1. soluie tampon HEPES 40 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 pentru
prepararea unui litru de soluie tampon, ntr-un balon cotat de 1000 ml
se dizolv n 500 ml ap distilat 9,52 g HEPES i 5,84 g NaCl; se
ajusteaz pH-ul la 7,4 dup care soluia se aduce la 1000 ml cu ap
distilat; pentru prelungirea duratei de via a coloanei cromatografice
207
Lungime
Debit(ml/min)
Echilibrare coloan
1 CV
600 l
Eluie izocratic
1 CV
208
209
44,8500
440
46,1690
232
48,3200
158
54,5600
67
64,7000
43
80,4980
17.4
96,2200
Kav
Vo*
0,0173325
0,0455979
0,1275953
0,2608410
0,4684363
0,6750329
Blue-dextran-ul are masa molecular de 200000 kDa i a fost utilizat pentru determinarea
volumului liber Vo
210
1000
y =314.44e-4.4433x
kDa
100
10
0,2
Kav
0,4
0,6
0,8
211
5. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. (1975) Metal chelate
affinity chromatography, a new approach to protein fractionation,
Nature, 258, 598-599.
6. Twyman, R. (1999) Advanced Molecular Biology: A Concise
Reference, p 499. BIOS Scientific Publishers.
7. Griffiths, A. J., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart,
W. M. (2000) An Introduction to Genetic Analysis, p 250-375. W.
H. Freeman.
8. Reece, R. J. (2004) Analysis of Genes and Genomes, p 490. Wiley.
9. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott,
M. P., Zipursky, L., Darnell, J. (2003) Molecular Cell Biology, p
361-380. W. H. Freeman.
10. Twyman, R. (1998) Advanced molecular biology: a concise
reference. Bios Scientific Publishers, Oxford UK.
11. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. (2003) NEBcutter: a program to
cleave DNA with restriction enzymes, Nucleic Acids Research, 31,
3688-3691.
12. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, p 1.21-1.53. Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
13. de Boer, H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983) The tac promoter:
a functional hybrid derived from the trp and lac promoters.,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 80, 21-5.
14. Makrides, S. C. (1996) Strategies for achieving high-level expression
of genes in Escherichia coli., Microbiological reviews, 60, 512-38.
15. Gottesman, S. (1996) Proteases and their targets in Escherichia coli.,
Annual review of genetics, 30, 465-506.
16. Higgins, S. J., Hames B.D. (1999) Protein Expression: A Practical
Approach (Practical Approach Series), p 304. Oxford University
Press, USA.
17. Creighton, T. E. (1999) Encyclopedia of Molecular Biology (Wiley
Biotechnology Encyclopedias), p 2878. Wiley-Interscience.
18. Khan, R. H., Rao, K. B., Eshwari, A. N., Totey, S. M., Panda, A. K.
Solubilization of recombinant ovine growth hormone with
retention of native-like secondary structure and its refolding from
the inclusion bodies of Escherichia coli., Biotechnology progress,
14, 722-8.
212
19. Hansen, L. H., Knudsen, S., Sorensen, S. J. (1998) The Effect of the
lacY Gene on the Induction of IPTG Inducible Promoters, Studied
in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens, Current
Microbiology, 36, 341-347.
20. Blackwell, J. R., Horgan, R. (1991) A novel strategy for production
of a highly expressed recombinant protein in an active form, FEBS
Letters, 295, 10-12.
21. Studier, F. W. (2005) Protein production by auto-induction in high
density shaking cultures., Protein expression and purification, 41,
207-34.
22. Mihasan, M., Ungureanu, E., Artenie, V. (2007) Optimum
parameters for overexpression of recombinant protein from tac
promotors on autoinducible medium, Romanian Biotechnological
Lettters, 12, 3473-3482 .
23. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. (1988) A simple salting
out procedure for extracting DNA from human nucleated cells.,
Nucleic acids research, 16, 1215.
24. Ozaita, A., Olmos, G., Boronat, M. A., Lizcano, J. M., Unzeta, M.,
Garca-Sevilla, J. A. (1997) Inhibition of monoamine oxidase A
and B activities by imidazol(ine)/guanidine drugs, nature of the
interaction and distinction from I2-imidazoline receptors in rat
liver., British Journal of Pharmacology, 121, 901-12.
25. Li, M., Su, Z.-G., Janson, J.C. (2004) In vitro protein refolding by
chromatographic procedures., Protein expression and purification,
33, 1-10.
26. Singh, S. M., Panda, A. K. (2005) Solubilization and refolding of
bacterial inclusion body proteins., Journal of bioscience and
bioengineering, 99, 303-10.
27. Tsumoto, K., Ejima, D., Kumagai, I., Arakawa, T. (2003) Practical
considerations in refolding proteins from inclusion bodies, Protein
Expression and Purification, 28, 1-8.
28. Williams, A., Hagel, L. (1999) Column Handbook for Size Exclusion
Chromatography in Column Handbook for Size Exclusion
Chromatography (Chi-san, W., Ed.), p 27-74. Elsevier.
29. Hagel, L. (2001) Gel-filtration chromatography., Current protocols
in protein science, John E. Coligan et al.Chapter 8, Unit 8.3.
30. Scopes, R. (2000) Protein Separation in Encyclopedia of Separation
Science - Level II: Methods and Instrumentation (Wilson, I., Ed.), p
405-410. Academic Press.
213
31. Ranadive S.A., Pipkin J.D., Varia S.A., N. H.C., Barry E.P., Porubcan
M., Unger S.E., McCormick T.J. (1995) Formation, isolation and
identification of oligomers of aztreonam, European Journal of
Pharmaceutical Sciences. Elsevier 3, 11.
32. Dondos, A. (2006) Applicability of the modified universal
calibration of gel permeation chromatography on proteins., Journal
ofchromatography, 1127, 183-6.
IX. DETERMINAREA
CONCENTRAIEI PROTEINELOR
Gradul de reuit al oricrui experiment ce implic lucrul cu
moleculele proteice depinde, de cele mai multe ori, de specificitatea i
sensibilitatea metodelor utilizate pentru cuantificarea proteinelor (1). Pn
la momentul actual au fost descrise numeroase metode de msurare a
concentraiei proteinelor dintr-o soluie, metode ce utilizeaz proprietatea
acestora de a absorbi n domeniul UV, de a participa la reacii de culoare
sau de a ncorpora diferii compui radioactivi. Alegerea metodei de
utilizat depinde, n general, de proprietile moleculei proteice de interes
i de compoziia soluiei tampon n care se afl aceasta.
Proteina de interes sau compoziia probei sunt parametri
importani, deoarece o protein bogat n arginin, spre exemplu, va
reaciona foarte puternic cu reactivul Bradford, ceea ce va duce la
obinerea unei concentraii mari n mod eronat. Pentru aceste proteine este
indicat metoda Lowry sau BCA. De asemenea, o protein bogat n
cistein va conduce la rezultate anormal de mari prin folosirea metodei cu
BCA, metodele Bradford sau Lowry putnd fi utilizate fr nici o
problem.
Compoziia soluiei tampon n care se afl proba de analizat poate
avea o influen foarte mare asupra rezultatelor, prin interferenele pe care
le introduce. De exemplu, metoda Lowry, dei are o sensibilitate foarte
bun, nu permite utilizarea unor compui comuni precum EDTA (acid
diaminotetracetic). Metoda cu BCA este susceptibil la interferene din
partea agenilor reductori, iar reactivul Bradford d reacie de culoare cu
o list lung de detergeni. O prezentare destul de explicit a compuilor
care interfer cu metodele comune de dozare a proteinelor este realizat
de Coligan (1).
Alegerea metodei optime de dozare a proteinelor trebuie, de
asemenea, s in cont de: volumul de prob disponibil, domeniul de
concentraie preconizat, specificitatea dorit i uurina n realizarea
msurtorilor (aparatur disponibil, timp necesar).
216
unde:
,
A absorbana soluiei;
l lungimea drumului parcurs de lumin;
c concentraia soluiei;
coeficientul de absorbie molar a proteinei de interes.
217
218
unde:
c concentraia proteic n mg/ml
A280 absorbana la 280 nm determinat anterior;
M masa molecular a proteinei de interes (Da);
280 coeficientul de absorbie molar (mol-1cm-1);
219
unde:
c concentraia proteic n mg/ml
A280,260 absorbana la 280 nm sau respectiv 260 nm;
Metoda Lowry
Aceast metod a fost una dintre cele mai utilizate tehnici de
dozare a proteinelor, lucru demonstrat de faptul c lucrarea original
publicat de Lowry et al.n 1951 (5) este cea mai citat lucrare din istoria
biochimiei.
220
Principiul metodei
Metoda are la baz dou reacii distincte. Pe de o parte, n condiii
alcaline, ionii Cu2+ reacioneaz cu legturile dipeptidice din componena
proteinelor i formeaz Cu+ n aa numit reacie a biuretului (6). Pe de
alt parte, resturile de triptofan, tirozin i cistein, mpreun cu ionii Cu+
particip la a doua reacie n care reactivul Folin-Cioclteau
(fosfomolibdat i fosfotungstenat) este convertit la un compus de culoare
albastr, care absoarbe n domeniul 500-750 nm. Intensitatea culorii la
660 nm este direct proporional cu cantitatea de protein.
Avantaje:
1.
2.
Limitri:
1. foarte muli dintre reactivii comuni utilizai pentru prepararea
soluiilor tampon interfer cu dezvoltarea culorii (ageni
reductori, ageni chelatani ai cuprului (EDTA), detergeni,
carbohidrai, glicerol, tricin, TRIS, compui cu potasiu, derivai
sulfhidril, majoritatea fenolilor, acid uric, xantin, guanin, ionii
de Mg2+ i Ca2+);
2. intensitatea culorii depinde i de numrul de resturi de tirozin,
triptofan i cistein din proteina de interes;
3. este o metod relativ complicat, datorit reactivilor care trebuie
preparai extemporaneu.
221
Materiale necesare:
1. soluie Na2CO3 2 % n soluie de NaOH 0,1N;
2. soluie CuSO4 x 5H2O 1 %;
3. tartrat de sodiu sau potasiu 2 %;
4. soluie de lucru se prepar extemporaneu prin amestecarea a
50 ml reactiv 1 cu 0,5 ml reactiv 2 i 0,5 ml reactiv 3;
5. reactiv Folin-Cioclteupoate fi achiziionat sub form de soluie
de concentraie 2 N (Sigma-Aldrich) sau poate fi preparat n laborator;
pentru aceasta, se dizolv, ntr-un balon cu fundul rotund prevzut cu
refrigerent ascendent, 20 g Na2WO4 x 2H2O (wolframat de sodiu) i
5 g Na2MoO4(molibdat de sodiu) n 140 ml ap distilat; se adaug
1 ml H3PO4 85 % i 20 ml HCl concentrat i se fierbe moderat
amestecul, sub reflux, timp de aproximativ 10 ore; dup acest interval
de timp se oprete fierberea, se adaug 30 g Li2SO4 i cteva picturi
de Br2, dup care amestecul se mai fierbe timp de aproximativ
15 minute fr refrigerent, pentru a se elimina excesul de brom; dup
rcire, se aduce volumul reactivului la 200 ml cu ap distilat i se
filtreaz; reactivul trebuie s aib culoarea galben (10); nainte de
utilizare, reactivul se dilueaz cu ap distilat;
6. reactiv Folin-Cioclteu diluat se prepar prin diluarea unui ml
reactiv concentrat cu 2 ml ap distilat;
7. soluie standard de albumin seric bovin (BSA) 0,1 mg/ml se
cntresc la balana analitic 10 mg BSA i se transfer cantitativ
ntr-un balon cotat de 100 ml; se dizolv proteina standard n 50 ml
ap distilat, dup care se aduce la semn; dizolvarea se realizeaz cu
atenie, pentru a prentmpina formarea spumei (aceasta conine
protein denaturat i modific concentraia final a soluiei standard)
Mod de lucru:
Un volum de pn la 1 ml prob coninnd 10-100 g protein se
amestec cu 5 ml soluie de lucru. Dac volumul de prob este mai mic de
1 ml se completeaz cu ap distilat pn la 6 ml, dup care se incubeaz
timp de 10 minute la temperatura camerei. Amestecul obinut se trateaz
cu 0,5 ml reactiv Folin-Cioclteu diluat, se agit foarte bine amestecul,
222
Ap distilat
(ml)
0,0
1,0
10
0,1
0,9
20
0,2
0,8
30
0,4
0,6
40
0,6
0,4
60
0,8
0,2
80
1,0
0,0
2.
3.
4.
5.
6.
223
Mod de lucru:
1. se amestec400 l reactiv Lowry cu cel mult 400 l prob;
2. se completeaz volumul pn la 800 l cu ap distilat;
3. amestecul se incubeaz la temperatura camerei timp de cel puin
10 min;
4. se adaug 200 l reactiv Folin-Cioclteu diluat i se agit energic.
Agitarea este necesar deoarece reactivul se descompune repede.
Operaiunea este considerat corect atunci cnd nu se mai observ
gradient de culoare n interiorul microeprubetei;
5. amestecul se incubeaz la temperatura camerei timp de 30 minute.
Culoarea rezultat este relativ stabil pentru perioade de ordinul orelor,
astfel nct, n cazul mai multor probe acestea pot fi spectrofotometrate
la distane de pn n 10 minute una de cealalt.
Cuantificarea probelor se realizeaz la un spectrofotometru VIS
utiliznd cuve din sticl sau plastic la lungimea de und de 660 nm fa de
un control al reactivilor (400 l reactiv Lowry, 400 l ap distilat, 200 l
reactiv Folin-Cioclteu diluat). Dac absorbana la 660 nm este prea mare,
se poate utiliza i lungimea de und 500 nm.
224
Ap distilat
(l)
400
10
20
380
20
40
360
30
60
340
40
80
320
60
120
280
80
160
240
100
200
200
Metoda Bradford
Introdus de Bradford n 1976 (11), metoda se bazeaz, n
principiu, pe legarea direct a colorantului Briliant Blue G250 de resturile
de aminoacizi bazici i aromatici (12). Metoda a devenit deosebit de
popular datorit simplitii, sensibilitii i rapiditii, fiind folosit n
special pentru cuantificarea concentraiei proteinelor din extracte brute
sau n vederea electroforezei.
225
Principiul metodei
Metoda se bazeaz pe proprietatea colorantului Brilliant Blue
G250 de a-i modifica spectrul de absorbie n urma interaciunii cu
resturile de arginin, triptofan, tirozin i fenilalanin din moleculele
proteice. n forma liber, colorantul are un maximum de absorbie la
470 nm (maro). dar prin interaciunea cu proteinele are loc o schimbare a
maximumului de absorbie la 595 nm (albastru), intensitatea culorii fiind
direct proporional cu concentraia proteic.
Avantaje:
1. sensibilitate bun sensibilitatea variaz ntre 1-20 g protein
(micrometoda descris de Coligan et al. 2007 (1) sau 20-140 g
(macrometoda descris de Rosenberg (12)); metoda descris n
cele ce urmeaz are o sensibilitate intermediar;
2. simplitate, rapiditate se utilizeaz un singur reactiv care este
stabil mult timp;
3. numr mai mic de compui care interfer, comparativ cu metoda
Lowry.
Limitri:
1. lipsa de linearitate dintre intensitatea culorii i cantitatea de
protein, care fac necesar acordarea unei atenii deosebite n
realizarea curbelor de etalonare;
2. colorantul format este deosebit de aderent de suprafee i de aceea
este greu de ndeprtat;
3. detergenii frecvent utilizai (Triton, Tween) dau reacii de culoare
cu reactivul Bradford astfel nct prezena lor n soluiile tampon
interfer cu msurtoarea;
4. albumina seric bovin are o reacie de dou ori mai puternic
dect media cu reactivul Bradford (3), de aceea nu este indicat
utilizarea sa pentru construirea curbelor etalon; unii autori
recomand utilizarea lizozimului sau imunoglobulinei G.
226
Materiale necesare:
1. etanol 96 %;
2. H3PO489 %;
3. reactiv Bradford poate fi achiziionat gata preparat de la
furnizori consacrai precum Sigma, Biorad sau Roth; pentru
prepararea n laborator, 10 mg colorant Brilliant Blue G-250 se
dizolv n 10 ml etanol 96 % i 9,8 ml acid fosforic 89 % i se
completeaz cu ap distilat pn la 100 ml; Soluia obinut se
pstreaz la frigider n sticl de culoare brun, fiind stabil cteva
sptmni;
4. NaOH 1 M (opional) se dizolv 4 g NaOH n ap distilat i se
aduce la semn ntr-un balon cotat de 100 ml;
5. soluie standard BSA 0,05 mg/ml se cntresc la balana
analitic 5 mg albumin seric bovin i se transfer cantitativ
ntr-un balon cotat de 100 ml; se dizolv proteina standard n
50 ml ap distilat, dup care se aduce la semn; dizolvarea se
realizeaz cu atenie, pentru a prentmpina formarea spumei.
Mod de lucru:
1. proba, n cantitate de maximum 500 l (400 l n cazul utilizrii
soluiei de NaOH), se pipeteaz ntr-o eprubet curat i uscat;
2. dac este necesar, peste prob se pipeteaz 100 l NaOH 1 M;
soluia are rolul de a prentmpina formarea de precipitat prin
reacia dintre reactivul Bradford i extractul proteic i de a
solubiliza proteinele membranare;
3. peste prob se pipeteaz cantitatea corespunztoare de ap
distilat, pn la un volum final de 500 l;
4. se adaug 1,5 ml reactiv Bradford i se agit imediat;
5. dup 5 minute, se citete absorbana la 595 nm fa de controlul
reactivilor (n care proba este nlocuit cu acelai volum de
tampon de lucru); culoarea este stabil, dar este recomandat ca
citirea extinciilor s se realizeze nu mai trziu de 30 minute de la
introducerea reactivului Bradford n soluia proteic;
227
Ap distilat
(l)
0,0
500
2,5
50
450
5,0
100
400
7,5
150
350
10,0
200
300
12,5
250
250
15,0
300
200
20,0
400
100
228
Materiale necesare:
1.
2.
3.
4.
5.
Mod de lucru:
1. ntr-o microeprubet Eppendorf se pipeteaz maximum 700 l prob
cu un coninut de 2-20 g protein; dac proba are un volum mai mic,
se completeaz cu ap distilat pn la 700 l;
2. peste prob se introduc 100 l NaOH 1 M; adugarea soluiei NaOH
este facultativ, ea avnd rolul de a prentmpina formarea de
precipitat i solubilizarea proteinelor membranare;
3. n amestecul de reacie se adaug 200 l reactiv Bradford;
4. se agit energic microeprubeta, se menine la temperatura camerei
timp de 5 minute dup care se citete extincia la 595 nm fa de un
control al reactivilor (proba este nlocuit de tamponul de lucru);
5. cantitatea de protein se calculeaz n raport cu o curb de etalonare
pentru realizarea creia se pipeteaz n microeprubete curate i uscate
volume de soluie standard BSA 0,05 mg/ml i ap distilat nscrise n
Tabelul 17; n fiecare microeprubet se introduc, n continuare, 200 l
reactiv Bradford i 100 l soluie NaOH; amestecul se agit energic i
se incubeaz la temperatura camerei timp de 5 minute; se citesc
extinciile i se traseaz curba de etalonare, de pe care se vor exprima
prin interpolare concentraiile probelor necunoscute.
229
Ap distilat
(l)
0,0
700
2,5
50
650
5,0
100
600
7,5
150
550
10,0
200
500
12,5
250
450
15,0
300
400
20,0
400
300
230
231
232
Soluie standard
BSA 0,05 mg/ml
(l)
Ap distilat
(l)
0.0
500
2,5
50
450
5,0
100
400
7,5
150
350
10,0
200
300
12,5
250
250
15,0
300
200
20,0
400
100
233
234
BSA
(g)
Soluie standard
BSA 1 mg/ml
(l)
Ap distilat
(l)
100
10
10
90
20
20
80
30
30
70
40
40
60
60
60
40
80
80
20
100
100
235
236
unde:
x cantitatea de protein;
y extincia.
Se poate observa c pentru a determina concentraia n proteine a
unei probe necunscute este necesar rezolvarea unei ecuaii de gradul doi.
Dac valorile se nscriu pe acelai tip de grafic doar c se
inverseaz axele de coordonate n aa fel nct pe axa OY se vor afla
concentraiile de proteine i pe axa OX extinciile corespunztoare, curba
de calibrare polinomial are forma din Figura 27, B i este descris de
ecuaia:
unde:
y concentraia de proteine;
x extincia.
n aceast reprezentare exprimarea concentraiei unei probe
necunoscute se poate realiza direct prin utilizarea formulei, fr a fi
necesar prelucrarea ei.
237
TABEL 20. Valori ale extinciilor utilizate pentru construirea unei curbe de
etalonare folosind micrometoda Bradford cu etalon BSA 0,05 mg/ml
(pentru fiecare concentraie au fost efectuate trei determinri)
BSA
(g)
Soluie standard
BSA 0,05 mg/ml (l)
Ap distilat
(l)
Extincie
0,001
500
0,001
0,003
0,100
40
460
0,095
0,129
0,204
80
420
0,182
0,183
0,256
120
380
0,227
0,234
0,290
160
340
0,281
0,290
10
0,336
200
300
0,315
0,335
0,374
12
14
240
260
0,358
0,359
0,399
280
220
0,379
0,390
0,435
18
360
140
0,436
0,431
0,467
20
400
100
0,464
0,476
238
239
240
X. SEPARAREA ELECTROFORETIC
A PROTEINELOR
Electroforeza este o metod de separare care se bazeaz, n
principiu, pe capacitatea particulelor coloidale sau moleculelor ncrcate
electric de a migra, sub influena unui cmp electric generat de doi
electrozi, n direcia electrodului purttor al sarcinii opuse. Viteza de
migrare depinde n principal de dimensiunea sarcinii electrice i din acest
motiv moleculele cu sarcini diferite vor avea o mobilitate electroforetic
diferit, separndu-se n fracii. n principiu, aceast metod poate fi aplicat tuturor macromoleculelor ncrcate electric, separarea realizndu-se
fie n soluii apoase libere, fie pe medii cu rol stabilizator (plci cu
silicagel, filme, geluri) (1).
n general electroforeza este folosit pentru separarea proteinelor,
peptidelor, glucidelor i acizilor nucleici. Utilitatea acestei metode de
separare se refer, n special, la caracterizarea din punct de vedere
calitativ a unui amestec i aprecierea puritii unui compus. Dac se ine
cont de o serie de precauiuni, tehnica poate fi utilizat i n scopul unor
separri cantitative i preparative. Domeniul n care electroforeza i
gsete cea mai mare aplicabilitate este studiul proteinelor, domeniu
denumit proteomic (termen ce desemneaz ansamblul de tehnici i
metode folosite pentru studiul expresiei, localizrii, structurilor, funciilor
i interaciunii proteinelor, introdus pentru prima dat de Wasinger n anul
1995) (1).
Una dintre primele metode de separare electroforetic a fost pus
la punct de Arne Tiselius n anul 1937 (1). Metoda se refer la separarea
fraciilor proteice n interiorul unui tub de forma literei U plin cu
electrolit, fraciile proteice fiind identificate densitometric. Datorit
sensibilitii reduse a acestei tehnici, s-a preferat dezvoltarea metodelor
care folosesc medii stabilizatoare. Electroforeza pe hrtie, utilizat de
acelai Tiselius n anul 1951 pentru separarea proteinelor din ser (2), a
fost urmat de apariia unor medii suport din ce n ce mai complexe:
acetat de celuloz (Kohn, 1957) (3), amidon (Smithies, 1955) (4), plci de
silica-gel pentru analiza poliglucidelor (Scherz, 1990) (5), agaroz i
poliacrilamid. O prezentare mai detaliat a avantajelor, dezavantajelor i
aplicaiilor acestor medii suport este realizat de ctre Dennison, 1999 (6).
242
Electroforeza proteinelor
243
2.
3.
4.
Principiul metodei
Separare proteinelor n sistemul discontinuu are loc n dou etape,
corespunztoare celor dou geluri:
1. Etapa de concentrare a fraciilor proteice sau etapa de izotachoforez (1)
Probele reprezentate de soluia proteic sunt plasate n gelul de
concentrare, al crui pH este de 6,8. La aceast valoare a pH-ului, glicina
(punctul izoelectric, pI=6,7) este practic lipsit de sarcin electric, iar
244
Electroforeza proteinelor
245
Limitri:
O atenie deosebit n cazul acestui tip de separare trebuie
acordat punctului izoelectric al proteinelor de interes. n sistemul
discontinuu descris nu pot fi separate proteine al cror pI este mai mare
de 6,8 (la pH-ul gelului de concentrare aceste proteine sunt ncrcate
pozitiv i migreaz spre anod) (1). n general, pentru o bun separare,
sistemul tampon folosit trebuie s fie cu dou uniti de pH mai bazic
dect pI-ul proteinelor de separat. O prezentare detaliat a unor alternative
de sisteme tampon de migrare i aplicaiile lor este realizat de
Chrambach i Jovin, 1983 (9).
Acest tip de electroforez nu poate fi utilizat pentru aprecierea
maselor moleculare relative ale proteinelor, deoarece migrarea se
realizeaz i n funcie de sarcinile acestora. Pentru a nltura acest dezavantaj Niepmann (2006) (10) descrie o metod de separare electroforetic
care utilizeaz colorantul Serva Blue G. Acesta ecraneaz sarcinile native
ale proteinelor i confer acestora sarcini negative. Autorul utilizeaz
aceast metod pentru a aprecia gradul de oligomerizare a proteinelor ns
precizeaz c modul de migrare al moleculelor proteice pe gelurile de
poliacrilamid depinde i de forma acestora.
Materiale necesare:
1. soluie stoc de acrilamid se prepar prin dizolvarea a 29 g
acrilamid i 1 g N-N'-metilen-bisacrilamid (puritate pentru
electroforez) n 100 ml ap distilat; se verific pH-ul soluiei
care trebuie s fie mai mic de 7 i se pstreaz n sticle brune, la
ntuneric, la temperatura de 4oC; este indicat, de asemenea, ca
soluia s fie degazificat sub vid, n vederea eliminrii oxigenului
solvit; soluiile preparate n laborator au o durat de via limitat,
deoarece acrilamida i bisacrilamida se dezamineaz i formeaz
acizii corespunztori, procesul fiind catalizat de lumin i alcalii;
Prezena acidului acrilic n soluia de acrilamid duce la
diminuarea rezoluiei i apariia unor benzi difuze. Soluia de
acrilamid preparat n laborator se poate folosi timp de cteva
luni, dup care trebuie refcut (11); soluia stoc de acrilamid
246
Electroforeza proteinelor
247
248
Electroforeza proteinelor
249
dintre cele dou geluri, dup care se aplic 15 mA/gel pn cnd frontul
colorantului atinge limita inferioar a gelului.
Dup finalizarea migrrii, plcile din sticl se scot din cuv, se
aeaz pe o foaie de hrtie de filtru i se desfac cu atenie, n vederea
recuperrii gelului. Acestuia i se marcheaz colul din dreapta jos n
vederea orientrii ulterioare. Gelul este apoi plasat ntr-un vas pentru
colorare. Pericolul ruperii gelului la mutarea lui de pe placa de sticl n
vasul de colorare este mult diminuat dac operaia se realizeaz prin
antrenarea gelului cu un jet de ap dintr-o piset.
10%
8%
6%
1,0
1,3
0,05
0,05
0,004
2,3
1,3
1,3
0,05
0,05
0,003
1,9
Acrilamid 30%
SDS 10%*
APS 10%
TEMED
Ap distilat
Acrilamid 30%
SDS 10%*
APS 10%
TEMED
Ap distilat
3,3
2,5
4,0
0,006
0,1
0,1
2,5
2,7
4,6
0,008
0,1
0,1
2,5
2,0
5,3
3,8
5,0
5,9
0,009
0,15
0,15
3,8
4,0
6,9
0,012
0,15
0,15
3,8
3,0
7,9
10 ml 15 ml
1,7
Acrilamid 30%
2,6
5 ml
5,0
6,7
7,9
0,012
0,2
0,2
5,0
5,3
9,3
0,016
0,2
0,2
5,0
4,0
10,6
20 ml
6,3
8,3
9,9
0,015
0,25
0,25
6,3
6,7
11,5
0,020
0,25
0,25
6,3
5,0
13,2
25 ml
7,5
10,0
11,9
0,018
0,3
0,3
7,5
8,0
13,9
0,024
0,3
0,3
7,5
6,0
15,9
10,0
13,3
15,9
0,024
0,4
0,4
10,0
10,7
18,5
0,032
0,4
0,4
10,0
8,0
21,2
30 ml 40 ml
12,5
16,7
19,8
0,03
0,5
0,5
12,5
13,3
23,2
0,04
0,5
0,5
12,5
10,0
26,5
50 ml
Ap distilat
TABEL 21. Componentele necesare preparrii gelului de separare utilizat n electroforeza nativ sau n SDS -PAGE (dup
Sambrook et al.1989 ) (11)
250
Biologie molecular. Metode experimentale
0,05
0,002
1,6
2,0
1,3
0,05
0,05
0,002
1,1
2,5
1,3
0,05
0,05
0,002
APS 10%
TEMED
Ap distilat
Acrilamid 30%
SDS 10%*
APS 10%
TEMED
Ap distilat
Acrilamid 30%
SDS 10%*
APS 10%
TEMED
0,004
0,1
0,1
2,5
5,0
2,3
0,004
0,1
0,1
2,5
4,0
3,3
0,004
0,1
0,1
0,006
0,15
0,15
3,8
7,5
3,4
0,006
0,15
0,15
3,8
6,0
4,9
0,006
0,15
0,15
10 ml 15 ml
0,008
0,2
0,2
5,0
10,0
4,6
0,008
0,2
0,2
5,0
8,0
6,6
0,008
0,2
0,2
20 ml
0,01
0,25
0,25
6,3
12,5
5,7
0,01
0,25
0,25
6,3
10,0
8,2
0,01
0,25
0,25
25 ml
*component care trebuie eliminat dac se are n vederea realizarea unei electroforeze native
15%
12%
0,05
5 ml
0,012
0,3
0,3
7,5
15,0
6,9
0,012
0,3
0,3
7,5
12,0
9,9
0,012
0,3
0,3
0,016
0,4
0,4
10
20,0
9,2
0,016
0,4
0,4
10,0
16,0
13,2
0,016
0,4
0,4
30 ml 40 ml
0,02
0,5
0,5
12,5
25,0
11,5
0,02
0,5
0,5
20,0
20,0
16,5
0,02
0,5
0,5
50 ml
SDS 10%*
Electroforeza proteinelor
251
0,17
0,13
0,01
0,01
0,001
Acrilamid 30%
Tris 1 M pH 6,8
SDS 10%*
APS 10%
TEMED
0,002
0,02
0,02
0,25
0,33
1,4
2 ml
0,003
0,03
0,03
0,38
0,5
2,1
3 ml
0,004
0,04
0,04
0,5
0,67
2,7
4 ml
0,005
0,05
0,05
0,63
0,83
3,4
5 ml
*component care trebuie eliminat dac se are n vederea realizarea unei electroforeze native
0,68
1 ml
0,006
0,06
0,06
0,75
1,0
4,1
6 ml
0,008
0,08
0,08
1,0
1,3
5,5
8 ml
Ap distilat
Component
0,01
0,1
0,1
1,25
1,7
6,8
10 ml
TABEL 22. Componentele necesare preparrii gelului de concentrare utilizat n electroforeza nativ sau n SDS-PAGE
(dup Sambrook et al.1989) (11)
252
Biologie molecular. Metode experimentale
Electroforeza proteinelor
253
254
Electroforeza proteinelor
255
Materiale necesare:
Se utilizeaz aceleai materiale folosite n cazul electroforezei n
condiii native, la care se adaug:
1. tampon de electroforez Tris-Glicin-SDS (Tris-baz, 25 mM
glicin 250 mM, SDS 0,1%) se prepar prin dizolvarea a 3,02 g
Tris-baz, 18,8 g glicin, 10 ml SDS 10% n 1000 ml ap distilat;
n cazul utilizrii frecvente se pot prepara soluii de pn la 10X
mai concentrate, acestea necesitnd diluare nainte de folosire;
2. soluie 10% SDS; aceasta se prepar prin dizolvarea a 10 g SDS n
90 ml ap distilat; pentru dizolvare complet poate fi necesar
nclzirea; soluia se pstreaz la temperatura camerei;
256
Mod de lucru
A. Turnarea gelului de poliacrilamid
Operaia se realizeaz identic ca n cazul electroforezei n condiii
native, cu observaia c n compoziia gelurilor intr i SDS-ul, urmnd
indicaiile din Tabelul 21 (pagina 250) i Tabelul 22 (pagina252).
Concentraia gelului de separare se alege n funcie de dimensiunea
proteinei de interes, urmnd indicaiile din Tabelul 23. De precizat c
rezoluia n limitele superioar i inferioar este redus.
Tabel 23. Dependena dintre concentraia gelului de separare i masele
proteinelor posibil a fi separate (dup Ausubel, 2002) (16)
Concentraie gel de separare
(%)
60 -200
30-95
10
16-70
12
12-60
15
12-45
B. Pregtirea probelor
Cantitatea de proteine ce pot fi separate pe un gel depinde de
dimensiunile acestuia. Ca punct de reper, pe un gel n format mini, cu
dimensiunile de 8 x 10 cm i grosimea de 0,1 cm se pot separa amestecuri
de proteine cu un coninut de pn la 25-30 g i proteine purificate cu un
coninut de pn la 5 g.
ntr-o microeprubet Eppendorf se repartizeaz 5 l tampon pentru
probe 4X n care se adaug soluia de analizat coninut ntr-un volum X
(de maximum 15 l). Se completeaz amestecul cu 2 l soluie DTT 1 M
i ap distilat pn la volumul final de 20 l, dup care se nclzete la
95oC timp de 5 minute. Dup rcire probele se ncarc cu o sering
Hamilton, n godeurile din gel.
Electroforeza proteinelor
257
258
Sensibilitate
0,3-1 g/band
Observaii
Simpl, tradiional, cu
sensibilitate
redus.
Recomandat
pentru
gelurile SDS-PAGE, dar
poate fi folosit i pentru
gelurile native (n acest caz
proteinele se coloreaz mai
slab i sensibilitatea scade)
Coomassie brilliant
blue G-250 (coloidal)
100 ng/band
Coloraie cu argint
10 ng/band
Coloraie cupric
10-100 ng/band
Coloraie cu Zn
10-100 ng/band
1-8 ng/band
Colorani
luminescenti
SYPRO
.
tip
Electroforeza proteinelor
259
260
Electroforeza proteinelor
261
262
Limitri:
-
Materiale necesare
1. soluie de fixare etanol:acid acetic: ap 30:10:60 (v/v);
2. etanol 30% n ap deionizat (sau bidistilat);
3. soluie stoc AgNO3 20% n ap deionizat (sau bidistilat); se
pstreaz la temperatura camerei, n vase de culoare brun, bine
nchise; nainte de utilizare se prepar o soluie 0,1% prin diluare
cu ap deionizat (sau bidistilat);
4. soluie carbonat de sodiu 2,5%, formaldehid 0,02% se prepar
extemporaneu prin dizolvarea a 2,5 g carbonat de sodiu i
0,054 ml formaldehid 37% n 97,48 ml ap deionizat (sau
bidistilat);
Vaporii de formaldehid sunt toxici, motiv pentru care
soluia trebuie pregtit sub ni.
5. soluie de stopare acid acetic 1% n ap deionizat (sau
bidistilat)
6. agitator orbital de laborator;
7. vas pentru colorare;
Eventual, dup caz sunt sunt necesare de asemenea i:
Electroforeza proteinelor
263
264
Electroforeza proteinelor
265
266
Electroforeza proteinelor
267
268
C
FIGURA 29. Interfaa de utilizare a programului ImageJ.
Electroforeza proteinelor
269
FIGURA 30. Rezultate tipice obinute prin densitometrarea unui gel SDS-PAGE
(A) i trasarea curbei de etalonare (B).
Utiliznd dreapta de etalonare obinut din ariile probelor 3, 4 i 5 se
poate calcula cantitatea de protein din proba necunoscut (proba 2,
mg protein = (5513,820 - 27.94)/688.59 = 7,96 mg.
Pentru aprecierea masei moleculare relative este necesar migrarea
n paralel a unor proteine cu mas molecular cunoscut (n cazul gelului
din Figura 28, godeul 1, Sigma Wide Range Protein Markers). Etapele
care trebuie parcurse sunt identice cu cele folosite pentru aprecierea
concentraiei pn la punctul 3, dup care se procedeaz astfel:
1. se nchide fereastra coninnd densitograma i se rspunde da la
ntrebarea dac se dorete salvarea imaginii; din meniul File se
selecteaz comanda Open i se indic calea ctre imaginea salvat;
2. se selecteaz Straight line selections i cu ajutorul cursorului,
innd tasta Shift apsat se traseaz o linie orizontal de la captul
din stnga al densitogramei pn la vrful peak-ului de interes;
3. se apas Ctrl+M (sau se acceseaz meniul Analyze Measure)
pentru a msura distana marcat; se va deschide o fereastr care
ne arat rezultatul msurtorii (lungimea poriunii marcate i
unghiul); Valoarea unghiului trebuie s fie zero la toate msurtorile;
4. etapele 7 i 8 se repet pentru toate fraciunile (peak-urile)
standard i pentru prob; se msoar de asemenea distana de la
captul din stnga al desitogramei pn la peak-ul corespunztor
frontului colorantului (sau pn la captul din dreapta, dac
colorantul nu este vizibil); rezultatele obinute pot fi salvate n
format .cvs i importate n Microsoft Excel; se mparte distana
obinut pentru fiecare peak la distana corespunztoare
270
Electroforeza proteinelor
271
274
Western-blot
275
3.
4.
5.
6.
276
Modul de lucru
1. nainte de prima imunizare se practic sngerarea animalului i se
colecteaz snge n tuburi de centrifug de 50 ml; pentru obinerea serului
sanguin pre-imun se procedeaz dup cum urmeaz:
se las tuburile de centrifug ce conin sngele recoltat 4 ore la
temperatura camerei pn la coagulare, apoi se pstreaz peste noapte la
4oC.
se deprind cu atenie cheagurile de pe pereii tubului de centrifug
i se ndeprteaz cu ajutorul unui aplicator de lemn;
se transfer serul ntr-un tub de centrifug curat;
se centrifugheaz 10 minute la 4000 rpm i 4oC i se pstreaz
supernatantul;
se stocheaz serul n alicote la -20oC (unele seruri i pierd
activitatea prin cicluri succesive congelare-decongelare; altele sunt
instabile la 4oC).
Serul preimun este utilizat ca un control pentru a avea certitudinea
c anticorpii detectai la sngerrile ulterioare se datoreaz imunizrii i
nu unui contact anterior al animalului cu antigenul (element extrem de
important n special dac proteina de imunizat provine de la bacterii
potenial patogene).
2. se agit adjuvantul Freund complet pentru dispersia celulelor
inactivate de Mycobacterium tuberculosis; se adaug 2 ml din adjuvantul
Freund complet n 2 ml soluie ce conine 0,25-0,5 mg protein-antigen;
aceste volume sunt suficiente pentru imunizarea a 4 iepuri sau 80 de
oareci (1);
3. amestecul adjuvant Freund complet protein este introdus ntr-o
sering de 3 ml, nlturndu-se excesul de aer; cu ajutorul unui conector
se leag aceast sering de o alt sering steril de volum asemntor;
dispozitivul obinut se utilizeaz pentru omogenizarea amestecului
adjuvant Freund complet protein care este forat s treac dintr-o
sering n alta n mod repetat; cnd amestecul este omogen i alb se
deconecteaz dispozitivul i se verific stabilitatea emulsiei obinute prin
depunerea unei picturi la suprafaa apei, dintr-un pahar Berzelius: o
emulsie bun va rmne la suprafaa apei sub forma unei picturi; dac
pictura disperseaz pe suprafaa apei se repet operaiunea de
Western-blot
277
278
XI.2 Imunobloting-ul
Tehnicile de imunobloting sau Western bloting-ul se utilizeaz n
scopul identificrii unor proteine recunoscute specific de anticorpi
monoclonali sau policlonali. Termenul de Western bloting a fost folosit
pentru prima dat de Burnette (5) cu referire la metoda imobilizrii
proteinelor pe membrane dezvoltat de Towbin i colab (6).
n scopul identificrii, proteinele sunt separate electroforetic
folosind SDS-PAGE (pentru detalii consultai capitolul X Separarea
electroforetic a proteinelor, pagina 241), dup care sunt transferate pe
membrane de nitroceluloz, nailon sau difluorur de poliviniliden.
Proteinele transferate se leag de suprafaa membranei utilizate, furniznd
suprafaa de reacie cu reactivii de imunodetecie.
Imuno-detecia propriu-zis const n tratarea membranei cu un
anticorp primar care se leag specific de proteina de interes. Situsurile de
legare rmase libere sunt apoi blocate prin imersarea membranei ntr-o
soluie ce conine un agent de blocare (o protein sau un detergent inert
din punct de vedere imunologic). Membrana este splat i apoi tratat cu
un anticorp secundar anti-IgG ce se va lega de anticorpul primar.
Anticorpul secundar este modificat n mod specific, n sensul c este
cuplat cu o enzim ce poate genera n prezena unui substrat cromogen,
produs colorat ce marcheaz prezena proteinei de interes.
O variant mai simpl de imunobloting este reprezentat de dot
blot. n acest caz proteinele de interes nu mai sunt separate electroforetic,
ci sunt depuse direct pe membran sub forma unui spot. Dot blot-ul este o
tehnic preliminar folosit pentru identificarea antigenului ntr-o prob.
Western-blot
279
Plac anod
Anod
FIGURA 31. Schema sistemului de electrotransfer semi-uscat al proteinelor pe
membrane
280
Principiul metodei
Identificarea unei proteine prin imunobloting se bazeaz pe reacia
specific antigen-anticorp. Proteinele separate electroforetic sunt
transferate de pe geluri pe membrane datorit proprietii lor de a migra n
cmpurile electrice n funcie de ncrcarea lor. Ulterior membranele sunt
incubate n prezena unui anticorp primar care se leag specific de
proteina de interes. Anticorpul primar ofer situsuri de recunoatere
pentru un anticorp secundar care este cuplat cu o enzim ce permite
vizualizarea uoar printr-o reacie cromogen.
Avantaje:
Tehnicile de imunobloting se utilizeaz n principal pentru studiul
expresiei, purificrii i modificrilor proteinelor avnd numeroase
aplicaii n cercetare i diagnosticul clinic (8). Dei iniial a fost folosit
doar pentru identificarea unor proteine din amestecuri migrate
electroforetic, ulterior imunobloting-ul a fost combinat cu electroforeza
bidimensional i spectrometria de mas permind studiul isoformelor cu
reactivitate ncruciat ale aceleai proteine rezultate prin modificri posttranslaionale sau clivaje proteolitice (9).
Aplicaiile n diagnosticul de laborator se bazeaz pe identificarea
unor antigene de natur proteic asociate cu diferii patogeni, alergeni sau
tumori, folosind ca surs de anticorpi primari serul pacientului.
Limitri:
Metoda se bazeaz pe reacia specific dintre un anticorp i
proteina corespunztoare. Deoarece pe parcursul electroforezei proteinele
sufer un proces de denaturare, recunoaterea acestora de ctre anticorpii
specifici poate avea de suferit. Din acest motiv eficiena unui anumit
anticorp de a se lega specific de proteina corespunztoare trebuie
determinat mai nti empiric. Frecvent anticorpii diponibili comercial
sunt caracterizai de productori din punctul de vedere al eficienei lor n
diferite aplicaii (Western blot, imunoprecipitare).
Western-blot
281
Materiale necesare:
1. gel SDS-PAGE pe care a fost separat amestecul proteic
2. membran de transfer din nitroceluloz (0,45 m); se manipuleaz
doar cu mnui.
3. tampon transfer: 25 mM TRIS-HCl, 150 mM glicin, 0,02% SDS,
20% (v/v) metanol; nu se ajusteaz pH-ul, acesta fiind 8,2-8,4;
4. hrtie Watmann
Modul de lucru:
Separarea electroforetic
Prima etap const n separarea amestecului de proteine folosind
electroforeza SDS-PAGE, ceea ce permite o ordonare a proteinelor n
funcie de masele moleculare (Pentru detalii privind realizarea acestei
etape consultai capitolul X Separarea electroforetic a proteinelor,
pagina 241).
Electro-transferul proteinei de interes pe membrane de nitroceluloz
1. se aeaz 4 foi de hrtie de filtru saturate cu soluie tampon de
transfer peste placa anod;
2. peste acestea se aeaz membrana de nitroceluloz echilibrat n
prealabil 5 minute n soluie tampon de transfer; se ndeprteaz
bulele de aer cu ajutorul unei eprubete care se ruleaz peste
ansamblul format din hrtia de filtru i membrana de
nitroceluloz;
3. se aeaz gelul de poliacrilamid peste membran; se ruleaz cu
grij eprubeta peste gel pentru ndeprtarea eventualelor bule de
aer i asigurarea un contact intim ntre aceasta i membran;
4. se adaug 4 foi de hrtie de filtru saturate cu soluie tampon de
transfer peste gel i se ndeprteaz bulele de aer; deasupra se
amplaseaz placa catod, iar ntreg ansamblul format se strnge cu
ajutorul unor uruburi;
5. se conecteaz aparatul la o surs de electroforez i se realizeaz
electro-transferul timp de o or la 250 mA;
282
Western-blot
283
2.
3.
4.
5.
284
6.
7.
8.
9.
286
Metode computaionale
287
288
A
FIGURA 33. Utilizarea SMS pentru a realiza translarea secvenei de nucleotide a
genei orf388 n secven de aminoacizi
A funcii selectabile n SMS conform Tabelului 27, B csu text n care a fost
inserat secvena genei orf388 n format FASTA
Descriere
Metode computaionale
Denumire
operaie*
289
Descriere
EMBL to FASTA
Filter DNA
Filter Protein
GenBank to
FASTA
One to Three
Analiza secvenelor
Codon Plot
Codon Usage
DNA Molecular
Weight
DNA Stats
290
Denumire
operaie*
Descriere
PCR Products
Protein Isoelectric
Point
Protein Molecular
Weight
Protein Stats
Translate
Reverse Translate
Metode computaionale
291
Site web
Dimensiune *
http://www.insdc.org/
DDBJ
http://www.ddbj.nig.ac.jp
135.440.924 secvene
Aceste baze de date sunt
292
Baz de date
Site web
Dimensiune *
EMBL
Nucleotide
Sequence
Database
http://www.ebi.ac.uk/embl/
GenBank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
genbank/
European
Nucleotide
Archive
(ENA)
http://www.ebi.ac.uk/ena/
KEGG
http://www.genome.jp/kegg/
7.913.359 secvene
nr
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
17.919.084 secvene
UniProtKB/ http://www.uniprot.org/
Swiss-Prot
535.698 secvene
UniProtKB/ http://www.uniprot.org/
TrEMBL
21.552.793 secvene
http://www.ebi.ac.uk/pdbe/
PDBj
http://www.pdbj.org/
BMRB
http://www.bmrb.wisc.edu/
80.850 secvene
Aceste baze de date sunt
sincronizate
ntre
ele
alctuind wwPDB; conin
aceleai intrri
BRENDA
http://www.brendaenzymes.org/
ReLiBase
http://relibase.ccdc.cam.ac.uk Conine
* n Aprilie 2012.
Metode computaionale
293
294
Metode computaionale
295
296
Metode computaionale
297
Principiul metodei
ProgramulBLAST identific, dintr-o baz de date, secvenele
similare cu o secven int. Aceste secvene poart numele de secvene
subiect iar identificarea lor se bazeaz pe aa numitele alinieri locale.
Dup identificarea tuturor secvenelor subiect din baza de date,
programul BLAST cuantific nivelul de similaritate dintre acestea i
secvena int realiznd un clasament.
O aliniere local const dintr-o pereche de secvene de aceeai
dimensiune ntre care exist potrivire perfect. Cu ajutorul unui algoritm
special (Smith-Waterman modificat) (14) programul BLAST identific
rapid poriunile din secvena int i secvena subiect, realizeaz
alinierile locale i pornind de aici suprapune cele dou secvene de
dimensiuni diferite. n acest fel, secvenele comparate vor fi alctuite din
zone perfect aliniate i zone nealiniate (aa numitele GAPs) care
formeaz bucle ntre o aliniere local i urmtoarea aliniere local.
Pentru a cuantifica gradul de similaritate dintre dou secvene,
programul calculeaz un punctaj care are la baz diverse tipuri de matrici
de substituie. Cel mai frecvent utilizate sunt matrici de tip PAM (15) sau
de tip BLOSUM62 (16)(Figura 35), ambele tipuri fiind construite
inndu-se cont de observaiile experimentale legate de frecvena cu care
un aminoacid este nlocuit de un alt aminoacid. n general, matricele PAM
sunt utilizate pentru compararea unor secvene apropiate evolutiv, n timp
ce matricele de tip BLOSUM au o utilizare mai general.
Evenimentele mutaionale pot duce nu doar la schimbarea unui
aminoacid din secven, dar i la inserarea sau deleia unuia sau mai
multor aminoacizi. n acest caz dou fragmente adiacente de pe o
secven se ntlnesc i pe cealalt, ntre ele interpunndu-se o alt
secven n care o baz nu are corespondent pe cealalt, aceast secven
reprezentnd o pereche aminoacid-nimic. O asemenea potrivire
aminoacid-nimic poart numele de GAP. Punctajul pentru GAP este
negativ. Deoarece se pot insera sau terge unul sau mai muli aminoacizi,
nu intereseaz foarte mult dimensiunea spaiului (GAP), ci doar existena
lui.
298
Substituie
GAP
Metode computaionale
299
300
Metode computaionale
301
Mod de lucru:
1. se copie secvena proteinei de interes n format FASTA; pentru
exemplificare vom investiga rolul proteinei necunoscute ORF388depe
megaplasmidul pAO1 din Arthrobacter nicotinovorans (2);secvena de
aminoacizi a fost obinut din secvena de nucleotide a genei codificatoare
folosind suita de programe SMS (pentru detalii consultapitolul XII.1
Fiiere FASTA i operaii simple cu secvene, pagina 286) sau informaia
poate fi descrcat direct din GenBank, indicativul CAD47898.1;
secvena de aminoacizi a fost editat i a fost formatat pentru a respecta
standardul FASTA (Figura 37);
302
Metode computaionale
303
C
D
FIGURA 38. Pagina NCBI de accesare i stabilire a parametrilor unei investigaii
BLAST.
A csua text n care a fost inserat secvena de aminoacizi a proteinei ORF388 n
format FASTA; B zona cu parametrii utilizai pentru restrngerea spaiului de cutare;
C buton pentru lansarea investigrii; D zona cu parametrii algoritmului de cutare
304
Metode computaionale
305
E
FIGURA 39. Pagin cu rezultate ale unei interogri BLAST.
306
e.
Metode computaionale
307
308
C
FIGURA 40. Evaluarea utilitii rezultatelor BLAST pe baza referinelor
bibliografice.
A secvena YP_002488236.1, nepublicat n reviste de specialitate; B secvena
YP_002541450, publicat ntr-un articol ce raporteaz secvenierea genomului a trei
specii de Agrobacterium; C secvena 2GLX_A publicat ntr-un articol care descrie
structura teriar a ,5-anhidro-D-fructoz-reductaza NADP+ dependent din Sinorhizobium
morelense.
Metode computaionale
309
310
Metode computaionale
311
312
Comentarii
(51)
(52)
(53)
www.biocomp.chem.uw.edu.pl/servi
ces.php
http://foldx.crg.es/
www.salilab.org/modeller/
http://swift.cmbi.ru.nl/whatif
http://biskit.pasteur.fr/
Program comercial
Fold-X
Modeller
What If
Biskit
Ref.
bibl.
Adres web
CABS
MC
Programe independente
Nume
TABEL 27. Instrumente utilizate frecvent pentru modelarea structurii tridimensionale a proteinelor
Metode computaionale
313
Comentarii
Adres web
ESyPred3D
Geno3D
Swiss-Modell
(41)
(42)
(43)
http://www.fundp.ac.be/sciences/bio
logie/urbm/bioinfo/esypred/
http://geno3d-pbil.ibcp.fr
http://swissmodel.expasy.org/
3D-PSSM
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpss
(44)
(40)
(39)
Ref.
bibl.
www.bmm.icnet.uk/~3djigsaw/
http://supfam.org/SUPERFAMILY/
3D-JIGSAW
CM
Servere
SUPERFAMILY
Nume
314
Biologie molecular. Metode experimentale
Phyre
(48)
(49)
(50)
http://www.cs.bgu.ac.il/~dfischer/pr
edictprotein/submit_meta.html
http://meta.bioinfo.pl/submit_wizar
d.pl
http://robetta.bakerlab.org/
3D-JURY
Robetta
Meta-PP
(47)
GeneSilico
(45)
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/
http://zhanglab.ccmb.med.umich.ed
u/LOMETS/
(46)
(45)
Ref.
bibl.
http://modbase.compbio.ucsf.edu/m
odloop/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/
m/index2.html
Adres web
www.genesilico.pl/meta2/
Lomets
Metaservere
modificat/dezvoltat.
Comentarii
ModLoop
Ab-initio
Phyre
Nume
Metode computaionale
315
316
Metode computaionale
317
318
Metode computaionale
319
(88)
http://www.biosolveit.de/Flex
X/
CR, FL
FlexX
Dock 6
HADDock
(89)
(63)
(87)
Glide
products/14/5/
(86)
Ref.
bibl.
Observaii
Pagin web
AutoDock 4
Programe
Program/Server Tipuri de
andocare*
320
Biologie molecular. Metode experimentale
(73)
http://www.molegro.com/mvd
-product.php
http://www.sdsc.edu/CCMS/D
OT/
DOT
CR, PP
(74)
(72)
CR, AN
http://hex.loria.fr/
HEX Protein
docking
(91)
ICM
(90)
oducts/life_sciences/gold/
Ref.
bibl.
GOLD
Observaii
autorului un acord de utilizare; nu are interfa
grafic; programul este disponibil sub forma unei
colecii de scripturi
Pagin web
experimental
e pentru a
mri
acurateea
Program/Server Tipuri de
andocare*
Metode computaionale
321
Pagin web
http://zdock.bu.edu/
Dezvoltat n special pentru andocare proteinprotein, poate utiliza direct fiiere .pdb
http://simbiodasys.ca
FL, AN
eHiTs
Servere
(78)
http://fitted.ca/
FL, FR
Fitted
(80)
(79)
(77)
http://gemdock.life.nctu.edu.t
w/dock/
FL, FR
(76)
GEMDOCK
disponibil
http://dockvision.com/
(75)
Ref.
bibl.
FL, AD
Observaii
DockVison
Program/Server Tipuri de
andocare*
322
Biologie molecular. Metode experimentale
* CR andocare cu corpuri rigide, FL andocare cu liganzi flexibili, FR andocare cu receptor flexibl, AN andocare
nedirecionat, AD andocare direcionat, PP andocare proteinprotein
DockBlaster
(84)
http://hexserver.loria.fr
CR
Hex Server
(83)
http://rosettadock.graylab.jhu.
edu
CR, FL, PP
RosettaDock
Server
http://vakser.bioinformatics.k
u.edu/resources/gramm/gram
mx
LB, BD, PP
GRAMM-X
(85)
(82)
(81)
http://cluspro.bu.edu
Ref.
bibl.
Observaii
Pagin web
Program/Server Tipuri de
andocare*
Metode computaionale
323
324
Metode computaionale
325
326
Bibliografie:
1. Xu, D. (2009) Computational methods for protein sequence
comparison and search., Current protocols in protein science,
Chapter 2, Unit2.1.
2. Igloi, G. L., Brandsch, R. (2003) Sequence of the 165-kilobase
catabolic plasmid pAO1 from Arthrobacter nicotinovorans and
identification of a pAO1-dependent nicotine uptake system, J
Bacteriol, 185, 1976-1986.
3. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E.
W. (2011) GenBank, Nucleic Acids Research, 39, D32-7.
4. Bairoch, A., Apweiler, R. (1999) The SWISS-PROT protein sequence
data bank and its supplement TrEMBL in 1999., Nucleic Acids
Research, 27, 49-54.
5. Rodriguez-Tome, P., Stoehr, P. J., Graham, N. C., Flores, T. P. (1996)
The European Bioinformatics Institute (EBI) databases, Nucleic
Acids Research, 24, 6-12.
6. Barker, W. C., George, D. G., Mewes, H. W., Tsugita, A. (1992) The
PIR-International Protein Sequence Database., Nucleic Acids
Research, 20 Suppl, 2023-6.
7. Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Nakamura, H., Markley, J. L. (2012)
The Protein Data Bank at 40: Reflecting on the Past to Prepare for
the Future, Structure, 20, 391-396.
8. Bernstein, F. C., Koetzle, T. F., Williams, G. J., Meyer, E. F., Brice, M.
D., Rodgers, J. R., Kennard, O., Shimanouchi, T., Tasumi, M.
(1977) The Protein Data Bank: a computer-based archival file for
macromolecular structures., Journal of Molecular Biology, 112,
53542.
9. Bourne, P. E., Berman, H. M., McMahon, B., Watenpaugh, K. D.,
Westbrook, J. D., Fitzgerald, P. M. D. (1997) Macromolecular
Crystallography Part B, Methods in Enzymology, 277, 571-590.
10. Sayle, R. A., and Milner-White, E. J. (1995) RASMOL:
biomolecular graphics for all., Trends in biochemical sciences, 20,
374.
11. Doolittle, R. F. (1981) Similar amino acid sequences: chance or
common ancestry?, Science, 214, 149-59.
Metode computaionale
327
12. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J.
(1990) Basic local alignment search tool, Journal of Molecular
Biology, 215, 403-10.
13. Pizzi, E., Attimonelli, M., Liuni, S., Frontali, C., Saccone, C. (1992)
A simple method for global sequence comparison., Nucleic Acids
Research, 20, 131-6.
14. Smith, T. F., Waterman, M. S. (1981) Identification of common
molecular subsequences., Journal of Molecular Biology, 147, 1957.
15. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) A model of
evolutionary change in proteins, Atlas of protein sequence and
structure, 5, 345-352.
16. Henikoff, S., Henikoff, J. G. (1992) Amino acid substitution matrices
from protein blocks., Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 89, 10915-9.
17. McGinnis, S., Madden, T. L. (2004) BLAST: at the core of a
powerful and diverse set of sequence analysis tools., Nucleic Acids
Research, 32, W20-5.
18. Berman, H., Westbrook, J., Feng, Y., Gilliand, G., Bhat, T., Weissig,
H., Shindyalov, I., Bourne, P. (2000) The Protein Data Bank,
Nucleic Acids Res, 28, 235-242.
19. Rost, B. (1999) Twilight zone of protein sequence alignments.,
Protein engineering, 12, 85-94.
20. Sayers, E. W., Barrett, T., Benson, D. A., Bolton, E., Bryant, S. H.,
Canese, K., Chetvernin, V., Church, D. M., Dicuccio, M.,
Federhen, S., Feolo, M., Geer, L. Y., Helmberg, W., Kapustin, Y.,
Landsman, D., Lipman, D. J., Lu, Z., Madden, T. L., Madej, T.,
Maglott, D. R., Marchler-Bauer, A., Miller, V., Mizrachi, I., Ostell,
J., Panchenko, A., Pruitt, K. D., Schuler, G. D., Sequeira, E.,
Sherry, S. T., Shumway, M., Sirotkin, K., Slotta, D., Souvorov, A.,
Starchenko, G., Tatusova, T. A., Wagner, L., Wang, Y., John Wilbur,
W., Yaschenko, E., Ye, J. (2010) Database resources of the
National Center for Biotechnology Information., Nucleic acids
Research, 38, D5-16.
21. Madden, T. (2002) The BLAST Sequence Analysis Tool in The
NCBI Handbook (McEntyre, J., Ostell, J., Eds.). National Center
for Biotechnology Information (US).
22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers,
E. W. (2010) GenBank, Nucleic Acids Research, 38, D46-51.
328
23. Dutta, S., Burkhardt, K., Young, J., Swaminathan, G. J., Matsuura, T.,
Henrick, K., Nakamura, H., Berman, H. M. (2009) Data
deposition and annotation at the worldwide protein data bank.,
Molecular Biotechnology, 42, 1-13.
24. Anfinsen, C. B. (1973) Principles that govern the folding of protein
chains., Science, 181, 223-30.
25. Kolata, G. (1986)Trying to crack the second half of the genetic code.,
Science, 233, 1037-9.
26. Fiser, A. (2004) Protein structure modeling in the proteomics era.,
Expert review of proteomics, 1, 97-110.
27. Lesk, A. (1980) How different amino acid sequences determine
similar protein structures: The structure and evolutionary dynamics
of the globins, Journal of Molecular Biology, 136, 225-230.
28. Floudas, C. A. (2007) Computational methods in protein structure
prediction., Biotechnology and Bioengineering, 97, 207-13.
29. Xiang, Z. (2006) Advances in homology protein structure modeling.,
Current Protein & Peptide Science, 7, 217-27.
30. Kopp, J., Schwede, T. (2004) Automated protein structure homology
modeling: a progress report., Pharmacogenomics, 5, 405-16.
31. Zhang, Y. (2009) Protein structure prediction: when is it useful?,
Current Opinion In Structural Biology, 19, 145-55.
32. Vitkup, D., Melamud, E., Moult, J., Sander, C. (2001) Completeness
in structural genomics., Nature structural biology, 8, 559-66.
33. Floudas, C. A., Fung, H. K., McAllister, S. R., Mnnigmann, M.,
Rajgaria, R. (2006)Advances in protein structure prediction and
de novo protein design: A review, Chemical Engineering Science,
61, 966-988.
34. Zhang, Y., Skolnick, J. (2005) The protein structure prediction
problem could be solved using the current PDB library.,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 102, 1029-34.
35. Mihan, M. (2010) Basic protein structure prediction for the
biologist: A review, Archives of Biological Sciences, 62, 857-871.
36. Ring, C. S. (1993) Structure-Based Inhibitor Design by Using
Protein Models for the Development of Antiparasitic Agents,
Proceedings of the National Academy of Sciences, 90, 3583-3587.
37. Vernal, J., Fiser, A., Sali, A., Mller, M., Cazzulo, J. J., Nowicki, C.
(2002) Probing the specificity of a trypanosomal aromatic alpha-
Metode computaionale
329
330
50. Chivian, D., Kim, D. E., Malmstrm, L., Bradley, P., Robertson, T.,
Murphy, P., Strauss, C. E. M., Bonneau, R., Rohl, C. A., Baker, D.
(2003) Automated prediction of CASP-5 structures using the
Robetta server., Proteins, 53, 524-33.
51. Kolinski, A. (2004) Protein modeling and structure prediction with a
reduced representation, Acta Biochimica Polonica, 51, 349-371.
52. Schymkowitz, J., Borg, J., Stricher, F., Nys, R., Rousseau, F., Serrano,
L. (2005) The FoldX web server: an online force field., Nucleic
Acids Research, 33, W382-8.
53. Fiser, A., Sali, A. (2003) Modeller: generation and refinement of
homology-based protein structure models., Methods in enzymology,
374, 461-91.
54. Ritchie, D. W. (2008) Recent progress and future directions in
protein-protein docking., Current Protein & Peptide Science, 9, 1-15.
55. B-Rao, C., Subramanian, J., Sharma, S. D. (2009) Managing protein
flexibility in docking and its applications., Drug Discovery Today,
14, 394-400.
56. Sousa, S. F., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. (2006) Protein-ligand
docking: current status and future challenges., Proteins, 65, 15-26.
57. Halperin, I., Ma, B., Wolfson, H., Nussinov, R. (2002) Principles of
docking: An overview of search algorithms and a guide to scoring
functions., Proteins, 47, 409-43.
58. Plewczynski, D., aniewski, M., Augustyniak, R., Ginalski, K.
(2011) Can we trust docking results? Evaluation of seven
commonly used programs on PDBbind database., Journal Of
Computational Chemistry, 32, 742-55.
59. Huang, N., Shoichet, B. K., Irwin, J. J. (2006) Benchmarking sets for
molecular docking., Journal Of Medicinal Chemistry, 49, 6789-801.
60. Huang, S.-Y., Zou, X. (2010) Advances and challenges in proteinligand docking., International Journal of Molecular Sciences, 11,
3016-34.
61. Huang, S.-Y., Grinter, S. Z., Zou, X. (2010) Scoring functions and
their evaluation methods for protein-ligand docking: recent
advances and future directions., Physical Chemistry Chemical
Physics: PCCP,12, 12899-908.
62. Dias, R., de Azevedo, W. F. (2008) Molecular docking algorithms.,
Current Drug Targets, 9, 1040-7.
Metode computaionale
331
63. Kuntz, I. D., Blaney, J. M., Oatley, S. J., Langridge, R., Ferrin, T. E.
(1982)A geometric approach to macromolecule-ligand
interactions., Journal Of Molecular Biology, 161, 269-88.
64. Wang, Q., Pang, Y.P. (2007) Preference of Small Molecules for Local
Minimum Conformations when Binding to Proteins, PLoS ONE, 2,
e820.
65. Najmanovich, R., Kuttner, J., Sobolev, V., Edelman, M. (2000) Sidechain flexibility in proteins upon ligand binding., Proteins, 39, 261-8.
66. Ferrari, A. M., Wei, B. Q., Costantino, L., Shoichet, B. K. (2004)
Soft docking and multiple receptor conformations in virtual
screening., Journal of Medicinal Chemistry, 47, 5076-84.
67. Fitzjohn, P. W., Bates, P. A. (2003) Guided docking: first step to
locate potential binding sites., Proteins, 52, 28-32.
68. Cole, J. C., Murray, C. W., Nissink, J. W. M., Taylor, R. D., Taylor, R.
(2005) Comparing protein-ligand docking programs is difficult.,
Proteins, 60, 325-32.
69. Irwin, J. J., Shoichet, B. K. (2005) ZINC--a free database of
commercially available compounds for virtual screening., Journal
of Chemical Information and Modeling, 45, 177-82.
70. Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H.
(2009) PubChem: a public information system for analyzing
bioactivities of small molecules., Nucleic Acids Research, 37,
W623-33.
71. Cobzaru, C., Ganas, P., Mihasan, M., Schleberger, P., Brandsch, R.
(2011) Homologous gene clusters of nicotine catabolism,
including a new -amidase for -ketoglutaramate, in species of
three genera of Gram-positive bacteria., Research In Microbiology,
162, 285-91.
72. Ritchie, D. W., Ritchie, D. W., Kemp, G. J. L. (1999) Protein
Docking Using Spherical Polar Fourier Correlations, Proteins, 39,
178-194.
73. Thomsen, R., Christensen, M. H. (2006) MolDock: a new technique
for high-accuracy molecular docking., Journal Of Medicinal
Chemistry,49, 3315-21.
74. Mandell, J. G., Roberts, V. A., Pique, M. E., Kotlovyi, V., Mitchell, J.
C., Nelson, E., Tsigelny, I., Ten Eyck, L. F. (2001) Protein
docking using continuum electrostatics and geometric fit, Protein
Engineering Design and Selection, 14, 105-113.
332
75. Trott, O., Olson, A. J. (2010) AutoDock Vina: improving the speed
and accuracy of docking with a new scoring function, efficient
optimization, and multithreading., Journal of Computational
Chemistry, 31, 455-61.
76. Hart, T. N., Read, R. J. (1992) A multiple-start Monte Carlo docking
method, Proteins: Structure, Function, and Genetics, 13, 206-222.
77. Yang, J.M., Chen, C.C. (2004) GEMDOCK: a generic evolutionary
method for molecular docking., Proteins, 55, 288-304.
78. Corbeil, C. R., Englebienne, P., Moitessier, N. (2007) Docking
Ligands into Flexible and Solvated Macromolecules. 1.
Development and Validation of FITTED 1.0, Journal of Chemical
Information and Modeling,47, 435-449.
79. Zsoldos, Z., Reid, D., Simon, A., Sadjad, B. S., Johnson, A. P. (2006)
eHiTS: an innovative approach to the docking and scoring
function problems., Current Protein Peptide Science, 7, 421-435.
80. Chen, R., Li, L., Weng, Z. (2003) ZDOCK: An initial-stage proteindocking algorithm, Proteins: Structure, Function, and Genetics, 52,
80-87.
81. Comeau, S. R., Gatchell, D. W., Vajda, S., Camacho, C. J. (2003)
ClusPro: an automated docking and discrimination method for the
prediction of protein complexes, Bioinformatics, 20, 45-50.
82. Tovchigrechko, A., Vakser, I. A. (2006) GRAMM-X public web
server for protein-protein docking., Nucleic Acids Research, 34,
W310-4.
83. Lyskov, S., Gray, J. J. (2008) The RosettaDock server for local
protein-protein docking., Nucleic Acids Research, 36, W233-8.
84. Macindoe, G., Mavridis, L., Venkatraman, V., Devignes, M.D.,
Ritchie, D. W. (2010) HexServer: an FFT-based protein docking
server powered by graphics processors, Nucleic Acids Research,
38, W445-W449.
85. Irwin, J. J., Shoichet, B. K., Mysinger, M. M., Huang, N., Colizzi, F.,
Wassam, P., Cao, Y. (2009) Automated docking screens: a
feasibility study., Journal of Medicinal Chemistry,52, 5712-20.
86. Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R. S., Huey, R., Hart, W. E.,
Belew, R. K., Olson, A. J. (1998) Automated docking using a
Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy
function, Journal of Computational Chemistry, 19, 1639-1662.
87. Friesner, R. A., Murphy, R. B., Repasky, M. P., Frye, L. L.,
Greenwood, J. R., Halgren, T. A., Sanschagrin, P. C., Mainz, D. T.
Metode computaionale
333
ANEX
Factor de multiplicare
Abreviere
Atto
10-18
Femto
10-15
Pico
10-12
Nano
Micro
-9
-6
-3
10
10
Mili
10
Centi
10-2
Deci
10-1
Deca
10
da
Hecto
Kilo
10
10
Myria
10
my
Mega
106
Giga
109
Tera
Peta
Exa
12
15
18
10
10
10
336
n:
se multiplic cu:
Microlitri (l)
103
Mililitri (ml)
Litri (l)
10-3
Galoane (US)
2.641 x 10-4
10-6
Litri (L)
6,102 x 10-2
Microlitri (l)
106
Mililitri (ml)
103
Galoane (US)
0,2642
3
103
10-3
Mililitri (ml)
Microlitri (l)
61.02
Litri (l)
10-3
Microlitri (l)
103
Mililitri (ml)
10-3
Litri (l)
10-6
Anex
337
n:
se multiplic cu:
Concentraia
Miligrame per litru (mg/l) Pri pe milion (ppm)
Distana
Centimetri (cm)
Inchi (in)
Milimetri (mm)
Angstromi ()
3,281 x 10-2
Inchi (in.)
0,39
Metri (m)
10-2
Milimetri (mm)
10
Yarzi (yd)
1,094 x 10-2
Centimetri (cm)
2,54
8,333 x 10-2
Metri (m)
2,540 x 10-2
Milimetri (mm)
25,4
Yarzi (yd)
2,778 x 10-2
Centimetri (cm)
0,1
3,281 x 10-3
Inchi (in.)
3,937 x 10-2
Metri (m)
10-3
Nanometri (nm)
0,1
Metri (m)
10-10
Picometri (pm)
100
6,45
104
Curentul i sarcina
electric
Amperi pe centimetru
ptrat (A/cm2)
338
n:
se multiplic cu:
Amperi pe centimetru
ptrat (A/cm2)
0,16
1,55 x 103
Coulombi (C)
3,6 x 103
Faraday (F)
3,731 x 10-2
Coulombi(C)
Faraday (F)
1,036 x 10-5
Coulombi pe centimetru
ptrat (C/cm2)
Amperi or (A-hr)
Coulombi pe metru
patrat (C/m2)
Coulombi pe inci ptrat
(C/in2)
Faraday (F)
104
1,55 x 103
Amperi-or (A-hr)
26.,8
Coulombs (C)
9,649 x 10-4
Bari
1,01
Presiunea
Atmosfere (atm)
Milimetri coloana de Hg
(mmHg) sau torri
Atmosfere (atm)
0,99
Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2)
1,020 x 104
psi
14,5
Atmosfere (atm)
1,316 x 10-3
Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2)
136
Anex
339
n:
se multiplic cu:
Pascali (P)
Rezistena electric
Ohmi ()
Megaohmi (M)
106
Microhmi ()
10-6
Ore (hr)
24
Minute (min)
1,44 x 103
Secunde (sec)
8,64 x 104
K-273,13
[(K 273,13)
95] + 32
1,8 x oC + 32
(F -32)/1,8
Picioare pe minut
(ft/min)
1,2
Picioare pe secund
(ft/sec)
3,281 x 10-2
Timp
Zile
Temperatura
Grade Kelvin (K)
C + 273,13
Viteza
Centimetri pe secund
(cm/s)
2,237 x 10-2
Mile pe minut
(miles/min)
3,728 x 10-4
340
22% (w/w)
Molecule mici
Ap
70% (w/w)
Monoglucide
3% (w/w)
Lipide
2% (w/w)
Aminoacizi liberi
0,4% (w/w)
Nucleotide
0,4% (w/w)
Ioni anorganici
1% (w/w)
Na+
5-15 mM
K+
140 mM
Mg2+
Ca
Cl
2+
pH
30 mM
1-2 mM
4 mM
7,4
Anex
341
342
Nucleotid
Adenin
Citozin
Guanin
Timin
Uracil
Prescurtarea
cu trei litere
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Glu
Gln
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Aminoacid
Alanin
Arginin
Asparagin
Acid aspartic
Cistein
Glutamat
Glutamin
Glicin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lizin
Metionin
149.2
146.2
131.2
131.2
155.2
75.1
146.2
147.1
121.2
133.1
132.1
174.2
89.1
Prescurtarea cu o Mas
litera
molar
(g/mol)
185
200
170
175
195
75
180
190
135
150
160
225
115
Aria
suprafeei
accesibilea
1.02
-0.67
1.22
1.25
-0.64
-0.67
-0.91
-1.22
0.17
-1.31
-0.92
-0.59
-0.4
94
56
40
96
66
49
93
102
20
106
134
65
100
HidroMutabilitate
b
fobicitate relativ c
Anex
343
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Prolin
Serin
Treonin
Triptofan
Tirozin
Valin
117.1
181.2
204.2
119.1
105.1
115.1
165.2
Prescurtarea cu o Mas
litera
molar
(g/mol)
155
230
255
140
115
145
210
Aria
suprafeei
accesibilea
0.91
1.67
0.5
-0.28
-0.55
-0.49
1.92
74
41
18
97
120
56
41
HidroMutabilitate
fobicitateb relativ c
Aria suprafeei accesibile este exprimat n i este calculat pentru fiecare aminoacid ca parte a unui schelet polipeptidic (2)
Hidrofobicitatea este exprimat n uniti arbitrare folosind scala OMH descrisa de Sweet i Eisenberg (1983) (3)
c
Mutabilitatea relativ este exprimat nuniti arbitrare(alanina fiind aleas ca referin) i reprezint probabilitatea ca un aminoacid s sufere o mutaie ntr-un timp
dat (4)
Phe
Fenilalanin
Prescurtarea
cu trei litere
Aminoacid
344
Biologie molecular. Metode experimentale
A
N/A
A
C
D
C
A
D
D
D
D
D
D
D
D
Benzen
Cloroform
Diclorbenzen
Hexan
Nitrobenzen
Fenol
Toluen
Dicloretan
A
A
A
A
A
A
D
N/A
B
D
Alcool amilic
Alcool benzilic
Alcool izopropilc
Etanol
Metanol
Alcooli
N/A
Acrilonitril
A
Acetal
Aceton
Sloveni organici
ABS
CPVC
N/A
LDPE
N/A
PC
PEEK
PP
TABEL A8. Compatibilitate chimic a diverselor tipuri de materiale plastice utilizate n laborator:
PTFE
PVC
N/A
N/A
PVDF
Anex
345
B
A
D
C
D
N/A
N/A
D
D
D
D
D
D
C
A
B
N/A
N/A
C
D
D
Acid citric
Acid formic
HF pn la 75%
HCl 37%
H2SO4 10-75%
H2SO4 98%
HNO3 pn la 50%
HNO3
D
B
A
Amoniac
Mg(OH)2
KOH
Baze
Acetal
Acizi
ABS
N/A
CPVC
LDPE
N/A
PC
N/A
PEEK
PP
PTFE
PVC
PVDF
346
Biologie molecular. Metode experimentale
A
A
D
D
A
A
D
B
B
A
D
B
B
A
Detergeni
Formaldehid
H2O2
Iod
AgNO3
Uree
NaOCl pn la 20%
CPVC
LDPE
N/A
PC
PEEK
PP
PTFE
PVC
PVDF
A = compatibilitate excelent, B = compatibilitate bun, efecte mici o uoar decolorare sau coroziune, C = compatibilitate relativ
bun, efecte mai pronunate, nu se recomand pentru utilizarea continu; pot aprea fenomene de nmuiere sau umflare, D = efecte
severe, nu se recomand utilizarea, N/A = nu exist informaii despre compatibilitate
Acetaldehid
Altele
NaOH pn la 80%
Acetal
ABS
Anex
347
348
FIGURA A1. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie
(rpm).
Pentru a identifica pe nomogram o valoare necunoscut se traseaz o dreapt
descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la
intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru centrifugri la viteze mai mari se
folosete nomograma din figura A2. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia
prezentat n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15.
Anex
349
350
Anex
351
352
Anex
353
354
Bibliografie:
1. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J.
G., Smith, A. J., Struhl, K. (2002) Short Protocols in Molecular
Biology, p. A2-1,. John Wiley & Sons Inc.
2. Chothia, C. (1976) The nature of the accessible and buried surfaces in
proteins, Journal of Molecular Biology, 105, 1-12.
3. Sweet, R. M., Eisenberg, D. (1983) Correlation of sequence
hydrophobicities measures similarity in three-dimensional protein
structure, Journal of Molecular Biology, 171, 479-88.
4. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) A model of evolutionary
change in proteins, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 345352.