Sunteți pe pagina 1din 8

fac apel la metode matematice pentru compararea rezultatelor numerice obinute, exprimate

n mg/l. Astfel s-a ajuns la examinarea Concentraiei Minimale Inhibitorii (CMI) a


antibioticului la 2mg/l 4mg/l, putndu-se trasa curbe de cretere a diferitelor specii
bacteriene n prezena unor concentraii variabile dintr-un antibiotic, i totodat fcnd
posibil trasarea limitei dintre efectul bacteriostatic i bactericid.

1.5.4. Testarea variabilitilor genetice la bacterii


Variabilitatea genetic reprezint o proprietate fundamental a microorganismelor (ca
de altfel a tuturor organismelor vii), care asigur generarea de noi genotipuri. Se cunosc dou
mecanisme care au rol n generarea variabilitilor: mutaiile i recombinarea.
1.5.4.1. Caracterul spontan al mutaiei
Mutaiile se traduc prin modificri n secvena nucleotidelor din moleculele de ADN
cromozomial i care se transmit la descendeni. Caracterul spontan al mutaiilor la bacterii,
nedirecionate de factorii de mediu, dar care au rol de selecie a mutantelor prin experiena
convingtoare, sunt: testul fluctuaiei i testul nsmnrii repicative.

Testul fluctuaiei (Luria i Delbruck)


Pune n eviden apariia, ntr-o celul de Escherichia coli sensibil la bacteriofag,
mutantele rezistente la virusul respectiv. Pentru aceasta, se inoculeaz bacilul coli ntr-un
mediu de cultur, ntr-o diluie calculat astfel ca s ajung la 1000 celule/ml mediu, dup
care aceasta se repartizeaz:
- ntr-o eprubet, 10ml din acest mediu;
- n alte 12 eprubete mici, cte 0,5ml mediu;
Dup 18 ore de incubare, se nsmneaz pe plci Petri cu geloz, care conin
bacteriofag, astfel:
- din eprubeta cu 10 ml mediu, se nsmneaz 12 plci cu geloz cu bacteriofag;
- din fiecare eprubet mic, se nsmneaz cte o plac ce conine geloz cu
bacteriofag.
Apariia variantelor rezistente la bacteriofag, se evideniaz n raport cu dou
posibiliti:
- rezistena poate aprea n urma adaptrii la bacteriofag (considerat ca factor de
mediu), i n acest caz, n cele 24 de plci Petri, numrul coloniilor va fi egal sau variaz
n limite restrnse;
- rezistena la bacteriofag poate aprea prin mutaie (independent de factorul de mediu),
i atunci pe plcile nsmnate din cultura unic (de 10 ml), se va dezvolta un numr
egal de colonii rezistente (clonele mutante fiind repartizate egal n mediul lichid). Pe
plcile nsmnate din cele 12 eprubete mici, numrul de colonii va fi variat, deoarece
mutantele rezistente se dezvolt diferit n fiecare eprubet. n acest caz, n unele
eprubete nu apare nici o clon mutant, iar n altele, mutantele rezistente aprute sunt
n numr variabil.
Testul nsmnrii repicative (Lederberg)
Cu ajutorul unei tampile din lemn, acoperit cu material din catifea (ale crei fire joac
rol de anse de nsmnare), aplicat pe suprafaa unei plci Petri pe care s-au dezvoltat
colonii izolate, se transpune cultura din aceast plac pe un mediu proaspt. Fiecare colonie
va fi astfel transpus pe mediul nou i se va obine o dezvoltare n copie a culturii de pornire.
Cu aceast tehnic, se nsmneaz un numr de plci Petri (cu geloz simpl), cu o
cultur de E. coli sensibil, de exemplu, la streptomicin, i apoi se fac nsmnrile repicative
pe plci cu geloz n care s-a nglobat streptomicin. Pe multe copii nu se va dezvolta nici o
colonie. Dac pe una dintre plci se va dezvolta chiar i o singur colonie rezistent, aceasta
nsmnat pe un mediu fr antibiotic i repetnd nsmnarea repicativ, se obine o
cultur pur de E. coli rezistent la streptomicin (demonstrnd rolul selectiv al factorului de
mediu streptomicina).
1.5.4.2. Transferul de rezisten la antibiotice prin plasmide R
Principalele mecanisme de transfer genetic i recombinare sunt: transformarea,
transducia i conjugarea, aceasta din urm putnd fi mediat de urmtoarele plasmide:
- plasmida sau factorul F de fertilitate;
- unele plasmide R de rezisten la antibiotice;
- unele plasmide sau factori colicinogeni (Col).
Plasmidele R au importan medical deosebit, avnd capacitatea de a transfera

rezistena n bloc la mai multe antibiotice. Acest transfer de la o tulpin bacterian donatoare
la alta receptoare, prin mecanismul principal de ctigare a rezistenei, este nepenit la
bacteriile Gram negative.
Utiliznd o tulpin test cunoscut, receptoare de plasmide R, care are markeri de
rezisten cromozomial, se poate urmri rezistena la antibiotice a unei bacterii izolate de la
bolnav, datorate unei plasmide R conjugate.
Pentru efectuarea transferului prin conjugare, se utilizeaz:
- Tulpina donatoare A Shigella izolat de la bolnav, care este rezistent la
sulfamid, streptomicin i cloramfenicol;
- Tulpina receptoare B E. coli care are markerul de rezisten cromozomial la
acid nalidixic, dar este sensibil la alte antibiotice.
Din fiecare tulpin, se face o inoculare cu ansa a cte 5 ml, n bulion nutritiv special, i
ambele culturi se incubeaz 18-20 ore la 37C, dup care se va rensmna n bulion,
obinndu-se culturi tinere pentru produsul de conjugare. Dup aducerea ambelor culturi la o
densitate bacterian bine determinat, se amestec o parte din tulpina donatoare (A), cu
patru pri din tulpina receptoare (B). Se incubeaz amestecul de conjugare la 37C timp de 4
ore, dup care se nsmneaz cte 0,1ml pe urmtoarele medii de selecie:
- geloz simpl, n care s-a inclus: sulfamid, streptomicin i cloramfenicol;
- geloz simpl, n care s-a introdus acid nalidixic;
- geloz simpl cu sulfamid, streptomicin, cloramfenicol i acid nalidixic.
Dup incubare la 37C, 24 de ore, se remarc dezvoltarea tulpinii donatoare A, numai
pe mediul cu primele trei antibiotice, a tulpinii receptoare B, numai pe mediul cu acid nalidixic
i a transconjugaiilor pe toate trei mediile. Explicaia fenomenului este posibil prin transferul
plasmidelor R de la tulpina donatoare la cea receptoare, demonstrnd posibilitatea
transmiterii plasmidelor R ntr-o populaie bacterian, i permind nelegerea modului de
ctigare a rezistenei la antibiotice a unor bacterii.

1.6. REACII ANTIGEN ANTICORP


UTILE DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC
Reaciile antigen-anticorp practicabile n scop de diagnostic etiologic se execut cu
produsele biologice (seruri i antigene) standardizabile, n dou situaii:
- pentru identificarea unui agent bacterian izolat din produsele patologice cu ajutorul
serurilor imune standard (seruri de animale imunizate cu antigene purificate, cunoscute);
- pentru evidenierea anticorpilor specifici n serul bolnavilor cu ajutorul antigenelor
standardizate (diagnostic serologic).
Antigen nseamn orice substan sau particul, vie sau inert, pe care organismul o
recunoate ca nefiind a lui proprie - nonself - i care odat recunoscut conduce la un
rspuns imun, cu formare de anticorpi specifici.
Din punct de vedere tehnic -in vitro- serurile i antigenele de diagnostic se utilizeaz n
cadrul mai multor sisteme antigen-anticorp i anume:
- reacii de aglutinare - n care antigenul este particulat (de tip corpuscular);
- reacii de precipitare - cu antigen solubil ce reacioneaz cu anticorpul, formnd un
precipitat vizibil;
- reacii de fixare a complementului de ctre complexul antigen-anticorp, fixare pus
n eviden cu un al doilea sistem antigen-anticorp, cunoscut (format din hematii i
anticorpi antihematie);
- reacii de imunofluorescen (direct sau indirect) n care antigenul formeaz
complexul cu un anticorp marcat cu o substan fluorescent, reacie vizibil la
microscopul cu fluorescen;
- reacii de neutralizare (in vitro sau in vivo) bazate pe neutralizarea de ctre anticorp
a unei proprieti (infectante, toxice,...) a antigenului (ex.: neutralizarea toxinelor);
- intradermoreacii (in vivo) I.D.R.

1.6.1. Reacii de aglutinare


1.6.1.1. Reacia de aglutinare n identificarea agentului patogen
Aglutinarea bacterian este o reacie antigen-anticorp (Ag-Ac) de agregare n care
antigenul este reprezentat de celule bacteriene (antigen particulat). Sub aciunea anticorpilor
din serurile standard (seruri aglutinante) apar agregate bacteriene vizibile macroscopic, n
urma formrii complexelor Ag-Ac. Reacia de aglutinare direct - macroscopic - se poate
efectua pe lam sau/i n tuburi.
Aglutinarea pe lam
Pentru aceast metod serurile de diagnostic se dilueaz cu soluie salin fiziologic
conform indicaiei de pe etichet (obinuit la diluie de 1/10).
Tehnica. Pe o lam de sticl degresat, se depune cte o pictur din serurile
aglutinante i, n imediata apropiere, o cantitate mic din cultura de cercetat. Se
omogenizeaz, treptat, pn cnd ntreaga cultur este suspendat n serul aglutinant.
Se consider aglutinare pozitiv atunci cnd apar agregate vizibile (dup un timp de 1-

4 minute). Pentru comparaie, se poate folosi o suspensie din aceeai cultur n ser fiziologic
(fr ser aglutinant) (fig.38).

Fig.38 Testul aglutinrii pe lam: n stnga, testul pozitiv


(suspensia bacterian a fost aglutinat de ctre anticorpii specifici din serul standard);
n dreapta, testul negativ (suspensia bacterian nu a fost aglutinat, test martor).

Aglutinarea n tuburi
Se practic atunci cnd este necesar o confirmare a unei aglutinri pozitive pe lam
sau n cazul cnd aglutinarea pe lam este incert.

Schema reaciei de aglutinare n tuburi


Eprubeta nr.
Soluie salin
fiziologic (ml.)
Ser standard diluat
1/10 (ml.)
Antigen (suspensie
bact.)(ml)
Diluiile finale

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5
1/40

0,5
1/8
0

0,5
1/16
0

0,5
1/320

0,5
1/64
0

0,5
martor

Practic, reacia se efectueaz de obicei n 6 tuburi (conform schemei), n care se


realizeaz diluii crescnde din serul standard la care se adaug aceeai cantitate de antigen
0,5 ml dintr-o suspensie omogen de cultur bacterian de 800 milioane germeni /ml.
n fiecare eprubet se pune cu pipeta gradat o cantitate de 0,5 ml soluie salin
fiziologic. Apoi, n prima eprubet se adaug 0,5 ml ser standard diluat 1/10 (cnd reacia se
folosete pentru dozarea anticorpilor n sngele bolnavilor - diagnostic indirect - atunci se
adaug ser de bolnav n aceeai diluie). Se omogenizeaz, prin aspirare-respingere, cu
pipeta, dup care se trec 0,5 ml din prima eprubet (5 inclusiv) din care se arunc 0,5 ml
(eprubeta nr.6 nu conine anticorp martor). n toate cele 6 eprubete se adaug 0,5 ml antigen
(suspensie bacterian). Se incubeaz la 37 C, timp necesar (variabil dup tipul de bacterie de antigen) formrii complexelor Ag-Ac:
- pentru antigene O sistemul se incubeaz timp de 20 de ore;
- pentru antigene H 4-5 ore la 37C;
- pentru antigene de suprafa Vi, K 2 ore sau peste noapte.
Citirea reaciei se face apreciind caracterul aglutinrii (floconar sau granular). Limita de
aglutinabilitate a tulpinii bacteriene supus identificrii reprezint diluia de ser standard la
care se mai poate observa o aglutinare vizibil cu ochiul liber, notndu-se aceast diluie,
care reprezint titrul reaciei. (ex. 1/160) (fig. 39).
n aglutinarea bacterian, dup natura i localizarea antigenului care particip la
reacie, se distinge:
- aglutinarea O sau somatic este dat de antigenul care intr n constituia
peretelui celular al unor bacterii fiind n general identic cu endotoxina i avnd natura glucidolipido-polipeptidic, termostabil, aprnd sub forma unor grunji fini;
- aglutinarea H sau flagelar dat de antigenul H , prezent la bacteriile mobile,

antigen de natur proteic, termolabil, apare sub forma unor flocoane care formeaz un
sediment abundent, lax, care dispare la agitare energic.
Reacia de aglutinare se utilizeaz n identificarea diferitelor genuri, specii i tipuri de
bacterii.

Fig. 39 Reacia de aglutinare n tuburi: pozitiv pn la 1/160(la 1/40 proporia dintre


Ag i Ac este optim).

1.6.2.1. Reacia de aglutinare n diagnosticul serologic


Evidenierea anticorpilor serici i a strii de sensibilizare se poate face cu ajutorul unor
antigene purificate, cunoscute sub denumirea de antigene pentru diagnosticul serologic al
infeciilor bacteriene. Deci, diagnosticul serologic este orientat spre decelarea anticorpilor n
serul bolnavilor cu ajutorul unor antigene cunoscute, care pot fi de tip aglutinant,
hemaglutinant, fixatori de complement i neutralizani.
Reacia de aglutinare pentru evidenierea aglutininelor serice (anticorpi serici
aglutinani), ca mijloc de diagnostic, se practic la noi n ar pentru urmtoarele infecii
bacteriene: febr tifoid i paratifoid reacia Widal; bruceloz reacia Wright i reacia
Huddleson; tifos exantematic reacia Weil-Felix; tularemia i yersinioza prin tehnica
standard.
Tehnica general (standard) const n: diluarea serului de bolnav cu soluie fiziologic
tamponat pH 7; adugare de antigen standard (diluat dup
indicaiile productorului) n cantitate fix; incubare variabil n funcie de antigen i citirea
reaciei prin notarea caracterului aglutinatelor (O - granular, H - floconar).
Titrul reaciei este dat de ultima diluie a serului, n care se constat o aglutinare
vizibil cu ochiul liber.
De reinut c tehnicile pentru febrele tifoparatifoide i cea pentru bruceloz sunt
adaptate diagnosticului acestor afeciuni.
Reacia de hemaglutinare pasiv (pe suport)
Acest tip de reacie este standardizat pentru diagnosticul tifosului exantematic al crui
agent etiologic este Rickettsia prowazeki.

Reacia de aglutinare pasiv sau aglutinare pe suport se utilizeaz

atunci cnd antigenul este o soluie, iar n urma fixrii pe un suport


particulat (latex, polistiren, hematii etc.) devine aglutinabil. n cazul
hemaglutinrii pasive amintite antigenul este un extract din culturi
toxigene (o toxin de R. prowazeki cultivat